实时定量PCR技术原理.doc

实时定量PCR技术原理陈云地8008100192，021- 64736366- 4071提 要基本概念定量PCR的数学原理定量PCR的化学原理等位基因鉴定原理定量PCR仪光学原理2基本概念什么是PCR链式反应的雪崩效5353535forward primer5535reverse primer535353553535355355355335353555355353535535353355354？ PCR能否只用一条引物？三条引物？ PCR能否使用ddNTP？5典型的PCR四阶段平台期线性增长期指数增长期基线期6PCR理论方程N = N0 x (1+e)nN:N0:e：n:产物分子数起始分子数扩增效率循环次数平台期PCR方程只在指数期成立线性期lg DNA7指数期y = x(1+e)n循环次数起点定量与终点定量起点量是样本中原来的DNA量，更有意义；终点量经过PCR 放大，并非研究所期望的数据起点定量误差小，终点定量误差大终点定量同一个样品重复96次起点定量8标准曲线方法CT20-19-18-17-16- C B A15-IIIIIIAbsolute amount. (copies)3,1256,25012,50025,00050,000100,000 EXACT scale通过CT值测定起始DNA量CTAbsoluteamount9Sample ASample BSample C16181950,000 copies12,500 copies6,250 copies定量PCR的数学原理什么是CT值荧光信号有统计学意义显著增长(即穿过阈值线)时的循环次数从基线到指数增长的拐点所对应的循环次数11线性图谱CT值半对数图谱CT值？ 浓度增加1倍，CT值减小1个单位 浓度增加10倍，CT值减小3.3个单位12为什么CT 起始DNA浓度?Rn = RB + X0 (1+ E)n Rs当循环次数n=CT值时：RT = RB + X0 (1+ E)CT Rslg (RT - RB) = lg X0 + CT lg (1+ E) + lg RsCT lg (1+ E) = - lg X0 + lg (RT - RB) lg RsCT = log X Olog(1 + E X )+log(RT RB ) log RSlog(1 + E X )13即 CT =- k lg X0 + b （线性方程）CT值与起始DNA浓度的关系CT值lg 起始DNA浓度CT = - k lgX0 + b？ 单拷贝检测在理论和实验上能做到吗？ 最理想的标准曲线斜率是多少？15什么是阈值基线信号的标准偏差 x 10基线范围标准偏阈值差16基线 阈值 CT值基线调整规则如果CT值 18，不需调整，使用自动分析结果如果CT值 18，使用自动分析结果，出报告3. 如果有CT值18，根据最小的CT值-4修改基线终点，重新分析数据19软件自动的数据分析方法软件自动计算全部参数：基线、阈值、CT值、浓度20？ 能否用鼠标拖阈值线以正确区分阴性与阳性？ 阈值与DNA浓度成反比，对吗？21定量PCR的化学原理两种定量化学 染料染色 SYBR Green I 溴乙锭(Ethidium Bromide) 探针标记23TaqManTMTaqMan MGBDual-oligo FRET pairs分子信标(Molecular beacons)ScorpionsTM/AmplifluorTM1、TaqMan探针5355RQ3353524TaqMan探针定量原理5forward primerRprobeQ335531. 聚合reverse primer553Q355352. 链取代RQ533553RQ53. Taq酶的53外切活性R = 报告基团ReporterQ = 淬灭基团Quencher2553534. 聚合完成535共振能量转移荧光共振能量转移(FRET)当某个荧光基团的发射谱与另一个荧光基团的吸收光谱重叠，且两个基团距离足够近时，能量可以从短波长（高能量）的荧光基团传递到长波长（低能量）的荧光基团，这个过程称为荧光共振能量转移(FRET),实际相当于短波长荧光基团释放的荧光被屏蔽。Frster resonance energy transfer through space(Frster Ann. Phys. 1948)272、TaqMan MGB探针MGB探针能够分辨1个碱基的差别完全配对，有信号FAMMGB一个碱基不配对，没有信号28FAMMGBTaqMan MGB探针原理(non-fluorescent quencher)NFQRAGGCCTTGAGAGATATQMGBQ(minor groove binder)R提高探针Tm值Q|GCTACACAGTCCGGAACTCTCTATAGCATCACACR报告荧光NFQ无荧光淬灭基团MGB小沟结合物29AGGCCTTGAGAGATATMGB探针的优势NFQQR53MGB提高信噪比 没有背景荧光 更高的淬灭效率 提高Tm值15 mer 提高 18C 探针更短只要13-19个碱基 更多一重PCR30两种探针比较TAMRA探针：长38-mer: ACTTTTCTGTAAGTAGATATAACTTTTCAAAAAGACAGMGB探针：长17-mer:1.41.2CTGTAAGTAGATATAACMGB1.00.8TAMRA0.0051015202530354031Cycle NumberR nTm决定探针杂交特异性TAMRAMGBTm=65Tm=65Tm=59Tm=49(Tm = 6C)(Tm = 17C)70C Tm = Tm配对65C- Tm60C不配对55C50C 要有效地区分等位基因，退火/延伸温度必须落在Tm 区间内323、分子信标(Molecular beacon)TaqMan探针的衍生形式334、杂交双探针TaqMan探针的衍生形式34变 性延 伸退 火完 成探针法小结既灵敏又特异：PCR与分子杂交的结合双倍放大：PCR放大与荧光放大的结合35No Blots!No Gels!？ 4种探针相比较，你更倾向于使用哪种？36SYBR Green I染料法SYBR Green I 是一种DNA小沟结合染料与DNA结合时发光游离时不发光37SYBR Green I荧光染料在PCR过程中染料与DNA结合发光聚合开始聚合完成38染料法小结成本低不需要探针适合初步筛查先用SYBR筛查，再用探针法精确定量少数关键样品熔解曲线鉴定PCR有无杂带、引物二聚体无模板特异性不能分辨主带与杂带，给出的是总信号不能做多重检测每孔只能检测一个目标基因灵敏度低适合于5000 拷贝以上的基因定量39熔解曲线(Dissociation curve)只有染料法才需要做熔解曲线探针法没有必要40原始数据导数图谱？ 能否用融解曲线区分点突变或SNP？ 探针能做融解曲线吗？41多重荧光定量 原 理同一样本，多对引物，分别扩增不同的靶基因不同的探针识别不同的靶基因不同的探针标记不同的颜色。 特 点一次提取DNA/RNA、一次反应得出多个定量结果信号之间要保证互不干扰42多色荧光技术荧光定量需要ROX校正和IPC校正检材和对照可以在同一管中定量仪器须有多荧光检测能力推荐的4色组合FAMVIC目的基因第二个目的基因或者IPCTAMRA 淬灭基团43ROX参比荧光荧光染料功能分类Reporter dye :Quencher dye:Reference dye:6-FAM 、VIC、TET、NEDTAMRA (TaqMan 探针)Dark Quencher (MGB 探针)ROX- passive internal reference for signal normalisation- allows relative (not absolute) fluorescence to be measured- critical for precision447000：4色荧光FAM/SYBR Green I 报告荧光1/染料VIC/JOETAMRAROX报告荧光2淬灭荧光参比荧光7900：4色荧光FAM/SYBR Green I 报告荧光1/染料45VIC/JOENED/TAMRAROX报告荧光2报告/淬灭荧光参比荧光7300：4色荧光FAM / SYBR Green IVIC / JOETAMRA / NEDROX (参比荧光passive reference)7500：5色荧光 5 片激发滤色片、5片发射滤色片FAM, SYBR Green IVIC, JOENED, TAMRA, CY3 DyeROX (passive reference), Texas RedCY5 Dye46 增加荧光无须硬件变动：多重荧光解析算法软件？ 你为什么会想到做多重定量？ 多重定量能达到目的吗？47等位基因鉴定原理两种探针加入同一管野生型(wt)突变型(mut)49等位基因鉴定实验分两步混合试剂实时循环终点读板分析数据50PCR试剂 + 引物探针 + 2 ng样品ABI PRISM 7300 SDS等位基因鉴定实验数据纯合子FAM杂合子51空白对照纯合子VIC实时结果定量PCR仪光学原理光学结构简图光源灯滤光镜反射镜CCD夫累尔透镜双色镜多元镜相机96孔透镜组滤镜轮96孔板53AB定量PCR仪大家族第一代7700和57007700 ：4色5700 ：单色54第二代7000和79007000 ：中小规模7900 ：激光源第三代7300和75007300 ：三重定量7500 ：5色检测定量PCR仪功能一览 绝对定量(Absolute Quantification) 自动计算基线、阈值、CT值、浓度、百分比 相对定量(Relative Quantification) 等位基因分型(Allelic Discrimination) 阴阳性鉴定(Plus/Minus with IPC)55定量PCR仪的性能569个数量级熔解曲线试验1倍分辨率基因表达软件实时定量小结污染