（食品科学专业论文）烟草绿原酸的提取纯化工艺研究.pdf

摘要 我国烟草植物的种植面积和产量均居世界首位。烟草中含有绿原酸、烟碱和茄 尼醇等多种生物活性成分，可以采用一系列的技术工艺，对其进行提取、纯化，从 而应用于农业、医药、食品、化工等行业。绿原酸具有抗菌、抗病毒、升高白细胞、 保肝利胆和兴奋中枢神经系统等多种药理作用。本论文对烟草绿原酸的提取分离纯 化工艺进行了系统地研究，主要内容如下： 1 建立了测定绿原酸的纸层析一紫外分光光度法( p c u v ) 和高效液相色谱法 ( h p l c ) 。两种方法对样品重复测定的变异系数分别为1 5 4 和1 2 3 ，平均加标 回收率分别为1 0 0 7 1 和1 0 0 4 6 ，说明两种方法都准确可靠。采用高效液相色谱 法时，色谱柱为h y p e r s i lb d c 1 82 5 0 m m x 4 6i n l ni d ，流动相为2 5 乙腈+ o 5 乙 酸，流速为1m l d m i n ，检测波长为3 2 6n l l l ，测得烤烟c l f 中绿原酸含量为3 3 2 0 。 2 研究了超声波辅助提取法提取烟草主要活性成分的工艺，并与热回流提取法 进行了比较。超声波辅助提取绿原酸的最佳工艺条件为：p n4 的9 5 乙醇，料液比 1 ：1 5 ，提取温度8 0 ，提取两次，每次4 5m i n 。所得烟草提取物a 的固形物得率为 2 1 1 8 ，其中绿原酸含量1 3 9 3 ，提取率9 3 6 5 ，结果明显优于热回流法。 3 进行了大孔吸附树脂分离富集提取物a 中绿原酸的性能研究。通过静态吸附 一解吸实验，从8 种大孔吸附树脂中筛选出l s a - 8 b 、x d a 1 和l s a 一2 1 三种较佳的 树脂，通过吸附动力学实验，从中确定出x d a 1 树脂最适合烟草绿原酸的富集分离。 a - l 树脂吸附分离烟草绿原酸的工艺条件为：吸附液中绿原酸的浓度3 5m g m l ， p h3 0 ，流速2b v h ，以6b v 的4 0 乙醇洗脱，解吸附效果最佳。得到的绿原酸粗 品b 中绿原酸含量为3 9 1 2 0g 1 0 0 9 ，回收率为8 0 0 6 。 4 采用乙酸乙酯萃取对绿原酸粗品b 进行进一步富集分离研究。最佳萃取条件 为：料液初始绿原酸浓度1 2 m g m l 左右，p r l 2 0 ，1 ：1 萃取三次。得到了绿原酸产 品c ，其纯度达到6 4 5 3g 1 0 0 9 ，得率为8 2 5 8 。 5 研究了聚酰胺柱层析纯化绿原酸产品c 的工艺。最佳的工艺条件为：先利用 8 0 1 0 0 目聚酰胺柱( 母3 0 x 5 0 0 ) ，上柱样液浓度在1 0 m g m l 左右，4 b v 的2 0 乙醇洗脱，得到绿原酸产品纯度为8 6 7 1 ，得率为6 0 4 1 ；再采用1 5 0 2 0 0 目聚 酰胺柱( 巾3 0 5 0 0 ) 进一步纯化，得到最终绿原酸产品d ，纯度达到9 2 7 3 ，得 率为5 9 2 8 。 6 采用熔点测定、纸色谱、紫外光谱、红外光谱、高压液相色谱和l c m s 对 绿原酸产品d 进行了鉴定。 关键词：烟草；绿原酸；提取；聚酰胺：纯化 江南大学硕士学位论文 a b s t r a c t 1 1 1 ep l a n t i n ga r e aa n do u t p u to ft o b a c c oi nc h i n as t a n df i r s ti nt h ew o r l dl i s t t h e r e a l em a n yb i o a c t i v ec o m p o n e n t si nt h et o b a c c o ，s u c ha se h l o r o g e n i ca c i d , n i c o t i n e , s o l a n e s o l ，e t c t h e s eb i o a c t i v ec o m p o u n d sc a l lb eu s e di na g r i c u l t u r e ，m e d i c i n e ，f o o d , a n d c h e m i c a li n d u s t r y c h l o r o g e n i ca c i di sa ni m p o r t a n tb i o a c t i v ec o m p o n e n tw h i c hp o s s e s s e s m a n yp h a r m a c e u t i c a lf u n c t i o n s ，s u c ha sa n f i b a c t e r i a , c h o l a g o g u e ，r e d u c i n gb l o o dp r e s s u r e ， i n c r e a s i n gh e m o l a u k o e y t e , e x c i t i n gn e r v ec e n t e rs y s t e ma n ds o o i li nt h i sp a p e r , t h e e x t r a c t i o n , i s o l a t i o na n dp u r i f i c a t i o no fc h l o r o g e n i ca c i df r o mt o b a c c ow e r es t u d i e d s y s t e m a t i c a l l y t h em a i na c h i e v e m e n l sa r ea sf o l l o w i n g ： 1 t h ep a p e rc h r o m a t o g r a p h y - u l t r a v i o l e ta n dv i s i b l es p e c t r o s o o p y ( p c - u v ) m e t h o d a n dh i 业p e r f o r m a n c el i q u i dc h r o m a t o g r a p h y ( h p l c ) w e r ee s t a b l i s h e dt od e t e r m i n e c h l o r o g e n i ca c i d t h ev a r i a t i o nc o e f f i c i e n to ft h et w om e t h o d sw a s1 5 4 a n d1 2 3 r e s p e c t i v e l y , a n ds a m p l er e c o v e r yo ft h et w om e t h o d sw a s1 0 0 7 1 a n d1 0 0 4 6 r e s p e c t i v e l y s ob o t hm e t h o d sa l ee x a c ta n dc r e d i b l e t h ec o n d i t i o n so fh p l cm e t h o d w e r e h y p e r s i lb d - c i sc o h u n n ( 2 5 0n l i n 4 6m mi d ) ，m o b i l ep h a s ew a s2 5 a c e t o n i t r i l e + 0 5 删ca c i d , t h ef l o wr a t ew a s1m l _ m i n , a n dt h ed e t e c t i o nw a v e l e n g t h w a sa t3 2 6 姗t h ec o n t e n to f c h l o r o g e n i ca c i di nf l u e - c u r e dt o b a c c oc i fi s3 3 2 0 2 n l eu l t r a s o n i ca s s i s t a n te x t r a c t i o no f t h em a i nb i o a c t i v ee o m p e n e n t sf r o mt o b a c c o w a si n v e s t i g a t e d t h eo p t i m u mc o n d i t i o n sw e r eo b t a i n e d ：9 5 e t h a n o la se x t r a c t i o n s o l v e r t , a t8 0 ，p h4 ，r a t i oo f m a t e r i a lt ol i q u o r1 1 5 ( w v ) ，e x t r a c t i o nt w i c ea n de a c hf o r 4 5m i n t h ey i e l do fc r u d ee x t r a c taw a s2 1 1 8 1 0 0 9 , t h ec o n t e n to fc h l o r o g e n i ca c i d w a s1 3 9 3g 1 0 0 9 a n dt h ee x t r a c t i o nr a t i oo f c h l o r o g e n i ca c i dr e a c h e d9 3 6 5 3 t os t u d yt h es e p a r a t i o ne f f e c to fm a e r o p o r o u sr e s i nf o rt h ep u r i f i c a t i o no f c h l o r o g e n i ca c i d ，t h r e et y p e so fm a c r o p o r o u sr e s i n sw e l es e l e c t e df r o me i g h tk i n d so f r e s i n s ，a n dt h e i ra d s o r p t i o nd y n a m i c sw e i es t u d i e d t h er e s u l t ss h o w e dt h a tx d a - 1r e s i n w a st h eb e s t t h eo p t i m a ls e p a r a t i o nc o n d i t i o n sw e r ea sf o l l o w i n g ：u s i n gc r u d ee x t r a c ta a ss a m p l e ，c h l o r o g e n i ca c i dc o n c e n t r a t i o no fs a m p l es o l u t i o nw a s3 5m # m l ，a tp h3 0 ， f l o wr a t e2b e dv o l u m e ( b v ) p e rh o u r u s i n g6b v4 0 ( v v ) e t h a n o la st h ed e s o r p t i o n s o l v e n tt oo b t a i nt h ec r u d ec h l o r o g e n i ca c i dp r o d u c tb t h ec o n t e n to fc h l o r o g e n i ca c i d r e a c h e d3 9 2 0g 1 0 0 9i n t h ee t u d ep r o d u c tb ，a n dt h er e c o v e r yo f c h l o r o g e n i ca c i dr e a c h e d 8 0 0 6 4 e t h y la c e t a t ew a su s e dt oe x t r a c tc h l o r o g e n i ca c i df r o mt h ec r u d ep r o d u c tbt o i n c r e a s ei t sc o n t e n t i tw a sf o u n dt h a tt h eo p t i m a le x t r a c t i o nc o n d i t i o nw e r ea sf o l l o w s ：t h e c h l o r o g e n i ca c i dc o n c e n t r a t i o no fi n i t i a le r o d ep r o d u c tb s o l u t i o nw a sa b o u t1 2r a g m e ， p h2 0 ，p h a s er a t i ow a s1 1 ( v v ) ，e x t r a c t i n g3t i m e s t h ep u r i t yo f e r u d ec h l o r o g e n i ca c i d i l a b s w a c cw a s6 4 5 3g 1 0 0 9 ，t h er e c o v e r yo f c h l o r o g e n i ca c i dw a s8 2 5 8 5 f i n e l y ，t h ep u r i f i c a t i o no fc r u d ec h l o r o g e n i ca c i dcb yp o l y a m i d ec o l u m n c h r o m a t o g r a p h yw a si n v e s t i g a t e d t h eo p t i m a lc o n d i t i o n so fs e p a r a t i o na n dp u n f i c m i o no f c h l o r o g e n i ca c i db y8 0 - - 1 0 0m e s hp o l y a m i d ec o l u m nf 巾3 0 5 0 0 ) w e r ec o n f i r m e da s f o l l o w s ：t h ec o n c e n t r a t i o no fc h l o r o g e n i ca c i di ns a m p l i n gl i q u o rw a sa b o u t1 0m g m l ， 4 b v2 0 ( v v ) e t h a n o la st h em o b i ls o l v e n t a f t e rt h i sp r o c e d u r e t h ec o n t e n to f c h l o r o g e n i ca c i dr e a c h e d8 6 7 1g l o o g t h er e c o v e r yo f c h l o r o g e n i ca c i dr e a c h e d6 0 4 1 t h r o u g ht h ef u r t h e rp u r i f i c a t i o nb y1 5 0 2 0 0m e s hp o l y a m i d ec o l u m n ( 巾3 0 5 0 0 ) ， w h i t ec h l o r o g e n i ea c i dp o w d e rdw a so b t a i n e d a n dt h ec o n t e n to fc h l o r o g e n i ca c i d r e a c h e d9 2 7 3 1 0 0 9 , t h er e c o v e r yr e a c h e d5 9 2 8 6 o nt h eb a s i so fm e l t i n g - p o i n td e t e r m i n a t i o n , t l c ，i r , l c m s ，t h ew h i t e c h l o r o g e n i ca c i dp o w d e rd w a si d e n t i f i t e da sc h l o r o g e n i ea c i d k e yw o r d s ：t o b a c c o ；e h l o r o g e n i ca c i d ；e x t r a c t i o n ；p o l y a m i d e ；p u r i f i c a t i o n i l l 独创性声明 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工 作及取得的研究成果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地 方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含 本人为获得江南大学或其它教育机构的学位或证书而使用过的材料。 与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明 确的说明并表示谢意。 甜刁 签名：基! 竖坠 日期：函。7 年彭月，箩日 关于论文使用授权的说明 本学位论文作者完全了解江南大学有关保留、使用学位论文的规 定：江南大学有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和 磁盘，允许论文被查阅和借阅，可以将学位论文的全部或部分内容编 入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、 汇编学位论文，并且本人电子文档的内容和纸质论文的内容相一致。 保密的学位论文在解密后也遵守此规定。 签名：丝监基导师签名：签名： 墨监这 导师签名： 日期：函。 第一章绪论 第一章绪论 1 1 烟草概况 烟草属茄科( s o l a n a c e a e ) 烟属( n i c o t i a n a ) ，主要栽培品种有普通( 红花) 烟 草( t a b a c u ml ) 和黄花烟草( r u s t i c al ) 两种，均为一年生草本。烟草是 一种重要的经济作物，原产于南美洲，1 6 世纪末传遍欧洲，到1 7 世纪后期已遍及世 界，于明朝万历年问传入我国。生产上种植的烤烟品种叶面积差别较大，底部叶片 约6 0 0c m 2 ，中部叶1 8 0 0c n l 2 ，顶部叶约1 2 0 0c n l 2 。雪茄烟叶面积略小，香料烟最小【1 1 。 随着烟草工业的兴起，烟草科技也得到迅速发展。烟草是现今在植物学、生命科学、 物理化学以及生物技术方面研究最多的物种之一。 我国土地辽阔，资源丰富，烟叶生产遍及全国，根据全国烟叶种植区划，分为 七个一级区，即北部西部烟区，东北部烟区，黄淮海烟区，长江中下游烟区，长江 上中游烟区，西南部烟区，南部烟区，以及2 7 个二级烟区。我国是一个烟草大国， 烟叶和卷烟产量均居世界首位，烟草业在我国国民经济中占有重要的地位。目前， 我国烟草年种植面积约1 0 0 万公顷左右，烟叶产量为1 5 0 1 7 0 万吨。2 0 0 3 年烟叶总 产量为1 5 5 6 万吨，其中烤烟1 5 3 2 万吨，晾晒烟2 4 万吨；2 0 0 4 年种植烟叶9 5 0 万 公顷，烟叶总产量1 7 3 3 万吨，其中烤烟1 6 9 8 万吨，晾晒烟3 5 万吨i z j 。 1 9 6 0 年，所有类型的烟叶中鉴定出的化学成分的数目仅2 0 0 种多一点，烟气中 鉴定出的化学成分少于4 5 0 种。而今，烟叶中鉴定出约3 0 0 0 种化合物，烟气中约4 0 0 0 种。估计烟叶和烟气中化合物的总数目分别超过4 0 0 0 种和6 0 0 0 种。烤烟的物理性 质和化学性质受遗传、农业措施、土壤类型及营养成分、气候、病害、部位、采收 方法和调制方法的影响，这些因素中任何一种因素的变化，均可显著地改变烟叶的 化学组成i l j 。 烟草中的化学物质可分为矿物质、碳水化合物、含氮化合物、有机酸及其衍生 物、色素、低聚糖，多糖，多缩戊糖化合物。烟草中的有机酸含量十分丰富，主要 是二元酸和三元酸，如苹果酸、柠檬酸、草酸、琥珀酸、延胡索酸、乌头酸和戊二 酸等，以苹果酸和柠檬酸含量较高，达3 0 以上1 3 】。烟叶成分见表1 一l 。 表1 1 烟叶成分 成分 含量范围 蜡和蜡酯 茄尼醇和酯 有机酸 多酚 还原糖 非还原糖 0 6 6 1 2 0 o 8 0 2 o o 3 o o 7 6 7 o 7 5 5 7 0 o 8 0 2 5 o o 1 o o 5 0 0 江南大学硕士学位论文 淀粉和果胶 烟碱 氨基酸 纤维素和木质素 挥发油 蛋白质 水( 游离态和结合态) 0 o o 8 0 0 o 2 8 4 o o o 2 5 3 o o 2 5 o o 2 8 5 0 0 2 5 1 o o 1 0 0 3 0 0 1 1 0 0 2 4 0 0 1 2 绿原酸的研究进展和概况 1 2 1 绿原酸的理化性质和结构 绿原酸( c h l o r o g e n i ca c i d ) 是由咖啡酸( c a f f e i ca c i d ) 与奎尼酸( q u i n i ca c i d ) 组成的缩酚酸，异名咖啡鞣酸，化学名3 o 一咖啡酰奎尼酸( 3 一o - c a f f e o y l q u i n i ca c i d ) ， 分子式为c 1 6 h 1 8 0 9 ，分子量为3 5 4 3 0 ，分子结构式见图1 - 1 。 图1 1 绿原酸的分子结构式 绿原酸的半水化合物为白色或微黄色针状结晶，1 1 0 变为无水化合物，与稀盐 酸共热产生咖啡酸，熔点为2 0 5 2 0 9 ，比旋光度【n 】d = 3 5 2 0 ( c = 2 8 ) ，在2 5 水中溶解度约为4 ，热水中溶解度更大，且溶解度随温度而变化。绿原酸类化合物 是含有羟基和邻二酚羟基的有机物，除极易溶于乙醇外，还易溶于水、甲醇和丙酮 等溶剂，微溶于乙酸乙酯，难溶于氯仿、乙醚等弱极性溶剂【4 】。 根据咖啡酰在奎尼酸上的结合部位和数目不同，从理论上讲，单咖啡酰奎尼酸 和二咖啡酰奎尼酸所组成的绿原酸异构体共有1 0 种，分别为1 咖啡酰奎尼酸、3 一咖啡 酰奎尼酸( 绿原酸) 、4 咖啡酰奎尼酸( 隐绿原酸) 、5 - 咖啡酰奎尼酸( 新绿原酸) 、 1 3 二咖啡酰奎尼酸( 莱蓟素) 、1 , 5 二咖啡酰奎尼酸、1 , 6 二咖啡酰奎尼酸、3 ，4 二咖 啡酰奎尼酸( 异绿原酸b ) 、3 , 5 二咖啡酰奎尼酸( 异绿原酸c ) 、4 ，5 一二咖啡酰奎尼酸 ( 异绿原酸a ) 。 绿原酸是由咖啡酸与奎尼酸形成的酯，其分子结构中有酯键、不饱和双键及多 元酚三个不稳定部分【5 j 。在从植物提取过程中，通过水解和相继分子内酯基迁移而发 生异构化【6 】。绿原酸和异绿原酸分子中含有邻二酚羟基，受热、见光易氧化成绿色醌 2 第章绪论 类；在碱性和高温条件下，可发生水解1 7 , 8 j 。 1 2 2 绿原酸在植物中的分布与生物合成 绿原酸广泛存在于高等双子叶植物和蕨类植物中，主要存在于忍冬科忍冬属 ( l o n i c e r a ) 、菊科蒿属( a r t e m i s i a ) 植物中，含量较高的植物包括杜仲、金银花、 向日葵、继木、咖啡、可可树等。此外，水果( 如苹果、梨) 、蔬菜( 如土豆、马铃 薯) 、大豆、小麦、绿茶等日常食用品中都含有绿原酸类物质1 9 j 。 在烟草中发现的酚类物质包括单宁类( 绿原酸的异构体、咖啡酸和奎尼酸) 、香 豆素类( 莨菪亭和莨菪亭的糖苷衍生物) 、黄酮类( 芸香苷、黄酮、鼠李糖、黄酮醇) 、 花色素类( 花色素、芸香糖苷、花葵素、芸香苷、堪非醇) 、简单酚衍生物等，其中 绿原酸、芸香苷和莨菪亭是烟草中最主要的酚类物质【姗。烟草植株不同部位的绿原 酸含量存在着差异，主要积累于叶中，少量积累于茎和根中。大田生长的烟草绿原 酸在成熟烟株上、中、下部的分配有显著的差异，一般上部叶含量高，中部叶次之， 下部叶含量低【1 l 】。在同一片烟叶中，分布也呈现一定的规律性，m i l l o n 等( 1 9 5 8 ) 指出，绿原酸含量从尖端到基都含量逐渐降低，尖端的绿原酸几乎为基部的二倍。 在烤烟中含有3 或更高的绿原酸，它对烟草的生长发育、烟叶颜色和烟气香吃味等 方面有重要影响。 绿原酸是植物中的葡萄糖经过一系列的酶促反应生物合成的。绿原酸可能的生 物合成途径： d - t 萄糖 磷酸唏丙醇式丙酮酸 厂专奎尼酸 卜专5 脱氢奎尼酸_ | 4 磷酸一赤藓糖_ j l 争5 脱氢葬苹酸争 葬草酸- - - - l - ：蕃丙氨酸 反一肉挂酸号香豆酸号咖啡酸号绿原酸 图1 2 绿原酸可能的生物合成途径 1 2 - 3 绿原酸及其类似物的生物活性 绿原酸具有广泛的生物活性，现代科学对绿原酸生物活性的研究已深入到食品、 保健、医药和日用化工等多个领域。 1 2 3 1 清除体内自由基和抗氧化作用 绿原酸是一种有效的酚型抗氧化剂，其抗氧化能力要强于咖啡酸、对羟苯酸、 阿魏酸、丁香酸，丁基羟基茴香醚( b h a ) 和生育酚【1 2 1 。绿原酸之所以有抗氧化作 用，是因为它含有一定量的r - o h 基，能形成具有抗氧化作用的氢自由基，以消除 羟基自由基和超氧阴离子等自由基的活性，从而保护组织免受氧化作用的损害。因 此，绿原酸对体内自由基的有效清除，对于维持机体细胞正常的结构和功能，防止 和延缓肿瘤、突变和衰老等现象的发生具有重要作用。 1 2 3 2 抑制突变和抗肿瘤 ， 绿原酸具有较强的抑制突变能力，它可抑制黄曲霉素b l 引发的突变和亚消化反 3 江南大学硕士学位论文 应引发的突变，并能有效地降低y 射线引起的骨髓红细胞突变；同时，绿原酸还可 通过降低致癌物的利用率及其在肝脏中的运输来达到防癌、抗癌的效果。并能抑制 由苯并芘、4 - n q o ( 氧化硝基喹啉) 引发的癌症，绿原酸对大肠癌、肝癌和喉癌具 有显著的抑制作用，它被认为是癌症的有效化学防腐剂【1 3 1 。 1 2 3 3 对心血管作用 异绿原酸b 对大鼠具有较强促进前列腺环素( p g l 2 ) 的释放和抗血小板聚集作 用；对豚鼠肺碎片感应的抗体诱导s r s - a 释放抑制率达6 2 3 。此外，对血小板血 栓素生物合成和氢过氧化物诱导的内皮素细胞损伤有极强抑制作用i 钔。 1 2 3 4 对透明脂酸酶及葡萄糖6 磷酸酶的抑制作用 透明脂酸酶( h a a s e ) 是裂解粘多糖的酶之一，可催化透明脂酸( h a ) 的分解， 关系到血管系统的通透性和炎症反应。h a 是由糖醛酸和乙酰氨基葡萄糖组成的一种 粘多糖，具有多种功能，如治愈创伤、使皮肤润湿健康、润滑关节和防止炎症等。 因此，从天然产物中发现多种抑制h a a s e 激活的活性成分，同时又具有较强的抗变 态反应活性，有望作为先导化合物，进一步开发为新的抗变态反应药物。从狭叶紫 锥花根的乙酸乙酯提取物中发现3 ，5 二咖啡酰奎尼酸( d c q a ) 和绿原酸( i c 5 0 分别 为1 8 5 和2 2 5r e t o o l l ) 有较强的抑制h a a s e 激活的作用。 葡萄糖6 磷酸酶体系( g 1 6 p a s e ) 在体内平衡血糖调控中发挥重要作用。它承 担着由糖原异生和糖原分解产生内源性葡萄糖的形成。最近，绿原酸被确认为是大 鼠肝微粒体中葡萄糖6 磷酸位移酶( g l c 6 p 仃a n s l o c a s e ) 的一个新型特异性抑制剂。 绿原酸与大鼠肝脏中微粒体g l c 6 - p 酶体系相互作用的动力学研究显示g l e 6 - p 位移 酶为靶分子，而甚至在毫摩尔浓度绿原酸作用下也不影响催化单元和磷酸酯位移酶。 因此绿原酸是迄今发现的第一个g l c 6 - p 位移酶天然特异性抑制剂【9 】。 1 2 3 5 保肝利胆 莱蓟素具有保肝利胆的作用【1 4 1 。娄红祥等【1 5 1 从金银花水溶性部分经乙酰化后得 绿原酸四乙酰化物，经药理实验表明，对四氯化碳引起的小鼠肝损伤有明显的保护 作用，这为阐明金银花具有保肝利胆之功效提供了理论依据。 1 2 3 6 抗菌、抗病毒等 文献报道【1 6 ，1 7 】，绿原酸和异绿原酸对多种致病菌和病毒有较强的抑制和杀灭作 用。对急性咽喉炎症及皮肤病有明显疗效，临床上用于治疗急性细菌性感染疾病。 绿原酸的水解产物咖啡酸也具有升白、止血、利胆及抑制单纯疱疹病毒之功效。德 国f r e e 大学e i c h 教授【i 研在研究有些植物次生代谢物作为抗逆转录病毒剂时，认为绿 原酸是有希望的抗爱滋病毒( m v ) 先导化合物。 1 2 4 绿原酸的提取方法 1 2 4 1 水提法 利用绿原酸易溶于水的特性，采用水作溶剂提取，可分为单纯的水提【1 9 1 、水提 4 第一章绪论 醇沉【2 0 】和水提石灰乳沉淀【2 l i 。单纯的水提法不能有效地将绿原酸提尽；水提然后用 高浓度醇沉淀蛋白质、多糖等杂质，工艺简单、经济，但是水提液中杂质较多，醇 沉过程中伴随吸附夹带，使部分绿原酸消失：水提石灰乳沉淀法是利用绿原酸与钙 盐生成沉淀，在水提液中加入石灰乳，使绿原酸沉淀下来，然后用硫酸分解沉淀， 操作简单、经济，其缺点是石灰乳为氢氧化钙的溶液和混悬物，属强碱性，故可引 起绿原酸水解，从而降低绿原酸含量，而且石灰乳沉淀不完全，硫酸钙对绿原酸有 吸附作用，从而降低绿原酸产率。 1 2 4 2 有机溶剂提取法 溶剂提取法是根据中草药中各种成分在溶剂中的溶解性质，选用对活性成分溶 解度大，对不需要溶出成分溶解度小的溶剂，而将有效成分从药材组织内溶解出来 的方法。中草药成分在溶剂中的溶解度直接与溶剂性质有关。溶剂可分为水、亲水 性有机溶剂及亲脂性有机溶剂。总的来说，只要中草药成分的亲水性和亲脂性与溶 剂的此项性质相当，就会在其中有较大的溶解度，即所谓“相似相溶”的规律【l ”。 因此，可以利用绿原酸易溶于甲醇、乙醇、丙酮等极性有机溶剂的特性提取绿原酸。 张伟农等圈对从葵花籽仁中提取绿原酸的工艺进行了研究，通过正交实验获得了最 佳工艺参数，实验结果表明采用两次醇提工艺，每次浸提4 0m i n ，p r i 为4 5 ，温度 7 0 ，乙醇浓度为7 0 时，绿原酸的提取率较高；高锦明等 2 3 1 用混合溶剂提取杜仲 叶中绿原酸等生物活性成分，绿原酸得率达到3 6 9 ，纯度达5 8 7 。 1 2 4 3 物理场强化提取法 物理场强化提取法就是在传统的溶剂萃取中加入某种物理场，如微波或超声波 等。 超声波辅助技术是利用超声波能击碎细胞壁，使细胞内组分渗透到溶液中，从 而达到分离的目的。该方法综合成本低，污染较小，工艺简易，适合于工业化生产。 无水提法难以过滤的制约因素，无醇提法因溶剂使用而带来的成本高、溶剂回收难 之弊，而且绿原酸的得率和纯度都有所提高，但目前仅限于实验室规模。 微波辅助技术是利用微波能来提高提取效率，被提取的物质有效成分在微波电 磁场中快速转向及定向排列，从而产生撕裂和相互摩擦引起发热，可以保证能量的 快速传递和充分利用，易于溶出和释放。应用于生物活性物质的提取具有短时、高 效、节能等特点。微波结合水浴提取，不仅生物活性物质浸出率高，优于乙醇水提 取，而且降低了成本，减少了污染。微波预处理法与传统法比，选择性高，操作时 间短、溶剂耗量少，有效成分收率高、粗产品中杂质少；但是由于绿原酸提取使用 的是极性溶剂，直接把提取器置于微波场中提取，大量溶剂吸收微波使微波能的利 用率大为下降，故应注意利用微波对物料进行预处理的操作方法。 李雪梅【2 4 】的实验结果表明，以丙酮和水( 1 ：2 ) 作为浸提剂，在料液比l ：9 ，温度 4 0 c ，4 8h 的条件下，烟草浸出液中多酚类物质的浓度为4 1 3r a g m e 。而用超声波 江南大学硕士学位论文 处理时，浸提时间缩短至5r a i n ，浸提液中多酚的浓度为4 3 1m g m l ；在用微波处理 时所需时间更短( 9 0s ) ，浸提液中的多酚类浓度为4 9 9m g m l 。利用微波或超声波 辅助处理，可以大幅度缩短浸提时间，提高浸提效率。尹波【2 5 】采用超声波法提取金 银花中的绿原酸，并与水提法进行比较，发现超声波法的提取率大大高于水提法， 所需时间比直接用水提法所需时间缩短一半，提取条件温和，操作简单，平均收率 为1 9 0 7 。 1 2 4 4 超临界c 0 2 法 周贵新等【2 6 】用超临界c 0 2 从杜仲叶中提取有效成分，特别是用超临界c 0 2 从杜 仲叶中提取绿原酸、京尼平苷酸、丁香素二糖苷。他是将杜仲的叶片粉碎后放入萃 取釜中，在萃取温度为摄氏3 0 7 0 、萃取压力为1 0 6 0m p a 的条件下，经过5 7h 的循环萃取，获得有效成分。与现有技术相比，该方法具有操作范围广，便于调 节的特点，可以通过控制压力和温度，有针对性的将杜仲叶中的有效成分充分萃取 出来。超临界c 0 2 萃取将萃取和蒸馏合为一体，不需要回收溶剂，可以大大提高生 产效率、节约能耗，制取的产品纯度高( 达9 0 以上) 。但是，超临界c 0 2 提取法 目前的生产成本较高，故仍未大规模应用于工业生产。 1 2 4 5 酶法 采用纤维素和果胶酶分别或联合处理药材，然后再提取。用纤维素酶处理后， 结构致密的细胞壁中纤维素水解成水溶性糖类物质，而细胞壁水解有利于胞内绿原 酸的溶出。宋宏新等1 2 7 对杜仲叶药效成分酶法提取工艺进行了研究，最佳提取工艺 为杜仲叶1 2g ，加入2 0 0 0 u m l 纤维素酶1 0 m l 和1 2 0 0 u m l 果胶酶1 0 m l ，酶解 温度为5 0 ，酶解时间为6 0r a i n 。加酶与不加酶相比，绿原酸提取量提高了1 9 8 。 酶法提取，绿原酸得率高，反应条件温和；但采用酶法处理，大大增加了生产成本， 其经济可行性有待于进一步研究。 1 2 5 绿原酸的分离纯化方法 1 2 5 1 沉淀法 利用某些植物化学成分与某些试剂产生沉淀的性质而得到分离或除去“杂质” 的方法。某些金属离子能与绿原酸等活性成分生成沉淀，其沉淀再用酸或盐洗涤， 达到分离的一种经典方法。该法主要和水提工艺结合采用。 ( 1 ) 石硫醇法：用质量分数为2 0 的石灰乳将浓缩液的p h 值调至1 2 ，过滤沉淀 物，加2 倍量乙醇混悬，再用体积分数为5 0 的h 2 s 0 4 将p h 值调为3 4 ，充分搅 拌、过滤，滤液用质量分数为4 0 的n a o h 中和至中性，过滤、浓缩干燥得绿原酸 粗品 2 s l 。粗品中绿原酸含量一般在2 0 3 0 之间，收率较低，约为1 2 。 由于绿原酸结构中存在酯键，在碱性条件下易水解，所以绿原酸的收率低。 ( 2 ) 铅沉法：用乙醇提取，将提取液真空浓缩制备浸膏，再加水转溶，然后加铅 盐沉淀，过滤沉淀物，加2 0 的硫酸溶解沉淀，析出绿原酸，用乙酸乙酯萃取，浓 6 第一章绪论 缩析出粗品，最后重结晶得纯品1 2 9 】。因为铅沉法对绿原酸有一定的选择性，所以此 方法可以得到较纯的绿原酸，但是由于使用了有毒的重金属铅，所以可能对绿原酸 产品造成一定的污染。 1 2 5 2 有机溶剂萃取法 利用溶剂对绿原酸和环烯醚萜等物质不同的溶解度，多次萃取达到富集绿原酸 的目的。该分离方法通常与其他方法配合应用，才能达到完全分离。杨海燕 3 0 l 利用 乙酸乙酯纯化绿原酸，经过四级萃取的绿原酸回收率将近9 0 ，得到的产品经u v 和h p l c 检测，绿原酸含量分别为6 9 1 和3 5 2 。胡锦蓉【3 l 】利用天然沉降剂、超 滤膜、乙酸乙酯、d 1 4 0 树脂处理从杜仲叶中提取的绿原酸粗品，最后得到绿原酸纯 度为9 2 9 9 的绿原酸产品。该方法操作简单、方便、成本低，适合于产业化，但是 溶剂萃取的选择性差，对原料液的质量要求高，得率低。 1 2 5 3 大孔吸附树脂法 大孔吸附树脂是2 0 世纪6 0 年代末发展起来的一类新型高分子分离材料，具有 良好的吸附性能。进入上世纪9 0 年代后，大孔吸附树脂广泛应用于天然产物的分离 和纯化，尤其是对水溶性化合物的分离有独特效果圈。李进飞1 3 3 】采用n k a - 9 树脂从 杜仲叶中分离富集绿原酸，得到粗产品纯度为2 5 1 2 ，收率为7 8 5 。该法具有吸 附容量大，选择性好，易于解吸，机械强度高，再生处理简单，吸附速度快，操作 简单，得率恒定，产品质量稳定，生产成本低等特点，且吸附法仅用少量溶酶洗脱 树脂就能达到浓缩目的。目前应用于纯化绿原酸的吸附树脂主要有n k a 9 型树脂、 d 1 0 1 型树脂、d 1 4 0 型树脂以及x d a - 5 型树脂等。 1 2 5 4 膜分离法 膜分离技术是指借助于外界能量或化学位差的推动，通过特定膜的渗透作用， 实现对两组分或多组分混合的气体或液体进行分离、分级、提纯和富集的技术。目 前用于绿原酸纯化的主要是微滤和超滤技术。 超滤法是以选择性透过膜为分离介质，在外界压力作用下，使小分子如绿原酸 等透过膜，而大分子如蛋白质、多糖等则不能透过膜，从而达到分离、提纯的目的。 刘振丽等p 4 】比较了超滤法和醇沉法从金银花中提取绿原酸的效果，用超滤法，绿原 酸的回收率可达到9 9 ，而用7 0 醇沉法，绿原酸的回收率仅为6 7 8 2 。该方法 优点是能保留有效成分，操作方便，能耗低，分离效率高，无二次污染，可在常温 下进行操作；缺点是对提取液预处理要求高、产量易受膜条件的制约、而且膜被污 染后清洗比较麻烦。 1 2 5 5 聚酰胺层析法 聚酰胺( p o l y a m i d e ) 是通过酰胺基聚合而成的一类高分子化合物，分子中含有 丰富的酰胺基，可与酚类、酸类、醌类、硝基化合物等形式氢键结合而被吸附，与 不能形成氢键的化合物分离1 3 5 】。利用聚酰胺柱的这个特性，可以将绿原酸和黄酮较 7 江南大学硕士学位论文 好地分离和提取。吸附剂聚酰胺可反复使用，反复层析可以得到较纯的产品，但操 作起来比较麻烦，且产量低、洗脱时间长，主要用于分析研究中。刘世名1 3 6 】将牛蒡 叶经8 0 甲醇抽提，减压浓缩后，用氯仿去色素，得粗提物经p o l y a m i d es c6 柱层 析，依次用水、3 0 甲醇、6 0 甲醇以及甲醇洗脱，甲醇洗脱组分进行r p - h p l c 和 l c e s i m s 分析为纯品绿原酸。 1 2 5 6 凝胶层析法 凝胶色谱法是利用凝胶微孔分离分子大小不同的物质的一种技术。k o p s c h 等印】 利用凝胶色谱法，将咖啡中的绿原酸的异构体3 、舢、5 绿原酸分离开来，其纯度达 到9 4 。徐涛【3 8 1 采用亲脂性吸附树脂与葡聚糖凝胶色谱纯化技术，将金银花水提物 经亲脂性吸附树脂柱色谱预分离后，0 1m o l l 盐酸调节p h 到4 0 左右，葡聚糖凝胶 s e p h a d e xl h 2 0 精制纯化，洗脱溶剂为5 0 丙酮水溶液，产品经m s 、红外、紫外和 h p l c 图谱鉴定，并与对照品比较对照，结果显示所得的绿原酸纯度大于9 8 。该 方法设备简单，操作方便，结果准确，纯度商；但生产成本很高，产量低，凝胶价 格昂贵，产业化生产投资大。 1 2 5 7 制备色谱法 现代制备色谱法具有柱效高，分离速度快等特点，是制备纯化天然产物和化学 合成产物的极好手段。该方法在医药工业、生化技术和精细化学品的生产方面已成 为越来越重要的制备分离手段。 彭密军【3 9 l 利用制备型高效液相色谱( h p l c ) 法从杜仲叶中分离纯化得到绿原酸， 纯度达到9 8 6 l 。该方法分离效果高，产品纯度高，速度快，自动化程度高；但仪 器价格昂贵，产量低，技术要求高，目前只能用于实验室制备以及有效成分测定和 结构类似组分的分离上。 高速逆流色谱( h s c c c ) 是一种基于液液多级逆流萃取建立的色谱体系，没有 固相载体，避免了待分离样品与固相载体表面产生化学反应而变化和不可逆吸附1 4 0 j 。 高速逆流色谱可以直接纯化粗制样品，尤其适于分离极性较大的组分【4 i j 。h a l 一1 抽 l u 4 2 1 采用制备型高速逆流色谱从金银花提取物中分离纯化绿原酸，得率为5 6 3 ， 回收率达到9 0 ，纯度达到9 4 8 。h s c c c 的仪器及试剂成本明显低于h p l c ，适 用于制备高纯度、高附加值的化合物。 1 2 6 绿原酸的应用 1 2 6 1 食品工业 绿原酸具有利胆、抗菌、抗病毒、止血、增加自血球。缩短血凝和出血时间及 兴奋中枢神经系统生理功能，可用绿原酸制作保健食品或饮料。绿原酸具有增香和 护色作用，可用于食品和果品保鲜。绿原酸用于果汁保鲜，可有效防止饮料和食品 的腐败变质；w i l s k a 等【4 3 1 研究还发现，绿原酸大大提高草莓等果汁稳定性。 天然食品抗氧化剂越来越受到消费者欢迎，绿原酸是一种新型高效的酚型天然 8 第一章绪论 抗氧化剂。在某些食品中可取代或部分取代目前常用的人工合成抗氧化剂。如 h i r a z a w a 等将绿原酸用于鱼片的保鲜后，发现其效果要优于茶叶提取物和n 一生育酚； 绿原酸用于果汁保鲜后，可有效防止饮料的腐败变质；在猪油中，若添加少量绿原 酸，可提高猪油氧化稳定性，增长贮存期。将少量绿原酸加到天然色素溶液中，对 色素颜色有稳定作用，因此，绿原酸又是一种良好的食品添加剂。目前，日本将葵 花籽粕中提取的绿原酸成功开发成水溶性天然抗氧化剂。 1 2 6 2 医药工业