（食品科学专业论文）高产ε聚赖氨酸白色链霉菌的诱变育种与发酵优化.pdf

摘要 摘要 聚赖氨酸( p o l y l y s i n e ，p l ) 是8 0 年代由日本首先发现由微生物发酵产生的一种 新型食品抑菌剂，其化学组成是由人体必需氨基酸l 赖氨酸构成的多肽，它经消化后又 可变成单一的赖氨酸而成为人体营养的强化剂，已作为g r a s 物质通过了美国f d a 认 证，c a s 登记号为2 8 2 1 1 0 4 3 ，标志着- 聚赖氨酸己被国际标准所认可。故聚赖氨酸作 为食品防腐剂，具有无毒副作用，安全性高的特点。 本课题对实验室保存的一株具有聚赖氨酸生产能力菌株白色链霉菌s t r e p t o m y c e s a l b u l u ss a 进行研究，通过对其分泌产物与带电染料的静电作用及d r a g e n d o r f f 试剂反应 和产物的氨基酸组成分析可以得出，聚赖氨酸带正电荷，是一种生物碱物质并且为l 赖氨酸的聚合物。通过以上实验，为筛选和验证具有聚赖氨酸生产能力的菌株提供了 简便而快捷的方法。 对白色链霉菌s t r e p t o m y c e sa l b u l u ss a 进行诱变选育，首先研究了紫外线复合氯化 锂诱变中不同的照射剂量对细胞存活率的影响得到了致死率曲线，根据遗传育种的经 验，正向突变较多发生在偏低剂量中，确定了以2 5s 作为最适紫外诱变剂量。初筛采用 打孔琼脂柱抑菌圈法可以大批量并快速选出抑菌效果显著的菌株，经过复筛得到一株产 量为1 3 3g l 的突变株u l 2 7 ，产量提高了2 7 9 。 以紫外诱变获得的突变株u l 2 7 作为出发菌株，进行亚硝酸诱变筛选a e c 抗性菌 株，根据诱变剂量对细胞存活率的影响得到了致死率曲线，确定2 0r a i n 的处理时间作 为最适亚硝酸诱变剂量。通过复筛得到高产菌株u n 2 7 1 ，- 聚赖氨酸产量为1 6 4g 几， 提高了5 7 7 。 对诱变得到的菌株u n 2 7 1 进行发酵稳定性能研究，经过5 次传代实验结果表明突 变株性状稳定，并对白色链霉菌u n 2 7 1 的培养特性及生理生化特性进行了观察。 对不同碳源和氮源对聚赖氨酸产量的影响进行了研究，得到可溶性淀粉是最佳碳 源，而州4 ) 2 s 0 4 和酵母提取物的组合是最佳氮源。在碳源、氮源优化的基础上，进行 摇瓶发酵培养基的优化，对培养基八种成分可溶性淀粉、硫酸铵、酵母提取物、k 2 h p 0 4 、 k h 2 p 0 4 、m g s 0 4 7 i - 1 2 0 、z n s 0 4 7 h 2 0 、f e s 0 4 7 h 2 0 进行了p l a c k e t t - b u r m a n 筛选试验， 得到可溶性淀粉、硫酸铵和酵母提取物为显著影响因素，对这三因子进行三水平的 b o x b e h n k e n 试验，通过r s m 分析得到优化模型，优化后的培养基组成为：可溶性淀 粉4 0g 、硫酸铵8g 、酵母提取物6 4 5 5 7g 、k 2 h p 0 40 8g 、k h 2 p 0 41 3 6g 、m g s 0 4 7 h 2 0 0 7 5g 、z n s 0 4 7 h 2 00 0 6g 、f e s 0 4 - 7 h 2 00 0 4 5g 。在最优条件下，一聚赖氨酸预测产量 达到2 5 4g l ，验证实验结果为2 4 8g l 。 关键词：聚赖氨酸，白色链霉菌，生物防腐剂，诱变，发酵优化 a b s t r a c t a b s t r a c t e - p o l y l - l y s i n e ( - p o l y l y s i n e ，e - p l ) w a sf i r s td i s c o v e r e d 硒an o v e lf o o da n t i m i c r o b i a l p r e s e r v a t i v e w h i c hw a sp r o d u c e db ym i c r o o r g a n i s mi n j a p a ni n t h e19 8 0 s i ti sa h o m o p o l y - a m i n oa c i dc h a r a c t e r i z e db yt h ep e p t i d eb o n db e t w e e nt h ec a r b o x y la n da - a m i n o r e s i d u eo fl - l y s i n e i tc a l lb ed i g e s t e dt oas i n g l el y s i n ef o rh u m a nn u t r i t i o n m o r e o v e r , e - p o l y l y s i n ew a sr e c o g n i z e da sag r a sm a t e r i a lb yf d a i nu s c a sr e g i s t r yn u m b e ri s 2 8 21l - 0 4 3 t h u st h ep o l y l l y s i n eh a st h en o n - t o x i ce f f e c t sa n ds a f ec h a r a c t e r i s t i c sa saf o o d p r e s e r v a t i v e i nt h ee s s a ys t r e p t o r a y c e sa l b u l u ss aw a ss t u d i e d t h r o u g ht h ee l e c t r o s t a t i cr e a c t i o n 晰n lc h a r g e dd y e s ，d r a g e n d o r f fr e a c t i o na n da m i n oa c i da n a l y s i s ，i tc a nb ed r a w nf r o mt h e a n a l y s i sa b o v et h a te - p o l y l y s i n ew a sap o l y m e ro fl y s i n e 、i mp o s i t i v ec h a r g ea n dw a sak i n d o fa l k a l o i d s i tp r o v i d e das i m p l ea n dq u i c km e t h o df o rs c r e e n i n ga n dc o n f i r m i n gt h es t r a i n s w h i c hh a dt h ec a p a c i t yf o re - p o l y l y s i n ep r o d u c t i o n s t r e p t o m y c e sa l b u l u ss aw a st r e a t e db yu va n dl i c lm u t a t i o nf i r s t l y t h ed i f f e r e n t d o s e so fu vw e r es t u d i e da n dt h ed e a t hr a t ec u r v eo fu vw a so b t a i n e d a c c o r d i n gt ot h e g e n e t i cb r e e d i n ge x p e r i e n c e st h a tah i g h e rp o s i t i v em u t a t i o nw a si nl o wd o s e sm o s t l y , t h e o p t i m u mi r r a d i a t i o nw a ss e l e c t e d 舔2 5s a f t e ri n i t i a ls e l e c t i o n , t h es t r a i n sw i t hs i g n i f i c a n t i n h i b i t o r ye f f e c t sw e r eq u i c k l ye l e c t e db yd r i l l i n ga g a r - i n h i b i t i o ni nl a r g eq u a n t i t i e s t h e p r o d u c t i o nw a si n c r e a s e dt o1 3 3g lt h a tw a sh i g h e rt h a ns t r e p t o m y c e sa l b u l u ss ab y2 7 9 a f t e ru vm u t a t i o n t h em u t a n to b t a i n e db yu vw a st r e a t e db yn i t r o u sa c i dn e x t t h eo p t i m u mp r o c e s s i n g t i m ew a s2 0m i n 。a r e rm u t a t i o n , a na e cr e s i s t a n tm u t a n th i g h - y i e l du n 2 - 71w a so b t a i n e d t h ep r o d u c t i o no fe - p o l y l - l y s i n ew a s1 6 4g l ，谢t l lap r o d u c t i o ni n c r e a s e db y5 7 7 i no r d e rt oi n v e s t i g a t et h ef e r m e n t a t i o ns t a b i l i t y , t h em u t a n tu n 2 71w a st e s t e da f t e r c o n t i n u o u sc u l t u r eg e n e r a t i o nb yg e n e r a t i o n t h er e s u l ts h o w e dt h a tt h em u t a n th a dag o o d g e n e t i cs t a b i l i t y t h e c u l t i v a t i o nc h a r a c t e r i s t i c sa n db i o p h y s i c l o g i c a la n db i o c h e m i c a l c h a r a c t e r i s t i c so fs t r e p t o m y c e sa l b u l u su n 2 71w e r eo b s e r v e d d i f f e r e n tc a r b o na n dn i t r o g e ns o u r c e sh a dc o n s p i c u o u sd i f f e r e n c e si ns y n t h e s i so f e - p o l y l y s i n e 1 1 1 et e s ti n d i c a t e dt h a ts o l u b l es t a r c hw a st h eb e s tc a r b o na n dt h ec o m b i n a t i o no f ( n h 4 ) 2 8 0 4 谢t l ly e a s te x t r a c tw e r et h eb e s ts o u r c e so fn i t r o g e n o nt h eb a s i so f c a r b o na n d n i t r o g e ns o u r c e ss c r e e n i n g ，t h ee l e m e n t so ff e r m e n t a t i o nm e d i u mw e r eo p t i m i z e d i nt h e p l a c k e t t - b u r m a ns c r e e n i n gt e s t ，t h ee i g h tf a c t o r sw h i c hw e r ei n g r e d i e n t so ft h ef e r m e n t a t i o n m e d i u ms u c ha ss o l u b l es t a r c h ，a m m o n i u ms u l f a t e ，y e a s te x t r a c t , k 2 h p 0 4 ，k h 2 p 0 4 ， m g s 0 4 7 h 2 0 ，z n s 0 4 7 h 2 0 ，f e s 0 4 7 h 2 0w e r ea n a l y s e d s o l u b l es t a r c h , a m m o n i u ms u l f a t e a n dy e a s te x t r a c tw e r et h es i g n i f i c a n tf a c t o r s at h r e e - f a c t o ra n dt h r e e l e v e lb o x - b e h n k e n e x p e r i m e n tw a sd e s i g n e d ，a n dt h eo p t i m i z a t i o nm o d e lw a so b t a i n e db yr s ma n a l y s i s t h e i n g r e d i e n t so ft h eo p t i m i z e dm e d i u mw e r ea sf o l l o w s ：s o l u b l es t a r c h4 0g a m m o n i u ms u l f a t e 8 g ，y e a s t e x t r a c t6 4 5 5 7g ，k 2 h p 0 40 8 g ，k h 2 p 0 4 1 3 6 g ，m g s 0 4 7 h 2 0o 7 5g ， z n s 0 4 7 h 2 00 0 6g ，f e s 0 4 7 h 2 0o 0 4 5g t h ep r e d i c t i v ep r o d u c t i o no fe - p o l y l y s i n ew a s 2 5 4 l ，t h er e s u l t sf o rc o n f i r m a t i o nw a s2 4 8g l 1 1 a b s t r a c t k e y w o r d s ：i ；- p o l y l y s i n e ，s t r e p t o m y c e sa l b u l u s ，b i o l o g i c a lp r e s e r v a t i v e ，m u t a t i o n ， f e r m e n t a t i o no p t i m i z a t i o n i i i 独创性声明 本人声明所呈交的学位论文是苯人在导师指导下进行的研究工作及取 得的研究成果尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文 中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含本人为获得江南 大学或其它教育机构的学位或证书而使用过的材料与我一同工作的同志 对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示谢意。 签名：彳洫至蔓 日 期： 关于论文使用授权的说明 沙谴。b 、沌 本学位论文作者完全了解江南大学有关保留、使用学位论文的规定： 江南大学有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允 许论文被查阅和借阅，可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库 进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文， 并且本人电子文档的内容和纸质论文的内容相一致 保密的学位论文在解密后也遵守此规定 签名：名渐菇导师签名： 第一章绪论 第一章绪论 1 1 新型生物防腐剂 食品防腐剂是食品添加剂领域中主要门类之一，随着食品工业的快速发展，食品防 腐保鲜的重要性也越来越明显，人们对食品防腐剂的研究和开发也更加深入。防腐剂按 其来源可分为合成防腐剂和天然防腐剂，但目前使用以化学合成防腐剂为主，如苯甲酸 及其钠盐、山梨酸及其钾盐、二氧化硫、焦亚硫酸钾或钠、丙酸钙或钠、脱氢醋酸、双 乙酸钠等。科学家在长期的研究中，发现一些化学合成的防腐剂有诱癌性、致畸性和易 引起事物中毒的现象，而天然抗菌防腐剂在人体内可以分解成各种营养物质，安全性好。 随着人们对食品安全要求的提高，食品添加剂掀起了强烈的回归自然、享受绿色与健康 的浪潮，天然抗菌防腐剂的研究和开发成为食品工业的热点之一【l , 2 1 。因此开发新型的抗 菌性强、安全性能高、使用方便的天然抗菌防腐剂就成了必然的趋势。 天然抗菌防腐剂按其来源可分为植物源抗菌防腐剂、动物源抗菌防腐剂及微生物源 抗菌防腐剂，其中微生物源抗菌防腐剂往往又称为生物防腐剂。生物防腐剂主要以天然 农副产品为原料，用发酵等生物技术制备而来，与传统的化学防腐剂相比它们具有高效、 适用p h 范围宽、无特殊感官性状、专性抑制某种成分而不影响食品中有益成分、不会 使微生物产生抗性、安全性高等特点【3 j 。由于人们对食品安全及食品营养的日益重视， 越来越多的消费者在购买食品时都希望看到一个“干净 的食品标签( c l e a nl a b e l ) ，即 不含任何化学防腐剂，因此，这就给天然生物防腐剂创造了一个巨大的市场机会。现在 研究比较多的有溶菌酶( l y s o z y m e ) 、乳酸链球菌素( n i s i n ) 、纳他霉素( n a t a m y c i n ) 、聚赖 氨酸( p o l y l y s i n e ，p l ) 、曲酸( k o j i ca c i d ) 等。生物防腐剂不但对人体健康无害，而且还 具有一定的营养价值，有些生物防腐剂己达到或超过化学合成防腐剂的效果，而且价格 也大大降低，开发来自微生物的天然抗菌防腐剂是寻找新型防腐剂应用于食品工业的重 要方向。 1 1 1 溶菌酶( l y s o z y m e ) 溶菌酶( 1 y s o z y m e ) 又称胞壁质酶( m u r a m i d a s e ) 或n 乙酰胞壁质聚糖水解酶 ( n a e e t y l m u r a m i d eg l y c a n o h y d r l a s e ) ，是一种能水解致病菌中粘多糖的碱性酶。主要通过 破坏细胞壁中的n 乙酰胞壁酸和n 乙酰葡萄糖胺之间的p 1 ，4 糖苷键，使细胞壁不溶性 粘多糖分解成可溶性糖肽，导致细胞壁破裂内容物逸出而使细菌溶解，多存在于哺乳动 物的乳汁体液、禽类蛋白中，植物和微生物中也存在。溶菌酶对革兰氏阳性菌、好气性 孢子形成菌、枯草杆菌、地衣型芽孢杆菌等均有良好的抗菌能力，尤其对溶壁微球菌的 溶菌能力最强。溶菌酶还可与带负电荷的病毒蛋白直接结合，与d n a 、r n a 、脱辅基 蛋白形成复盐，使病毒失活。因此，该酶具有抗菌、消炎、抗病毒等作用。 从上世纪6 0 年代以来，溶菌酶就作为一种抗菌剂使用在食品中。它是一种无毒球 蛋白，能选择性地分解微生物的细胞壁，抑制微生物的繁殖，作为一种天然的防腐剂已 江南大学硕士学位论文 广泛应用于低度酒、香肠、奶油、糕点、干酪等食品中。如日本用溶菌酶代替水杨酸用 于清酒的防腐。有报道表明，溶菌酶结合其它抗菌剂可以产生比单独使用溶菌酶更有效 的防腐体系和更低的使用浓度，如与植酸、聚合磷酸盐、甘氨酸等配合使用，可大大提 高其防腐效果【4 】。溶菌酶对人体安全、无毒、无害，且具有一定的保健作用，应用于食 品中不仅可以起到防腐保鲜作用，还能强化营养价值。在婴儿体内可以直接或间接促进 婴儿肠道细菌双歧乳酸杆菌的增殖；促进婴儿胃肠内乳酪蛋白形成微细凝乳，有利于婴 儿消化吸收。此外，溶菌酶杀菌防腐，由于不经过加热，属于冷杀菌，因而避免了高温 杀菌对食品风味的破坏作用，可增强食品的风味【5 】。 1 1 2 乳酸链球菌素( n i s i n ) 乳酸链球菌素( n i s i n ) 又称乳酸链球菌肽或乳链菌素，是以蛋白质原料经过发酵提制 的一种多肽抗菌素类物质，由3 4 个氨基酸组成，分子量为3 5 1 0d a 。n i s i n 能有效地杀 死或抑制引起食品腐败的革兰氏阳性菌，如乳酸杆菌、肉毒杆菌、葡萄球菌、李斯特菌、 耐热腐败菌、棒杆菌、小球菌、明串球菌、分枝杆菌等。特别是对产生孢子的细菌，如 芽孢杆菌、梭状芽孢杆菌、嗜热芽孢杆菌、致死肉毒芽孢杆菌、细菌孢子等有很强的抑 制作用。但是在目前条件下，n i s i n 对革兰氏阴性菌、酵母、霉菌及病毒一般无效。n i s i n 对营养细胞的研究作用点是细胞质膜，使细胞壁质膜和磷脂化合物合成受阻，抑制细胞 壁中肽聚糖的生物合成，造成最重要的细胞质如三磷酸腺苷的渗出，更重要的导致细胞 溶解，对原生质作用方式的精细研究表明，由于乳酸链球菌素的破坏使细胞质中的基质 失去活性【6 。 1 9 6 9 年联合国粮食及农业组织世界卫生组织( f a o w h o ) 确认n i s i n 为安全、高效、 可靠的食品防腐剂，到目前为止已在全世界5 0 多个国家广泛应用。1 9 8 8 年，美国食品 药物管理局( f d a ) 确定n i s i n 为公认安全产品( g r a s ) ，并批准使用。欧盟也认定其为天 然及安全性，n i s i n 并在欧洲各国广泛使用。1 9 9 0 年我国卫生部签发的证明指出“可以 科学的认定n i s i n 作为食品防腐剂是安全的 并允许使用。n i s i n 可使用于肉制品加工、 乳及乳制品和酸性罐头食品中，能有效的阻止耐热性孢子的萌发及毒素的形成，在- 孚l s s j 品中的应用尤其广泛。目前有报道表明，n i s i n 作为防腐剂还可应用于焙烤食品、冰淇 淋食品、果汁饮料等。 1 1 3 纳他霉素( n a t a m y c i n ) 纳他霉素是一种高效、广谱的真菌抑制剂，由s t r e p t o m y c e sn a t a l e n s i s 和s t r e p t o m y c e s c h a t a n o o g e n s i s 等链霉菌发酵生成的【8 】，它是2 6 种多烯烃大环内酯类抗真菌剂的一种， 多烯是一平面大环内酯环状结构，能与甾醇化合物相互作用且具有高度亲和性。纳他霉 素能有效地抑制和杀死霉菌、酵母、丝状真菌，其抗菌机理在于它能与真菌细胞膜上的 甾醇化合物反应，由此引发细胞膜结构改变而破裂，导致细胞内容物的渗漏，使细胞死 亡 9 1 。但有些微生物如细菌的细胞壁及细胞质膜不存在这些类甾醇化合物，所以纳他霉 素对细菌、病毒以及其他微生物没有活性。 纳他霉素的溶解度低，可用其对食品表面进行处理以增加食品的保质期，却不影响 2 第一章绪论 食品的风味和口感。纳他霉素在食品中的应用研究较早，涉及乳酪、果汁、粮储等诸多 领域。我国于1 9 9 6 年批准纳他霉素用作食品防腐剂，使用范围为乳酪、肉制品表面、 广式月饼、糕点表面、果汁原浆表面、易发霉食品加工器皿表面【1 0 1 。 1 1 4 聚赖氨酸( e - p o l y l y s i n e ，p l ) 聚赖氨酸是8 0 年代由日本首先发现的继n i s i n 之后的一种新型食品抑菌剂，具有 广谱抑菌性，对于酵母属的尖锐假丝酵母菌、法红酵母菌、产膜毕氏酵母、玫瑰掷孢酵 母；革兰氏阳性菌中的耐热脂肪芽孢杆菌、凝结芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌；革兰氏阴性 菌中的产气节杆菌、大肠杆菌等引起食物中毒与腐败的菌有强烈的抑制作用，同时还具 有一定的抗噬菌体的能力。其化学组成是由人体必需氨基酸l 赖氨酸构成的多肽，它经 消化后又可变成单一的赖氨酸而成为人体营养的强化剂，故聚赖氨酸作为食品防腐剂， 具有无毒副作用，安全性高的特点【1 1 1 。聚赖氨酸的热稳定性非常好，其最适p h 5 8 ，也 就是说其在中性和微酸性环境中有较强的抑菌性，但在酸性和碱性条件下抑菌效果不理 想。聚赖氨酸作为抑菌剂在食品中应用时，通常与其它物质配合使用，以达到增效和经 济的目的。如与酒精、有机酸、甘油脂、甘氨酸等配合使用。常使用的有机酸一般有醋 酸、苹果酸、马来酸、柠檬酸、琥珀酸等。还可与其它天然抑菌剂，如鱼精蛋白、茶多 酚等配合使用【1 2 1 。聚赖氨酸在食品中多用于肉制品、高盐食品、快餐、色拉、蛋糕等食 品的保鲜，而且保鲜效果较好，在美国建议把聚赖氨酸作为防腐剂用于大米中【1 3 1 。 1 2 - 聚赖氨酸的研究进展 1 2 18 - 聚赖氨酸的发展情况 1 9 4 7 年kle p h r a i m 利用化学合成法首次合成了聚赖氨酸，这种聚赖氨酸是l 赖氨 酸残基通过羧基和q 氨基形成的酰胺键连接成的同聚物，因此，被称为a 聚l 赖氨酸 m p l ) ，由于其特殊的聚阳离子性质，a p l 在生命科学及医药领域得到广泛应用。但a p l 有一定毒性，因此，进一步筛选天然的聚赖氨酸取代化学合成的a p l 显得很有必要。 1 9 7 7 年日本学者s s h i m a 和h s a k a i 在从微生物中筛选德雷根道尔夫阳性( d r a g e n d o r f f p o s i t i v e ，简写为dp ) 物质的过程中，发现一种放线菌n o 3 4 6 能产生大量而稳定的dp 物质，通过对酸水解产物的分析及结构分析，证实该dp 物质是一种含有2 5 3 0 个赖氨 酸残基的同型单体聚合物，这种赖氨酸聚合物是l 赖氨酸残基通过a 羧基和氨基形 成的酰胺键连接而成，所以称为聚l 赖氨酸( p l ) 1 1 4 l 。p l 所具有的众多优良特性， 如水溶性的、高阳离子含量、可食用等，使其可应用于化妆品、美容用品、饲料添加剂、 药物、杀虫剂、食品添加剂、电子器材等方面，特别是在食品添加剂领域，其作为天然 食品防腐剂正日益受到人们的重视，研究发现p l 对大多数g + 、g 。细菌、真菌及某些 病毒都有强烈的抑制作用，且抑菌作用明显强于a p l ，在日本已作为食品防腐剂广泛使 用，将其用于快餐、奶油、鲜肉、肠类、禽类的保鲜，效果很好。p l 是一种吸湿性强 的物质，很难获得其粉末状态，但p l 的无机盐或有机盐可以以粉末状或固形物存在， 比较容易获得，无论以游离态还是以盐的形式存在，p l 都具有相同的食品防腐效果。 江南大学硕士学位论文 目前聚赖氨酸盐有盐酸盐、氢溴酸盐等，价格比较昂贵。 1 2 2 - 聚赖氨酸的理化与生物学性质 1 2 2 1 - 聚赖氨酸的结构特性 聚赖氨酸( p o l y - l 1 y s i n e 缩写为e - p l ) 是由链霉菌属和麦角真菌的生产菌产生的 代谢产物，经分离提取精制而获得的发酵产品。采用白色链霉菌( s t r e p t o m y c e sa l b u l u s ) 以葡萄糖为原料发酵制得多聚赖氨酸的合成方法较为理想【”】。白色链霉菌通过变异育 种，可以从葡萄糖中获得高效率生产次生代谢产物的多聚赖氨酸菌，进而完成多聚赖氨 酸的大批量工业生产。由于赖氨酸含有两个氨基，聚合时有a 和两个位点的聚合产物， 化学法合成的聚赖氨酸为q 型，而生物合成的聚赖氨酸为型，其赖氨酸残基之间的酰 胺键是由a 氨基和羧基缩合而成( 图1 1 ) 。研究证明p l 比a p l 有更强的抑菌活性， 由于伍多聚赖氨酸有毒性，目前在国际市场上聚赖氨酸作为食品防腐剂已经取代了a 聚赖氨酸【1 6 1 ，其结构式为： 姗卅嘶畔h 图1 - 1 - 聚赖氨酸的结构 f i g 1 1s t r u c t u r eo fg - p o l y l l y si n e 1 2 2 2 聚赖氨酸的物化特性 具有高抑菌活性聚赖氨酸的分子量在3 6 0 0 4 3 0 0 之间，当分子量低于1 3 0 0 时， 聚赖氨酸失去抑菌活性。聚赖氨酸没有固定的熔点，2 5 0 以上开始软化分解；易溶于 水、乙醇，但不溶于乙酸乙酯、乙醚等有机溶剂；热稳定性高，1 2 0 加热1 0m i n 仍具 有抑菌活性。对其表征进行红外光谱分析表明：在1 6 8 0 1 6 4 0c m l ，和1 5 8 0 1 5 2 0c m 一， 有强吸收峰【1 4 1 。 1 2 2 3 聚赖氨酸的生物学特性 聚赖氨酸是由人体必需氨基酸l 赖氨酸构成的多肽，它经消化后又可变成单一的 赖氨酸而成为人体营养的强化剂，故聚赖氨酸作为食品防腐剂，具有无毒副作用，安全 性高的特点。2 0 0 4 年2 月2 4 日日本c h i s s o 公司生产的聚赖氨酸这种天然食品添加剂作 为g r a s 物质通过了美国f d a 认证，c a s 登记号为2 8 2 1 1 0 4 3 ，标志着聚赖氨酸已 被国际标准所认可。 聚赖氨酸抑菌谱广，对革兰氏阳性菌、革兰氏阴性菌、酵母菌、霉菌均有一定的 抑菌作用，而且其对一些耐热性芽孢杆菌和一些病毒也有抑制作用，被认为由微碱性至 酸性，p h 值范围内对细菌繁殖都有抑制作用【l 7 。 热稳定性较好，聚赖氨酸经1 2 0 c 、1 0 0 、8 0 处理l o 分钟与未经热处理的样 品对细菌具有相同的抑制作用【l 引。 1 2 3 _ 聚赖氨酸的抑菌机理 1 9 8 4 年s s h i m a 等对p l 的抑菌作用和机理进行了研究，发现当其浓度为1 8 4 第一章绪论 r t g m l 时，即对g + 、g 细菌有抑制作用，且抑菌能力强于仅p l ，p l 必须含有1 0 个以 上赖氨酸残基才具有抑菌活性，对氨基的化学修饰会降低其抑菌能力。p l 通过与细胞 膜作用影响微生物细胞的呼吸，与胞内的核糖体结合抑制蛋白和酶生物大分子的合成 1 1 9 1 。1 9 8 3 年v a a r am 等发现聚阳离子能破坏g 细菌的外膜，并进一步杀死这些细菌【2 0 1 。 1 9 9 2 年v a a r am 进一步发现，聚赖氨酸是通过吸附到g 。细菌的外膜上，释放出大量的 脂多糖，破坏细菌外膜，而起到抑菌作用的1 2 1 1 。除了对细菌有抑制作用以外，1 9 8 2 年s s h i m a 等还发现p l 可以灭活大肠杆菌的t 4 、t 5 噬菌体1 2 2 】。1 9 9 5 年nd e l i h a s 等发现 分枝杆菌属的细菌对e - p l 的抑菌作用具有高度的敏感性，说明p l 及其衍生物可用作 抗结核药物田j 。因为生物膜系统是微生物进行能量转化、物质代谢等生命活动的主要场 所，所以聚赖氨酸踞留生物膜后，可直接而迅速地破坏依赖于膜结构完整的能量代谢 和细胞及细胞器赖以生存的对物质的选择性，导致胞内溶酶体膜破裂而诱导微生物产生 自溶作用，最终导致细胞死亡。2 0 0 0 年刘慧等对聚赖氨酸的抑菌性能进行了研究，发现 e - p l 不仅可抑制耐热性较强的g 广的微球菌，而且对其它天然防腐剂( 如n i s i n ) 不易抑制 的g 的大肠杆菌、沙门氏菌抑菌效果亦非常好，同时还抑制保加利亚乳杆菌、嗜热链球 菌、酵母菌的生长。但是单独使用p l 时对枯草芽孢杆菌、黑曲霉抑制不明显，采用e - p l 与醋酸复合处理，对枯草芽孢杆菌抑制作用增强，经高温处理后的e - p l 对微球菌仍有 抑菌活性l l s j 。 1 2 4 - 聚赖氨酸的毒性研究 f u k u t o m e 等进行的慢性毒性和致癌性联合试验表明，每日摄取食物的p l 含量在 6 5 0 0u g g ，属于极安全的水平；在2 0 0 0 0u g g ，无明显的组织病理变化，也观察不到可 能的致癌性 2 4 1 。根据美国的标准，p l 作为食品保鲜剂在米饭或寿司中的添加量为5 5 0u g g ，以每人每天进食3 0 0g 米饭( 加有5 0u g g 的p l ) ，一个6 0k g 体重的人每天进 食的p l 量只有1 5m g ，因此p l 作为食品保鲜剂是极安全的【2 5 1 。 2 0 0 3 年h i r a k ij 等使用了a d m e ( 动物的吸收性、分布性、代谢性和排泄性试验) 研 究方法证实8 p l 作为食品防腐剂的安全性1 2 6 。他们在老鼠体内对p l 进行了一系列药 物动力学和代谢途径的研究，以了解在老鼠的食物中添加高达5 0 0 0 0m g k g p l 的亚慢 性及慢性饲养的生物检测中，没有毒理学影响的原因。对老鼠进行急性口服毒性实验， 发现p l 是实际无毒的，口服量高达5g k g 时死亡率为0 ，在细菌回复突变检测中，p l 也没有诱变作用。用c 1 4 标记的p l 进行吸收、分布、代谢和排泄( a d m e ) 研究，发现 胃肠道很少吸收p l ，绝大多数的放射性在1 6 8h 内通过排泄物排出，整个身体的放射 自显影结果也显示任何组织和器官都没有吸收p l 。基于a d m e 研究的发现及安全性 研究中p l 无毒性的结果，他们认为p l 作为食品防腐剂使用是安全的。 1 2 5 - 聚赖氨酸的发酵生产 1 9 8 1 年ss h i m a 等研究了p l 的发酵生产条件i l6 。，发现在缺乏补充碳源的发酵培 养基中，尽管菌体生长良好，但是没有p l 的积累，在补充碳源中甘油和葡萄糖是最 好的：单独使用有机氮源不适合于p l 的生产，硫酸铵和酵母膏的混合使用更有利于 if j h n m h o f l f i n a o h ( p l h 8 5 l i f m i t _ 开| t l l t c e r e & d i l m c f 。 ia d s o r l l l i o r * a m l r l i t ci r c ，5 0 h i f n iv = c h t n 8w i l ha c o h ( n2 n j le l u l i o nw i t hh c t ( oin ) i n a o i i ( p i1 6 5 ie v a p o f a t i o nl o 锄- v l 时1 1 n 1 1 c l m e o ! ! ! ! ! ! 塑 p r e c t p iz a c e f a i r = = = i 1 t ! c o l o r d l i u n 卜f t o h e t o e l r 1 i i n m ：p t 口” i - lj i r a x q i 善m m ：s q ：) h d a l r ”o s e 射a 。n d 煳乞数g 2 5 i 【 。- q ，h a 血 p l p o l y b l n 。 图1 - 2 聚赖氨酸的分离提纯流程图 f i g 1 2p u r i f i c a t i o nf l o w c h a r to f 一p o l y l l y s i n e 6 第一章绪论 1 2 7 聚赖氨酸的生物合成途径 尽管p l 在应用与理论研究方面前景可观，但p l 的生物合成机制还没有被完全 阐明，至今尚在研究之中。s s h i m a 等人通过将【1 4 c 】l l y s 渗入培养基中验证了l l y s 是聚赖氨酸的生物合成的前体物，这表明聚赖氨酸是途经赖氨酸合成途径，由 聚赖氨酸聚合酶催化合成的。s s h i m a 还研究指出，聚赖氨酸是由白色链霉菌细胞内 的非核糖体多肽合成酶催化合成的聚赖氨酸，然后转运到胞外【2 9 】。 葡萄糖 磷酸烯丙生丙酮酸 丙酮酸 八 草酰乙酸乙酰c a a l 天冬氮酸 i 天冬氨商嘲嚏 l 天冬氪酸丰睦 二氨基舅e 二壤 t j 童髓t 一景甑蔹 l 一亲兢氨酸合成醇 图1 - 3 - 聚赖氨酸的可能生物合成途径 f i g 1 3t h ep r o b a b l es y n t h e ti cp a t h w a yo fg - p o l y l l y si n e t a k a h i r ok a w a i 等人已经于2 0 0 3 年报道了可用非核糖体缩氨酸合成酶生产p l 2 5 3 5 ，赖氨酸分子在它们被连接起来形成不同长度的产物之前被转换成腺苷酸形式而激 活p 0 】。同年，p l 生物合成机理研究取得突破，t a k a h i r ok a w a i 等将s a l b u l u s 的细胞破 碎后离心去除细胞碎片，上清液经先后两次高速离心分级和一次离子交换柱层析后，得 到了催化活性较强的组分，该组分可以在细胞外以赖氨酸为底物催化合成p l 。这一研 究表明，p l 不是在d n a 指导下转录出m r n a ，再以m r n a 为模板通过核糖体的翻 译作用合成的，而是通过细胞内的某一种或某几种酶催化合成的。该研究还阐明了催化 合成p l 的酶促反应条件，发现合成作用需要a t p 参与，并且需要以m 矿+ 为辅助因子， 但是，该研究没有得到纯化的酶【3 l 】。在l 赖氨酸形成过程中发现了有a m p 的生成，但 a d p 的生成是不受l 赖氨酸约束的，可能是由于磷酸酶仍然存在于被使用的酶制剂中， 用l 丙氨酸、l 甘氨酸、l 鸟氨酸替换l 赖氨酸都有发现明显的a m p 生成；a t p p p i 的转换活性是在用l l y s 作为反应基质的条件下检测到的。但是，当l 赖氨酸被其它在 蛋白质合成中作用的l 氨基酸和只比l 赖氨酸少一个次甲基的l 鸟氨酸替代时，都没 有检测到腺苷酸转换活性。因此，认为a m p 的形成与a t p p p i 的转换完全依靠在p l 合成反应中的l 赖氨酸。依赖于l 赖氨酸的砧订p 生成表明l 赖氨酸在p l 合成反应 中第一次被转换成腺苷酸，依赖于l 赖氨酸的a t p p p i 交换活性与非核糖体肽合成【3 l 】。 7 江南大学硕士学位论文 图卜4p n 0 3 3 的限制性酶切图 f i g 1 4r e s t r i c t i o nm a po fp n 0 3 3 h i r o s h it a k a g i 等人报道，在- 聚赖氨酸产生菌白色链霉菌i f 0 1 4 1 4 7 中发现了一种 高分子( 3 7 k b ) 隐蔽性质粒。目前认为质粒p n 0 3 3 只在产生聚赖氨酸的白色链霉菌中 发现。因此，该质粒可能是编码- p l 合成或抗性基因。h i r o s h it a k a g i 以p n 0 3 3 为载体， 进行了白色链霉菌i f 0 1 4 1 4 7 株p 内酰胺酶基因的克隆与分析，结果发现，p 内酰胺酶 的产生是由氨苄青霉素诱导的。p 内酰胺酶基因可用作是白色链霉菌i f 0 1 4 1 4 7 克隆载 体的标记基因【3 0 捌。 研究还发现，发酵液在p h4 0 时，白色链霉菌可以很快合成和分泌- 聚赖氨酸，而 当p u5 0 8 0 时，聚赖氨酸则立即被降解掉，这说明存在s 聚赖氨酸降解酶【i l 】。m i t s u a k i k i t oe ta 1 将聚赖氨酸降解酶提取，纯化后发现在白色链霉菌中，降解酶和细胞膜紧密 结合，并且可以被c 0 2 + ，c a 2 + 等激活，这种聚赖氨酸降解酶的活性与产生菌的自身保 护及聚赖氨酸合成密切相关【3 3 】。 1 2 8 - 聚赖氨酸的应用 1 2 8 1 - 聚赖氨酸在食品工业中的应用 - 聚赖氨酸在食品中多用于肉制品、高盐食品、快餐、色拉、蛋糕等食品的保鲜， 而且可以达到较好的保鲜效果。 ( 1 ) 聚赖氨酸在奶制品中的防腐保鲜作用 徐红华等人通过饱和试验设计研究了聚赖氨酸和甘氨酸对牛奶的保鲜作用。结果 表明单独使用聚赖氨酸和甘氨酸，其抑菌能力明显低于二者混合使用的效果。混合使 用时其增效随二者用量的增加而增加，但当聚赖氨酸用量过高时，这种增效作用会有 所减弱，其中添加4 2 0m g l 聚赖氨酸和2 的甘氨酸抑菌效果最佳f 3 4 】。 ( 2 ) s 聚赖氨酸在含淀粉类食品中的防腐保鲜作用 日本学者腾井正弘在米饭中添加0 4 0 6 聚赖氨酸醋酸制剂研究对米饭的防 腐作用，结果显示：3 0 c 培养4 8 小时后，添加聚赖氨酸防腐剂的样品中细菌总数为 6 0 1 0 3 个儋，而空白样中细菌总数为3 6 x 1 0 8 个儋，表明聚赖氨酸的醋酸制剂有明显 的抑菌作用1 3 5 1 。 ( 3 ) 聚赖氨酸在动物性食品中的防腐保鲜作用 将鸡肉、肉类浸渍在溶有0 1 2 聚赖氨酸甘氨酸制剂调味液中，再涂上面粉用油 炸。这种炸鸡在3 0 c 放置7 2 小时，经细菌总数检测发现：浸渍过炸鸡中细菌总数为 8 第一章绪论 1 0 x 1 0 4 个儋，而空白样中为1 0 8 个儋以上瞰l 。 产气荚膜梭菌( c l o s t r i d i u mp e r