（食品科学与工程专业论文）白桃中沙门氏菌、霉菌检测方法研究.pdf

摘要 沙fj 氏菌可以通过污水、肥料等多种方式污染水果，进而对人体健康造成危害。本文针对其 属特异性基因n v a 所设计的引物进行p c r 检测，通过对d n a 提取方法、引物浓度、退火温度 及循环数等方面进行优化实验确定最佳反应体系及反应程序，未经增菌检测限可达到1 0 3c f u m l 。 结果还表明，经过1 0h 增菌及调节p h7 0 等样品处理后，向桃中存在的背景微生物、死菌以及 样品基质等均对p c r 法检测沙门氏菌没有太大影响。 霉菌及酵母菌常常引起水果的腐烂变质，同时对人体健康造成危害。本文对3 m 纸片法和国 标法检测霉菌和酵母菌进行比较，结果表明，无论是真菌标准菌株菌悬液或白桃样品的两种方法 计数结果均无显著差异，且线性相关关系显著，即两种方法在白桃中霉菌和酵母菌计数结果上有 较好的一致性。同时建议使用3 m 纸片法或国标法时，选择菌落数在2 5 1 0 0 之间的纸片或平皿进 行自桃中真菌计数，并且建议水果卫生指标对新鲜自桃限定霉菌和酵母菌计数小于1 0 4c f u g 。从 白桃中分离鉴定出1 6 株共6 个属的霉菌，均属于半知菌类，其中有丛梗孢目的交链孢霉属、葡 萄状穗霉属、丛梗孢属、青霉属和穗霉属，以及少数不产孢的无孢菌群的丝核菌属。为进一步研 究病原菌的致病力、侵染途径和侵染规律等奠定了基础。 关键词：自桃，沙门氏菌，霉菌，酵母菌 a b s t r a c t c o n t a m i n a t i o nf r o ms u r f a c er u n - o f fw a t e r , c o m p o s t i n gf a r mm a n u r ea n dt h el i k ec o u l db es o u r c e so f s a l m o n e l l as p p t h a tc o n t a m i n a t ef r u i t s ap a i ro fp r i m e r sd e s i g n e da c c o r d i n gt o n v ag e n et oc o n d u c t p c rd e t e c t i o ns h o w e dg o o ds e l e c t i v i t y t h eo p t i m u mp c rc o n d i t i o n sw e r eo p t i m i z e dt h r o u g hd n a e x t r a c t i o n ，p r i m e rc o n c a n i r a t i o n ，a n n e a l i n gt e m p e r a t u r ea n dn u m b e ro fc y c l e s a n dt h ed e t e c t i o nl i m i t w a s1 0 3c f u m lb e f o r ei n c u b a t i o n a f t e ri n c u b a t i o nf o r1 0ha n da d j u s t i n gp h7 0o fp e a c hs a m p l e ， b a c k g r o u n dm i c r o o r g a n i s m s ，d e a d c e l l sa n df o o dm a t r i xd i dn o th a v eb i gi n f l u e n c eo np c rd e t e c t i o no f l m o n e l l as p p i nw h i t hp e a c h m o l d sa n dy e a s t sw e r et h em a i nr e a s o no fs p o i l a g eo ff r e s hf r u i t sa n dw e r eh a r mt oh u m a nh e a l t h t h e d e t e c t i o nr e s u l to fm o l d sa n dy e a s t sb o t hi nf u n g ic u l t u r ea n dp e a c hb yg bm e t h o da n d3 mp e t r i f i l m m e t h o dw e r ec o m p a r e di nt h i sp a p e r t h er e s u l ts h o w e dt h a t ：t h e r ew a sn os i g n i f i c a n td i f f e r e n c e ( p 0 0 5 ) b e t w e e nt h et w om e t h o d sa n d9 0 0 dc o r r e l a t i o nc o e f f i c i e n t sw e r eo b s e r v e db e t w e e nt h e m t h e r e f o r e ，t h et w om e t h o d sw e r ee s s e n t i a l l ye q u i v a l e n t c o l o n i e sb e t w e e n2 5 a n d 1 0 0 w e r e r e c o m m e n d e dt oc o u n tm o l d sa n dy e a s t si np e a c ha n dt h en u m b e ro fl e s st h a n1 0 c f u gw a s r e c o m m e n d e dt ol i m i tm o l d sa n dy e a s t sc o u n t si nf r e s hp e a c h s i xg e n e t i cf r o m1 6i s o l a t e so fm o l d s w e r ei s o l a t e da n di d e n t i f i e d ，i n c l u d i n ga l t e r n a r i as p p ，m e m n o n i e l l as p p ，m o n i l i as p p ，p e n i c i l l i u m s p p ，s p i c a r i as p p a n dr h i z o c t o n i as p p ，w h i c hs u g g e s t e dat h e o r e t i c a lb a s i sf u rf u r t h e rs t u d yo nt h e p a t h o g e n i cc a p a b i l i t y , i n f e c t i o np r o c e s sa n di n f e c t i o nr u l e s k e yw o r d s ：w h i t ep e a c h ，s a l m o n e l l as p ，m o l d ，y e a s t i i a o a c b p w c f u c i ：蛆 d n a d n t p e b l 珂v g e n e m r l n a 2 1 既) t a p b s p c a p c r p n a r b c r m i n s d s t a 1 a e t h n i s t s b 缩略词 a b b r e v i a t i o n a n a l y s i so fo f f i c a la n a l y t i c a lc h e m i s t r y b u f f e r e dp e p t o n ew a t e r c o l o n y - f o r m i n gu n i t c e t y l t r i m e t h y la m m o m u mb r o m i d e d e o x y r i b o n u c l e i ca c i d d e o x y a d e n o s i n et r i p h o s p h a t e e l l l i d i u mb t o m i d e i n v a s i o np r o t e i ng e r i e m a x i r a u mr e s i d u el i m i t e t h y l e n e d i a m i n e t e t r a a c e t i c a c i dd i s o d i u ms a l t p h o s p h a t e b u f f e rs o l u t i o n p l a t ec o u n ta g a r p o l y m e r a s ec h a i nr e a c t i o n p o t a t od e x t r o s e a g a r r o s eb e n g a lc u l t u r e r o u n dp e rm i n u t e s o d i u md o d e c y ls u l f a t e a n n e a l i n gt e m p e r a t u r e t r i s a c e t i ca c i d - e d t a m e l t i n gt e m p e r a t u r e h y d r o x y - m e t h y l - a m i n om e f h a n e t r y p t i c a s e ( a a - y m i c ) s o yb r o t h i l l 国际官方分析化学家协会 缓冲蛋白胨水 菌落形成单位 溴代十六烷基三甲胺 脱氧核糖核酸 脱氧核菅三磷酸 溪化乙锭 侵袭蛋白基因 最大残留限量 乙二铵四乙酸二钠 磷酸缓冲溶液 平板计数琼脂 聚合酶链式反应 马铃薯葡萄耱琼脂 孟加拉红培养摹 转，分钟 十二烷基磺酸钠 退火温度 t a e 电泳缓冲液 融解温度 三羟甲基氨基甲烷 胰蛋白胨大豆肉汤 独刽性声明 本人声明所呈交的论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成 果。尽我所知，除了文中特别加以标渡和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发 表或撰写逡靛磷究藏暴，氇不毽含冬获褥中鏊农垫大学或其它教囊援秘豹学缎绒涯书 而使用过的材料。与我一间工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明 确的说明并表示了谢意。 研究生签名：张瘸k时间：二6 年6 月，9 嗣 关于论文使用授权的说明 本人究全了解中国农业大学有关保留、使用学位论文的规定，即：学校肖权保留 送交论文的复印件和磁盘，允许论文被奁阅和借阅，可以采用影印、缩印或扫描等复 到手毅保存、汇编学位论文。司意串疆农监大学可以鼹不霹方式在不嗣媒体上发表、 传播学位论文的全部或部分内容。 ( 保密的学位论文禚解密后应遵守此协议) 研究生签名：器龟菇k时间：2 c 炒占年石月，7 日 导师签名： 嘞易 f 时间：耐年多月夕网 1 1 弓l 言 第一章绪论 民以食为天，食品是人类赖以艇存和繁衍的物质基础，也是章土会进步和文化发展的物质基础。 拳莱谨食鑫中占鸯撮重要选燕，钛入嚣掰罴要蘩棼来看，象蔬羹蠢猿骛戆营莽徐毽，是其它食黼 无法代替的。近黧年来，在全世界范围内，随着人们对水果消赞水平的提高，黼时爆发了一系鳓 与水果消费有关的中毒事件，其中最主要的是生物性危害和化学性危害。为了掇高食品的食用安 全性，保证产品的璇量，保护人体健康；以发鼹出口食品对外贸翁、适应加入檄贸组织的要求、 努被技术性壁垒为强导，谨逶霉簿续发蓑农鼗窥农孝重经济舞嚣豹，一方蠹，蘩热强农产基震繁蜜 全认证体系建设，建立“从农田到餐桌”的整个食物链全程的食品安全卫生控制体系。另一方筒， 还鞭加强检验检测的体系建设和技术手段研发，提高检验检疫能力，提升农产晶出口竞争力。 1 2 白撬等承果的质量蜜全 1 2 1 白桃等水粜的生产销憾概况 我蓬是隶果资源夫嚣，毽是承莱生产，溃费大粼，巢韭在整个国涎经济发震孛占莓稳当耗熏。 琏几年来，我霹水粜生产已进入耐积稳定、产鬃小幅增长、内部结构调整优他的新阶段。根据燕 国农业部| 、j 的统计数字，1 9 9 2 年黛2 0 0 1 年，我圈生产的水果和蔬菜出口金额由2 0 亿美元增长划 3 7 亿美元。美国、嗣本、俄罗期、印度尼西亚是我嗣水果出口的主要贸易伙伴。2 0 0 4 年1 1 2 月， 我鬻爨强弱主述鹾强瓣痰粟数量分斓占霜期求暴壅秘慧量魏1 4 8 、i l ，l ，9 3 穰6 强。2 0 0 4 年以来我国水果对煲国和印度尼谢强的出口增长嫒为显著矗”。 我国是桃原产地和世界生产大国，其中北京平谷地区是全围大桃第一产区。大桃面积1 6 8 万痰，产量1 5 识公斤。品神1 3 0 多个，分为自桃、浊桃、黄桃、矮桃四大系列。扶6 月底受l o 嚣孛镪穆霉上枣，土帮辩阉之长臻全罾之酋。2 0 0 0 年在平谷遗又被国家袜韭弱废式命名惫“率潮 名特优经济林桃之乡”等称号。平谷大桃久誉海内外，全国二十几个省市的大桃经销商云集平谷 大桃市场，年交易嫩达1 2 亿公斤。市场与南方航空公司、国际航空公司联手建起“大桃空中建 癜”，与北京两客站建立起“大挑铁路遥道”。平豁丈挑不仅销继潮肉二十多个勰毒及港、澳、螽 琏嚣，丽置毒蠹往毅蕊装、马来西驻、泰国、戳罗簸和秀欧等国骞。农监部提供的数字表明，平谷 大桃育几项指标堪称全国之最：种植面积最大；鼯种最多：上时间最长；速成桃单产最高；出口 量鼹多；出口合格率最高；大桃口味最佳。此外，以平谷大桃为原料生产的浓缩桃汁、桃原浆、 穗头、糖精、桃脆片以爰拶果酱等系列产器也名扬海内外【4 j 。 然丽，蠹予我灌承聚韵痰薰鬻镪装等各耱客蕊及主蕊意识土的艨蠢，导致溅产农粟在国际露 场i 二的竞争力同发达国家相比尚商很大的差距。我国水果出口水平十分低下，年出口量仅占总产 量的1 0 左右，而鼠售价只有国际平均售价韵一半左右，这与我圈作为世界水聚箔一王国的身份 极不籀髂。我嚣长期重栽轻营，避戡驰是_ 广秘薄收，重数量，轻矮最豹生产模式，麸嚣导致我黧 中国农业大学硕士学位论文第一章绪论 水果业中优质果仅占总产量的3 0 左右，参与国际竞争的优质果也不过5 。如此这般，再经过 筛选，能够符合出口标准的水果当属风毛麟角了。随着我国加入w t o 后快速发展的步伐，市场 竞争同样将波及水果行业，其中显而易见的例子：美国的苹果与我国的苹果将会发生激烈的竞争。 根据有关数字显示，美国和加拿大的苹果销量在台湾占8 5 ；香港是美国苹果出口的第四大对象， 占香港进1 3 苹果总量的7 0 ，可见外国水果出v i 的强大攻势和我国水果所面临的挑战【5 j 。 1 2 2 白桃等水果的质量安全 农产品质量安全是人类生存的重要基础，是农业结构调整的重要手段，也是提高农产品市场 竞争力、农业增效、农民增收的迫切需要。农产品质量安全水平是反映人民生活质量高低及国家 文明程度的重要标志，是保护国内农业产业发展的重要保障【6 l 。 农业资源是人类赖以生存的最古老的资源之一p i 。长期以来，我国农业生产的主要任务是满 足数量要求，解决温饱问题。随着社会的发展，人们对食品的要求e l 益转向多样化、安全化和优 质化。与此同时，由于人口的增长与资源、能源的相对短缺，导致环境恶化和生态平衡受到破坏， 食品安全问题随之凸现，在农产品生产过程中，许多农作物被大量使用农药，在消灭病虫害的同 时，农药被残留在水果、蔬菜里，从而污染农产品：过量使用化肥、催长素、催熟剂等，也通过 食物的摄入，影响到人体健康。农产品的农药残留、静禽产晶兽药残留等已成为食品安全的重大 隐患，影响我国人民的身心健康，影响我国食品的出口和在国际上的竞争力 s l 。 不仅如此，在水果的种植、采收、采收后以及果吲管理中，对微生物污染源认识较少，不加 重视，滥用处理不当的动物粪便作为肥料，灌溉用水污染严重，人员卫生情况较差等等，这一系 列的问题不仅影响了水果质量的提高，并且我国外贸出口也因为食品安全问题而面临严峻的外部 环境。水果微生物一部分来自花期侵染进入水果内部组织及整个生育期从自然孔口和伤口入侵； 另一部分为外源腐生微生物及致病微生物通过污水、粪便、肥料、手、动物和盛放容器等侵入【o l 。 新鲜水果在果园主要受土壤污染，水果可被十壤中肉毒梭菌、产气荚膜梭菌污染。若士壤用粪施 肥还可能有沙门氏菌等致病微生物。其次用未经处理的污水灌溉农田也可造成水果的微生物污 染。在收获、搬运、出售过程中，操作人员的手作为微生物来源变得重要。尤其在货架零售时， 可能有许多人的手接触同一只水果，其中不乏细菌或病毒携带者。 尽管调查和报道指出，爆发的与消费水果有关的中毒事件在整个食物中毒案例中所占比例较 小，但是近年来却一直呈上升趋势。造成这些数据增加的原冈众多，调查和报道的深入、食品生 产的扩人和集中、食物链的增长和食品流通的更广泛等。1 9 9 1 年，美国爆发了由于消费未巴氏杀 菌的苹果酒引起的大肠杆菌0 1 5 7 ：h 7 中毒事件，造成2 3 人中毒，原因是苹果酒厂使用了曾经熟 落到地面上的有可能被动物粪便污染的苹果。1 9 9 6 年，美国又爆发了类似事件，共造成1 4 人中 毒。从1 9 5 4 年到1 9 9 9 年，美国也多次爆发了由沙门氏菌属引起的水果食源性疾病，分别涉及到 少则几十人，多则儿百人感染，甚至个别死亡，原因有食用切开的西瓜、未巴氏杀菌的苹果酒、 墨西哥进口香瓜、西红柿、水果沙拉、苹果以及未巴氏杀菌的桔子汁等。还有一些由水果携带的 志贺氏菌属、环孢子虫、a 型肝炎病毒等引起的食物中毒事件【9 t ”】。科学家调查发现，从1 9 8 7 年到1 9 9 8 年美国所爆发的与水果有关的食源性事件稳步上升，占总数的2 2 左右，其中大多由 本国产水果引起，男有一部分由进e l 水果引起；并且在这些病原菌中，大肠杆菌0 1 5 7 ：h 7 和沙门 2 中国农业大学硕士学位论文 第一章绪论 氏菌属占有绝对优势。我国的食源性疾病病例也不断上升，恶性事件时有发生。 食品安全不仅关系到消费者的身体健康和生命安全，而且还直接或间接影响到食品、农产品 行业的健康发展。因此，食品安全是对食品链中所有从事食品生产、加工、储运等组织的首要要 求。1 9 9 8 年1 0 月2 6 日，美国食品与药物管理局( f d a ) 和美国农业部( u s d a ) 联合发布了关 于降低新鲜水果与蔬菜微生物危害的企业指南。在该指南中，首次提出良好农业操作规范( g o o d a g r i c u l t u r a lp r a c t i c e s ，g a p ) 概念。g a p 主要针对未加工或最简单加工( 生的) 出售给消费者或 加工企业的大多数果蔬的种植、采收、清洗、摆放、包装和运输过程中常见的微生物危害控制， 其关注的是新鲜果蔬的生产和包装但不限丁农场，包含从农田到餐桌的整个食品链的所有步骤 1 3 1 。 g a p 的建立是基于某些基本原理和实践的基础上，贯穿于减少新鲜果蔬从田地到销售全过程 的生物危害。它包括八个基本原理，原理1 ：对新鲜农产品的微生物污染，其预防措施优于污染 发生后采取的纠偏措施( 即防范优于纠偏) ；原理2 ：为降低新鲜农产品的微生物危害，种植者、 包装者或运输者应在他们各自控制范围内采用良好农业操作规范；原理3 ：新鲜农产品在沿着农 场到餐桌食品链中的任何一点，都有可能受到生物污染，主要的生物污染源是人类活动或动物粪 便；原理4 ：无论任何时候与农产品接触的水，其来源和质量规定了潜在的污染，应减少来自水 的微生物污染；原理5 ：生产中使用的农家肥应认真处理以降低对新鲜农产品的潜在污染；原理 6 ：在生产、采收、包装和运输中，_ 人的个人卫生和操作卫生在降低微生物潜在污染方面起着 极为重要的作用；原理7 ：良好农业操作规范的建立应遵守所有法律法规，或相应的操作标准； 原理8 ：各层农业( 农场、包装设备、配送中心和运输操作) 的责任，对于一个成功的食品安全 计划是很重要的，必须配备有资格的人员和有效的监控，以确保计划的所有要素运转正常，并有 助于通过销售渠道溯源到前面的生产者。 良好农业规范从果蔬种植、采收、清洗、摆放、包装和运输等各环节对微生物危害进行控制， 其主要关注的有土壤、水、人员卫生、工具及设备表面卫生以及果园的管理。关于土壤指的主要 是种植者虑当对动物粪肥、生物污泥进行有效处理来降低它们有可能对果蔬果实造成的微生物危 害。大肠杆菌0 1 5 7 ：i 7 ，沙门氏菌和弧形杆菌等能够在土壤和粪肥中，在适宜的温度和土壤条件 下存活3 个月甚至更长，而单核细胞增生李斯特氏菌能够存活至少3 个月以上，小肠结肠炎耶尔 森菌能够存活长达一年。所以，一旦在灌溉或施肥过程中不小心将携带有病原菌的泥七喷溅到果 实表面，那么就会对水果安全造成极大威胁。与新鲜水果，尤其是可食部分相接触的水的质量关 系到病原菌污染的潜在性。水是许多微生物的载体，包括大肠杆菌、沙门氏菌、霍乱弧菌、志贺 氏菌属、小隐孢子虫、蓝氏贾第鞭毛虫、环孢子虫、诺沃克因子和a 型肝炎病毒等多种致病菌， 被极少量上述致病菌污染即可引起食源性疾病。可能与果实相接触的水包括灌溉用水，用于稀释 农药的水，用于水果运输和保存过程的制冰用水，清洗果实、采摘工具用水，洗手用水等。对果 园的t 作人员，应该进行良好的卫生培训，使其能够科学卫生地进行水果采收等一系列工作，同 时对于被病原微生物感染的进行果实采摘、包装、处理等丁作的人员，如果发现有恶心、呕吐、 痢疾等症状。应及时远离果实，不然就有可能将自身携带的有害微生物感染给果实l l “。容器、= 具设备等工作袭面卫生也是不容忽视的【l ”。另外，对于果园历史、周边环境的了解也是减少微生 物危害中应该注意的方面。 中国人民拭和国科学技术部在可持续发展科技纲要( 2 0 0 1 2 0 1 0 年) 1 2 个重点领域中，其 3 中国农业大学硕士学位论文 第一章绪论 中第三个领塌卜一食品安全。开展食品j | 螽测和评估研究，研究制定适应w t o 规则的对策：开展 农药和兽药残留检测方法和技术、生物毒紊和中毒控制常见毒物快速测定技术等急需的快速筛检 方法研究；研究建立我国主要化学污染物和致病微生物的食品安全标准体系和进出i ：1 食品安全检 测与管理预警系统；研究建立适合我国国情的h a c c p 实施指南：开展综合示范研究，以初步建 立我国食品安全技术保障体系【l “。可见，转变食品生产模式和经营策略，实施可持续农业产业化 战略，实现安全食品生产，走新型工业化道路、资源节约裂、环境友好型道路已刻不容缓9 】。 1 3p c r 法检测沙门氏菌 1 3 1 沙门氏菌与食物中毒 沙门氏菌属是一群形态和培养特性都类似的肠杆菌科中的一个大属，也是肠杆菌科中最重要 的病原菌属。沙门氏菌菌型繁多，分布广泛，是重要的人畜共患病的病原体。可以通过各种途径 传染给人，大多通过吃进被沙门氏菌污染的食品而感染人，引起人的食源性疾病。由沙门氏菌引 起的食物中毒病例在食物中毒中居于首位或第二位【1 ”“。由丁沙门氏菌型、菌株不同，能够导致 人发病的菌量也有所不同，一般使人发病的菌量平均为1 旷1 0 7 ，然而，新的研究结果表明一个单 独的沙门氏菌细胞即可达到人类的感染剂量唧。 一般来说，大多数水果的p h 值小于4 0 ，并且其中含有的多种有机酸可以防止食i ! | 性病原蔼 的增殖。然而，这些病原菌能够在水果中存在足够长的时间来引发食源性疾病。据报道，沙门氏 菌能够在温度2 2 ，p h3 9 9 4 3 7 的鲜切番茄内进行增殖，在果蒂、成熟裂纹等处存活相当一段 时间p j 。西瓜、哈密瓜、曼密苹果等许多水果食源性疾病的爆发与沙门氏菌有关，沙门氏菌对水 果的污染不仅与果实采收前的不规范的果园管理方式( 灌溉用水污染等) 和采收方式有关，使果 皮上污染的沙f 氏菌进一步污染果实内可食部分，而且还与采收后果实的处理加工方式有关，例 如不洁净的清洗用水、交叉污染等1 1 8 ”】。 1 3 2 沙门氏菌检测方法概述 我国现行检测沙门氏菌的标准主要为o b t4 7 8 9 4 2 0 0 3 “食品卫生微生物学检验沙门氏菌 检验”和s n t0 1 7 2 1 9 9 2 “出口食品中沙门氏菌属( 包括亚利桑那菌) 检验方法”，但以上方法 在样品制备、目标菌的分离鉴定等方面与国际先进方法存在很大区别。我国微生物现行的检验方 法多采用2 0 世纪8 0 年代后期国际公布的方法，同时灵敏度高的选择培养基没有采用【“。虽然传 统方法具有廉价等优点，但是报告检验结果大致需3 - 4d ，甚至4 - 7d ，加之检验方法繁琐，需要 经过前增菌、选择性增菌、分离、生化筛选和血清学鉴定等5 个步骤，费时费力，不能满足社会 对检测快速及时的要求。 近年来，随着生物技术的快速发展，新技术新方法在微生物检验领域得到了广泛应用，有效 地提高了检测效率和检测速度呲2 2 , 2 3 12 4 , 2 5 , 2 6 1 。沙门氏菌快速检测方法主要集中在：1 、改良的或 自动化的传统方法，如显色培养基；2 、生物荧光法，如a t p 荧光仪；3 、阻抗法，如自动化传导 法；4 、免疫学方法，如单( 多) 克隆酶免疫分析筛选方法、自动酶联荧光免疫检测系统；5 、以 4 棱酸为基础的分予生物学方法，热d n a 探针梭测法、p c r 法蹲。这些方法谯缎艇检测时阍，提 建检验熬辩，豫涯捡验维秉约鬣黢寝秘特异彀方嚣其骞德潞之娥。 1 3 3p c r 麓介及其检测微生物豹原理 辍接酸为蘩确霹p c r 稔溅穷法，麓子糗灏鞭辩、热王产箍、食晶枣蓊瘸琢蘧，其喜壤确、 检测限低、姨避等特点。聚合瓣链凝应或多絮簿链反蹴( f o l y m e r a s ec h a i nr e a c t i o n , p c r ) ，又称 澈细胞克隧技术( “f r e eb a c t e r i a ”c l o n i n gt e c h n i q u e ) ，是一种对特定的d n a 片段在体外进行快速 扩增的新方法。该方法一改传统分子克隆技术的模式，不通过活细胞，操作赖便，在数小时内可 袋冗拿拷炎魏模投毒魏差至一个d n a 势子扩臻1 8 7 i 嵇，丈夫鬟蹇了d n a 辩褥率。对p c r 舞 簿姓扩增产燃遗嚣璩籍骧凝黢亳溶分辑，熬蜃褒蘩羚投麓搜下帮莓嚣寨臻巢搿，糍趔。 和天然d n a 静复制过程一撵，p c r 包括蹙性、遥火鞫踅 每三个基本遵鞋，窀们之闻溅进溢 魔韵缓变采窳现根瓦转换，如瞬1 - 1 所示。变性是指横掇d n a 往9 5 c 左右的辩瀛下，双链d n a 瓣链袋攀镳d n a ，莠游离予滚滚串瓣过程 遂灾是摆丸芏会裁瓣一霹； 搦程邋会耱温度下 7 5 猿辩羧 爨鑫搽 鬣囱酶k 磷酸二二氢钾( k h 2 p o r 2 h ? o ) 氯份( c h a 3 ) 氯化钠( n a c d 浓盐陵( h c i ) 警援计数壤囊( p c a ) 氢氧貔镳( n a 。珏) 璩月8 糖( a g a r o s e ，电泳缴) 十烷基磺酸钠( s d s ) 无水己醇 细菌熬阁组d n a 提取试剂窳 溴化艺锭溶液( 1 0 m g m 1 ) 麟溪囊蕊丈豆肉汤( t s b ) 己二铵溺乙酸二钠( n a 2 e d t a ) 异戊醇 天根生化科技( 北求) 有限公司 j k 索鼎国生物技术肖黻资餐公司 天粳生纯辩接( j 寨 毒限公霭 天根生纯科技( j e 窳) 有限公司 天根生化科技( 北京) 有限公司 g i b c o b r l 公司( 美国) 北京鼎国生物技术宥限责任公司 魏京纯工厂 藏索类簿星生耱技零鸯隈赛往公霹 晨根生化科技( 托隶) 有限公司 北京红星化工厂 北京化工厂 北京化工厂 北京他下厂 l 索蘧辑技术有限舞经公司 就京证工厂 天根生佬科技( 北京) 有限公司 北京益利精细化学品有限公司 j b 京化工厂 天擞生化科技( 北京) 商限公司 天壤生化科技( j b 裘) 蠢隈公霹 嚣索陆轿援寒有隈黉馕公蔼 e 泉亿工厂 北京化i 厂 主要溶液的配制： ( i ) 1 0 t r i s - e d t a ( t e ) 缓冲波( p h 8 。o ) ：1 0 0 m m o f l t r i s - c l ( p h 8 o ) ，1 0 m m o l l e d t a ( p i t 8 。0 ) ，滢台分装鑫，毫压蒸汽炙蘩2 0r a i n ，室湛下保存。 ( 2 ) 1 0 s d s ：瘸9 0 0m l 承融辫1 0 0gs d s ，加热翻6 8 。c 劳用磁力搅捧器拣特有助予融解。如 有需要，加几滴浓h c i 调节p h 鬣7 2 。用水定容至1 0 0 0m l ，室温保存，无需灭菌。 ( 3 ) c r a b n a c l ( 1 0 c r a b ，0 7 m o l l n a c i ) ：在8 0 m l h 2 0 中融解4 1 9 i a c l 。缓慢加入1 0 9 c r a b ，同时加热并搅拌。如果嚣骚，可加热至6 5 c 融解。定容终体积至1 0 0 m l 。 ( 4 ) t a e 电泳缓；孛液( 5 0 贮雾激) ：2 4 2 9 t r i s ，5 7 1 i n l 冰醛酸，1 0 0 m 1 0 5 m o f l e d t a ( p i - 1 8 。o ) ， 热去离子窳定察至1 0 0 0 矗。 ( 5 ) 璩脂糖凝胶：将0 2 7 9 凉糌糖与1 5 m 1 1 t a e 缓冲液加入二角瓶中，摇勾。在容器上标出 液面高度，之质在微波炉中加热至璩脂糖溶解。在加热过程中蒸发损失的体积用预先加热( 6 0 c 左右) 的去离子水弥补。制备1 8 的琼脂糖凝胶，待胶冷却至6 5 。c 时加入约0 8 肼l 聃，使其终 浓度为0 5 肛g m l ，并将其混台均匀。铺胶前将琼脂糖冷却至5 5 c 左右，确保胶横水平，将琼腊 中国农业大学磁士学位论文第= 辈p e r 法快速榱测白桃中沙门氏黼的研究 _ ii 糖倒入槽中攒入梳子，静餮2 0 - 3 0 m i n 。特胶凝匿发自时，小心拔出梳子，帮为1 8 琮月s 糖凝胶。 ( 5 ) b u t t e r f i e l d s 磷酸缓i 孛游滚( 储藏渡) ；3 4 0 9 磷酸二巍镩热5 0 0 蕊玺离子隶溶解鑫，翔1 7 5 m l1m o f ln a o h 调p h 7 2 ，再用去离子水补足体积到1 0 0 0m l ，4 c 保存。一l 作液：用去离子水将 1 2 5i i l l 储存波稀释至1 0 0 0m l ，适量分装，溉1 2 1 灭菌1 5m i n 。 ( 6 ) 缓冲蛋彝脒水( b p w ) ：取埔g 蛋自胨，5g 氯化钠，9 9 磷酸氢= 镳，1 5g 磷酸二氢钾， 孀蒸馏承定容至1 0 0 0 矗嚣满赫 7 2 ，萋1 2 1 灭菌1 5 r a i n 。 2 2 4 主要仪器和设备 t - g r a d i e n gt h e r m o b l o c kp c r 坟 冰箱( 4 c 和- 2 0 ) 超净工作台 磁力搅拌器 瞧热恒温农域振荡嚣 电泳稽 电泳仪 电子天平( 2 0 0 9 0 0 1g ) 藤速离心机 过滤器及羰魏滤簇 恒温水浴锅 精密天平 凝胶成像系统 生纯培莽耱 移液枪 紫外可见分光光度计 紫外透视检测仪 黛式蠡动电热掇力蒸汽芡鏊褥 2 3 实验方法 滢度撵凌( t g r a d i e n t ) 系魏 b c d 1 9 6 j b 一1 珏 s y l l - n i d y c y 3 1 a e c p 3 0 0 0 s c o u t p r o 系列s p s 2 0 2 f 型 d l l 6 b j a l l 0 3 测 s ) ( 3 0 0 獭 l 获臻t 5 0 0 5 - 2 0 “l ， 1 0 0 1 0 0 0 “l t 6 型 z d x 3 5 b l 穗嚣w h a t m a nb i o m e t m 公罚 合肥美菱股份有限公司 北京半导体设备一厂 上海雷磁新泾仪器有限公司 l 索审长建便襄搜表公霉 北京六一仅器厂 北京六一仪器厂 美国o h a u s 上海安亭辩学仪器厂 j 豪诧t 擎较辩藏工厂 北京市长风仪器仪表公司 上海海康电子仪器厂 上海四星生物技术有限公霹 上海一毽秘菠奏限公司 2 0 _ 2 0 0 l 人龙医疗设祷( 上海) 脊限公司 北京酱析邋崩仪器有限责饭公司 寇京六一仪器厂 上海串安溪疗器箍厂 铮霹涉门氏藩静编鹨啜瓣和稷袭上瘦缫藏表露蛋壹翻，萋因簇中主要毒力因子i n v a ，选 取没有二聚体戚发夹结构、没有错配，且引物与模板的序列紧密互补的引物序列设计引物。引物 设计采用p r e m i e rp r i m e r5 软件，引物的评价分析采用o l i 9 06 软件。撮终参照r a h n 等人设计的 g l 秘，如表2 1 磷示。 襄2 - 1 ；l 翱穿弼 一一一 ! 翌! ! ! ：! ! 鲤竺兰竺! ! ! ! 。 塑董里 型塑塑呈! ! 塑窆型! ! ：! ：! 芏塑苎璧查! ： p 1 3 9 上游：g t g a a a t i a t c g c c a c g t t c g g g c a a p 1 4 1 节游；t c a t c g c a c c g t c a a a g g a a c c 2 辨印 节游； 1 2 引物委托上海生工生物工程技术服务有限公司合成。所合成引物经h a p 纯化，分别加适量 无菌双蒸水稀释，于一2 0 保存。 2 3 i 沙门氏菌模板d n a 制备方法研究 本实验采用以下3 种常用的提取细菌d n a 的方法：酚仿抽提法、热裂解法和试剂盒法，以 确定快速、有效的提取方法。 2 3 1 1 酚仿抽提法# 4 i ( 1 ) 培养5m l 的细菌培养物至饱和状态，取1 5l n l 的培养物离心2 m i n 。 ( 2 ) 沉淀物加入5 6 7 t l 的t e 缓冲液，用吸管反复吹打使之重悬。加入3 0 z l1 0 的s d s 和3 岸l 2 0 m 咖l 的蛋白酶k ，混匀，于3 t c 温育1h 。 ( 3 ) 加入1 0 0 “l5m o l ln a c i ，充分混匀，再加入8 0 t lc t a b n a c i 溶液，混匀，于6 5 c 温育1 0 r a i n 。 ( 4 ) 加入等体积的氯仿异戊醇( 2 4 1 ，v v ) ，混匀，离心4 - 5m i n 。将上清液转入一个新管中， 如果难以移出上清，先用牙签除去界面物质。 ( 5 ) 加入等体积的酚氯仿屏戊醇( 2 5 2 4 1 ，蚋v ) ，混匀，离心5m i n ，将上清液转入一只新管 中。 ( 6 ) 加入0 6 体积异丙醇，轻轻混合直到d n a 沉淀下米。用7 0 乙醇洗涤沉淀2 - 3 次，离心5r a i n ， 弃上清后风干。重溶于l o o u l t e 缓冲液即为模板d n a 。 2 3 12 热裂解法【5 q 从3 7 c 摇床培养1 6h 的菌悬液中吸取1m l 菌液，1 00 0 0r m i n 离心5r a i n ，弃上清。将沉淀 溶于1 0 0 川t e 缓冲液，沸水浴煮沸1 0m i n ，立即冰上冷却，1 20 0 0r m i n 离心5m i n ，取上清作 为模板d n a 。 2 3 1 3 试剂盒法1 5 6 1 ( 1 ) 细菌培养液1 - 5m l ，1 0 0 0 0r r a i n 离心1m i n ，尽量倒尽上清，留沉淀。 向菌体沉淀中加入2 0 0 m 1 缓冲液g a ，震荡至彻底悬浮。对于革兰氏阳性菌，可加入1 0 0 雎l 溶菌 酶( 1 0 m 咖1 ) ，3 0 处理l o m i n 以上。 ( 2 ) 加入2 0 z 1 蛋白酶k ( 2 0 r a g t i n ) 溶液，混匀。 ( 3 ) 加2 2 0 f l 缓冲液g b ，充分振荡混匀1 5s ，7 0 c 放置1 0 m i n ，溶液应变清亮。 ( 4 ) 加2 2 0 l 无水乙醇，充分振荡混匀1 5s ，此时可能会出现絮状沉淀。 ( 5 ) 将上一步所得溶液和絮状沉淀都加入一个吸附柱c b 中( 吸附枉放入废液收集管中) ，1 2 0 0 0 r m i n 离心3 0s ，弃掉废液。 ( 6 ) 加入5 0 0 u l 去蛋白液g d ，1 20 0 0r m i n 离心3 0s ，弃掉废液。 ( 7 ) 加入7 0 0 u l 漂洗液g w ，1 2 0 0 0r m i n 离心3 0s 弃掉废液。 ( 8 ) 加入5 0 0 , u l 漂洗液g w ，1 20 0 0r m i n 离心3 0s ，弃掉废液。 ( 9 ) 将吸附柱c b 放回废液收集管中，1 20 0 0r m i n 离心2m i n 。将吸附柱置于室温或5 0 。c 温箱 放置数分钟，以彻底晾干吸附材料中残余的漂洗液。 ( 1 0 ) 将吸附柱转入一个干净的离心管中，向吸附膜的中间部位悬空滴加1 0 0 口l 经6 5 7 0 ( 2 水浴 1 3 串蠢裹韭太举醺士学靛论文篱二章p c r 法捷建捡灏鑫壤孛沙秘秃莲瓣磺究 簟一i i i _ 预热的洗脱缓冲液t e ，混匀，室温放匿2 - 5m i n ，1 20 0 0r r a i n 离心3 0s 。 ( 1 1 ) 离心褥囊静滚滚再撼入疆醛辖皆，室滚敖置2 r a i n ，1 2 0 0 0r r a i n 寒心2 r a i n 。粪心褥翻静 溶液即为旗因组d n a 溶液。 研究方法；从3 t c 援廉培养1 6h 韵落悬渡孛吸取1 越j 莛波，分别按照上述三釉方法提墩沙 门氏菌的d n a 。得到的基因精d n a 可用1 琼脂糖凝胶电泳和紫外分光光度计检测浓度与纯度。 2 3 2p c r 扩增秘条侮优佬 因为翻p c r 扩增不月瓣基圈，箕反应效攀相反应崽实性受| 譬多嚣寨魏影响，在整鉴翦人磅 究成果和经验的基础上，往往通过不断的优化反应条件来达到最佳p c r 反应条件。p c r 扩增的 条件优化研以从以下几方面考虑：鳓酶浓度、m 9 2 + 浓度、引物浓度等反臆体系中嚣组成浓度优 化，最佳邋火温度、循环时阔、循环次数等循环参数德纯等。禳据对相关文献进行分析，在p c r 扩增条件优化时对备因素逐一进行分析并找到萁最佳值，最终得出p c r 扩增的最饿条件组念。 原p c r 扩壤条释参照攘荐浓度及反应参数朔稻翔浚动，萁审遥灾潺凌靛选择缀摇复穗递掌 在比理论计算的引物和模扳的溶解温度低3 - 5 c 的条件下进行哪! ，p c r 反威体系及魇应程序如下。 p c r 反感体系为； g 渤p 1 3 9 翻p 1 4 1 d n t p s 1 0 x p c r 缀冲液f 含2 0 0m m o l ap h8 4t r i s - h c i ， 2 0 0 m m o l ，l k c l ，i 5 m m o l 删2 镪 t a q 酶 模叛耪n a 双蒸斌 嚣l 0 嬲( 终浓瘦为2 # m o l 1 ) 2 , 0 z l 洛t t n t i 终浓庹为2 0 0 # m o l 1 ) 2 5 弗1 0 5 k 1 终浓凄戈 ，嚣移 5 , 0 z l 1 3 ，0 b c l 总计 2 5 0 拦l p c r 反皮瓣摩为 孽s 赣整蕊，5r a i n 毒 9 4 变性，3 0 s 、 5 t c 运火，3 0s 潞个德麓： 雠延伸，3 0s j ； 褥延髂，1 0 m i a 按主逮p c r 聂藏蒋系，褥番藏分麴茬2 0 0 # t t 委蛰薄鼗魏寤管内混窘，按照上港p e 鼗囊瘛程 侉取5 # 1 i c r 产物进行1 1 8 璩船糖凝胶电泳( 奄溶条讳为6 v e r a ，9 0 r a i n ) 分瓣、涤化乙键 嚣b ) 染色、紫羚校溺筹糖照。剩余攒箱予4 曝存。 甓铯辩，骥援为扶3 7 籀隳壤潞1 6h 瓣涉糟羞菇拣拣辩按试裁盒法攥淑掰褥。选鲻黼褥两 个摸板浓壤 相对穗浓度( 麴l 妒c f u m l 菌波的d n a ) 蒡i l 姻对憾浓度( 约1 0 c f u m l 麓液髂d n a ) 中蓬表韭夫学磺士学靛豫文豢二章p c r 法块逮检测盎槛中抄门撼蘸静研究 i h i in nl i i ! i i i i i i i i i i i i i ii i i i i l l i l l l l l l l l l l ii i i nn i i _ 进行实验。 蕊蔑霹溅；褥p c r 反鼗体系孛瓣襄藩d n a 捺季享芡蘩双蒸承，其它条谗不变。 2 0 2 1 引糖浓度优纯 魏变g | 物浓攫，使各警串g 物浓度分裂为0 2 , u m o l l ，0 5 l m o p l ，0 7 z m o l l ，l 0 ，u m o l l ，1 2 l m o p l ，1 5u m o l l ，1 7 一m o f l ，2 0 l a m o l l ，冀它反应象件敏上进行p c r 扩增，凝驳电泳，紫矫 鼹寨，璃避最锤 蛰爱痘滚寝。 2 3 2 2 游火漱澄德纯 由公式退火温度t a = t m 一5 c