（食品科学专业论文）稻壳提取低聚糖的研究.pdf

摘要 稻壳是碾米厂的副产品，为了扩大稻壳的利用途径，本研究用酶法水解稻壳， 以提取功能性低聚糖( 纤维寡糖和低聚木糖) 。首先用氢氧化钠浸泡稻壳，然后 分别加纤维素酶和木聚糖酶进行酶解。 用纤维素酶酶解预处理后的稻壳，以酶解产物中还原糖含量作为评价指标， 预处理条件的优化结果：氢氧化钠溶液浓度为8 5 ，浸泡温度为7 0 。c ，浸泡时 间为2 h ，固液比为1 ：9 。 用木聚糖酶酶解预处理后的稻壳，以酶解产物中还原糖含量作为评价指标， 预处理条件的优化结果：氢氧化钠溶液浓度为8 o ，浸泡温度为7 0 。c ，浸泡时 间为2 h ，固液比为1 ：9 。 通过单因素实验和响应面实验，优化酶解条件。加入纤维素酶的最佳提取条 件为：温度5 3 、加酶量1 0 5 0 、p h 4 5 0 、时间1 9 h ，所得的酶解率为2 6 3 0 ，聚合度为1 1 9 。加入木聚糖酶的最佳提取条件为：温度5 0 、加酶量1 0 2 0 、 p h 4 0 0 、时间1 7 h ，所得的酶解率为8 0 2 ，聚合度为1 7 0 。 经纤维素酶酶解后主要得到纤维寡糖产品，经木聚糖酶酶解后主要得到低聚 木糖产品。用乙酸乙酯溶液除去酶解液中的部分杂质，并且浓缩酶解液。用不同 浓度的乙醇溶液对纤维寡糖和低聚木糖产品进行提纯，最终确定用3 0 乙醇溶 液提纯纤维寡糖产品，用2 0 乙醇溶液提纯低聚木糖产品。 用质谱对产品进行检测，并对比薄层层析图谱进行分析。由纤维寡糖产品的 质谱图中只检测出纤维二糖一种成分，其它成分可能不易出峰或被纤维二糖峰隐 蔽。由低聚木糖产品的质谱图可知，只有木二糖，与薄层层析图谱结果相一致。 对酶解提纯得到的低聚糖量进行计算，用同样质量的稻壳得到的纤维寡糖产 品量明显高于低聚木糖产品量。 通过电镜扫描，稻壳提取低聚糖后残留的余渣，还可用作制取吸附剂的原料。 关键词：稻壳纤维寡糖低聚木糖提取纯化 a b s t r a c t r i c eh u s ki st h eb y p r o d u c to fr i c e f o rb r o a d e n i n gm o r ea p p r o a c hi nu s e ，i nt h i s p a p e r ，i t w a s h y d r o l y z e d u n d e rt h ee f f e c to fe n z y m ea n df u n c t i o n a l o l i g o s a c c h a r i d e ，f o re x a m p l ec e l l o o l i g o s a c c h a r i d e sa n dx y l o o l i g o s a c c h a r i d e s ，w e r e g o t f i r s t r i c eh u s kw a sd i p p e di ns o d i u mh u d r o x i d es o l u t i o n ，t h e nc e l l u l a s ea n d x y l a n a s ew e r ea d d e di nr i c eh u s kt h a td i p p e d t h ee v a l u a t i n gi n d e xo ft h ep r e t r e a t m e n to fr i c eh u s kw a st h ec o n t e n t so f r e d u c i n gs u g a rt h a ta d d e di nc e l l u l o s e t h eo p t i m u mr e s u l t so fp r e t r e a t m e n tw e r et h e c o n c e n t r a t i o no fs o d i u mh y d r o x i d e8 5 ，d i p p i n gt e m p e r a t u r e7 0 ，d i p p i n gt i m e 2 h ，t h er a t i oo f s o l i da n dl i q u i d1 ：9 t h ee v a l u a t i n gi n d e xo ft h ep r e t r e a t m e n to fr i c eh u s kw a st h ec o n t e n t so f r e d u c i n gs u g a rt h a ta d d e di nx y l a n a s e t h eo p t i m u mr e s u l t so f p r e t r e a t m e n tw e r et h e c o n c e n t r a t i o no fs o d i u mh y d r o x i d e8 o ，d i p p i n gt e m p e r a t u r e7 0 ，d i p p i n gt i m e 2 h ，t h er a t i oo fs o l i da n dl i q u i d1 ：9 t h r o u g hs i n g l e f a c t o rt e s t sa n dr e s p o n s e s u r f a c ee x p e r i m e n t sw eg o tt h e o p t i m u me x t r a c t i n gc o n d i t i o nf o rc e l l u l a s ew e r ea sf o l l o w i n gt e m p e r a t u r e5 3 c ， p h 4 5 0 ，h y d r o l y z i n gt i m e l 9 h ，c o n c e n t r a t i o no f c e l l u l a s e1 0 5 0 t h ee n z y m z i n gr a t e o fc e l l u l a s em e a s u r e du n d e rt h i sc o n d i t i o nw a s2 6 3 0 ，a n dt h ep o l y m e rd e g r e eo f c e l l o o l i g o s a c c h a r i d ei s 1 19 t h eo p t i m u me x t r a c t i n gc o n d i t i o nf o rx y l a n a s ew e r ea s f o l l o w i n gt e m p e r a t u r e5 0 ，p h 4 0 0 ，h y d r o l y z i n gt i m e l 7 h ，c o n c e n t r a t i o no f x y l a n a s e 1 0 2 0 t h ee n z y m z i n gr a t eo fx y l a n a s em e a s u r e du n d e rt h i sc o n d i t i o nw a s8 0 2 a n d t h ep o l y m e r d e g r e eo f x y l o o l i g o s a c c h a r i d e i s1 7 0 c e l l o o l i g o s a c c h a r i d e sp r o d u c t s w e r e g o t i nt h ee f f e c t o fc e l l u l a s e ， x y l o o l i g o s a c c h a r i d e sp r o d u c t sw e r eg o ti nt h ee f f e c to fx y l a n a s e ，p a r t i c a li m p u r i t y w e r er e m o v e dw h e ne t h y la c e t a t ew e r ea d d e di n t h e nt h e s es o l u t i o n sw e r e c o n c e n t r a t e da n dp u r i t i e db yd i f f e r e n te t h n o ls o l u t i o n ，a n dc o m b i n i n gt l c ，w e a s c e r t a i n t h i r t yp e n s e n t e t h n o ls o l u t i o nw e r e p u r i d i e dc e l l o o l i g o s a c c h a r i d e s p r o d u c t ，a n dt w e n t yp e n s e n te t h n o l s o l u t i o nw e r ep u r i d i e dx y l o o l i g o s a c c h a r i d e s p r o d u c t w ec h e c k e da n da n a l y s e dt h e c o m p o s i t i o no fc e l l o o l i g o s a c c h a r i d e sa n d x y l o o l i g o s a c c h a r i d e sb ym s a n dt l c i nt h em sp i c t u r eo f c e l l o o l i g o s a c c h a r i d e s w e o n l yf o u n dc e l l o b i o s e ，o t h e rc o m p o s i t i o n sm a yb en o te a s yt oc h e c ko rh a r d yc h e c k b e c a u s eo f c e l l o b i o s e ，i nt h em sp i c t u r eo f x y l o o l i g o s a c c h a r i d e sw ef o u n dx y l o b i o s e ， t h i sr e s u l tw a sc o n s i s t e n tw i t ht l c t h o u g hc a l c u l a t i n gt h ec o n t e n t so fc e l l o o l i g o s a c c h a r i d e sw e r eh i g h e rt h e nt h a to f x y l o o l i g o s a c c h a r i d e s t h o u g h s e mo ft h er e s i d u eo fe x t r a c t i n gc e l l o o l i g o s a c c h a r i d e s a n d x y t o o l i g o s a c c h a r i d e s ，w ef o u n d t h er e s i d u em a yb et h em a t e r i a lo fs o r b e n t k e yw o r d s ：r i c eh u s kc e l l o o l i g o s a c c h a r i d e sx y l o o l i g o s a c c h a r i d e s e x t r a c t i n g p u r i f i c a t i o n 独创性声明 本人声明所呈交的论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及 取得的研究成果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外， 论文中不包括其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得河 南工业大学或其他教育机构的学位或证书而使用过的材料。与我一同工 作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表 示了谢意。 论文作者签名：叙搬日期：i 鳗：竺：i 主 关于论文使用授权的说明 本人完全了解河南工业大学有关保留、使用学位论文的规定， 即：学校有权保留送交论文的复印件，允许论文被查阅和借阅；本 人授权河南工业大学可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数 据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编 学位论文。( 保密的论文在解密后应遵守此规定) 论文作者签名：鱼盘坠 日期 ，嘶否 0 a 导师签名：杠日期：g 乏! 坦 稻壳提取低聚糖的研究 第一章前言 稻壳又名砻糠或大糠，约占稻谷重量2 0 ，是碾米厂的主要副产品之一 目前，全世界年产稻壳6 0 m t 以上。 1 1 稻壳的理化特性 稻壳由内颖及较大的外颖组成，内外颖通过两个钩状结构彼此连结。稻壳长5 l o m m 、2 5 5 m m 、厚2 5 3 0um ，其色泽呈稻黄色、金黄色、黄褐色及综红色等。稻 壳堆积密度为9 6 1 6 0 k g m 一，稻壳被粉碎后，堆积密度可达3 8 4 - - 4 0 0k g m 一。 稻壳中硅含量愈高，则愈坚硬，耐磨性能也愈好。稻壳的静止角为3 5 。，稻壳粉碎 后通过8 0 1 6 0 目筛网的静止角为4 3 。4 5 。 稻壳燃烧后剩下的稻壳灰一般为稻壳质量的2 0 。稻壳灰的主要成分是二氧化硅， 含量高达8 7 9 7 。稻壳灰的容重为2 0 0 4 0 0k g 1 1 1 一，相对密度为2 1 4 ，热导系数 为o 0 6 2 。 稻壳中约含4 0 的粗纤维和2 0 的半纤维素，另外还含有灰分及少量蛋白质、脂 肪等有机化合物i ”。 1 2 稻壳中的纤维素与半纤维素 1 2 1 稻壳中的纤维素 纤维素是不溶于水的均一多糖，是由d 一葡萄糖基构成的链状高分子化合物。纤维 素大分子中的d 一葡萄糖基之间按照纤维二糖连接的方式联结。纤维素的化学结构是由 脱水d 吡喃式葡萄糖单元通过相邻糖单元的1 位和4 位之间的b 一苷键连接而成的一种 线性高分子聚合物。 纤维二糖分子式见图1 1 ，纤维三糖分子式见图l 一2 ，纤维素的化学结构式见图 】一3 。 图1 1 纤维二糖分子式 河南工业大学硕士学位论文 图1 2 纤维三糖分子式 图1 3 纤维素的化学结构式 纤维素中每个葡萄糖基环均具有3 个羟基，由上述结构可知这3 个羟基分别处于葡 萄糖基环的2 ，3 ，6 位，其中在第6 位碳原子c 6 上的羟基为伯醇羟基，而c 2 ，c 3 上的 羟基是仲醇羟基。这些羟基的存在直接影响到纤维素的化学性质，如酯化、醚化、氧化、 接枝共聚等反应，以及纤维素分子间的氢键作用。纤维素纤维的润张与溶解性能等等都 和纤维素大分子上的羟基有关。 纤维素受微生物的作用后，会引起降解，从而使纤维素的聚合度下降，引起纤维素 降解最有效的是纤维素酶，纤维素的酶解作用主要是导致纤维素大分子上的i - 4 b 苷键 断裂【2 1 。 纤维素酶是一种多组分酶，从目前看，至少包括三种不同性质的酶嘲。 ( i ) c l 酶 c 1 酶是纤维素酶系中的重要组分，它在天然纤维素的降解过程中起主导作用。但是 对它的作用方式还有争论。 ( 2 ) b - 1 4 一葡聚糖酶 b 一1 4 - 葡聚糖酶，亦称c 。酶，是水解酶。它可以水解水溶性的纤维素衍生物，也可 以水解已经膨胀和部分降解的纤维素，但不能作用于结晶的纤维素。 b - 1 - 4 - 葡聚糖酶有二种类型：内切b - i 4 一葡聚糖酶和外切b 一1 4 一葡聚糖酶。 内切1 3 - i - 4 - 葡聚糖酶以随机形式水解1 3 - i 4 葡聚糖，它作用于较长的纤维素链，对 末端键的敏感性比间键小，主要产物是纤维糊精、纤维二糖和纤维三糖。 外切b - 1 - 4 葡聚糖酶能从纤维素链的非还原性末端一个一个地依次切下葡萄糖单 2 稻壳提取低聚糖的研究 位，产物是a 一葡萄糖。专一性比较强。它对纤维寡糖的亲和力强，能迅速水解内切酶 作用产生的纤维寡糖。 ( 3 ) 1 3 - 葡萄糖苷酶 b 一葡萄糖苷酶水解纤维二糖和短链的纤维寡糖生成葡萄糖。对纤维寡糖和纤维三糖 的水解很快，随着葡萄糖聚合度的增加水解速度下降。这种酶的专一性比较差。 纤维素酶常称之为纤维二糖酶，实际上它能作用于所有的葡萄糖3 - 二聚物。 天然纤维素 lc 。酶 水化了的聚合脱水葡萄糖链 c 。酶 纤维二糖 lb 一葡萄糖苷酶 葡萄糖 图1 4 天然纤维素的纤维素酶降解反应过程 酶对纤维素的水解效能取决于酶的可及度。酶解时要使酶直接和受酶作用物接触， 因此必须使酶扩散到纤维素的基体中，这样，凡是限制对纤维素可及度的任何情况，都 会减少酶水解的效果，例如木质素的存在，纤维素的结晶度，还有水分、纤维素的聚合 度等等因素都对酶解有直接的影响。 纤维素可以溶解于某些无机的酸、碱、盐中，例如，它可以用7 2 h 2 s 0 4 ，4 4 h c l 和8 5 的磷酸来溶解。这些酸可以导致纤维素的均相水解。浓h n 0 3 ( 6 6 ) 不能溶解 纤维素，在n a o h 中形成一种加成化合物，作为纤维素硝化的一个中间体，纤维素也能 溶解在某些盐中。 纤维素原料经磨碎、压碎或强烈压缩时，纤维素受到机械作用而降解，表现为聚合 度下降，在同一聚合度时，受机械降解的纤维素比受氧化、水解或热降解的纤维素，具 有更大的反应能力和较高的碱溶解度。这说明纤维素在磨碎或受其它强烈机械作用时， 除纤维素大分子中的键断裂外，还发生天然纤维素结晶结构以及纤维素大分子间氢键的 破环。 纤维素在加热、酶解等条件下可降解为纤维二糖、纤维三糖等纤维寡糖。纤维寡糖 ( c e l l o o l i g o s a c c h a r i d e s ) 是由葡萄糖依靠1 3 1 , 4 糖苷键相连而成的低聚糖，它们不能被 人体消化吸收，具有肠道调节作用，可作为功能性食品或食品添加剂，也可作为糖尿病 患者的甜味剂【4 j o 1 2 2 稻壳中的半纤维素 河南工业大学硕士学位论文 半纤维素的概念是1 8 9 1 年s c h r d z e 提出的，他把用碱液从陆地植物抽提出来的聚糖 称之为半纤维素。半纤维素是低分子量的聚糖类( 其平均聚合度近2 0 0 ) ，它和纤维素一 起正常地产生在植物组织之中。它们可从原来的或脱出木质素的物料中被碱水溶液抽提 而分离出来【2 】o 常见的半纤维素主要有聚阿拉伯糖木糖、4 o 一甲基葡萄糖醛糖木糖、聚葡萄糖甘露 糖、聚半乳糖葡萄糖甘露糖、聚木糖葡萄糖等等。 聚木糖类是禾本科植物和阔叶木的主要半纤维素，针叶木半纤维素中也含有一定量 的聚木糖。酸水解后所得d 木糖与l 邛可拉伯糖的比例为4 ：1 1 2 1 。 稻壳中的半纤维素主要是聚阿拉伯糖木糖。由b - d 一木糖基以1 4 联接构成主链， w l 阿拉伯糖基以1 3 联接到木糖基的c 3 上形成支链，还有d 一葡萄糖醛酸基以1 2 联接到木糖基的c 2 上。分子式见图1 5 、1 6 、l 一7 。 图1 5 木二糖分子式 + 4 一d x p l 4 d 图1 6 木三糖分子式 l d x p l a 图1 7聚木糖分子式 a ：b ：木糖基= 3 ：1 ：3 0a 为a l 一阿拉伯糖基 4 一d - - x p l f l d - - g l u p a b b 为d 一葡萄糖醛酸基 一d x p l 稻壳提取低聚糖的研究 l a z c r n n u k h o v a 等人5 1 对稻壳进行了一系列处理后，得到多聚糖，并对其单糖成分 进行分析，结果见表l 一1 。 表1 1 从稻壳中提取的多聚糖中单糖组成和含量 j c p a r a j o 等人嘲分析对比了稻壳、玉米芯、大麦壳、桉树中缩糖成分，结果如表1 2 所示。 表1 2原材料的组分含量 半纤维素在加热、酶解等条件下可降解为木糖、阿拉伯糖、低聚木糖等。水解半纤 维素的酶称为半纤维素酶，也叫木聚糖酶木聚糖酶是木聚糖的专一降解酶。属于水解 酶类，包括内切木聚糖酶、外切木聚糖酶和木糖苷酶三种。内切木聚糖酶能随机切断木 聚糖主链上的木聚糖苷键，生成分子量不同的木寡糖；外切木聚糖酶则从木聚糖非还原 性末端切下单个的d 一木糖；而木糖苷酶则水解木寡糖生成d 一木糖，且仅能水解木二 糖。三种酶解作用产生d 一木糖可以被动物吸收和利用。近年来对木聚糖酶的研究发现， 它应用于饲料中提高了饲料营养价值，突破了饲料资源开发利用的局限，增强了动物的 生产与抗病能力，减少了动物排泄物造成的污染，作为一种环保添加剂，在发展环保型 畜牧业中具有十分重要的意义与价值。 河南工业大学硕士学位论文 低聚木糖( x y l o o l i g o s a c c h a r i d e s ) 是指由2 7 个木糖以1 3 1 ，4 糖苷键连接而成的 直链低聚糖，但以二糖和三糖为主。低聚木糖具有极好的双歧杆菌增殖活性，抑制病原 菌，防止腹泻、便秘，增强肌体免疫力，在人体内难以消化，肠道内残存率高，抵抗肿 瘤和分解致癌物等功能，与其他功能性低聚糖相比，用量少，效果好；可用于糖尿病、 肥胖症和高血压等患者食用；有利于口腔健康，不引起龋齿等特点，广泛用于食品、医 疗和饲料工业等 7 1 。 1 3 低聚糖 低聚糖( o l i g o s a c c h a r i d e s ) 又称寡糖类或少糖类，是由2 1 0 个单糖分子以糖苷键 连接而成的低度聚合糖，有功能性低聚糖和普通低聚糖两大类 9 1 。普通低聚糖可被机体 消化吸收，为人体提供能量，但不具有特殊的生理功能，属于这类的糖有蔗糖、乳糖、 麦芽糖、麦芽三糖和麦芽四糖等。功能性低聚糖具有特殊生理功能，能促进人体肠道内 固有的有益细菌双歧杆菌的增殖，从而抑制肠道内腐败菌的生长并减少有毒发酵产 物的形成。人体胃肠道内由于没有水解这些低聚糖的酶系统，因此它们不能被人体消化 吸收而直接进入大肠内优先为双歧杆菌所利用，为双歧杆菌的增殖因子。功能性低聚糖 由此而引起人们的广泛关注。 国际上最近开发的主要功能性低聚糖如表1 3 所示1 1 1 】。 功能性低聚糖不被人体消化吸收，属于低分子量的水溶性膳食纤维。功能性低聚糖 的某些生理功能类似于膳食纤维，但它不具备膳食纤维的物理特性，诸如粘稠性、持水 性和膨胀性等，功能性低聚糖的生理功能完全归功于其独有的发酵特性，功能性低聚糖 特殊的生理功效【9 】主要包括： 高效双歧杆菌的增殖因子。 调节胃肠内的菌群结构、抑制致病菌产生。 增强肌体免疫抗病力。 降血脂、降胆固醇、不提高血糖值。 抗龋齿性。 促进矿物质吸收功能等。 纤维寡糖和低聚木糖都具有功能性，属功能性低聚糖类。因此降解后的纤维素和半 纤维素为人们提供了特殊的功能特性。本课题是从稻壳中提取低聚糖( 主要是纤维寡糖 和低聚木糖) ，既为稻壳的综合利用提供了一种新的途径，又为人们开发功能性低聚糖提 供了一种新的原料。 6 稻壳提取低聚糖的研究 表1 3国际上最近开发的主要低聚糖 7 河南t 业大学硕士学位论文 1 4 国内外研究概况 国内对低聚木糖方面的研究开发和宣传推广还刚刚起步，吴克1 1 】、洪枫【1 2 、袁其明 1 1 3 1 、杨瑞金1 4 1 、王海等陆续报道了他们制备低聚木糖的研究结果。山东省龙力公司 与中国农业大学合作，研制出低聚木糖，其技术达到国内领先水平。 在国外，关于低聚糖研究报道最多的是日本。迄今为止低聚木糖的制备方法，大体 可归纳为如下四种【8 】：酸水解法1 7 圳1 、热水抽提法 1 92 0 ，2 ”、酶水解法2 3 + 2 4 。2 5 。2 6 2 7 2 8 2 9 1 、微波降解法 3 0 1 。 h a v l i c e ky 等 16 采用三氟醋酸、m i t s u i s h iy 等 1 7 】采用盐酸、b r a ymr t l 8 1 采用硫酸 等稀酸部分水解木聚糖进行低聚木糖的制备研究。日本专利昭5 3 - - 4 4 6 4 0 【1 9 j 曾提出热水 抽提法制备低聚木糖。户枝一喜等 3 l 】用蒸汽喷爆法预先处理稻壳，然后再利用s p e 菌 株生产的木聚糖酶，对所抽提出的木聚糖酶液进行酶解制备低聚木糖，结果比较满意。 东顺一等口0 提出了用微波降解木聚糖制备低聚木糖的方法，但仅限于实验室的研究。 有关利用纤维原料制备纤维寡糖的研究报道国内几乎没有。纤维寡糖作为功能性低 聚糖在国外的研究也很有限。 目前国内用玉米芯、甘蔗渣、稻草等纤维素物质为原料制低聚糖进行了探索，而以 稻壳为原料制低聚糖尚属空白，国外在此方面的报道也很少。 1 5 研究目的与内容 1 5 1 研究目的与意义 长期以来，国内外对稻壳的综合利用进行了广泛的研究，获得了许多可利用的途径 1 , 3 2 1 。 稻壳可以提供能量。 稻壳发热量为1 2 5 1 4 6 k j k g ，2 t 稻壳相当于i t 标准煤的发热量。通常，1k g 稻壳 可产生2 4 2 7k g 的蒸汽，2 3k g 稻壳可发l k w h 的电。对于缺煤少电的产稻区来说， 稻壳是一种值得开发利用的廉价能源。 稻壳用来加工饲料。 可将7 0 - - 8 0 稻壳粉与米糠混合，制成统糠饲料。稻壳粉在统糠饲料中只起填充 物作用。据有关单位研究和营养分析，稻壳粉的消化能、代谢能和可消化蛋白质均为负 值。稻壳粉的干物质中，粗蛋白、粗脂肪和无氮浸出物含量很低，粗纤维和灰分含量特 别高，没有营养价值，其既不是能量饲料，也不是蛋白质饲料，不适合作配合饲料的主 要原料。 稻壳可以用来制取化工原料。 稻壳提取低聚糖的研究 稻壳经水解可以得到木糖、糠醛，进一步水解可制取酒精或乙酰丙酸，综合利用还 可以获得醋酸钠、硅酸钠、活性炭、植物激素等。由糠醛出发，可制取合成树脂、涂料、 农药和医药等所需的多种化工原料见图1 8 。稻壳经干馏后，除了可以从溜出液中制取 糠醛等数种化工原料外，燃烧后的稻壳灰中还含有大量的二氧化硅，可以用来制取活性 炭、二氧化硅、硅酸钠( 水玻璃) 等多种化工产品见图l 一9 。 虽然稻壳有许多可利用的途径口l ，但真正能够形成规模生产、大量消耗稻壳的利用 途径并不多，或是经济效益不显著、增值不大，或是在工艺上、技术上、质量上、环保 等方面还存在一些问题。因此，有些地方把稻壳视为废弃物，这不但浪费了资源，而且 也污染环境。本研究旨在探索从稻壳中提取功能性低聚糖，以期为稻壳利用拓宽途径， 最终达到使其增值变废为宝的目的。 本课题的研究意义在于以下几方面： ( a ) 有效地处理稻壳，为稻壳的综合利用提供了一种新的途径。 ( b ) 稻壳降解后产生的低聚木糖和纤维寡糖具有特殊的生理功效，可制成多种营养疗 效的补品与保健食品。 ( c ) 用稻壳制取低聚糖，不仅利于环保工作的进行，而且提高了稻壳的经济价值，充分 利用了可再生资源。 1 5 2 研究内容与实验方案 本课题在借鉴前人用玉米芯、甘蔗渣、油茶壳为原料生产低聚糖的工艺基础上，探 索从稻壳中提取低聚糖的工艺。在低聚糖的工业化生产过程中，酶解法是最常用的方法。 稻壳的天然结构主要是木质化和结晶化，如果直接进行酶解反应，效率极低。经过 适当的处理，就能显著地提高纤维素和半纤维素对酶作用的敏感性。预处理的作用主要 是改变天然纤维和半纤维的结构、降低纤维素和半纤维素的结晶度、脱去木质素、增加 酶与底物的接触面积，从而提高酶解效率 3 】。 磨碎稻壳是常用的预处理方法。磨碎能使颗粒变小，结晶度降低，而且所得到的粉 末具有较高的容积密度，有利于增加酶反应的底物浓度，提高酶的作用效率。 用氢氧化钠浸泡稻壳的主要作用可能是使纤维素和半纤维素分之间酯键皂化，促进 膨胀，是一种膨胀剂，有利于酶进入植物细胞壁的微细结构，消除木质素的障碍作用， 且不需要除去全部的木质素，主要是破坏纤维素和木质素之间的结合。郑成【33 】等在报道 植物纤维素的水解利用中叙述了预处理对纤维素的影响；刘家建【3 4 】等分别以酸、碱及蒸 汽爆碎预处理蔗渣，研究了预处理对纤维素降解的影响；鲁杰【35 】等用氢氧化钠对植物纤 维素进行预处理，对植物纤维素酶解特性进行了研究，并利用红外光谱对处理前后物料 组成变化进行了对比分析。 河南工业大学硕士学位论文 稻壳水 溜出液+ 粗糠醛卜糠醛 残液一醋酸钠 残渣干馏 醋酸冰醋酸 醋酸乙酯 图1 8 稻壳水解生成的化工原料 醋酸- - 冰醋 甲醇 丙酮 活性炭 二氧化硅 燃料 酸 粗甲醇。甲醇 粗糠醛- - 糠醛 酚油 白炭黑 硅胶 图1 9 稻壳千馏生成的化工原料 1 0 粗糠醛 轻质油 酚油 重油 柏油 篡 错酸醋 稻壳提取低聚糖的研究 本研究是以稻壳为原料经酶法提取纤维寡糖3 6 3 7 3 8 低聚木糖7 ，8 川1 2 1 3 川 。 即先将稻壳粉碎过筛，碱液预处理后离心分离，得到稻壳渣，干燥后备用。然后向稻壳 渣的水溶液中分别加入纤维素酶和木聚糖酶进行酶解，并且对酶解的工艺条件进行优 化，得到最佳的酶解条件。在最佳酶解条件下，分别加入纤维素酶和木聚糖酶进行酶解 反应。之后对酶解液进行除杂、浓缩。由于浓缩液中含有多种成分如单糖、二糖、三糖 等低聚糖。因此需对这两种浓缩液中的成分进行分离及鉴定。 加入纤维素酶进行酶解得到的酶解产物中可能含有葡萄糖、纤维二塘、纤维三糖等 纤维寡糖。加入木聚糖酶进行酶解得到的酶解产物中可能含有木糖、木二塘、木三糖等 低聚木糖。对于纤维寡糖、低聚木糖等低聚糖的分离有多种方法。 目前国内生产的功能性低聚糖中大多是经酶法转化得到。在生产中除目标产品外， 还含有大量的副产物，因此，功能性低聚糖的分离纯化是必不可少的。常见的分离方法 有柱色谱分离法、膜分离法、酶法、微生物发酵法及其他分离纯化方法p 9 1 。 柱色谱分离法是基于混合物中各组分于色谱柱的填料间结合强弱的差异，即各组分 在固定相( 填料) 与流动相间分配系数不同的性质而使混合物中难吸附与易吸附组分分 离的技术。其优点在于通过数百次连续循环操作，重复使用吸附剂，可以充分利用材料、 能量和时间。但此法初期设备投资高，操作复杂。迄今为止，只有以离子交换树脂为填 料的色谱柱成功用于糖类的工业化分离纯化 4 0 , 4 1 4 2 】。 膜分离法实质上是物质透过或被截留于膜的过程，近似于筛分过程，依据滤膜孔径 的大小而达到物质分离的目的1 4 3 1 。按分离粒子或分子大小可将膜分离法分为：反渗透、 透析、电渗析、纳膜过滤、微滤等5 种。其中超滤用于提取低聚糖已见报道，反渗透和 纳膜过滤有望于分离纯化功能性低聚糖。 酶法的原理是利用酶制剂将低聚糖混合物中的某一或某些组分专一性除去i 卅。例 如，用酶法制备低聚木糖中的木二糖或用酶法提取可德兰多糖。此法的优点是：设备投 资少，操作简单：其不足是酶价格较高，使得分离纯化成本提高。 微生物发酵法是利用多数功能性低聚糖的难发酵性，选择适当的微生物将非功能性 低聚糖成分发酵除去。我国已研制出兼具有糖化和发酵能力的酿酒酵母以及用此法制取 大豆低聚糖。其投资小，成本相对廉价，因此开发功能性低聚糖的生物分离方法将大有 前途。 除以上几种分离方法外，还有超临界萃取法( 4 “、微波协助萃取法等。 本实验研究的目标产品纤维寡糖和低聚木糖都溶于水，亦可溶于一定浓度的乙醇溶 液。m j v a z q u e z 等人【4 6 】采用乙醇溶液对低聚木糖进行纯化，此法简单且成本较低，本 实验采用一定浓度的乙醇溶液对纤维寡糖粗产品和低聚木糖粗产品进行纯化，结合膜分 河南工业大学硕士学 ! i ) ：论文 离法采用0 4 5 肛m 滤膜进行分离 4 7 , 4 8 1 。 功能性低聚糖的分析方法主要有物理法、化学法、色谱法和酶法。 物理法包括相对密度法、折光法和旋光法。此法只能使用于某些特定样品，如测定 糖液浓度、谷物中的淀粉含量等。 化学法是应用最广泛的常规分析法，它包括还原糖法、碘量法、缩合反应法等。食 品中还原糖、蔗糖和总糖的测定多采用化学法，但此法只能测定总糖和还原糖的含量， 不能确定出糖的种类及各种糖的含量。因此，化学法用于水解过程中间控制分析和最终 产品分析都不够理想【4 9 1 。 色谱法可以对样品中各种糖分进行分离和定量，常用的色谱法有：纸色谱法、薄层 色谱法、气相色谱法、液相色谱法、离子色谱法等。 纸色谱法是一种定性的分析手段，目前在生物化学，特别是在糖类的分析中广泛应 用。它是将低聚糖先水解成单糖组分再进行色谱分离，也可以不经水解进行分离。这种 方法设备简单，可分离不同类型的糖，但对于结构类似的糖分离不好，定量精度差，操 作时间长。 薄层色谱法又称薄层层析法，是在纸色谱和柱色谱的基础上发展起来的一种色谱分 离方法，多用于定性检验，薄层层析有以下优点 5 0 , 5 1 ： 展开时间短，对混合物分离迅速，一般仅需1 5 m i n 6 0 m i n 。 分离能力强，斑点集中。 需要样品量极少。 设备简单，操作方便。 显色方便，可以直接喷洒腐蚀性显色剂。 温度和饱和度对薄层色谱影响较小。 气相色谱法的原理是将样品经正己烷脱脂，用8 0 乙醇提取低聚糖，提取液浓缩至 干后用三甲氯硅烷处理，变为挥发性六甲基硅烷衍生物，然后进行气相色谱分析【5 2 。由 于使用合适的检测器，有较高的灵敏度，但因糖的挥发性差，分析时需先将糖制成易挥 发的衍生物，该过程较费时，衍生也难达到定量，另外衍生后一些糖的分离也存在问题， 所以给正确定量带来了一定困难。 气相色谱法虽然具有分离性能好，灵敏度高，分析速度快，操作方便等优点，但是 受技术条件的限制，沸点太高的物质或热稳定性差的物质都难于应用气相色谱法，而高 效液相色谱法要求试样能制成溶液，而不需要汽化，因此，不受试样挥发性的限制。对 于高沸点、热稳定性差、相对分子量大的有机物原则上都可以进行分离分析。此法具有 快速、方便、分辨率高、分离效果好、重现性好和不破坏样品等优点。目前广泛用于低 稻壳提取低聚糖的研究 聚糖的分析。对于不同的低聚糖需要特定的柱子及检测器，成本较高。 离子色谱法是一种新型的色谱分析方法，采用高性能阴离子交换柱，配合脉冲安培 检测器对糖类进行分析。具有灵敏度高，选择性好，样品用量少和易实验自动化等优点， 但分析时间长。 酶法测定糖类也有一定的应用，如用葡萄糖氢化酶测定葡萄糖等，但酶有专一性， 仅限于特定的糖且操作复杂费时。 除上述几种分析方法外，低聚糖的测定还有荧光分析法5 3 l ，生物传感法等。 由于在分离过程中采用乙醇溶液提纯，对于不同的乙醇浓度提纯产品，需要分析提 纯后的产品组分及效果，以确定乙醇浓度的大小，鉴于上述分析方法的优缺点，本研究 中选用薄层层析法分别对纤维寡糖产品和低聚木糖产品进行分析，并结合质谱法5 4 1 对产 品组分进行定性研究。 主要研究内容如下。 ( 1 ) 分析稻壳的化学组成。 ( 2 ) 测定纤维素酶和木聚糖酶的酶活。 ( 3 ) 稻壳预处理条件的优化，包括碱液浓度、处理时间、温度、固液比。 ( 4 ) 优化从稻壳中提取低聚糖的工艺参数。 ( 5 ) 提纯、浓缩酶解产物。 ( 6 ) 用乙醇溶液分离酶解产物，并作薄层层析分离。 ( 7 ) 作质谱对乙醇分离物进行鉴定。 ( 8 ) 作s e m 实验，分析稻壳渣的结构的变化。 实验方案如下： 稻壳一粉碎一过筛一碱处理一离心分离一稻壳渣一酶解一提纯一浓缩一t c l 分析一 质谱分析 河南工业大学硕士学位论文 第二章材料与方法 2 1 实验材料、试剂与仪器 2 1 1 主要实验材料与试剂 稻壳 纤维素酶 半纤维素酶 x y l a n ( 木聚糖1s i g m ar t 3 ，5 二硝基甲苯化学纯c p 木糖生化试剂b r 地衣二酚化学纯 w h a t m a n 滤纸1 号 乙醇、氢氧化钠、碘化钾、3 0 过氧化氢、 苯酚、硫酸、磷酸、硝酸、草酸 乙酸钠 硝酸钙 氯化钡 磷酸二氨钠 重铬酸钾 酒石酸钾钠 葡萄糖 无水碳酸钠 以上试剂均为分析纯 2 1 2 主要实验仪器 t d a 温度控制仪 b s 2 l o s 型电子天平 u v - 2 0 0 0 型分光光度计 j f s o 一10 0 粉碎机 1 0 1 c 1 电热鼓风干燥箱 数字酸度计p h s 一2 5 b 型 旋转蒸发器r e 5 2 9 9 1 4 郑州方欣米业公司提供 无锡酶制剂厂 诺维信公司 北京欣经科生物技术有限公司 国药集团化学试剂有限公司 北京奥博星生物技术责任有限公司 中国湖州市菱湖振兴助剂厂 北京经科宏达生物公司 洛阳市化学试剂厂 上海华彭实业有限公司 天津市双船化学试剂厂 天津市登峰化学试剂厂 天津市科密欧化学试剂开发中心 北京市红星化工厂 中国宿州化学试剂厂 天津市科密欧化学试剂开发中心 北京化工厂 北京光明医疗器械厂 北京赛多利斯仪器系统有限公司 尤尼柯( 上海) 仪器有限公司 上海市嘉定粮油检测控制仪器厂 上海市实验仪器总厂 上海大普仪器有限公司 上海亚荣生化仪器厂 稻壳提取低聚糖的研究 s h z 一3 型循环水真空泵巩义市英峪予仪器厂 8 0 2 型离心沉淀机江苏姜堰市天力医疗仪器有限公司 j j 一1 精密增力电动搅拌器金坛市科兴仪器厂 t g l 1 6 g 离心机湖南星科科学仪器有限公司 b r u k e r e s q u i r e 3 0 0 0 0 0 1 4 2l c m c 液质联用 s b c 一2 试样表面处理机中国科学院科学仪工厂 a m r a ym o d e l10 0 0 bs ca n n i n ge l e c t r o nm i c r o s c o p e 中国科学院科学仪工厂 s h a c 水浴恒温振荡器金坛市华峰仪器有限公司 0 4 5 “m 微孔滤膜上海市新亚净化器件厂 2 2 主要实验方法 2 2 1 稻壳中基本成分的测定 22 1 1 水分的测定 按g b 5 0 0 9 3 - - 2 0 0 3 法进行。 2 2 1 2 纤维素的测定 在纤维素含量的测定方法中，常用的有浓酸水解定糖法、硝酸乙醇法、氯化法等。 王玉万等“”用中性洗涤剂与2 m o l l 盐酸水解法和地衣酚比色定糖法相结合，测定了甘 蔗渣中的纤维素、半纤维素、木质素含量。薛惠琴等人“”在王玉万的方法基础上，用浓 酸水解法测定稻草秸秆中的纤维素含量。p b h a m ai y e r 等“7 埽0 用红外光谱的差异确定纤 维中纤维素成分含量，但此方法对谱图的分析较为繁琐。在前人工作基础上，笔者对稻 壳纤维素含量的测定方法加以改进，用7 2 浓硫酸水解法“。具体方案如下： 将稻壳粉碎后过3 0 目筛，称取o 0 5 o 1 9 稻壳置于试管中，加入5 m l 醋酸和硝酸 混合液，盖上球形玻盖，置沸水浴中加热2 5 m i n ，并不断搅拌，取出冷却后离心，弃去 上清液，沉淀用蒸馏水冲洗三次，向沉淀中加入1 0 m l l 0 硫酸和1 0 m l 0 1 m o l l 的重 铬酸钾溶液，摇匀，浸入沸水浴中1 0 m i n ，取出后倒入三角瓶中，用适量蒸馏水冲洗试 管三次，一起并入三角瓶中。溶液冷却后加5 m l 2 0 k i 和l m l o 5 淀粉溶液，用o 2 m o l l 硫代硫酸钠滴定，另外单独滴定入加入l o m l l o 硫酸的0 1 m o l l 的重铬酸钾 溶液1 0 m l 作为空白样。 纤维素含量按下式计算： x = k ( a _ b ) n 2 4 ) 式中：2 4 一l m o l c 6 h l 0 0 5 相当于硫代硫酸钠的当量数： 河南工业大学硕士学位论文 k 一硫代硫酸钠浓度( m o l l ) ； a 一空白滴定所耗硫代硫酸钠体积( m l ) ； b 一样品溶液所耗硫代硫酸钠体积( m l ) ； n 一稻壳重量( g ) 。 2 213 半纤维素含量的测定 半纤维素的主要成分是戊聚糖。戊聚糖含量的测定方法很多，如气相色谱法、地衣 酚一盐酸法、间苯三酚一冰醋酸法，以及d u f f a u 蒸馏法等饵“6 “16 “。 本实验采用2m o l l 盐酸水解法测定稻壳中半纤维素含量，并结合d n s 法“。“1 测定 还原糖含量。具体作法是：取o 1 9 o 2 9 稻壳于烧杯中，加入l o m l 8 0 硝酸钙，置电炉 上加热，j 、火煮沸5 m i n ，冷却后离心，将沉淀用热水冲洗3 次，。然后向沉淀中加 1 0 m l 2 m o l l 的盐酸，盖上玻盖，混匀，置沸水浴中，不时搅拌下沸腾4 5 m i n ，冷却后 离一1 1 , ，将上清液移入1 0 0 m l 容量瓶中，将沉淀冲洗三次，洗涤液并入容量瓶中。向容 量瓶中加1 滴酚酞，用氢氧化钠中和至显玫瑰色，稀释至刻度，随后将其过滤至烧杯中， 弃去最初滤出的几滴滤液。然后用d n s 法测定溶液中的还原糖，即取2 m l 滤液于试管 中加入1 5 m l d n s 试剂，于沸水浴中加热5 m i n ，冷却，在5 4 0 n m 波长下测定吸光度，并 对照葡萄糖标准曲线”“进行分析。 22 1 4 戊糖和多缩戊糖的测定 采用地衣二酚法的双波长吸光度差值法( 5 8 0 r i m ，6 7 0 n m ) “测定戊糖和多缩戊糖 ”“”1 。即从测定半纤维素所剩的溶液中取5 m l 移入5 0 m l 容量瓶中，用盐酸中和至中性， 定容至刻度，混匀。然后取溶液l m l 于试管中，加入4 m l 浓度为2 m g m l 的地衣二酚 试剂，沸水浴中加热1 5 m i n ，冷却，在5 8 0 n m 和6 7 0 n m 下测定吸光度。并对照木糖标 准曲线。进行分析。 2 2 1 5 木质素的测定 用浓硫酸法”1 测