（食品科学专业论文）酵母对茶多酚吸附性能的研究.pdf

摘要 拙食品髫排绷蜊黑鬻年月qylulliill88iiilllllilllllllll911111141111tlolllilt510112008 9专业：食品科学 入学时间：年月ly1b b y 4 u 3 硕士研究生姓名：刘寅答辩时间：2 0 1 0 年1 1 月9 日 指导老师：王淼教授授予学位时间： 摘要 近年来，国内外对酵母吸附性能的研究越来越多，结果表明酵母细胞具有很强的吸 附性。但是目前，对酵母细胞吸附酚类物质的研究多集中于现象的研究，尤其是国内， 对其吸附机理研究较少。本文选择茶多酚为被吸附对象，试图探讨酵母细胞对茶多酚的 吸附机理及影响因素。同时研究吸附前后茶多酚的稳定性及其抗氧化活性的变化。为酵 母作为吸附剂应用于食品行业提供一定的科学依据。 首先，采用常用的四种方法对酵母细胞进行预处理，制各了醇溶酵母细胞( a c y ) 、 酵母自溶酶解细胞( a e y ) 、酵母自溶细胞( a y ) 和碱提取酵母细胞( a w g p ) ，并研究它 们在水相中吸附茶多酚的性能。结果表明在3 0 m l 质量浓度为4 0 m g m l ，p h4 0 0 的茶 多酚溶液中，四种细胞加入量均为2 0 0 9 ( i n d ) ，吸附时间4 h ，吸附温度4 0 ，吸附率( w w ) 可达到a c y9 8 1 、a e y9 4 3 、a y9 2 2 、a w g p7 3 2 ，单位吸附量可达到a c y3 1 9 8 m g g 、a e y3 0 7 5m g g 、a y3 0 3 8m 魄、a w g p 2 3 8 5m g g 。当茶多酚浓度小于l o m g m l 时，吸附动力学均符合l a n g m u i r 和f r e u n d l i c h 等温吸附式。当茶多酚浓度大于1 0 m g m l 时，等温吸附模式不能用来描述吸附过程，说明酵母细胞对茶多酚的吸附不单是表面的 物理或化学吸附，同时茶多酚通过细胞壁和细胞膜进入细胞内部。 其次，研究不同预处理方法对酵母细胞成份及其细胞表面的物理化学性质的影响， 从而初步探讨吸附机理。结果表明，蛋白质有利于酵母细胞对茶多酚的吸附。通过酶解 释放研究证实蛋白质和茶多酚的缔合作用确实影响酵母细胞对茶多酚的化学吸附能力。 并且，如果细胞表面的疏水性越强、带正电越多、范德华力越强，也有利于吸附。细胞 对茶多酚的吸附行为是这些因素共同作用的结果。进一步说明酵母细胞对茶多酚的吸附 包含物理吸附与化学吸附，由于细胞表面的特性及蛋白质的作用，使茶多酚首先吸附于 酵母细胞表面，而细胞外更多的茶多酚受到细胞内蛋白质的化学吸附作用进入细胞内 部。整个吸附过程以表面吸附为主。 第三，通过静态实验法，确定了茶多酚解吸条件：采用n a c l 浓度为0 5 0 m o l l 的 9 0 乙醇溶液作为解吸剂，料液比为1 ：1 0 ，解吸3 0 m i n ，经过三次解吸后，解吸率分别 可达：a c y5 6 2 5 、a e y6 9 9 1 、a y5 5 8 l 、a w g p2 5 2 2 。 吸附前后茶多酚的抗氧化研究表明，茶多酚被吸入酵母细胞后，由于存在释放和传 质上的障碍，并且细胞中的蛋白质占据茶多酚中的部分羟基，使其抗氧化活性受到一定 影响。但是酵母细胞在某种程度上能发挥微胶囊的作用，并在介质中缓慢释放茶多酚。 故酵母可以作为茶多酚的保护性载体。 关键词：酵母细胞，茶多酚，蛋白质，吸附，解吸，抗氧化 ， a b s t r a c t a b s t r a c t s t u d yo nt h ea d s o r p t i o np r o p e r t i e so fy e a s to nt e ap o l y p h e n o l s s u b j e c t ，s p e c i a l t y ：e n g i n e e r i n g ，f o o ds c i e n c e m a s t e rg r a d u a t es t u d e n t ：y i nl i u f a c u l t ya d v i s e r ：m i a ow a n g i nr e c e n ty e a r s ，m o r ea n dm o r er e s e a r c h e sf o c u s e do nt h ea d s o r p t i o no fy e a s ta th o m ea n d a b r o a d b u tm o s to ft h e s er e s e a r c h e sf o c u s e do nt h ea d s o r p t i o np h e n o m e n o n , e s p e c i a l l yf o r c h i n a ，t h e r ew e r ef e ws t u d i e so na d s o r p t i o nm e c h a n i s m i nt h i sr e s e a r c h , t h ea d s o r p t i o n p r o p e r t i e so f p r e t e a t e dy e a s tc e l l so nt e ap o l y p h e n o l s ( t p ) w e r es t u d i e d t h eo b j e c t i v e so f t h i s s t u d ya r et of i n dt h ea d s o r p t i o nm e c h a n i s ma n di n f l u e n c i n gf a c t o r s a sw e l la st h ec h a n g e si n t h es t a b i l i t ya n da n t i o x i d a n ta c t i v i t yo ft pa b s o r b e d a n dp r o v i d i n gas c i e n t i f i cb a s i sf o ry e a s t u s e di nf o o d sa sa na d s o r b e n t f i r s to fa 1 1 y e a s tc e l l sw e r ep r e - t r e a t e db ya l c o h o l 、3 s o d i u mc h l o r i d e 、a l k a l i n ep r o t e a s e a n ds o d i u mh y d r o x i d er e s p e c t i v e l yt op r e p a r ea c y , 娅、王，心a n da w g p , w h i c hw e r eu s e dt o a d s o r bt pi na q u e o u ss o l u t i o n t h er e s u l t ss h o w e da sf o l l o w s ：3 0 m l ，4 0 m g m l ，p h4 0 0o f t ps o l u t i o n ，2 0 0g ( n l d ) p r e t r e a t e dy e a s tc e i l s ，a d s o r p t i o nt i m e4 ha n da d s o r p t i o nt e m p e r a t u r e 4 0 t h e nt h er a t eo f t pa d s o p t e d ( w w ) r e a c h e d ：a c y9 8 1 、a e y9 4 3 、a y9 2 2 、 a w g p7 3 2 a n dt h eu n i ta d s o r p t i o nq u a n t i t yw a s ：a c y319 8m g g ，a e y3 0 7 5m e g g ，a y 3 0 3 8m # ga n da w g p2 3 8 5m e g g t h ea d s o r p t i o nk i n e t i c sa n a l y s i ss h o w e dt h a tt h e p r o c e s s e so fa d s o r p t i o nw a s i na c c o r d a n c ew i mt h el a n g m u i ri s o t h e r mf o r m u l aa n d f r e u n d l i c hi s o t h e r mf o r m u l aa tt h ec o n c e n t r a t i o no ft ps o l u t i o nl o w e rt h a n10m e m l w 1 l i l e t h ec o n c e n t r a t i o no ft ps o l u t i o nw a sh i g h e rt h a n10m g m l ，t h ea c c o r d a n t eb e t w e e nt h e t h e o r e t i c a lc u r v e sa n dt h et e s tc u r v e sw a su n a c c o r d a n t t h er e s u l t si l l u s t r a t e dt h a tt h e a d s o r p t i o no fy e a s to nt pw a s n o tj u s tm o n o m o l e c u l a rp h y s i c a lo rc h e m i c a la d s o r p t i o n , a n da t t h es a m et i m et pw a sa d s o r b e di n t oc e l li n t e r i o rt h r o u g ht h ec e l lw a l la n dc e l lm e m b r a n e s e c o n d l y , t h ee f f e c to fp r e t r e a t m e n tm e t h o d so nc e l l u l a rc o m p o n e n t sa n dp h y s i c a l - c h e m i c a l p r o p e r t i e so fc e l ls u r f a c ew e r es t u d i e dt od i s c u s st h ea d s o r p t i o nm e c h a n i s m 1 1 1 er e s u l t s s h o w e dt h a ty e a s tp r o t e i nw a sc o n d u c i v et ot h ea d s o r p t i o no fy e a s to nt p t h er e s u l t so f d e s o r p t i o nb yp e p s i ns h o w e dt h a tt h ea s s o c i a t i o nb e t w e e nt pa n dp r o t e i nc e r t a i n l ya f f e c t e d t h ec h e m i c a la d s o r p t i o na b i l i t yo fy e a s tc e l l so nt p a n dc e l l sw o u l dh a v es t r o n g e ra d s o r p t i o n a b i l i t y 、析t ht h es t r o n g e rh y d r o p h o b i c i t y , m o r ep o s i t i v e l yc h a r g e da n ds t r o n g e rv a i ld e rw a a l s f o r c eo fc e l l ss u r f a c e t h ea d s o r p t i o nb e h a v i o rw a st h er e s u l to ft h e s ef a c t o r s t h er e s u l t s f u r t h e rs h o w e db o t hp h y s i c a la d s o r p t i o na n dc h e m i c a la d s o r p t i o nw e r ei n c l u d e di nt h ep r o c e s s o fa d s o r p t i o no fy e a s tc e l l so nt p b e c a u s eo ft h ep r o t e i na n ds o m ep r o p e r t i e so fc e l l ss u r f a c e ， ap a r to ft pa d s o r b e do nt h ec e l ls u r f a c e ，a n dm o r ee x t r a c e l l u l a rt pm o v ei n t ot h ec e l l sb y c h e ：m i c a la d s o r p t i o no fp r o t e i n t h ea d s o r p t i o np r o c e s sw a sm a i n l yl e db ys u r f a c ea d s o r p t i o n 1 1 1 i r d l y , t h ed e s o r p t i o nc o n d i t i o n sw e r es t u d i e db ys t a t i ce x p e r i m e n t sa sf o l l o w s ： 9 0 e t h a n o l 、) r i t l l0 5 0m o l ln a c la st h ed e s o r p t i o na g e n t ，l i q u i dr a t i ol ：10 ，d e s o r p t i o nt i m e3 0 1 1 i l l 目录 目录 摘要 a b s t r a c t 目录。 1 引言 i l 1 1 1 酵母菌一1 1 1 1 酵母细胞吸附酚类化合物l 1 2 酵母的预处理方法2 1 3 茶多酚3 1 3 1 茶多酚3 1 3 2 茶多酚的抗氧化作用3 1 4 立题意义和研究内容4 1 4 1 立题依据及意义4 1 4 2 研究内容5 2 材料和方法 2 1 主要实验材料和试剂7 2 2 主要仪器和设备一7 2 3 实验方法7 2 - 3 1 酵母细胞预处理7 2 3 1 1 醇溶酵母细胞( a c y ) 的制备7 2 3 1 2 酵母自溶细胞( a y ) 的制备7 2 3 1 3 酵母自溶酶解细胞( a e y ) 的制备8 2 3 1 4 碱提取酵母细胞( a w g p ) 的制备8 2 3 2 常规成份分析一8 2 3 3 茶多酚的定量方法8 2 3 4 酵母细胞对茶多酚的吸附研究( 静态吸附) 8 2 3 5 微生物粘着碳烃化合物法( m a t h ) 测定酵母细胞表面疏水性9 2 3 6 酵母细胞表面给电性( e l e c t r o n d o n o r a c c e p t o rc h a r a c t e r ) 的测定9 2 3 7 动态吸附9 2 3 8 解吸实验9 2 3 9 酶解解吸实验9 2 3 1 0 吸附前后茶多酚抗氧化作用的检测9 2 3 1 0 1 酸价( a v ) 的测定9 2 3 1 0 2 过氧化值( p o v ) 的测定一1 0 2 3 1 1 吸附前后茶多酚在花生酱中抗氧化作用的检测1 0 2 3 1 1 1 花生酱的制备lo 目录 2 3 1 1 2 花生酱过氧化值( p o v ) 的测定1 0 2 3 1 2 统计分析1 0 3 结果与讨论1 1 3 1 酵母细胞的成份分析1 1 3 2 酵母细胞对茶多酚( t p ) 吸附性能的研究1 1 3 2 1 吸附时间对茶多酚吸附率的影响1 1 3 2 2 酵母细胞的添加量对茶多酚吸附率的影响1 2 3 2 3 温度对茶多酚吸附率的影响1 3 3 2 4 茶多酚溶液p h 值对茶多酚吸附率的影响：1 3 3 2 5 在较佳条件下预处理酵母细胞对茶多酚的吸附情况1 4 3 3 预处理酵母细胞对茶多酚的吸附动力学探讨1 5 3 4 酵母细胞表面的化学性质对吸附的影响1 7 3 4 1 酵母细胞表面的疏水性对吸附的影响1 7 3 4 2 酵母细胞表面的带电性及范德华力特性对吸附的影响1 8 3 5 真空处理( 动态吸附) 对酵母吸附性能的影响1 9 3 6 茶多酚的解吸研究2 0 3 6 1 乙醇浓度对茶多酚解吸率的影响2 0 3 6 2 料液比对茶多酚解吸率的影响2 1 3 6 3 解吸时间对茶多酚解吸率的影响2 1 3 6 4 解吸剂p h 值对茶多酚解吸率的影响2 3 3 6 4 离子强度对茶多酚解吸率的影响2 3 3 6 6 解吸次数对茶多酚解吸率的影响2 4 3 7 酶解释放酵母中茶多酚的研究2 5 3 8 吸附前后茶多酚抗氧化活性的研究2 5 3 8 1 过氧化值( p o v ) 2 6 3 8 2 酸价( a v ) 2 6 3 9 吸附前后茶多酚在花生酱中抗氧化活性的研究2 7 主要结论3 0 展望3 3 致谢3 3 参考文献3 4 附录：作者在攻读硕士学位期间发表的论文3 9 i i 1 引言 1 引言 1 1 酵母菌及其吸附性能 酵母菌是人类文明史中被应用得最早的微生物，也是最常用的食品级工业微生物之 一。茵细胞的形态通常有圆形、卵圆形、腊肠形、柠檬形或藕节形等。比细菌的单细胞 个体大得多，一般为1 5 1 m a 或5 - 2 0 t t m 。酵母是单细胞真核微生物，具有典型的真核细 胞结构，由细胞壁、细胞膜、细胞质、细胞核、液泡等构成。酵母细胞壁中含葡聚糖5 0 、 甘露糖2 0 、蛋白质1 0 1 5 、脂类8 0 0 - - - 9 及少量的几丁质( 如图1 1 ) 。酵母富含蛋 白质，在酵母干细胞中，蛋白质的含量占据5 2 4 ，除细胞壁中的1 0 0 o , - - 1 5 以外，其余 大部分蛋白质都分布在细胞质内l l j 。 因酵母属于简单的单细胞真核生物，易于培养，且生长迅速，被广泛用于现代生物 学研究中。近年来，国内外对酵母的另一方面做了一些研究，结果表明酵母细胞具有很 好的吸附性能，能吸附重金属1 2 , 3 j 和酚类化合物【4 j 。在酵母吸附重金属方面的研究已经很 深入，并被广泛地应用污水处理1 5 , 6 , 7 】。而对于酵母吸附酚类化合物的研究才刚刚起步， 还有很多未知的地方有待研究。 图1 1 酵母的细胞结构 f i g l - iy e a s te y t o a r e h i t e c t u r e 1 1 1 酵母细胞吸附酚类化合物 近年来，国外研究表明酵母细胞表面具有较强的吸附能力，能吸附酒中一系列化合 物，如酚类化合物( v a s s e r o te ta 1 ，19 9 7 ) i s 】、硫代化合物( p a l a c i o se ta 1 ，19 9 7 ) 9 1 、芳香族化 合物( l u b b e r se ta 1 ，1 9 9 4 ) 1 1 0 】等，进而改善酒的风味及口感，并提高其非生物稳定性。例 如，4 乙基苯酚对红酒质量有负面影响，使红酒产生不愉快的气味( 辛辣味) ，降低红 酒的风味稳定性。p r a d e l l e s 等人采用酵母细胞吸附去除红酒中的4 一乙基苯酚，并初步探 讨了干燥过程对酵母细胞吸附4 乙基苯酚的影响【4 】。研究表明，由于不同的干燥过程会 不同程度地改变细胞表面的物理化学性质，导致细胞的吸附性能有着明显的差异，说明 酵母细胞吸附酚类化合物与其细胞表面的物理化学性质有着密切的联系。 酚类化合物是影响食品质量及人体健康的一类重要化合物，这种影响有正面的，也 江南大学专业硕士学位论文 有负面的。显然，需要去除产生负面影响的物质，而对食品或人体有益的，需要适当添 加。因此，国内外已开始研究酵母细胞对酚类化合物的吸附性能，酵母细胞可以作为酚 类物质的承载体，从某个体系中去除或添加于另一个体系。但是这些研究多集中于现象 的研究，尤其是国内，对其吸附机理及影响因素研究较少。 1 2 酵母的预处理方法 酵母细胞的成份及细胞表面的物理化学性质是研究其吸附机理的关键。不同的预处 理方法会不同程度地改变上述因素，因此有利于吸附机理的研究。 酵母d 葡聚糖是构成酵母细胞壁的主要成分，占细胞壁干重的3 0 - 6 0 。因此， 国内外对于酵母的研究多集中在酵母b 葡聚糖的分离纯化方面。为了能得到产率更高， 纯度更高的酵母p 葡聚糖，学者们先后采用很多方法对酵母进行预处理。 ( 1 ) 酸法： 酸法提取是提取酵母p 葡聚糖最早采用的方法。早期国内外学者对此法进行了较多 的研究。研究结果表明，此法得到的成品纯度低，故其应用受到限制，近年来此法应用 较少【1 1 1 。 ( 2 ) 碱法： 碱法提取是将细胞悬浮于3 n a o h ( w v ) 溶液中，并在一定条件下反复作用三 次，第三次后水洗并调节p h 至4 5 ，离心，残渣用蒸馏水洗涤，脱水，干燥。由于采用 酸性溶液洗涤，去除了其中一些酸溶性糖元及b 1 ，6 一葡聚糖，因而纯度较高。碱法提取 所得的产品纯度较高，但是得率稍低，此法较适用于对提取物纯度要求较高的领域，如 食品和医药用途1 1 1 j 。 ( 3 ) 酶碱法： 国内学者深入研究酶碱法，将酵母泥用蛋白酶处理，离心，残渣再用碱法提取。 此法由于先经酶处理，去除部分蛋白质，因而可以降低后续碱处理过程中碱的浓度与用 量，得到的产品分子链较完整，分子量较高，故酶碱法应用比较广泛【l l , 1 2 。 ( 4 ) 酵母自溶法： 酵母细胞在自身内源酶的作用下自溶，使得细胞内的营养物质外溢，有利于分离提 取营养成份和活性物质【1 3 】。因此，酵母自溶发是目前在开发利用酵母时使用最多的方法。 ( 5 ) 乙醇抽提法： 由于风味化合物都是由一些易挥发、热不稳定的成份组成，在食品加工过程中大量 损失，故需要保护风味化合物，将其包埋于热稳定的分子中，酵母细胞是最好的选择之 一 1 4 , 1 5 , 1 6 ，研究表明酵母细胞可以作为风味化合物的承载体应用于食品中。在包埋之前 需要去除酵母的大部分细胞质基质，使细胞质中有足够的空间存放外界物质，目前使用 最多的方法是用不同梯度浓度的乙醇溶液抽提。此方法简单易操作，并能获得良好的抽 提效果【1 7 , 1 8 1 。 综上所述，酵母自溶、酶解、碱法提取和乙醇抽提是目前开发利用酵母常用的方法。 因此本研究选择这几种方法作为酵母细胞的预处理方法。 2 1 引言 1 3 茶多酚 1 3 1 茶多酚 茶多酚( t e ap o l y p h e n o l s ，t p ) 是茶叶中一类主要的化学成分。它含量高( 占总干物 质的1 8 0 旷3 6 ) ，分布广( 植株各器官都有，主要集中在嫩叶和芽) ，是茶叶生物化学 研究最广泛，最深入的一类物质i l 引。 近年来，绿色工业和绿色食品在全球兴起，并快速发展起来，人们陆续发现从天然 茶叶中提取的茶多酚类物质具有优异的抗氧化【2 0 l 、抗诱变、抗辐射【1 9 , 2 、抗癌1 2 2 , 2 3 1 、杀 菌、抗菌1 2 4 、清除自由基【2 0 ，2 5 】等多种药理和保健功效。大量事实证明，茶多酚越来越受 到世人的青睐1 9 , 2 6 - - 2 9 1 。随着食品业及医药、保健品的迅猛发展，更是刺激了对茶多酚的 深入研究与开发，茶多酚已被列入国家正式批准使用的食品抗氧化剂，并且它是唯一一 种天然抗氧化刘3 0 】。茶多酚及其衍生物的开发和利用，已引起国内外茶学、医药学及食 品业等研究领域人士的极大关注。 目前对酵母细胞吸附茶多酚的研究很少，而且茶多酚是酚类化合物的一大代表，因 此本研究选择茶多酚作为被吸附对象，旨在研究预处理方法对酵母细胞吸附茶多酚的影 响及初步探讨其吸附机理。并且茶叶中多酚类物质能与亚铁离子形成紫蓝色络合物，含 量不同，颜色深浅不一，可以用分光光度法快速测定其含量，检测方法方便快捷。 1 3 2 茶多酚的抗氧化作用 茶多酚是由黄烷醇类( j l 茶素类) ，花黄素类( 黄酮及黄酮醇类) ，花色素类( 花白 素和花青素) ，酚酸及缩酚酸类组成。其中儿茶素类在茶叶中含量丰富，占茶叶干重的 1 2 2 4 ，而它占茶叶中多酚类总量的7 0 0 旷8 0 。儿茶素类物质是2 苯基苯并吡喃的 衍生物，主要包括：表没食子儿茶素没食子酸脂( e g c c ) ，表没食子儿茶素( e g c ) ， 表儿茶素没食子酸脂( e c g ) ，表儿茶素( e c ) ，没食子儿茶素( g c ) 、和儿茶素( c ) ， 儿茶素的抗氧化性与其结构密切相关，结构如图1 2 所示【3 1 1 。 0 h 表儿茶素e c 3 表没食子儿茶素e g c 江南大学专业硕士学位论文 o h 表儿茶素没食子酸脂e c g h o h 表没食子儿茶素没食子酸脂e g c c 图卜2 儿荼素的结构式 f i g l - 2s t r u c t u r eo fc a t e c h i n 由图1 2 可知，儿茶素具有很强的供氢能力。h + 与自由基结合，使自由基较稳定或 被还原为惰性化合物【3 2 】。故茶多酚是不可多得的天然抗氧化剂。 由于各种内外因素的存在，人在氧的利用过程中，会产生各种自由基和活性氧。体 内有各种消除自由基和活性氧和防御体系，使组织免遭伤害。但是，当体内负荷时，就 会使活性氧和自由基的形成和消除之间的平衡失调，从而诱发各种组织损伤和疾病【3 3 1 。 有很多疾病是由于氧化失衡引起，现发现的已超过1 0 0 余种，例如有动脉粥样硬化，老 年痴呆症，白内障，糖尿病，肾炎，高血压等等【3 4 1 。 人体代谢过程产生的自由基是维持生命所必须的，在正常情况下，体内自由基的产 生和清除处于平衡状态。但是，随着年龄的增长，抗氧化酶类如超氧化物岐化酶( s o d ) 等的活性下降，使体内清除自由基的能力下降。如果体内自由基过量，就会引起脂质过 氧化，影响细胞功能，导致生物膜破损、代谢紊乱、机体迅速衰老，所以清除多余自由 基可以延缓衰老【3 5 1 。故越来越多的天然抗氧化剂被应用于食品和医药行业。 茶多酚中的儿茶素类具有强抗氧化作用。但是，茶多酚被吸附于酵母细胞后，是否 会影响茶多酚的稳定性及其抗氧化性能，本研究将初步比较吸附前后茶多酚的抗氧化效 果。 1 4 立题意义和研究内容 1 4 1 立题依据及意义 酵母是一种新型的、可食用的吸附剂，利用酵母作为吸附剂有很多优势，例如具有 原材料来源丰富、品种多、成本低、吸附设备简单易操作等特点，还具有速度快、吸附 量大、选择性好等优点。并且，酵母p 葡聚糖是构成酵母细胞壁的主要成份，占细胞干 重的3 0 6 0 。酵母d 葡聚糖是一种活性多糖，具有多种生理功能，例如能抗肿瘤活 性、抗辐射、促进伤口愈合、还能降低胆固醇和血脂【3 们。因此，利用酵母作为吸附剂应 用于食品行业，不仅可以对食品本身的感官质量有着极大的帮助，还可以对人体有一定 的药理功效。 目前，酵母细胞对酚类化合物的吸附研究多集中于现象的研究，尤其是国内，对其 4 1 引言 吸附机理及影响因素的研究更为少见。国外已有研究显示，在红酒中酵母细胞吸附酚类 化合物与其细胞表面的物理化学性质有着密切的联系【4 】。而在水溶液中这种联系是否还 存在，并且酵母细胞的成份对其吸附性能又有哪些影响，本研究将初步探讨这些问题。 茶多酚是酚类化合物的一大代表。并且由于茶多酚具有极强的消除自由基的能力， 成为一种不可多得的天然抗氧化剂。茶多酚还具有多种药理和保健功效，也越来越受到 世人的青睐，有关茶多酚的研究也成为一大研究热点。茶多酚易溶于水，其水溶液的p h 值在3 4 之间，对酸比较稳定，在p h 值2 8 之间均较稳定1 3 5 1 ，并且茶多酚的检测方法 简便快捷，这些因素都有利于吸附机理的研究，因此选择茶多酚作为被吸附对象，试图 探讨酵母细胞对酚类化合物的吸附机理。 酚类化合物都具有一定的抗氧化性，茶多酚可以作为极佳的天然抗氧化剂。那么， 茶多酚的稳定性及其抗氧化性能在被吸附于酵母细胞后是否会发生变化，这也需要我们 进一步研究。 1 4 2 研究内容 本论文以面包酵母为吸附剂，茶多酚作为被吸附的酚类物质，研究预处理方式对酵 母细胞成份及表面物理化学性质的影响，及不同预处理酵母细胞对茶多酚吸附性能的影 响，进而初步探讨酵母对酚类化合物的吸附机理。并且将吸附茶多酚的酵母细胞添加于 猪油及花生酱中，研究吸附前后茶多酚的稳定性及其抗氧化活性的变化。主要研究内容 为： ( 1 ) 预处理方法对酵母细胞成份及表面物理化学性质的影响 ( 2 ) 预处理方法对酵母细胞吸附茶多酚性能的影响及其动力学研究 ( 3 ) 动态吸附对酵母细胞吸附性能的影响 ( 4 ) 茶多酚的解吸研究及蛋白酶对解吸的影响 ( 5 ) 吸附前后茶多酚在猪油及花生酱中稳定性及抗氧化活性的研究 5 江南大学专业硕士学位论文 6 2 材料与方法 2 1 主要实验材料和试剂 2 材料和方法 鲜面包酵母 茶多酚( t p 9 8 ) 氯化钠( 分析纯) 氢氧化钠( 分析纯) 无水乙醇( 分析纯) 无水乙醚( 分析纯) 冰醋酸( 分析纯) 硫代硫酸钠 十六烷 正己烷 三氯甲烷 石油醚3 0 - 6 0 2 2 主要仪器和设备 b a c k m a nc o u l t e r ( u s a ) 台式冷冻离心机 t g l 1 6 g 离心机 d k y 11 恒温调速回转式摇床 v 18 0 0 型可见光分光光度计 u v 11 0 0 型紫外可见分光光度计 s h z 3 循环水多用真空泵 a b 2 0 4 n 型电子分析天平 d e l t a3 2 0 s 型p h 计 冷冻干燥器 2 3 实验方法 2 3 1 酵母细胞预处理 2 3 1 1 醇溶酵母细胞( a c y ) 的制备 河北马利食品有限公司 遵义陆圣康源科技发展有限责任公司 国药集团化学试剂有限公司 国药集团化学试剂有限公司 国药集团化学试剂有限公司 国药集团化学试剂有限公司 国药集团化学试剂有限公司 国药集团化学试剂有限公司 国药集团化学试剂有限公司 国药集团化学试剂有限公司 国药集团化学试剂有限公司 国药集团化学试剂有限公司 上海力申科学仪器有限公司 上海安亭科学仪器厂 上海社科自动化设备有限公司 上海美谱达仪器有限公司 上海美谱达仪器有限公司 上海沪西分析仪器厂有限公司 梅特勒托利多仪器( 上海) 有限公司 梅特勒托利多仪器( 上海) 有限公司 i ，a b c o n c o 新鲜面包酵母泥依次与5 0 、7 0 、9 0 乙醇溶液混合，室温下搅拌2 h ，离心 ( 6 0 0 0 r m i n ，1 5 m i n ) ，去除上清液，残渣冷冻干燥至水分含量低于5 墨1 j 为所需醇溶酵 母细胞【1 8 1 。 2 3 1 2 酵母自溶细胞( a y ) 的制备 新鲜面包酵母泥与蒸馏水1 ：4 ( w v ) 混合，加入适量促进剂3 n a c l 溶液( w ) ， 7 江南大学专业硕士学位论文 5 5 。c 水浴下搅拌均匀，维持p h = 5 5 0 ，低速搅拌2 4 h ，离心( 6 0 0 0 r m i n ，1 5 m i n ) ，去除 上清液，残渣冷冻干燥至水分含量低于5 即为所需酵母自溶细胞【3 6 1 。 2 3 1 3 酵母自溶酶解细胞( a e y ) 的制备 酵母自溶残渣a y 与蒸馏水1 ：3 ( w v ) 混合，5 5 水浴下搅拌均匀，调节混合液 p h = 8 0 0 ，加入碱性蛋白酶，搅拌1 h ，离心( 6 0 0 0 r m i n ，1 5 m i n ) ，残渣冷冻干燥至水分 含量低于5 即为所需酵母自溶酶解细胞【3 6 1 。 2 314 碱提取酵母细胞( a w g p ) 的制备 酵母自溶残渣a y 与3 n a o h 溶液1 ：4 ( w v ) 混合，7 5 水浴下搅拌2 h ，自然冷 却后，继续搅拌1 h ，离心( 6 0 0 0 r m i n ，1 5 m i n ) ，残渣重复上述操作两次，然后调节混 合液p h - - 4 5 0 ，离心，蒸馏水洗三次，离心，残渣冷冻干燥至水分含量低于5 即为所 需碱提取酵母细胞【3 6 】1 。 2 3 2 常规成份分析 蛋白质一微量凯氏定氮法( g b5 0 0 9 5 1 9 8 5 ) 脂肪一索氏抽提法( g b t5 0 0 9 6 2 0 0 3 ) 总碳水化合物一苯酚硫酸法 灰分- - 5 5 0 6 5 0 灰化法( g b t5 0 0 9 4 2 0 0 3 ) 2 3 3 茶多酚的定量方法 按g b t8 3 1 3 2 0 0 2 方法测定茶多酚( t e ap o l y p h e n o l s ，t p ) 的含量，以试剂空白溶液 作参比，测定吸光度。茶多酚的计算公式如下： 茶多酚( ) ：a x l 9 5 7 x 2 当一1 0 0 ( 1 ) 1 0 0 0 l ，m 。xm 式中：l l 试液的总量，m l ； l 2 一测定时的用液量，m l ； m 0 _ 试样的质量，g ； m 一试样干物质含量，； 卜试样的吸光值； 1 9 5 7 一当吸光值等于0 5 0 时，每毫升溶液中含茶多酚相当于1 9 5 7 m g 。 2 3 4 酵母细胞对茶多酚的吸附研究( 静态吸附) 在一定浓度，一定体积的茶多酚溶液中加入适量预处理酵母细胞，置于恒温振荡器 中( 1 1 0 r r a i n ) 吸附一定时间，取出样品离心，按g b t8 3 1 3 2 0 0 2 的规定测定吸附前后 溶液中茶多酚的含量。茶多酚吸附率计算公式如下【3 7 】： 茶多酚的吸附率f ( ) ：竺生1 0 0 ( 2 ) 式中：a _ 吸附前溶液中茶多酚的含量，； 卜吸附前溶液中茶多酚的含量，。 8 2 材料与方法 2 3 5 微生物粘着碳烃化合物法( m a t h ) 测定酵母细胞表面疏水性l 柏l ( 1 ) 称取1 0 0 m g 酵母细胞与p h7 0 磷酸盐缓冲液混合，常温下搅拌6 h - 8 h ，使酵母细 胞充分分散于缓冲液中，至6 0 0 n m 下测定吸光值，以磷酸盐缓冲液作为空白对照。 ( 2 ) 取( 1 ) 中菌悬液4 m l ，加入1 5 m l 正己烷溶液，在常温下剧烈振荡l m i n ，静置 1 5 m i n ，使两相完全分层。用无菌注射针头快速吸取下相水溶液至6 0 0 n m 下测定吸光值 a l 。细胞表面疏水性( c s h ) 计算公式如下： c s h ：垒q ：垒! 1 0 0 ( 3 ) a o 2 3 6 酵母细胞表面给电性( e l e c t r o n d o n o r a c c e p t o rc h a r a c t e r ) 的测定 操作方法和计算公式均与m a t h 法相同( 如2 3 9 ) ，只是m a t s 法是在4 0 0 h m 下 测定吸光值【4 。 2 3 7 动态吸附 在一定浓度，一定体积的茶多酚溶液中加入适量预处理酵母细胞，置于真空干燥器 内，密封完全，抽真空0 5h ，之后取出样品离心，按g b t8 31 3 2 0 0 2 的规定测定吸附 前后溶液中茶多酚的含量。茶多酚吸附率计算公式按( 2 ) 式计算。 2 3 8 解吸实验 准确称取一定量吸附过茶多酚的酵母细胞，加入适量解吸溶剂，置于恒温振荡器中， 在一定条件下解吸，离心( 1 0 0 0 0 r m i n ，1 5 m i n ) ，量取上清液体积，并测定其中茶多酚 的含量【4 2 】。茶多酚解吸率计算公式如下： v 茶多酚的解吸率( ) = 丑1 0 0 ( 4 ) x 2 式中：x l 一解吸液中茶多酚的含量，； x 厂解吸前酵母细胞中茶多酚的含量，。 2 3 9 酶解解吸实验 准确称取一定量吸附过茶多酚的酵母细胞，加入适量蒸馏水，置于恒温振荡器中， 在3 7 下混匀，待溶液温度稳定后将p h 调至1 8 ，加入适量胃蛋白酶，解吸一定时间。 测定上清液体积及茶多酚的含量，并按( 4 ) 式计算茶多酚的解吸率。 2 3 1 0 吸附前后茶多酚抗氧化作用的检测 2 3 1 0 1 酸价( a v ) 的测定 按g b t5 0 0 9 3 7 2 0 0 3 的方法测定猪油的酸价。酸价计算公式如下： x ：亟= 匕) 兰! 兰! 坠( 5 ) 历 式中：x 一样品的酸价，a v 值，k o hm g g ； v 1 一样品消耗k o h 标准溶液的体积，m l ； 9 江南大学专业硕士学位论文 v r 试剂空白消耗k o h 标准溶液，m l ； c - k o h 标准溶液的摩尔浓度，m o l l ； 5 6 1 k o h 的摩尔质量，g m o l ； n l 一样品质量，g 。 2 3 1 0 2 过氧化值( p o v ) 的测定 按g b t5 0 0 9 3 7 2 0 0 3 的方法测定猪油的过氧化值。过氧化值计算公式如下： x ：( v l - v o ) x c x 0 1 2 6 9 1 0 0 m 式中：x 一样品的过氧化值，p o v 值，g 1 0 0 9 ； v l 一样品消耗n a 2 s 2 0 3 标准溶液的体积，m l ； v 一剂空白消耗n a 2 s 2 0 3 标准溶液，m l ； c n a 2 s 2 0 3 标准溶液的摩尔浓度，m o l