（食品科学专业论文）以链脲菌素致糖尿病大鼠为模型研究植物多糖的构效关系.pdf

摘要 近年来，多糖的研究异军突起，糖生物学尤其是糖链结构、糖基化工程的研究逐渐成为生命科 学研究中新的前沿和热点甚至有科学家提出2 1 世纪是多糖的世纪。科学研究已经确认多糖类物 质具有许多生物活性，包括抗肿瘤、免疫、降血糖和抗病毒等，且无毒副作用。本研究拟以链脲 菌素致糖尿病大鼠为模型研究植物多糖的构效关系，为糖生物学的结构、生理功效的研究提供试 验支持和基本素材。 本文首先对几种植物多糖的生物活性进行了比较筛选，确定了植物多糖的生物学功效。研究 选用接骨木多糖，麦冬多糖，茶叶多糖为原料，用链脲菌索建立糖尿病大鼠模型进行动物试验。 动态监测血糖的变化并在试验结束的时候，检测相关生化指标。统计分析得出试验结论：植物 多糖对于链脲菌素致糖尿病大鼠的血糖、血脂等生化指标有明显的调节作用，尤以接骨木多糖调 节作用最为显著，且为国内外首次发现。调节的效果在试验的前1 0 2 0 天最为明显。 植物多糖的活性与结构是密不可分的。为了更好的阐释多糖的构效关系，本文以接骨术多糖 为例研究了其一级结构。接骨木多糖一级结构的研究沿用了传统的化学方法，并结合现代分析手 段进行了进一步的探讨。试验结论证明接骨木多糖的主要组分的可能的结构为： n h 2 、 关键词：多糖，糖尿病，接骨木，结构，调节作用 a b s t r a c t g l y c o b i o l o g yi s t h el a s tf r o n t i e ri n b i o c h e m i s t r y , e s p e c i a l l yt h ec a r b o h y d r a t em o i e t yo fg l y c o l - c o n j u g a t eh a sb e e nd e v e l o p e dr a p i d l y o nt h eo t h e rh a n d ，d i a b e t e sm e l l i t u sh a sb e c o m e o n eo f t h em a i n d i s e a s e st h a tt h r e a t e nh u m a nh e a l t ha sar e s u l to f t h el o n gc o u r s eo f t h ed i s e a s ea n da b s e n c eo fs p e c i f i c m e d i c i n e s ot h e r e l a t i o n s h i p b e t w e e nf u n c t i o na n ds t r u c t u r eo ft h e p l a n tp o l y s a c c h a r i d e s o n s t m p t o z o t o c i n i n d u c e dd i a b e t e sr a t sw a s s t u d i e d t h e r ea r ea l lk i n d s o f p o l y s a c c h a r i d e s i no u rc o u n t r y , a l o to fw h i c hh a v eb e e nu s e dt ot r e a tt h ed i a b e t e s t h r e ek i n d so fp o l y s a c c h a r i d e sh a v eb e e n s e l e c t e da sat r e a t m e n tf o rn o n i n s u l i n d e p e n d e n td i a b e t e s r a t si n0 1 1 1 - r e s e a r c h t h e e x p e r i m e n tl a s t sf o r2 8d a y sa n db l o o dg l u c o s ew e r ea n a l y z e de v e r y1 0d a y s n 他o t h e r b i o c h e m i c a lp a r a m e t e r sw e r ea n a l y z e da tt h ee n do f t h ee x p e r i m e n t n l ep l a n tp o l y s a c c h a r i d e s e s p e c i a l l yt h ep o l y s a e c h a r i d e so fs a m b u c u sn i g r a ( e l d e r - b e r r y ) a n do p h i o p o g o n j a p o n i c u sk e r g r a n td o b e n e f i tf o rd i a b e t e s 1 1 l ea n t i h y p e r g l y c e m i c a c t i o no f t h ee l d e r b e r r yp o l y s a c c h a r i d e si sn e v e rd i s c o v e r e db e f o r e i no r d e rt o s t u d y t h e r e l a t i o n s h i p b e t w e e nt h ef u n c t i o na n ds t r u c t u r eo ft h e p o l y s a c e h a r i d e so nt h es t r e p o t o z o t o c i ni n d u c e dd i a b e t e sr a t s ，w es t u d i e dt h ee l e m e n t a r y s t r u c t u r eo f t h ee l d e r b e r r yp o l y s a c c h a r i d e s g e n e r a lc h e m i c a lm e t h o d s ，c o m b i n i n g 谢t i l t h e i n s t r u m e n ta n a l y s i s ( u v ，i r , n m r , h p l c ) a r ea p p l i e dt oa n a l y z et h es t r u c t u r eo ft h e e l d e r b e r r yp o l y s a c c h a r i d e s t h em o l a rr a t i oo fm o n o - s a c c h a r i d e sc o m p o s e d t l l e p o l y s a c c h a r i d e s i sd e t e r m i n e da n do t h e re l e m e n t a r ys t r u c t u r ei n f o r m a t i o no f t h ee l d e r b e r r y p o l y s a c c h a r i d e sa r e c o n f i r m e d k e yw o r d s ：p o l y s a c c h a r i d e s ，d i a b e t e s ，e l d e r b e r r y , s t r u c t u r e ，r e g u l a t i o n e f f e c t l l y j s s 鑫 独创性声明 本人声明所呈交的论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成 果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发 表或撰写过的研究成果，也不包含为获得中国农业大学或其它教育机构的学位或证书 而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明 确的说明并表示了谢意。 研究生签名： 云丹赫 时间： 多年。占月丛旧 关于论文使用授权的说明 本人完全了解中国农业大学有关保留、使用学位论文的规定，即：学校有权保留 送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅，可以采用影印、缩印或扫描等复 制手段保存、汇编学位论文。同意中国农业大学可以用不同方式在不同媒体上发表、 传播学位论文的全部或部分内容。 ( 保密的学位论文在解密后应遵守此协议) 研究生签名： 导师签名： 时间：年月日 时间：阳歹年一缃百 中国农业大学硕士学位论文日言 第一童引言 1 1 立题的背景及研究现状 1 1 1 多糖的构效研究 糖生物学的研究领域包括糖化学、糖链生物合成、糖链在复杂生物系统中的功能和糖链操作 技术。近l o 年来，随着分析技术的进步和分子生物学的发展，糖的研究也取得的了巨大进展，糖生物 学研究正成为生命科学研究中又一新的前沿和热点。 糖链的生物学功能正被不断揭示，已有证据表明，糖链参与几乎所有真核生物的每一生命过程， 其功能是复杂而多样的。无论受精、发生、发育、分化、神经系统、免疫系统恒态的维持，还是在 炎症及自身免疫疾病、老化、癌细胞异常增殖及转移、病原体感染、植物与病原菌相互作用等过 程中都涉及糖链的参与，糖链在这些生命和疾病过程中起特异性的识别和介导作用1 1 0 i 。 糖链的结构远比核酸和蛋白质要复杂比如由3 个核苷酸碱基或3 个氨基酸组成的直链分子有 6 种可能的序列，而由3 个己糖所构成的三聚糖，其可能的序列则可达1 0 5 6 2 7 6 4 8 种。糖链结构研究 的困难限制了糖链功能的研究。正因为如此，科学家近年来化大力气进行多糖结构的研究，取得了 很好的进展。多糖的结构分析首先要了解组成它的单耱成分，不同糖昔键糖基比例，相邻单糖糖基 的连接方式，多糖中单糖残基间的苷键类型等信息。 目前用于多糖的结构分析的除了传统的化学方法，如部分酸水解、甲基化分析、高碘酸氧化、 s m i t h 降解等，现代仪器分析手段如气相色谱仪、液相色谱仪、拉曼激光光谱、毛细管电泳、质 谱、核磁共振等在糖化学领域也获得了广泛的应用。除了上述谈及的各种技术外，目前还用同位 素”c ，免疫化学方法等来分析多糖结构，同时还有许多新技术正在开发利用，随着科学技术的不 断发展，新技术也在不断引入糖链的结构分析中p j 。 其次。糖链功能和调控的复杂性也制约了研究的速度。研究多糖的构效关系具有十分重大的意 义，具有何种结构的多糖才有活性，结构的改变如何影响多糖的活性诸如此类的工作都是为了 解释多糖的结构和功能的关系确定具有生物活性的多糖的结构。大量研究结果表明，不少多糖 的生物活性与分子量、溶解度、粘度、支化度、链构象及结晶度有关，这种多糖结构与生物活性 的关系称为多糖的构效关系，对它的研究目前尚不完善。多糖的高级结构的研究比较少，但是科 学家已经肯定多糖的高级结构对于多糖功能的影响比一级结构重要的多1 4 】。多糖的主链组成对抗 肿瘤活性的影响较大，对于葡聚糖，大多活性多糖都是具有b ( 1 ，3 ) 苷键主链的葡聚糖”1 。其有生 物活性的( 1 ，3 ) b d 葡聚糖的分支度范围很广：在o 0 1 5 o 7 5 0 之间都有分布。但其主要分布 在o 2 0 0 3 3 之间，该段的多糖活性也相对更强”1 。 研究发现，分子的大小是多糖具备生物活性的必要条件，这可能同多糖分子形成的高级构型 有关。其中相对分子质量在1 0 0 0 0 0 2 0 0 0 0 0 之间的多糖活性最强。同时研究中发现，来源相同， 相对分子质量范围为5 0 0 0 1 0 0 0 0 的多糖，都不具备生物活性。而相同来源的多糖其结构具有类 似性，由此可知其分子大小对于其生物活性至关重要【7 】多糖溶于水是其发挥生物学活性的首要 条件，如从茯苓中提取的多糖组分中，不溶于水的组分不具有生物学活性，水溶性组分则具有突 出的抗肿瘤活性。降低分子质量是提高多糖水溶性，从而增加其活性的重要手段，一种真菌多糖， 不溶于水，在大鼠体内仅有微弱的抑瘤活性，5 mg ，kg 剂量时抑瘤率为5 7 ，降低分子质量后。 完全溶于水，1mg kg 剂量可使抑瘤率达到1 0 0 i ”。向多糖引入分支可在一定程度上削弱分子 间氢键的相互作用，从而增加其水溶性，如具有a 一葡聚糖构型的灵芝多糖，不溶于水，羧甲基 化后溶解性提高，在体外也表现出一定的抗肿瘤活性，经红外色谱分析经羧甲基化后，a 一葡聚 糖在3 4 0 0cm “处的羟基伸缩振动峰变窄，且向高波长方向振动，说明分子间的氢键在引入羧甲 基分支后被破坏懈。由此可见降低分子质量、引入支链或对支链进行适当修饰，均可提高多糖溶 解度，从而增强其活性。如果多糖粘度过高，则不乖j 于其的扩散与吸收。通过引入支链破坏氢键和 对主链进行降解的方法可降低多糖粘度，提高其活性。如向纤维素引入羧甲基后，分子间的氢键 发生断裂，产物粘度从0 】5 pa s 降至00 5 pa s i lu j ；裂褶多糖起初由于粘度大而无法在临 床上使用，后来采用超声技术在不破坏其结构的前提下使其发生降解，从而降低其粘度，而抗肿 瘤活性保持不变，生物利用率大大提高j 。 多糖的结构和理化性质都与其活性紧密相关，然而两因素并不是孤立地影响多糖的活性，结 构决定理化性质，从而影响活性，因此，在多糖构效关系的研究中，除了单独考察各级结构和理 化性质分别对多糖活性的影响外，还应研究由于结构与理化性质之间、各级结构之间以及各种理 化性质之间的相互制约对多糖活性产生的综合效应i l “。 显然。要使糖生物学的发展速度得以提升就必须在化学合成和结构分析的方法学上获得突 破，为生物学功能研究提供强有力的技术平台；在细胞水平上逐个研究糖链的功能，阐明糖链对 细胞基本生命活动的调控机制。 1 1 2 植物多糖降血糖血脂研究 w h o 有关资料表明糖尿病的致病。致残病死率等危害，已居非传染病性疾病第三位。许 多资料表明我国的糖尿病患病率已经呈现上升趋势。在世界卫生组织发表公报中预测“世界糖尿 病成年人的总数到2 0 2 5 年将达到3 亿，比1 9 9 5 年增加1 2 2 倍，到那时世界上糖尿病人最多的国 家将分别是印度。中国，美国等十个国家【1 ”。因糖尿病及其并发症所带来的费用也令人震惊。美 国自1 9 8 年起每年直接或者间接用于治疗糖尿病的经费开支从2 1 0 亿美元增加至1 0 0 0 亿美元 在我国糖尿病的治疗费用也以惊人的速度增加，如不采取经济有效的防治措施，预计今后糖尿 病所造成的社会经济负担将日渐严重。因此，如何寻找有效的经济的治疗糖尿病的物质，已经成 为国内外医药，食品工作者所关注和迫在眉睫的任务。 糖尿病治疗的目标是要达到糖、脂质、蛋白质代谢正常或接近正常，保证体内既有足够的葡 萄糖利用，又可以使血糖下降到正常或接近正常水平。避免发生急性台著症( 如严重的低血耱、 血糖过高或酮酸中毒) ，并预防糖尿病的慢性合并症包括由微血管疾病引起的眼和肾损伤神经系 统疾病和由大血管疾病引发的心脏、脑和外周血管功能不全) 。 由于糖尿病病因未阐明，所以目前尚无根治的药物。但是有许多中药活性成分被用于糖尿病 的调节，其中，尤其以天然植物的活性多糖的研究比较深入广泛。植物多糖具有多种功能，它是 一种非特异性免疫增强剂，且具有降血压、降胆固醇、降血糖、抗炎、抗凝血、抗生育等作用。 目前国内外对植物多糖降血糖的研究基本上还处在动物实验研究阶段。有研究认为人参多糖 2 中国农业大学硕士学位论文 引言 的降血糖作用存在着胰岛索增加以外的作用。进一步研究发现人参多糖可引起血糖、肝糖原降 低，切除肾上腺并不影响其作用，并可使丙酮酸含量增加及抑制乳酸脱氢酶( ldh ) 活性，使乳 酸活性减少，还可增加琥珀酸脱氢酶( sdh ) 和细胞色素氧化酶( ccd ) 的活性，对胰岛素的释放 亦有促进作用。也有报道苍术多糖a 、b 、c 对正常鼠降血糖作用明显，其中a 对四氧嘧啶糖尿 病鼠降血糖作用显著；亦有报道【l m 有关苍术煎剂给正常兔灌胃有升血糖作用，而对四氧嘧啶糖尿 病兔则能降低血糖。学者们1 1 6 发现玉竹甲醇提取物的正丁醇部分对正常及链脲佐菌素( stz ) 诱 导的糖尿病小鼠有降血耱作用，但血清胰岛素无变化，对肾上腺素引起的高血糖小鼠，经口服给 药就能降血中葡萄糖，提高肝脏中的肝糖量。据此推测可能是通过降肝脏葡萄糖输出，也可能是 肝细胞吸收葡萄糖能力增加所致。有研究显示从c o c m i a i n d i c a 中分离的果胶对正常鼠有显著低血 糖作用：从其它植物中分离的果胶也有此作用并能增加肝糖原。糖原合成酶的活性亦有显著提 高，而磷酸化酶的活性显著降低。g l o m b i t z ak w 等i l ”报道，从酸枣仁叶丁醇提取物中分离出 c h r i s t i n i na ，其皂苷塘体对糖尿病鼠有显著降血清葡萄糖水平，降低肝磷酸化酶和葡萄糖6 - 磷酸 酯酶活性，显著提高血清丙酮水平及肝糖原量，增加葡萄糖的利用，提高血清胰岛素及胰腺ca m p 水平。 国内报道银耳孢子多糖和木耳多糖均能降低正常及四氧嘧啶糖尿病小鼠血塘，对四氧嘧啶糖 尿病小鼠的高血糖有明显防治作用，同时还能减少糖尿病小鼠的饮水量。这可能是由于其减弱四 氧嘧啶对胰岛b 细胞的损伤所致；李先荣等l l ”报道，黄芪多糖( a ps g ) 2 5 0 mg kg 5 0 0 m gtkg 给小鼠腹腔注射，具有双向性调节血糖的作用。可使小鼠的血糖水平显著下降，并能明显 对抗肾上腺索引起的小鼠血糖升高反应；对苯乙双胍致小鼠实验性低血糖具有明显对抗作用 而 对胰岛索性低血糖无明显影响。接着李先荣等”用aps g 冲剂治疗了3 8 例i i 型糖尿病患者t 结果该冲剂能改变糖尿病症状，降低血糖，总有效率为6 5 8 ，疗效与消渴丸相当。张卫星1 2 0 报 道，小鼠口服麦冬多糖1 0 0 mg kg ，对正常小鼠血糖具有明显的降低作用，给药】1h 时下降 5 0 ：若口服2 0 0 mg kg 时，能明显降低四氧嘧啶所致糖尿病小鼠的血糖水平，降糖作用不随 剂量的增大而增大。丁仰宪f 2 ”已用鲜麦冬全草治疗糖尿痛，方法是用鲜麦冬全草每日5 0g ，切 碎煎汤代茶饮，连服3 个月，血糖和尿糖均降至正常，这主要是麦冬中麦冬多糖的作用；高山红 景天多糖5 0 2 0 0 mg kg 体重能降低正常小鼠肝糖原和血总脂，此外，对四氧嘧啶、肾上腺素 和葡萄糖引起的小鼠高血糖均有抑制作用，并能抑制肝糖原增加，增强肝糖原分解，使高血糖小 鼠血总脂含量降低。唐仲进等【2 2 l 报道彩云多糖对糖尿病小鼠血糖无明显影响，预先给小鼠彩云多 糖5 0 0 mg ，kg 体重连续6 天，能明显抑制四氧嘧啶诱导小鼠的高血糖水平。这很可能是通过促 进胰岛b 细胞分泌内源性胰岛素，还可能有胰外的作用，且对胰岛细胞有保护作用。研究口”表明 慧苡仁多糖有类似作用。中日学者都认为这种植物多糖不促进胰岛素分泌，但i 临床发现它对i 型 糖尿病和h 型糖尿瘸都有一定治疗效果。其降糖机理不同于磺脉类和双胍类药物，对单纯饮食不 能控制的轻、中型型糖尿病患者有效：适用于并发肝肾功能受损、高脂、高尿酸血症的糖尿病 患者。陈福君口4 1 报道，自桑叶中提取的桑叶总多糖腹腔注射给药，对四氧嘧啶糖尿病小鼠具有 显著降血糖作用并提高糖耐量，还可促进正常大鼠胰岛素的分泌。此外，天花粉、乌头、苍术、 山药、麻黄、刺五加、紫草、昆布、紫菜、桑白皮、灵芝、云芝等7 0 余种中药中含有的植物多 糖都具有降血糖作用。 糖尿病病人除高血糖外，一股均有脂质代谢异常。因此评价生物活性物质降糖和降脂的作用 非常重要以往常用的研究糖尿病脂质代谢的动物模型多为链脲佐菌素( s t z ) 大鼠或四氧嘧啶 小鼠口”。本次研究选用的是链脲菌素致糖尿病大鼠模型。 链脲菌素是一种对一定种属动物胰岛1 3 细胞有选择性破坏作用的化学物质，可以使许多动物 产生糖尿病。由于其对组织毒性相对较小，动物存活率高，所以是目前国内外使用较多的一种制各 糖尿病动物模型的方法i ”2 7 ， 从前人的试验结果可以看出。给大鼠连续腹腔注射s t z 4 0 m g k g 后，动物的血糖、血清甘油 三酯和胆固醇均明显升高，高密度脂蛋白与甘油三酯的比例增加，类似血糖控制不整的糖屎病患 者。注射后3 周测定了载脂蛋白a 1 和载脂蛋白b 的含量，结果载脂蛋白a 1 含量减少载脂蛋 白b 含量增加。说明动物体内清除脂质能力下降。即s t z 糖尿病大鼠的高血脂主要是由于脂质 代谢降低引起“。 以前的试验结果还表明，腹腔注射s t z 后连续测定8 周，与对照组比较，血糖均上升2 4 0 以上；甘油三酯均上升1 6 0 以上，l 4 周胆固醇上升3 0 以上，8 周上升6 ，说明动物能一直 维持在高血糖和高甘油三酯状态，胆固酵水平在注射后1 4 周较稳定，4 周后有部分动物降低。 散在注射后1 4 周进行试验的作用较好。 对已知降血糖药二甲双胍的评价表明，此模型能很好地反应其降血糖作用和调节血脂作用。 可能成为一个较好的研究糖尿病脂质代谢、同时评价活性物质的降血糖作用和调节血脂作用的动 物模型【2 9 1 州。 1 1 3 多糖改善糖代谢和脂质代谢的机理 ( 1 ) 血糖等对糖尿病的影响 a 血糖与糖尿病 糖尿病的危害主要是多种慢性并发症导致的后果，临床实践证明，长期治不达标，任凭并发 症发生发展，其危害和后果必然是多脏器尤其是重要脏器功能受损，造成致残，甚或危及生命。 耱尿病控制和并发症试验( d c c t ) 已经证明了精确的血糖控制为目的的对i 型糖尿病的强化治疗 可以减低视网膜病变、肾脏病变和神经病变的发病率和严重程度”，英国前瞻性糖尿病研究 ( u k p d s ) 计划于1 9 9 8 年完成的u k p d s 是一项前瞻性的随机的多中心研究，计划明确血糖控制对 i i 型糖尿病并发症的影响瞰1 。结果证明i i 型糖尿病并发症与高血糖有明显的相关性，微血管及大 血管并发症均受高血糖影响，降低血糖可以延缓型糖尿病病人微血管合并症和神经病变的发 生。 b 。尿量与糖尿病 尿量增多是糖尿病患者的主要症状之一，亦是观察糖尿病治疗效果的主要指标。王红芝等研 究了尿量与糖尿病的关系【3 3 】。得出以下结论：高耱使得原尿渗透压增高，影响近曲小管吸收和远 曲小管调节性回吸收而导致多尿。糖尿病病人由于胰岛素不足，进入各组织细胞的葡萄糖大为减 少，糖原分解和糖异生的作用增加，因而导致血糖增加，动脉血中葡萄糖浓度超过一定水平，肾 小球滤液的葡萄糖负荷超过肾小球吸收的最大能力时，则出现尿耱，一般尿糖多少与血糖高低呈 平行关系。糖尿病研究中的各项指标均与尿量多少有着直接的关系。 4 c 血糖与胰岛素 2 0 世纪6 0 年代中期，有学者已经观察到糖尿病的高血糖状态对胰岛的b 细胞释放胰岛素有 损害作用改善糖代谢后可使胰岛素释放得到一定的恢复。目前已知i i 型糖尿病的基本病因是多 基因遗传背景下形成胰岛素抵抗驯，胰岛素相对分泌不足，加上环境因素如入口老化、营养因素、 肥胖、体力活动不足等而产生的以慢性高血糖为特征的代谢紊乱。长期高血糖不仅引起血管病变， 葡时可加重胰岛素抵抗特别是可进行性损害胰岛b 细胞功能。 d 胰岛素，c 肢与糖尿病的关系 关于i i 型糖尿病胰岛素抵抗的研究很多，在i i 型糖尿病发病机理中，外周组织的胰岛素不敏 感即胰岛素抵抗，主要是因为b 细胞胰岛素分泌反应异常和外周组织的胰岛素抵抗，胰岛素不 敏感，胰岛素分泌增加，可导致高胰岛素血症，但仍存在高血糖等一系列代谢异常。一般认为应 用过胰岛素者，由于血中存在胰岛素抗体，血中胰岛素升高。不能反映其未结合胰岛素水平，用 特殊方法处理后的游离胰岛素测定较可靠，而无胰岛素抗体者胰岛素应与游离胰岛素一致。通过 对本组胰岛素抗体阳性的型耱尿病人游离胰岛素与胰岛素的比较，发现胰岛素抗体阳性者游离 胰岛素，郾活性胰岛素水平亦低于胰岛素水平。有报告i i 型糖尿病人胰岛索正常或高胰岛素血症 者。其血中游离胰岛素并未随着胰岛素的增加而增加。但游离胰岛素峰值与胰岛素分泌峰值一致。 胰岛素空腹及2 h 与c 肽相关r = o 5 ，游离胰岛素2 h 与c 肽近相关。 目前研究胰岛素抵抗与胰岛功能往往倾向于测定游离胰岛索p ”。由于胰岛素测定受多种因素 影响，如胰岛素原，血中浓度约占放免活性胰岛素的1 2 2 0 ，而胰岛素原的活性只占胰岛素的 1 0 以下。因而研究i i 型糖尿病活性胰岛素浓度尚需注意除了胰岛素原影响，正常人游离胰岛素变 化基本同胰岛素。 刘红等研究表明i i 型糖尿病人虽然胰岛素水平正常或增高，但真正有活性的胰岛素并不高， 因而i l 型糖尿病抵抗中，胰岛功能及代谢影响还有待进一步研究”。 ( 2 1 多糖改善糖代谢紊乱和胰岛素抵抗的可能机理 a ，多糖受体的发现 植物多糖构效关系的研究至今尚未完善。多糖的活性与分子量、溶解度、牯度、初级结构和 高级结构有关。日本学者旧已开始了多糖化学结构中活性决定簇的研究，特别是近些年来有关多 糖受体的发现对阐明其作用机理有重要意义。当多糖与受体作用时只有分子中几个低聚糖片段与 受体结合。推测多糖象蛋白质和酶一样，可能在多糖分子中存在一个或几个寡糖片段的“活性中 心1 3 8 1 。由此发现具有药理活性的多糖表现出含半乳糖醛酸聚糖区和带中性糖铡链的鼠李半乳糖 醛酸中心。 b 植物多糖对激素水平的调节 大量试验表明，植物多糖能降低正常及实验性糖尿病鼠的血糖水平，与其促胰岛素分泌的作 用紧密相关。植物多糖能够有效地对抗肾上腺索、胰高血糖引起的高血糖3 9 1 。可能的机制是植物 多糖作用于糖代谢酶或是竞争性抑制激素受体作用的结果。 e - ，植物多糖对糖代谢酶活性的调节 5 植物多糖并不增加胰岛索的分泌，而是作用于糖代谢的酶，文献【柏】报道，怀庆地黄根茎的热 水提取物为果胶样多糖组分( rg ，wp ) r g 、w p 经化学修饰及蛋白酶处理得到的结果表明。 活性存在于多糖结构部分，它可明显提高肝脏葡萄糖激酶及葡萄6 一磷酸酶脱氢酶的活性；降低 肝脏葡萄糖6 - - 磷酸酶及磷酸果糖激酶的活性。g a l d nj 为从桑树叶中提取的6 个含n 糖化 合物之一，它可抑制口一葡萄糖苷酶、a 一甘露耱苷酶和p 一半乳糖苷酶活性。灵芝多糖则能增 加肝葡萄糖酶、磷酸果糖激酶、葡萄糖6 一磷酸脱氢酶的活性：降低肝葡萄糖6 磷酸酶、糖原 合成酶的活性。植物多糖可通过调节糖代谢酶的活性，抑制糖异生，促进葡萄糖的利用，达到改 善糖代谢紊乱和胰岛素抵抗的目的1 4 ”。 d 植物多耱的抗氧化和免疫调节作用 植物多糖具有重要的抗氧化和免疫调节作用，能促进细胞免疫功能和诱生多种细胞因子，增 强机体免疫瞰l ，这也是植物多糖在改善糖代谢紊乱和胰岛素抵抗过程中发挥药效作用的可能机制 之一。 1 1 4 应用糖生物学研究多糖的构效关系 糖生物学是糖化学与生命科学交叉的新领域。以生物大分子组成部分多耱为对象，以糖化学、 免疫学及分子生物学等学科为基础，研究寡糖链作为“生物信息分子”在多细胞的高层次生命中 功能将极大的推动这些学科的发展1 4 。 功能性多糖是目前研究的热点之一。至今功能性多糖已发现的生物功能有很多：抗肿瘤作用、 消炎及抗放射作用、抗凝血作用等，但这些功能都并非独立。一方面，有些多糖具有多种不同的 生物活性；另一方面多糖的多种生物活性中，许多作用机制可能是相同的如抗肿瘤、抗辐射、 抗衰老等活性都同多糖非特异的免疫增强有关m ”l 。 功能以结构为基础。构效关系的研究为活性多糖的目的性筛选、进行分子修饰提供理论指导。 目前研究比较多的多糖有：免疫增强类多糖、抗凝血多糖、抗病毒多糖、疫苗用多糖等。同一种功 能的多糖其作用机制可能存在一定的相似性，而多糖的作用机制同结构存在必然的联系，对其进 行分类综述有助于对其构效关系更好地认识。 为了提高多糖的活性，结构改造工作也有很大进展。如某些分子量较大的酸性多糖。经氧化 降解成较低分子量的酸性多糖，然后用氯磺酸磺酰化得到磺酰衍生物，其免疫活性也能提高。多 糖中的乙酰基对多糖活性很有影响因为它能改变多糖分子的定向性和横次序，从而改变了多糖 的物理性质及生物活性。 迄今已经建立的多糖一级结构分析的方法有化学法物理方法，生物学的方法，酶解分析等 4 8 , 4 9 。 化学方法是多糖结构分析中使用最早，最为广泛的方法。这主要可以确定多糖的组成以及糖 链的连接方式，并能提供大量的其他结构信息。阐明一种多糖或糖缀合物中糖类的结构，首要的 工作是检测多糖或寡糖的结构单元。其次，要了解这些结构单位排列的顺序，连接的碳位和键型。 因此采用的方法，就包括多糖的降解糖残基的顺序测定，键型分析与端基异构的构型分析，如 果有非糖取代物存在，还应进行鉴定与定位。化学的分析方法具有多样性。例如：生物材料中多 糖的分离和纯化。因为植物或动物组织中天然存在的多糖，通常都与其它组分相互键合，或者直 6 接地交混在一起分离与纯化，要视具体情况而定。化学的方法主要有甲基化分析过碘酸氧化， s m i t h 降解，乙酰解，三氧化铬氧化法。部分酸水解等。 酶促反应具有高度专一性的特点，且副产物少，因此酶学方法在糖链的结构分析中是一种重 要的手段。利用a 糖菅酶和b 糖苷酶对多糖底物的催化反应来确认多糖链中糖苷键类型，利用 酶学方法分析糖肽连接方式。美国m aley tarention 发现了内切b n 乙酰氩基葡萄糖 糖苷酶作为释放酰胺连接的糖链的工具酶。为研究与天冬酰胺连接的寡糖结构开辟了新世元。除 了内切酶，许多外切酶也在糖链分析中广泛使用，如唾液酸酶、1 3 半乳糖苷酶、a 甘露糖苷酶 和b - 乙酰氨基葡萄糖苷酶等。它们是从糖链的非还原端依次切除相应的单糖，是糖链序列分析和 决定异头碳构型常用的工具酶。由于酶解的高度专一性和放射性标记方法的引入使得酶切方法十 分有效并广为应用。但这种方法最大的缺陷在于酶解结束后需要很多次的分离和确定产物的流体 动力学体积。为了解决这个问题试剂阵列分析方法( r a a m ) 孕育而生【5 0 】，它将酶解方法的操作 简化为只要将纯化的多糖样品等分为几个试样，再将每个试样与各种精确设定的外切糖苷酶混合 物保温酶解，这种特定酶混合物就叫作试剂阵列。合并每次酶水解的产物，再对产物库进行一次凝 胶渗透色谱分离，把分离图谱与计算机数据库中的图谱进行对照即可确定结构。根据这一原理，商 品化的糖序列仪已被生产出来。 抗原和抗体会相互结合，一定结构的多糖( 寡糖) 会抑带j 抗体一抗顾的相互结合不同的糖( 半抗 原) 有不同的抑制常数。当某种未知结构的糖链对抗原和抗体的结合产生了抑制，通过测定其抑制 常数。再与已知结构的糖链相比较，有相近抑制常数的多糖，其结构也相似，这就是利用免疫方 法分析糖链结构的原理。 仪器分析与化学方法相比具有快速、灵敏等特点，是糖链结构分析不可缺少的手段。用于糖 链结构分析的仪器主要有比旋光仪、紫外分光光度计、红外光谱仪、液相色谱仪、质谱、核磁共 振等。此外还有电泳技术，x 射线纤维衍射分析法和细胞表面复合糖的标记电镜观察法等等。除 了传统的分析技术，现代分析技术的出现和发展以及仪器之间的联用，大大推动了糖链结构的研 究工作。 多糖的活性与其初级和高级结构密切相关，高级结构在活性方面比一级结构起更大作用。有 些多糖一级结构相同，但活性不同，其原因是二级及三级结构不同。目前多糖的立体结构研究一 般靠2 d - n v l r 及x 衍射法。除此之外。多糖的活性还与分子量、溶解度、粘度等理化性质有关。 在研究多糖的构效关系时，常用到多糖的分子修饰，对多糖进行化学修饰，如硫酸化、脱硫酸化、 化学降解、酶降解、乙酰化、烷基化等等，有助于深入探讨其构效关系。 在我国中医药多糖的研究仅限于一般分离和免疫药理研究。相反，在资源贫乏的e t 本，其汉方 制剂源于中国，原料大部分从中国进口，却历来重视中药多糖的研究，日本学者加强了对中药多 糖活性决定簇的化学结构与功能关系的系统研究，并在柴胡、当归多糖研究方面取得了突破性进 展。研究认为像蛋白和酶一样，可能在多糖分子中存在一个或几个寡糖片断的“活性中心”，并 从大量中药多糖一级结构中探索其活性决定簇，在中药多糖高专属性质量控制方法上获得突破， 如日本山田阳城等最近从中药柴胡多糖的活性部位考虑，制各对分支部分的特异抗体，开发使用 这种新抗体的高灵敏度e l i s a 法，可以明确活性部位，并基于活性部位进行中药多糖的质量控制， 该法不仅用于汉方药的质量评价。还能阐明中药活性多糖在机体内的吸收和动态变化规律。此外， 在多糖体内作用机理和结合复方研究多糖作用方面都有新的突破。日本学者在中药多糖常规化学 研究方法基础上，大量引入分子生物技术与手段。在多糖化学结构与功能研究上侧重对活性决定 簇的研究。其研究水平与进展远远超过我们1 5 1 】。面对这种严酷的现实和挑战戒们必须加强这一 领域研究工作。 基于上述情况，本次研究拟分两个部分进行。首先选取几种植物多糖作为试验原料。以链脲 菌素致耱尿病大鼠作为动物试验豹模型，定量供给植物多糖，同时设定阳牲对照，阴性对照和药 物对照。定期监测血搪，并在试验结束后检测有关生化指标。经过各项指标综合评定，筛选生物 活性最强的植物多糖，研究其一级结构，确定植物多糖和糖尿病构效关系的相关信息。 本课题通过试验的第一阶段三种植物多糖对链脲菌素致糖尿病大鼠的调节作用的研究，初步 确定了植物多糖对于链脲菌素致糖尿病大鼠的有关生化指标的良好的调节作用，其中接骨木多糖 的生物活性最强。为了更好的了解植物多糖和其生物活性之间的构效关系，选取接骨木多糖进一 步研究其一级结构。 接骨木为忍冬科接骨木属植物，是珍贵的药用植物，在民间医学中利用接骨木的花、果实和 树皮，新鲜果实和花的煎汁用来治疗风湿病，花浸汁含嗽治疗呼吸道、咽喉和口腔系统疾病。接 骨木花煎汁和茶，可作为发汗、利尿、收敛、杀菌等药剂，并能促进胆汁分泌。树皮煎汁用于治 疗肾炎和水肿病。果实和树皮制作的浸剂，有轻泻、利尿和发汗的功能。叶煎汤熏洗外用治疗皮 肤炎、跌打损饬、筋骨疼痛。接骨木植株根、花、叶煎汁可用于讽节人体物质代谢。一般由花加 工成热浸剂，由果实和叶加工成冷浸剂。 接骨木果实食用油含量达3 5 一“油中人体必需的脂肪酸8 5 1 7 ，接骨木果实干物质 含量1 8 ，其中糖5 2 7 4 ，果胶物质1 ，有机酸i 3 ，其组成为苹果酸、醋酸、酒石酸、 丁酸、奎宁酸、氯原酸。果实中纤维素约7 ，含氮物质2 5 6 ，无机物0 , 6 4 。成熟的果实百克 果汁含抗坏血酸l o - - 5 0 m g ，聚苯酚总量2 9 6 0 m g ，白花青素1 3 0 m g ，邻苯二酚9 0 r a g ，黄酮醇l o o m g 。 大部分聚苯酚为花青苷( 2 4 0 0 r a g ) ，花青苷同鼠李糖和葡萄耱结台，形成桑巴霉素。在植株营养生 长期间，果实和叶片化学成分动态是相同的。只有抗坏血酸浓度变化是相反的。在叶中还有微量 的生物碱、芳香油、单宁、树脂物质、安息香、己烯、乙醇醛。在树皮中含桑巴霉索、毒芹碱、 戊酸、胆碱、谷固醇、果胶物质、芸香苷、配糖物、苦杏仁苷。百克树皮中含抗坏血酸达3 0 r a g 。 在干花中含固态芳香油，以及戊酸、氯原酸、咖啡酸、苹果酸、醋酸、果胶物质。 现今已经有许多关于接骨木的抗癌作用降血脂。抗衰老1 5 ”，诱发淋巴细胞转化”，治 疗感冒等的报导，并且有关于生产接骨木的复合饮料的研究口”。开发接骨木的前景十分光明9 “。 1 2 本次研究工作的实用价值和理论意义 作为信息分子的糖类在生物体内发挥多方面的生物作用：决定了分子的抗原性和细胞的表 型：在很多生理和病理过程中起了关键的识别作用；也可作为动态和时空调节的信号p ”。糖类研 究的复杂性在于其结构的复杂多变和由此决定的功能和调控的研究的复杂性，各国科学家都在致 力于糖链的结构分析和合成研究，为糖链的功能分析提供技术支持，同时集中精力研究糖链的调控 和识别机制。毫无疑问，只有在结构上获得突破、在功能研究上获得更多的基础数据积累，开展糖 生物学研究的时代才能真正来临，而那一天的到来将会大力的促进耱化学、生物学和生理学等各 学科的按展。 g 大量研究结果表明，不少多糖的生物活性与分子量、溶解度、粘度、支化度、链构象及结晶 度有关，这秘多糖结构上生物活性的关系称为多糖的构效关系，对它的研究目前尚不完善。至今 已发现大多数具有抗肿瘤活性的多糖都具有b ( 】一3 ) d 葡聚耱的主链结构。但是，同样具有b 一( 1 - - 3 ) 一d 葡聚糖主链结构的p a c h y m a n 和l a m i n a r a n 却几乎没有抑瘤活性。这表明主链结构并不 是多糖抗肿瘤活性的最基本原因。据报道p ”如果多糖的构象由有序变为无序，其活性立即消失。 基于这一结果和其他的有关构效关系的信息，c h i h a r a 认为，多糖的抗肿瘤活性可能与其某一种“有 序构象”直接相关。研究多糖的构毅关系，有助于从分子水平阐明活性因子起作用的机理，然后用 化学修饰来改善它们的生物活性p w 。 本课题秉承本实验室生物大分子结构与功能研究的一贯思路，致力于研究我国植物多糖构效 关系。研究选用了链脲菌素致糖尿病大鼠为模型，并利用传统的化学手段和现代仪器分析相结合 的方法研究植物多糖的降血糖降血脂等生物活性与结构的关系。 本次试验结果显示，接骨木多糖的降血塘降血脂等生物活性显著，并且为国内外首次发现。 本文对其一级结构进行研究并且就构效关系进行了讨论。构效关系的研究将为活性多糖的目的 性筛选、进行分子修饰等提供理论指导。本实验室岬1 还研究了同样具有降血糖血脂的活性的麦冬 多糖的一级结构，本文在结论部分结台麦冬多耱的结构研究，对于具有降血糖降血脂的植物多糖 的共性秘不同进行了讨论，希望为多耱的构效关系的研究提供理论支持和试验依据。 9 第二章多糖的粗分离与动物试验部分 2 1 试验材料与方法 2 1 1 试验材料 接骨木( 山西临汾) 麦冬( 购自药店) 茶叶( 购自茶鞋) ) 盐酸二甲双胍( 北京双鹤现代医药技术有限公司) s p f 级雄性s d 大鼠( 北京市实验动物中心) 基础饲料( 由航天医学所5 0 7 提供) 2 1 2 试剂及主要仪器设备 无水乙醇( 分析纯，北京市化学试剂公司) 丙酮( 分析纯，北京市化学试剂公司) 乙醚( 化学纯，北京市化学试剂公司) 氯仿( 分析纯，北京市化学试剂公司) 链脲菌素( s i g m a 公司) 戊巴比妥钠( 由航天医学所5 0 7 提供) 活- 陛炭( 北京市化学试剂公司) 柠檬酸钠( 分析纯，北京市化学试剂公司) 血糖试剂盒( r a n d o x 公司) 甘油三酯试剂盒( r a n d o x 公司) 胆固醇试剂盒( r a n d o x 公司) 胰岛素放射免疫试剂盒( 北方生物技术研究所) 胰高血糖素放射免疫试剂盒( 北方生物技术研究所) 载脂蛋白a i ，b 试剂盒( 北京中生生物工程高科技公司) 高密度脂蛋白胆固醇试剂盒( 北京中生生物工程高科技公司) 低密度脂蛋白胆固醇试剂盒( 北京中生生物工程高科技公司) 蛋白试剂盒( 北京中生生物工程高科技公司) 肌酐试剂盒( 北京中生生物工程高科技公司) 尿素氮试剂盒( 北京中生生物工程高科技公司) 水浴锅( 天津中环科技开发公司) 真空泵( 巩义市杜甫仪器厂) 真空冷冻干燥机( 由5 0 7 所提供) 1 0 高效液相色谱仪( w a t e r s ) 全自动生化分析仪( 日立7 1 5 0 ) 2 1 3 试验方法 植物多糖的提取l “l ： ( 1 ) 茶叶多糖的提取： 茶叶磨碎，用温水( 4 】煨泡1 2 小时，减压浓缩，s e v a g e 法脱蛋白直至无蛋白，用三倍量的 9 5 的乙醇沉淀，离心。沉淀物用无水乙醇，丙酮，乙醚交替洗涤2 次后，真空干燥后的灰白色 粉状物( 茶叶粗多糖) 。待用。 ( 2 ) 麦冬多糖的提取： 麦冬干燥块根，用十倍水加热萃取，提取液趁热过滤，滤液加o 2 活性炭搅拌均匀，静置过 夜。滤除炭的提取液浓缩，浓缩液用s e v a g e 法脱蛋白，再加无水乙醇至含醇量为8 0 ，搅匀，静 置析出沉淀倾出上清液，沉淀分别用丙酮，无水乙醇洗涤5 次，6 0 c 烘干，得麦冬多糖。试验 时用蒸馏水配成所需浓度。 ( 3 ) 接骨本多糖的提取： 接骨木粉末在8 0 c 水浴中提取1 0 小时后，过滤，浓缩后，用s e v a g e 法脱蛋白，然后加3 倍 量的乙醇进行沉淀，离心，倾出上清液时，过滤，离心，合并过滤液并浓缩，以乙醇沉淀，乙醇 最终浓度不少于8 0 。沉淀物自然风干，得接骨木多糖。 植物多糖的鉴定 ( 1 ) 多糖样品的高效液相色谱分析： 试剂：葡萄糖，果糖，二糖( 标样，色谱纯( m e r c k ) 。水：重蒸并经0 4 5 u r n 滤膜过滤。 仪器：h p l c 色谱条件： 柱：s u g a r - p a k - 1 ( o ，6 5 3 0 e r a ) 流动相：h 2 0 流速：0 7 m l m i n 检测器：r i4 x 柱温：9 0 样品的制各： 标准溶液配制：精密称取各种糖的标样5 0 r a g 于2 5 m l 容量瓶中，加水溶解定容，摇匀备 用。 样品溶液配制：精密称取糖溶液l g 于5 0 m l 容量瓶中，用水溶解并定容，摇匀后经0 4 5 u m 滤膜过滤，清液待测定。 ( 2 ) 分析结果 糖样检测结果( 表1 ) 表1 多糖耱样的检测结果 计。 试验结果显示；样品中的葡萄糖和蔗糖的含量很少，对于糖尿病大鼠血糖的影响可以忽略不 动物试验 ( 1 ) 糖尿病大鼠模型的建立n ： 雄性s d 大鼠8 0 只，体重约2 0 0 _ _ _ 2 0 克，用普通饲料适应性喂养一周，取其中的6 0 只为试 验组，按6 5 毫克，千克体重在大鼠的左下腹腔一次性注射链脲菌素( s t