（食品科学专业论文）酵母固定化及其在啤酒发酵中的应用.pdf

摘要 固定化细胞技术是二十世纪六十年代发展起来的一种新型生物技术。所谓细 胞固定化技术是指利用化学或物理手段将游离的微生物细胞定位于限定的空间 区域，并使其保持活性和可反复使用的一种新型生物技术。 文章制备三种固定化载体：壳聚糖海藻酸钠胶珠、壳聚糖聚乙烯醇水凝胶 和壳聚糖一甲基丙烯酸水凝胶，并研究了这些载体的性能，将载体包埋啤酒酵母 运用于啤酒发酵，并用气相色谱质谱联用仪测定啤酒中风味物质，找出适合啤 酒发酵的固定化载体。 在壳聚糖- 海藻酸钠胶珠制备过程中，首先考察海藻酸钠浓度、壳聚糖浓度、 固化时间、覆膜时间对胶珠硬度的影响，得出壳聚糖海藻酸钠胶珠的优化工艺 条件为：当海藻酸钠浓度为3 、固化时间为2 h 、壳聚糖浓度为o 5 和覆膜时 间为3 0 m i n 时胶珠硬度最大。其次研究了载体耐浸泡性和固定化条件，结果表明 包埋0 4 m l 菌液有利于啤酒发酵以及壳聚糖海藻酸钠胶珠能进行连续发酵。 在壳聚糖- 聚乙烯醇水凝胶制备过程中，首先考察壳聚糖，聚乙烯醇比例、冰 乙酸用量、戊二醛浓度、甲醛浓度对水凝胶硬度的影响，得出壳聚糖聚乙烯醇 水凝胶的优化工艺条件为：当聚乙烯醇与壳聚糖质量为6 、冰乙酸用量6 m l 、戊 二醛浓度为4 和甲醛浓度为5 时水凝胶硬度最大；其次通过对载体的红外光 谱及电镜扫描图、固定化啤酒酵母条件以及固定化啤酒酵母的生长动力学曲线的 研究，得出该载体具有良好的耐浸泡性和较好的生物相容性。 在壳聚糖- 甲基丙烯酸水凝胶制备过程中，首先考察甲基丙烯酸用量、硝酸 铈铵用量、戊二醛用量、水浴温度对水凝胶硬度的影响，得出壳聚糖甲基丙烯 酸水凝胶的优化工艺条件为：当3 0 甲基丙烯酸8 m l 、0 1 6 硝酸铈铵0 2 m l ， 水浴温度为3 5 4 c 和2 戊二醛2 m l 时水凝胶硬度最大；其次通过对载体的红外 光谱及电镜扫描图、固定化啤酒酵母条件以及固定化啤酒酵母的生长动力学曲线 的研究，得出该载体具有良好的耐浸泡性和固定化酵母降糖速度较游离酵母慢。 将三种固定化载体发酵啤酒后进行风味物质的测定，结果显示壳聚糖海藻 酸钠胶珠在啤酒发酵方面较其它两种载体占优势。 关键词：啤酒酵母固定化啤酒发酵壳聚糖海藻酸钠聚乙烯醇甲基丙烯酸 a b s t r a c t a b s t r a c t i m m o b i l i z e dc e l lt e c h n o l o g yi san e wb i o t e c l m o l o g yt h a tf i x e df r e ec e l li n t o l i m i t e df i e l dw i t hc h e m i s t r yo rp h y s i c a lm e t h o di no r d e rt ok e e pt h ea c t i v i t yo fc e l l a n da l l o wi t 黜b eu s e dr e p e a t e d l y t h i sp a p e rm a i n l yd i s c u s s e st h es y n t h e s i sm e t h o do fc h i t o s a n - a l g i n a t es o d i u m b y d i o g e l , c h i t o s a n - p o l y v i n y l a l c o h o l h y d r o g e l a n dc h i t o s a n - m e t h y l a c r y l i ca c i d h y d r o g e l i no r d e r t of r e do u tt h es u i t a b l ei m m o b i l i z e dc a r r i e rf o rb e e rp r o d u c t i o n , t h e c h a r a c t e r i s t i co ft h e s ec a r r i e r s 、e m b e d i n gs a e c h a r o m y c e sc e r e v i s i a lt ob r e w i n gb e e r a n dd e t e r m i n i n gf l a v o rs u b s t a n c eo fb e e rb yg a sc h r o m a t o g r a p h m a s ss p e c t r o m e t e r a t es t u d i e d t h i sp a p e ra l s od i s c u s s e st h ee f f e c t so fa l g i n a t es o d i u mc o n c e n t r a t i o n , c h i t o s a n c o n c e n t r a t i o n , m m a o b i l i z e dt i m e ，m u l c h i n gf i l mt i m eo nh a r d n e s so f c h i t o s a n - a l g i n a t e s o d i u m t h er e s u l ts h o w st h a tt h e o p t i m i z a t i o n t e c h n i c a lc o n d i t i o n so f c h i t o 鼢n - a l g i i l a t cs o d i u mh y d r o g e l ：a l g i n a t es o d i u mc o n c e n t r a t i o n3 ，i m m o b i l i z e d t i m e2 h , c h i t o s a nc o n c e n t r a t i o no 5 m u l c h i n gf i l mt i m e3 0 m i n t h et o l e r a n c e i m m e r s i o na n di m m o b i l i z e dc o n d i t i o n so fc a l t i e ra l es t u d i e d t h ed a t as u g g e s t st h a t e m b e d i n g0 4 m ly e a s ts u s p e n d s i o n s i s a d v a n t a g e o u st ob r e w i n gb e e r a n d c h i t o s a n - a l g i u a t es o d i u m c a l lt a k ec o n t i n u sf e r m e n t a t i o n t h es t u d yo ft h ee f f e c t so fr a t i oo fc l l i t o s a na n dp o l y v i u y la l c o h o l , a m o u n to f a c e t i ca c i d ，g l u t a r a l d e h y d ec o n c e n t r a t i o n , f o r m a l d e h y d ec o n c e n t r a t i o no nh a r d n e s so f d l i t o 鼢f l - p o l y v i i l y l a l c o h o li l l n m i a t e dt h eo p t i m i z a t i o nt e c h n i c a lc o n d i t i o n so f c h i t o s a n - p o l y v i n y la l c o h o lh y d r o g e l ：r a t i oo fc l i i 【o s a n a n dp o l y v i n y la l c o h o l6 ， a m o u n to fa c e t i ca c i d6 m l ，g l u t a r a l d e h y d ec o n c e n t r a t i o n 铴，f o r m a l d e h y d ec o n t e n t - r a t i o n5 t h ei n f r a r e ds p e c t r u m , s e m i m m o b i l i z e ds a c c h a r o m y c e se e r e v i s i a l c o n d i t i o n sa n dt h eg r 0 、 ，t hk i n e t i cc n r v eo fb e e ry e a s ti m p l yt h a ti m m o b i l i z e dc a r r i e r h a sg o o dt o l e r a n c ei m m e r s i o na n dw e l lb i o c o m p a t i b i l i t y t h eo p t i m i z a t i o ne x p e r i m e n ts h o w st h a tt h eo p t i m i z a t i o nt e c h n i c a lc o n d i t i o n s o fc h i t o s a n - m e t b y l a c r y l i ca c i dh y d r o g e l ：a m o u n to fm e t h y l a c r y l i ca c i d ( 3 0 ) 8 m l ， a m o u n to fa m m o n i u mc e r i cn i t r a t e ( 3 m m o l f l ) 0 2 m l ，a m o u n to fg l u t a r a l d e h y d e 至三竺銮兰三主翌圭兰竺兰銮 ( 2 ) 2 m l ，r e a c t i o nt e m p e r a t u r e3 5 1 2 t h ei n f r a r e ds p e c t r u m , s e li m m o b i l i z e d s a c c h a r o m y c e sc e r e v i s i a lc o n d i t i o n sa n dt h eg r o w t hk i n e t i cc u r v eo f b e e ry e a s ts h o w t h a ti m m o b i l i z e dc a r r i e rh a sg o o dt o l e r a n c ei m m e r s i o n , b u tv e l o c i t yo f f e r m e n t a t i o ni s s l o w e rt h a nf l e ey e a s t c o m p a r i n gt h e f l a v o rs u b s t a n c eo fb e e rm a d e b yt h r e ei m m o b i l i z e d s a c c h a r o m y c e sc e r e v i s i a lc a r r i e r , t h er e s u l ts h o w st h a tc h i t o s a n - a l g i n a t es o d i u mi s s u p e r i o ri nb e e rf e r m e n t a t i o i l g e y w o r d s ：s a c c h a r o m y c e sc e r e v i s i a l ，i m m o b i l i z a t i o n , b e e rf e r m e n t a t i o n , c h i t o s a n ( c s ) ，a l g i n a t e s o d i u m ( s a ) ，p o l y v i n y l a l c o h o l ( p v a ) ，n n e t b y l a c r y f i c a c i d ( m a a ) n 1 独创性声明 独创性声明 秉承学校严谨的学风和优良的科学道德，本人声明所里交的论文是我个人在 导师的指导下进行的研究工作以及取得的研究成果。尽我所知，除了文中特别加 以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，不 包含本人或其他用途使用过的成果。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡 献均已经在论文中做了明确的说明，并表示谢意。 本学位论文成果是本文在广东工业大学读书期间在导师的指导下取得的，论 文成果归广东工业大学所有。 申请学位论文与资料若有不实之处，本人承担一切相关责任，特此声明。 一：罗阂杰 论文储肄够受 6 8 第一章绪论 第一章绪论 1 1 固定化技术定义及特点 固定化技术就是利用化学的或物理的手段将游离的细胞定位于限定的空间 区域，并使之成为不悬浮于水仍保持生物活性、可反复利用的方法1 】1 2 l 。它包括 固定化酶技术、固定化细胞技术和固定化藻技术。固定化细胞技术是2 0 世纪7 0 年代从固定化酶技术发展起来的，由于此技术既不需要把酶从细胞中提取出来， 也不需要加以纯化，酶活力损失少，因此固定化细胞技术已超过固定化酶技术的 应用。 固定化微生物技术具有独特的优越性和巨大的潜力，引起了人们的普遍关注 并获得了广泛的研究，但要实用化还有许多问题亟待解决：( 1 ) 固定化载体类型 以及包埋方式的研究；( 2 ) 寻找高效、廉价、抗毒性强的微生物；( 3 ) 开发多种 生物共生的固定化载体；( 4 ) 开发具有良好流态的固定化反应器；( 5 ) 协同固定 化的研究1 4 1 。 1 2 固定化方法 目前经常采用的生物固定化方法主要有：吸附法、包埋法、交联法和共价结 合法【3 - 7 1 。 吸附法是将微生物细胞附着于固体载体上，微生物细胞与载体之间不起化学 反应，并且具有操作简单、固定化条件温和、细胞活性损失小、载体可以反复使 用等优点，但吸附法制得的固定化微生物易脱落。一般要求载体内部多孔、比表 面积大、传质性能良好、性质稳定、强度高、价格低廉等。常采用引入疏水和亲 水配位体后制成的载体衍生物来固定化微生物。 包埋法是将微生物封闭在天然高分子多糖类或合成高分子凝胶的网络中，从 而使微生物固定化。其特点是可以将固定化微生物制成各种形状( 球状、块状、 圆柱状、膜状、布状、管状等) ，但包埋法制得的固定化微生物对传质有一定的 影响【9 】。 交联法是指通过双功能试剂( 如戊二醛等) ，微生物细胞彼此交联，凝集成网 广东工业大学硕士学位论文 状结构，在实际中很少单独使用，大多数与吸附法和包埋法结合使用。 共价法是微生物细胞表面上的功能团和固相支持物表面的反应基团之间形 成化学共价键连接，从而形成固定化微生物。 图1 - 1 固定化方法 f i g i - 1m e t h o do f i m m o b i l i z a t i o n 使用较多的是包埋法和吸附法，各种固定化方法和载体都各有特点，见表1 1 所示。 表】1 各种同定化方法的比较 t a b 1 - lc o m p a r i s o no f i m m o b i l i z e dm e t h o d 微生物细胞的固定化方法以包埋法和吸附法最为常用。 1 3 固定化载体材料及其研究进展 理想的固定化细胞载体材料应具有对微生物无毒性、传质性能好、性质稳定、 寿命长、价格低廉等特性。就目的在固定化细胞技术中所使用的载体材料而苦， 主要分为三大类：有机高分子载体、无机载体和复合载体【8 l o 2 第一章绪论 1 3 1 有机高分子载体材料 有机高分子载体材料又分为天然高分子凝胶载体和合成有机高分子凝胶载 体。 1 3 1 ，1 天然高分子载体材料 此类载体材料一般对生物无毒性，传质性能好，但强度较低，在厌氧条件下 易被微生物分解，寿命短。常见的此类载体有琼脂、角叉莱胶、海藻酸钠等。在 这几种天然载体中，琼脂强度最差。天然角叉莱胶在分离出影响其强度的k _ 角叉 莱胶成分后，强度和稳定性有所提高，但价格较贵。相比之下，海藻酸钠具有价 格低廉、制备容易、传质性能好等优点，应用最为广泛。 1 3 1 2 合成有机高分子载体材料 合成高分子凝胶载体一般强度较大，但传质性能较差，在进行细胞固定时对 细胞活性有影响。常见的此类载体有聚丙烯酰铵( 简称a c a m ) 、聚乙烯醇( 简称 p v a ) 、光硬化树脂、聚丙烯酸凝胶等。 有机高分子载体材料在形成凝胶时可将微生物细胞包埋在凝胶内部从而达 到固定细胞的目的，在废水处理中得到较多的研究和应用。 几种常用固定化细胞有机载体材料的性能比较如表1 2 所示。 表1 - 2 几种固定化细胞有机载体材料的性能比较 t a b 1 - 2c h a r a c t e r i s t i cc o m p a r i s o no f s o m ei m m o b i l i z e dc e i lo r g a n i cm a t e r i a l s 广东工业大学硕士学位论文 1 3 2 无机载体材料 无机载体如多孔陶珠、红砖碎粒、砂粒、活性炭等，具有机械强度大、对微 生物无毒性、不易被微生物分解、耐酸碱、成本低、寿命长等特性，因而是一类 重要的载体材料。 1 3 3 复合载体材料 由于有机载体材料和无机载体材料各有优缺点，而两类材料在许多性能方面 互补，因此可将这两类载体材料结合，组成复合载体材料，以改进材料的性能。 1 3 。4 国内外固定化技术的研究进展 s h a n 等利用固定化的硝化细菌去除对虾养殖池中高浓度的氨氮，结果表明固 定化细胞能有效去除养殖池中的总氨氮，高达2 0 m g l 。 吴乾菁等利用聚丙烯酰胺固定化酵母菌细胞去除电镀废水中的c d ( i i ) ，固定化 细胞对c d ( i i ) 的去除率为9 8 9 ；采用未固定化细胞则去除3 7 6 。分别采用0 1 m h c i 和0 1 me d t a 解吸，c d 2 + 的回收率为8 8 5 和8 7 6 f 1 0 j 。 严国安利用褐藻酸钙包埋固定普通小球藻，对人工配置的含汞污水进行净化 试验，结果表明固定藻对汞的去除明显高于悬浮藻。固定化小球藻对汞的去除效 率中，藻体的去除作用占7 0 ，藻类代谢活动引起汞的挥发2 0 ，载体凝胶吸附 1 0 【1 1 1 。 郑迎迎等以甲壳素为原料，制备出壳聚糖载体，并对脲酶进行固定化，游离 脲酶活力不易保持，难于重复利用，不能长期贮存，使其应用受到很大的限制， 固定化脲酶与游离酶相比较，热稳定性有很大的提高，且具有良好的操作稳定性。 张东霞等利用固定化细胞技术生产l 苹果酸，产量高，反应时间短，得到的 产物不需要拆分，可反复使用，应用前景光明【1 2 】。 i n e s 等用海藻酸钙固定化c h l a m y d o m o n a sr e i n h a r d t i i ，与浮游生长的藻比较， 在较宽的p h 丰 i 温度范围内显示出较高的硝酸盐吸收能力和生长力【1 3 】。 杨国营等利用壳聚糖固定化纤维素酶，发现固定化酶的最适p h 值向酸性方 向偏移，与底物的亲和力增加，热稳定性很高。固定化可使原酶的理化性质得到 改善，在较大温度范围内稳定性好，更适于工业生产的需要f 1 4 】。 s o m m a r i v ac o r r a d o 提出了包理细胞的酒精发酵的动力学模型，以海绵为细 4 第一章绪论 胞载体。这一发酵动力学模型考虑了产物和基质的抑制，同时考虑了c 0 2 气泡形 成和培养液中游离细胞的影响。 a r a s a r a t n a m 将s a c c h a r o m y e e sc e r e v i s i a e 细胞包埋于1 海藻酸盐中，当流速为 5 0 r a l h 和葡萄糖浓度为5 0 9 l 时，酒精产率达到最大。研究还发现添加0 0 5 m 的 c a c h 可延长海藻酸钙包埋酵母细胞的寿命1 1 6 1 。 r u g g e rb e r n a r d o 研究酿酒酵母和海藻酸盐基质之间的作用，研究了影响代谢 活性的主要因素，考虑了一些参数( 葡萄糖、酒精、钙离子、菌浓、p h 、海藻酸 盐颗粒直径等) ，采用了模糊算法，分析了宏观参数及其相关性【1 5 i 。 1 4 固定化啤酒酵母技术 啤酒酵母是啤酒发酵的灵魂和命脉，啤酒质量的好坏与啤酒酵母菌的质量有 密切关系。但啤酒酵母和其他微生物一样，在长期的移接管和保藏中，易受外界 环境的影响而常常发生变异、混杂或衰老，造成菌种的退化，一些重要性能如发 酵力，凝聚力会发生变化，发酵性能下降，从而影响啤酒的生产和质量 1 6 - 1 8 1 。 评价酵母菌种优良与否，主要从以下几个方面考虑【1 7 1 ： ( 1 ) 形态学上的要求：细胞形态为圆形或卵圆形，优良菌株酵母短轴与长轴之比 为l ：( 1 1 1 - 1 1 3 ) ，细胞大小趋向于中小型体积为( 1 0 0 u m 3 1 6 0 u m 3 ) ，相同接种量， 细胞比表面积大，发酵速度快。 ( 2 ) 生理学要求：希望选择繁殖速度快的菌株，细胞倍增时间短，细胞密度增长 快，缩短接种后的停滞期，很快进入对数生长期。 ( 3 ) 发酵力的要求：主要指酵母对糖的发酵能力，希望酵母具有良好的合成麦芽 糖和麦芽三糖渗透酶的能力，使酵母能利用麦芽糖、麦芽三糖进行发酵，提高发 酵度。 ( 4 ) 凝聚性和沉淀能力：凝聚性太强的酵母一般发酵速度较慢，发酵度偏低，双 乙酰还原慢。要求酵母凝聚性适中，即能达到较高的发酵度，又沉淀坚实，发酵 完毕后能顺利从发酵液中分离。 ( 5 ) 双乙酰峰值和还原速度：g - 望双乙酰峰值低，还原速度快。 ( 6 ) 挥发性风味物质：要求酵母最终代谢产物赋予啤酒以良好的风味。 ( 7 ) 酵母对压力的耐受力：希望酵母对压力有较强的耐受力。 广东工业大学硕士学位论文 ( 8 ) 酵母的稳定性：希望酵母能抗变异，连续发酵1 0 代以上发酵速度、发酵度、 双乙酰含量及酒的风格无显著变化。 ( 9 ) 主酵液和成品啤酒的风味品尝：不能有特殊的异香、异味。 ( 1 0 ) 啤酒泡沫特性：希望泡沫洁白细腻。 随着啤酒工业的不断发展，人们开始研究用固定化酵母进行发酵，固定化细 胞技术应用于酿酒主要是因为固定化酵母细胞浓度高，发酵速度快，可缩短发酵 周期，减少操作费用【1 9 】f 2 0 1 。 1 5 固定化微生物技术的应用 1 5 1 废水处理中的应用 固定化微生物技术用于废水处理，具有一系列优点。如可在反应器内保持 高生物浓度、反应启动快、处理效率高、操作稳定、产泥量少、固液分离简单等 2 5 1 。同时我们也应该看到，将固定化微生物技术从实验室走向废水处理的实际应 用上还是有一定难度的，许多问题有待研究，比如：实际废水是一个很复杂的体 系，单一菌种可能无法应对；固定化载体的成本和使用寿命目前都不够经济：需 要开发高效曝气和固定化设备，使其克服包埋载体对基质( 特别是氧气) 和产物存 在的扩散阻力m 2 6 1 。 1 5 2 酿酒工业中的应用 国外用固定化酵母实验始于1 8 9 2 年，第一次将固定化细胞用于工业酿造发 酵系统是从1 9 7 0 年开始的【1 7 】。上海工业微生物所和上海华光啤酒厂8 0 年代做了 很多研究，结果表明啤酒的生产发酵时间在4 8 h 以内，后置发酵时间在7 d 左右， 均比传统工艺缩短一半时间，该固定化酵母细胞可反复使用3 0 d 以上，酿成的啤 酒经装瓶，杀菌，品尝和分析，口味正常，泡沫性良好，各项理化指标均符合标 准；德国在固定化酵母啤酒生产中，使用的固定化载体材料是已获专利的具有特 殊结构的玻璃纤维；日本则使用的是多孔陶珠伫2 j 】。 1 5 3 生物传感器 生物传感器是利用生物高分子物质来检测特殊化合物的一种电子元件阱】。 近来，又发展起利用微生物细胞、动植物细胞甚至组织制成的生物传感器。活细 6 第一章绪论 胞的利用，为生物传感器的再生提供了可能。这类生物传感器特别适用于检测发 酵过程中的各种参数。在日本，已开始用微生物传感器测定醋酸、酒精、谷氨酸、 氨和b o d 。新一代生物传感器有可能经集成化技术制成“生物芯片”，进而制造 生物电子计算机，构成极有发展前途的研究领域一生物分子电子学。 1 5 4 其它领域 在食品方面，利用含葡萄糖异构酶的固定化细胞生产高果糖浆，是固定化细 胞在工业应用方面规模最大、产值最高的一项。除生产糖类物质外，固定化细胞 还可以生产风味物质，供添加到于酪中，也可以用于生产干酪所必须的一道工序 牛奶的预发酵。 在生物制药方面，已经可以利用固定化动物细胞生产单克隆抗体、干扰素、 白细胞间质素、组织血纤维蛋白溶酶激活剂( 1 r f a ) 、胰岛素和生长因子等。 在医学方面，固定化细胞主要用予治疗疾病和诊断疾病。用固定化细胞制成 的生物传感器测定各种化合物，如血糖、尿素、尿酸、胆固醇、肌酸等【2 】。 1 6 课题研究意义 本课题旨在通过固定化载体结构与性能之问的关系，优化合成固定化载体的 条件，通过性能的比较得出适合微生物发酵的固定化载体，将其运用并研究固定 化载体内微生物的生长情况、营养物质的传递以及代谢产物的排出等。 壳聚糖( c h i t o s a n ) 是自然界含量仅次于纤维素的一种天然多糖，广泛存在于 虾、蟹等的壳中f 2 刀。它来源丰富，价格低廉，机械性能和生物相容性好，特别是 它的侧链结构中含有大量的伯氨基，能够在水溶液中与海藻酸钠等阴离子聚电解 质发生络合反应形成聚电解质络合物，因此它是一种良好的成膜材料 4 1 。本课题 提出对壳聚糖进行改性，优化条件合成具有一定的溶胀性，机械强度，和生物相 容性好的固定化载体，推广其应用并研究载体内微生物的生长情况、营养物质的 传递以及代谢产物的排出。因此本研究对高分子功能材料，生物技术等学科都将 具有一定的学术意义。 广东工业大学硕士学位论文 1 7 课题研究目标、内容、可行性分析 1 7 1 研究目标 ( 1 ) 以壳聚糖为主要原料，制备三种固定化载体材料，用于包埋啤酒酵母发酵生 产啤酒，制备出具有一定的溶胀性、机械硬度和生物相容性好的固定化载体； ( 2 ) 制各过程中运用正交分析法优化实验条件( 如壳聚糖浓度、戊二醛浓度、水浴 时间等因素) ，从而确立最优的制备方法及其工艺条件。 ( 3 ) 比较由三种固定化载体制备的啤酒，根据啤酒中风味物质含量的不同，找出 适合啤酒发酵的固定化载体材料。 1 7 2 研究内容 ( 1 ) 壳聚糖一海藻酸钠胶珠的制备及性能研究 以海藻酸钠为原料，制各海藻酸钙胶珠，然后与壳聚糖溶液进行成膜反应。 研究反应时间、反应温度、壳聚糖溶液等对胶珠性能的影响，并测试其机械硬度， 用扫描电镜观察胶珠的形貌。最后将其包埋啤酒酵母应用，对其生物相容性、营 养物质传递进行探讨。 ( 2 ) 壳聚糖一聚乙烯醇水凝胶固定化载体 对壳聚糖进行改性，优化改良合成载体，研究聚乙烯醇浓度、甲醛浓度、戊 二醛浓度、水浴时间对凝胶性能的影响，并对固定化载体的发酵批次、结构、生 物相容性、物质传递等进行探讨。 ( 3 ) 壳聚糖一甲基丙烯酸水凝胶固定化载体 对壳聚糖进行改性，优化改良合成载体，研究甲基丙烯酸浓度、戊二醛浓度、 水浴时间对凝胶性能的影响，测试凝胶硬度，溶胀度等，并对固定化载体的性能 及生物相容性、物质传递等进行探讨。 1 7 3 可行性分析 壳聚糖具有来源丰富、价格低廉、机械性能好、化学性质稳定、耐热性好等 特点，尤其是分子中含有氨基，既易于与酶共价结合，又可络合金属离子，使微 生物免受金属离子的抑制，同时又易通过接枝而改性，是种急待开发利用的固 定化微生物的良好载体。根据科学的理论分析、初期探索及实验室仪器设备条件。 本方案是可行的。 第一章绪论 1 8 论文研究的创新点 壳聚糖作为固定化载体己应用于固定化酶方面，在固定化微生物方面的研究 较少，本课题以壳聚糖为主要原料，制备出性能好、强度高的固定化载体，系统 研究固定化载体的性能及包埋啤酒酵母的应用条件。 9 广东工业大学硕士学位论文 第二章壳聚糖一海藻酸钠胶珠的制备及固定化啤酒酵 母的研究 2 1 前言 海藻酸钠的分子式为( c 8 h 8 0 s ) n ，聚合度n 可以从8 0 至1 j 7 5 0 ，分子量1 4 0 0 0 - 1 3 2 0 0 0 。其中海藻酸系天然有机高分子电介质，其一价盐( n 矿、c 、n h 4 + ) 为 水溶性盐，而二价以上的盐( c a 、a 1 3 + ) 为水不溶性盐，因此可形成耐热的凝胶 或被膜，这是海藻酸钠经c a c h 溶液钙化后形成固定化凝胶的内在机理1 2 8 1 1 2 9 。同 时，海藻酸钠易与蛋白质、明胶等多种物质共溶，并可与细胞混合形成均匀的悬 浮液，使凝胶具有微生物分布的均匀性。除此之外，海藻酸钠还具有无毒、不易 被大多数微生物降解等良好特性。 壳聚糖具有良好的生物相容性、无毒性、无刺激性，其分子链上含有大量的 伯氨基。为天然的聚阳离子化合物 3 ”3 1 。壳聚糖的化学结构式如图2 1 所示。 一o 图2 i 壳聚糖的化学结构式 f i g 2 - 1c h e m i c a ls t r u c t u r eo f c h i t o s a n 2 2 实验部分 2 2 1 试剂及仪器 海藻酸钠( s a ) 化学纯 氯化钙分析纯 壳聚糖( c s l 生化试剂 醋酸分析纯 麦芽汁1 2 0 b x 啤酒酵母 j s m 5 6 0 0 l v 扫猫电镜 成都市联合化工试剂研究所 汕头市光华化学厂 上海伯奥生物科技有限公司 天津市博迪化工有限公司 珠江啤酒厂 广州微生物研究所 上海上光实业有限公司生产 第二章壳聚糖海藻酸钠胶珠的制备及固定化啤酒酵母的研究 唧s 型电热恒温水浴锅 m j 3 1 0 2 型电子天平 q t s - 2 5t e x t u r ea n a l y s e r y x 2 8 0 手提式压力杀菌器 s w - c j - 2 f 洁净工作台 b c d - 2 5 7 s l 冰箱 2 2 2 实验步骤 上海博迅实业有限公司医疗设备厂 余姚纪铭称重校验设备有限公司 c n s r 虹u i e l l 江阴滨江医疗设备厂 苏州安泰空气技术有限公司 青岛海尔股份有限公司 壳聚糖海藻酸钠胶珠的制备：将2 0 m l2 o 海藻酸钠溶液倒入注射器中， 以恒定的速度滴入4 氯化钙溶液中，固化2 l l 后，胶珠捞出冲洗干净，然后浸泡 于0 5 壳聚糖溶液三维摇床上振摇1 0 m i n ，完成与壳聚糖的成膜反应。水洗除去 未反应的壳聚糖，将胶珠保存于水中。 固定化壳聚糖海藻酸钠啤酒酵母的制备：向2 0 m l 3 o 海藻酸钠溶液中加 入3 6 x1 0 8 m l 的啤酒酵母菌液l m l ，搅拌均匀后倒入注射器中，以恒定的速度 滴入4 氯化钙溶液中，固化2 h 后，胶珠捞出冲洗干净，然后浸泡于o 5 壳聚 糖溶液三维摇床上振摇1 0 m i n ，完成与壳聚糖的成膜反应，用生理盐水冲洗三次 后放置冰箱备用。 2 2 3 啤酒发酵流程 广东 ：业大学硕士学位论文 2 2 。4 菌悬液的制备 在无菌操作台上，称取约1 o g 啤酒酵母溶于5 0 0 r i d 灭过菌且冷却至室温的 o 9 生理盐水中，用血球计数法测定酵母细胞浓度。菌液浓度为3 6 x1 0 s m l 。 按下列公式计算每毫升菌液中所含的酵母菌细胞数。 酵母菌细胞数m l = ( 1 0 0 个小格内酵母细胞数1 0 0 ) x 4 0 0 x1 0 0 0 0 x 菌液稀 释倍数 2 2 5 外观发酵度的测定 控制啤酒的发酵度，能改善和提高啤酒的口感、风味的稳定性，从而提高产 品质量。一般发酵度越高，高级醇含量也越高；发酵越强烈、发酵副产物的含量 也越高。用阿贝折光仪测定发酵前后麦芽汁的糖度，并按下式计算其外观发酵度。 外观发酵度c ，= 垦塑重茎笔荔篆翥鬈磊等t 。 2 2 6 胶珠硬度的测定 将q t s 2 5t e x t u r ea n a l y s e r 上直径为1 0 衄r a 的圆柱形探头置于凝胶表面，以 1 5 c m s 的速度下降，当圆柱形探头下降6 m m 时测得凝胶硬度，单位为克【3 4 】。 2 2 7 扫描电镜( s e m ) 将壳聚糖海藻酸钠干凝胶和固定化后的凝胶断面进行喷金处理后。用 j s m 5 6 0 0 l v 扫描电镜观察其横切面形貌。 2 3 实验结果及讨论 2 3 1 壳聚糖一海藻酸钠胶珠形成机理 海藻酸钠溶于水为胶体，成膜后强度和柔韧性较差，当与钙盐作用后，海藻 酸钠分子中钠离子与钙离子进行交换，生成海藻酸钙。由于c a 2 + 交联作用，分子 问相互作用力增强，使线性分子彼此相互连接形成空间网状结构，使体系的粘性 增强，海藻酸盐分子相互作用的结果形成海藻酸钙冻胶，再冻胶中水分子的流动 性受到抑制，在一定条件下形成不溶性的纤维丝和薄膜p 5 l 。 壳聚糖分子链上的伯氨基与海藻酸钠分子链上的羧基反应形成聚电解质络 合膜，反应式如下： 1 2 第二章壳聚糖海藻酸钠胶珠的制备及固定化啤酒酵母的研究 + 4 2 + + + 2 n a 十 壳聚糖是2 氨基葡萄糖通过1 3 1 ，4 糖苷键联接而成的高分子物质，分子中存 在大量的伯氨基，带正电荷，海藻酸钙是由1 3 1 , 4 结构的d 一型甘露糖醛酸的钠盐 ( m ) 和a - 1 , 4 结构的l 一型古罗糖醛酸( g ) 其聚而成，分子中存在大量的羧基，带 负电荷，当壳聚糖和海藻酸钙共存时，壳聚糖和海藻酸钙可以通过正负电荷吸引 形成聚电解质膜【3 射。 在钙化后的海藻酸钙凝胶微球中加入壳聚糖溶液，进行成膜反应，使海藻酸 钙凝胶微球的表面形成一层稳定的壳聚糖一海藻酸钠膜。其中海藻酸钙凝胶微球 与壳聚糖溶液的混合体积比为h 5 l ：1 0 。图2 2 描述了由海藻酸钠液滴制备海藻 酸钙凝胶微球，再经壳聚糖修饰的整个过程。 c c b c 珏i i 茹竣黼 c a 豫8 c ( ： 缱算 图2 2 壳聚糖海藻酸钠胶珠制备过程 f i g ，2 - 2p r e l r i n gp r o c e s so f c s - s ag e lb a l l 2 3 2 工艺条件对胶珠硬度的影响 2 3 2 1 海藻酸钠浓度对胶珠硬度的影响 在其它条件不变的情况下，即固化时间为2 h ，壳聚糖浓度为o 5 w t ，覆膜 时间为1 0 r a i n ，改变海藻酸钠浓度，结果见图2 3 。 从图2 3 可知，随着海藻酸钠浓度的增加，胶珠硬度逐渐增加。钠离子浓度 的增加使得可以和更多的钙离子交换，分子之问形成牢固的网状结构，导致胶珠 硬度增大。海藻酸钠的浓度一般不小于1 0 ，否则会因聚阴离子溶液的粘度太 低而在下滴过程中严重变形，最终使得凝胶的球形度很差。海藻酸钠的浓度也不 能大于3 ，否则无法从针筒中挤出成型。 广东工业大学硕士学位论文 6 0 0 5 0 0 芒 誉4 0 0 3 0 0 2 0 0 o0 5l1 522 533 5 海藻酸钠浓度( w t ) 图2 - 3 海藻酸钠浓度对胶珠硬度的影响 f i g 2 3e f f e c to f a l g i n a t es o d i u mc o n c e n t r a t i o no nh a r d n e s s 2 3 2 2 固化时间对胶珠硬度的影响 在其它条件不变的情况下，即海藻酸钠浓度为2 ，壳聚糖浓度为o 5 ，覆 膜时间为l o m i n ，改变固化时间，结果见图2 - 4 。 5 0 0 4 5 0 曲4 0 0 魁 髫3 5 0 3 0 0 2 5 0 0 图2 - 4 固化时间对胶珠硬度的影响 f i g 2 - 4e f f e c to f i m m o b i l i z e dt i m eo i lh a r d n e s s 从图2 - 4 可知，随着固化时间的增加，胶珠的硬度也随之增大。固化时间越 长，海藻酸钠与氯化钙的反应就越完全，胶珠内部的紧实度就越高，从而使凝胶 富有较大的硬度。 2 3 2 3 壳聚糖浓度对胶珠硬度的影响 在其它条件不变的情况下，即海藻酸钠浓度为2 ，固化时间为2 h ，覆膜时 间为l o m i n ，改变壳聚糖浓度，结果见图2 5 。 1 4 二5 一：肺问一。黼 一。 一 第二章壳聚梧海藻酸钠胶珠的制备及固定化啤酒酵母的研究 00 30 60 91 2 壳聚塘的质量百分数 图2 - 5 壳聚塘浓度对胶珠硬度的影响 f i g 2 - 5e f f e c to f c sc o n c e n t r a t i o no nh a r d n e s s 从图2 - 5 可知，胶珠的硬度随着壳聚糖浓度的增加而增大。壳聚糖浓度由0 3 0 5 时，胶珠硬度增加较快，壳聚糖浓度在o 5 1 o 时，胶珠硬度增加较为 缓慢。这是由于随着壳聚糖浓度的增大，胶珠外膜的厚度就越大，壳聚糖本身具 有一定的硬度，从而使得胶珠的硬度随着壳聚糖浓度增加而增大；但壳聚糖浓度 不能超过一定值，过高的浓度会阻止微生物的物质交换活动【3 9 】。 2 3 2 4 覆膜时间对胶珠硬度的影响 在其它条件不变的情况下，即海藻酸钠浓度为2 ，壳聚糖浓度为o 5 ，固 化时间为2 h ，改变覆膜时间，结果见图2 6 。 覆膜时同m i n 图2 - 6 覆膜时间对胶珠硬度的影响 f i g 2 6e f f e c to f m u l c h i n gf i l mo nh a r d n e s s 啪 啪 渤 姗 伽 趟雕 堪路 广东- 业大学硕士学位论文 从图2 - 6 可知，胶珠硬度随着覆膜时间的增加而缓慢增大。覆膜时间越长， 海藻酸钙与壳聚糖之间的正负电荷的吸附就越完全，同对，壳聚糖覆在胶珠表面 的厚度就越大，壳聚糖层赋予了胶珠硬度。但由于膜厚增加主要与壳聚糖浓度有 关，因此延长覆膜时间对胶珠硬度的增加影响不是太大。 2 3 3 优化制备工艺 选取海藻酸钠浓度( a ) 、在氯化钙溶液中的固定化时间( b ) 、壳聚糖浓 度( c ) 、覆膜时间( d ) 为因素，以胶珠硬度为指标，采用b ( 4 3 ) 正交设计 优化工艺条件，筛选出符合条件的最优条件。表2 1 、2 2 。 表2 i 正交试验因素与水平 tab21f r o n tt a b l eo f o r t h o g o n a ld e s i g n 因素海藻酸钠浓度，固化时问，h壳聚糖浓度冉覆膜时间r a i n 水平 ( a )( b )( c )( d ) 12l0 35 22 520 51 0 3 3 3i 03 0 表2 - 2 正交实验设计表 t a b 2 - 2t h ea r r a n g ea n dr e s u l to f o r t h o g o n a le x p e r i m e n t 从表2 2 可知四个因素的影响次序为：海藻酸钠浓度 壳聚糖浓度 覆膜时间 固化时间，海藻酸钠浓度对胶珠硬度影响最大，其次是壳聚糖浓度、覆膜时间， 最后是固化时问。最优工艺条件为a 3 8 2 c 2 d 3 ，即当海藻酸钠浓度为3 ，固化时 问为2 h ，壳聚糖浓度为o 5 ，覆膜时间为3 0 m i n 时，胶珠硬度达最大。 1 6 第二章壳聚糖海藻酸钠胶珠的制各及固定化啤酒酵母的研究 2 3 4 壳聚糖一海藻酸钠胶珠的性能研究 2 3 4 1 耐浸泡性研究 载体的选择要考虑以下几个原则：具有足够的机械、物理和化学稳定性；具 有惰性，不能干扰生物分子的功能；具备一定的容量；价廉易得。因此研究壳聚 糖海藻酸钠胶珠的耐浸泡性具有重要的意义【2 】。 将优化条件下制备的胶珠分别放置在三个盛有蒸馏水的烧杯中，观察浸泡一 个星期和浸泡三个月后胶珠的形态颜色变化。 图2 - 7 ( a ) 浸泡前图2 7 ( b ) 浸泡1 个星期图2 7 ( c ) 浸泡3 个月 f i g 2 - 7 ( a ) b e f o r ei m m e r s i o nf i g 2 - 7 ( b ) i m m e r s e1 w e e kf i g 2 - 7 ( ”i m m e r s e3m o n t h s 浸泡一个星期后胶珠比浸泡前形状稍微变大，部分胶珠上浮，这可能是有空 气混入胶珠中而导致其上浮。浸泡三个月后胶珠无明显变大，颜色变得较透明， 并无出现破裂现象。表明壳聚糖海藻酸钠胶珠具有良好的耐浸泡性，有利于 胶珠进行连续发酵生产。 2 3 4 2 耐热性研究 将优化条件下制备的胶珠分别置于2 0 、3 0 、4 0 、5 0 、6 0 、7 0 、 8 0 ( 2 水浴锅中恒温o 5 h ，观察不同温度对胶珠硬度的影响，结果如图2 - 8 所示。 从2 - 8 可知，8 0 ( 2 时胶珠的硬度达最大。2 0 7 0 胶珠硬度无显著差别。 温度过高容易造成胶珠表面水分挥发，胶珠变千且变形，导致硬度变大，不利于 胶珠作为固定化载体使用