（食品科学专业论文）粮谷中草甘膦残留量测定的高效液相色谱方法研究.pdf

独创性声明 本人声明所呈交的论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。尽我所 知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成 果，也不包含为获得沈阳农业大学或其它教育机构的学位或证书而使用过的材料。与我一同工 作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示了谢意。 研一：吞1 帆明年钿佃 导燃= f 訇掺词 帆椤衫眦 关于论文知识产权和使用授权的说明 本论文的知识产权为沈阳农业大学所有。本人完全了解沈阳农业大学有关保留、使用学位 论文的规定，即：学校有权保留送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅，可以采用 影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。同意沈阳农业大学可以用不同方式在不同 媒体上发表、传播学位论文的内容。 学位论文中的所有内容不经沈阳农业大学授权不得以任何方式擅自对外发表。 ( 保密的学位论文在解密后应遵守此协议) 时间：仰7 年和争日 帆习彩月帕 调 鲁rl、q， 彳参 专a 刘 -，l 备 ： 餐 昭 筮 塔 薤 师 碱 导 沈阳农业大学硕士学位论文 摘要 草甘膦是广谱、非选择性的有机磷酸类除草剂，近年来被广泛应用于农业生产中。但随 着草甘膦的大量和不合理的使用，造成了其在食品、环境中的残留，而引起食品，特 别是粮谷中的污染。但我国至今尚无检测粮谷草甘膦残留量的标准方法。本课题研究目的即 是建立种可靠、灵敏、简便的检测粮谷中草甘膦残留量的分析方法，为食品安全质量监控提 供技术依据与支撑。 本文通过系统的试验，研究建立了粮谷中草甘膦残留量测定方法。首先建立了高 效液相色谱( h p l c ) 分析条件；其次针对粮谷样品的特点采用合适的前处理技术；最 后对所建立的方法进行了可靠性分析与验证。建立的色谱分析条件为：采用强碱性阴 离子交换色谱柱，乙腈与p h 6 的柠檬酸缓冲溶液( 5 0 ：5 0 ) 作为流动相，选用的检测器 为荧光检测器，其激发波长为2 5 4 n m ，发射波长为3 1 5 r i m ，流速l m i _ m i n ，柱温4 0 c 。采 用的前处理方法为：以水为提取剂，超声波提取法提取粮谷样品中的草甘膦，提取液 经石油醚液液萃取和阳离子交换固相萃取净化，净化液与氯甲酸一9 一芴甲酯衍生化反 应；方法的可靠行分析结果为：最低检出限0 0 0 5 u g g ，满足国家对相关食品质量标准 要求，不同浓度梯度的添加回收率8 0 4 9 4 6 ，变异系数( c v ) 0 8 8 9 1 7 ，方法 的灵敏度、精密度、准确度较好。 本文研究结果表明：所建立的粮谷中草甘膦残留检测方法符合国家标准对食品中 农药残留测定的要求，可提供给相关部门用于对食品安全的监测。 关键词：液相色谱；草甘膦；荧光检测器；衍生；残留量 摘要 a b s t r a c t g l y p h o s a t ei sab r o a ds p e c t r u m ，n o n - s e l e c t i v e a m i n op h o s p h o n a t et y p eh e r b i c i d e b u tw i t h a g r e a td e a la n d u n r e a s o n a b l eu s i n g ，i t sr e s i d u ei nf o o da n de n v i r o n m e n th a sr e s u l tn e g a t i v e i n f l u e n c et oh u m a n sh e a l t ha n dt h ee c o s y s t e me n v i r o n m e n t d e v e l o pf a s t 、d e p e n d a b l e 、 s e n s i t i v ea n dp r a c t i c ea n a l y s i st e c h n i ci sag o o dm e t h o dt oc o n t r o lp e s t i c i d er e s i d u e 、 g u a r a n t e ef o o ds a f l ya n da v o i dt r a d ed i s p u t e t h e r e f o r ee s t a b l i s ha n dp e r f e c ta na n a l y s i s m e t h o do fg l y p h o s a t ei sv e r yi m p o r t a n t o u rc o u n t r yd o e s n th a v ea n a l y s i sm e t h o do f g l y p h o s a t eu n t i ln o w t h ep u r p o s eo ft h i ss e a r c hi st of i n dar e l i a b l e ，s e n s i t i v ea n ds i m p l e m e t h o df o rd e t e r m i n a t i o no fg l y p h o s a t er e s i d u ea n dw h i c hc a np r o v i d eb a s i sf o rc o n s t i t u t i n g s t a n d a r da n a l y s i sm e t h o d s b ys y s t e m i ct e s t ，t h i sr e a r c he s t a b l i s h e sad e t e r m i n i n gm e t h o d f i r s t ， e s t a b l i s hal i q u i d c h m m a t o f a p h ym e t h g o d t h a n ，t h eb e s tp r e p r o c e s s i n gm e t h o dh a sb e e nc h o s e na i ma tt h e s a m p l eo fc e r e a l s f i n a l l y , m a k i n gad e p e n d a b i l i t ya n a l y z ea n dv a l i d a t et o t h em e t h o d g l y p h o s a t ew a se x t r a c t e df r o mc e r e a l sb yw a t e r , l i q u i d - l i q u i de x t r a c t i o nb yl i g r o i n d e a n e du p o na c a t i o n e x c h a n g ec o l u m n ，t h e e x t r a c t sw e r ed e r i v a t i v ew i t hf m o c c l c h r o m a t o g r a p m cc o n d i t i o n ：a n i o ne x c h a n g ec o l u m n ，m o b i l ep h a s ei s c i t r i c a c i dt r i sa n d c y a n i d e ( 5 0 ：5 0 ) , f l u o r e s c e n c ed e t e c t o r , e x 2 5 4 n m ，e m 3 1 5 r i m ，f l o w r a t ei sl m l m i n ，c o l u m n t e m p e r a t u r ei s4 0 。c l d lo ft h em e t h o di so 0 0 5 u g g a d d i t i o n a lr e c o v e r y 8 0 4 9 4 6 ， c v 0 8 8 9 1 7 , t h es e n s i t i v e 、p r e c i s i o n 、a c c u r a c yo ft h em e t h o di sv e r yg o o d t h er e s u l to ft h i se x p e r i m e n tp r o v e st h a tt h em e t h o do fe x a m i n i n g 出y p h o s a t er e m n a n ti s a c c o r d i n gw i t ht h a to ft h es t a n d a r di nc h i n a w h i c hc a na f f o r ds o m ed e p a r t m e n t st ou s ei n s u p e r v i s i n gf o o ds a f e k e y w o r d s ：l i q u i dc h r o m a t o g r a p h y ：酉y p h o s a t e t f l u o r e s c e n c e d e t e c t o rd e r i v a t i v e ；r e s i d u e 2 沈阳农业大学硕士学位论文 第一章前言 农药是一类生物活性物质，可能会对特定环境中生物群落的组成和变化引起 某种冲击，同时农药又是类化学活性物质，能够同环境中的某些其他物质或物 体发生相互作用，或在特定的环境中扩散分布，最后也表现为对生物的影响( 冯 秀琼，1 9 9 8 ) 。全世界的化学农药品种约1 5 0 0 多种，按化学成分可分为：有机氯 类、有机磷类、有机氮类、有机硫类、氨基甲酸酯类等。若按用途可分为杀虫剂、 杀菌剂、除草剂、植物生长调节剂、粮食熏蒸剂等。除草剂是近年来使用量增长 最大的农药制剂，成为世界上用量最大的一类有机农药制剂。据估算，应用除草 剂可使粮食增产1 0 以上。因此，国际上常将除草剂在农药中所占的份额作为衡 量各国农药市场变化的一个重要指标。就世界范围而言，各国除草剂销售额占农 药销售额的4 7 ，我国的除草剂销售额占农药总量的1 3 ，对农药市场的影响很大 ( 陈云，1 9 9 5 ) 。 除草剂由于其本身所具有的优异特点，使用范围越来越广，推动了农业耕作 制度的改革，免耕技术的兴起及推广又促使除草剂的发展，为全世界农业、林业 经济发展做出了贡献。草甘膦是广谱、非选择性的有机磷酸类除草剂，草甘膦成 功的应用于免耕大豆等作物，为它赢得了很大的销售市场。抗草甘膦农业作物的 开发成功，为农民提供了一种防治已对其它除草剂产生抗性的杂草的强有力工 具，草甘膦的用途由原来的非耕地而又扩展到许多农业作物上，从而其市场销量 成倍增加。然而，由于草甘膦使用不当造成的药害以及对人类生活环境的负面影 响日益突出。由于草甘膦除草剂具有慢性毒性，短期内难以确定其危害，因而对 环境的破坏往往被人们忽视( 邓渊钰，2 0 0 0 ；朱国念，2 0 0 0 ) 。 1 1 草甘膦的性质和作用 草甘膦化学名称为n 一膦羧甲基甘氨酸，国内曾叫镇草宁、膦甘酸，英文名 称为g l y p h o s a t e ，它属于氨基甲基膦酸类含有羧基的化合物。草甘膦是非常稳 定的化合物，分子量1 6 9 1 ，草甘膦分子中含有羧基、氨基、甲基膦羧基，因此 它的化学性质兼有这些基团的特性，从而可以进行酯化、羟烷基化、胺化、亚硝 化、磺酰化、膦羧甲基化、脱水等，其分子式： 3 第一章前言 0 0 l h o - c - c h 2 n h c 心一f ) 一o h。 一 ， 0 h 草甘膦为白色、无味固体；草甘膦三甲基硫盐为琥珀色至黄色液体，7 0 以 上工业品有微硫味( 纯品严重吸湿，难贮存，故7 0 水溶液即为工业品) 。草甘 膦酸1 7 4 9 m l ，7 0 三甲基硫盐水溶液为1 2 3 1 2 5 9 m l ，2 0 c 。熔点与蒸气压： 熔点2 0 0 c ( 不降解) ，草甘膦酸蒸气压2 4 5 x 1 8 4 k p a ( 1 8 4 1 0 - t m m h g ) ，4 5 c ； 三甲基硫盐3 9 9 x1 8 4 k p a ( 3 1 0 - t m m h g ) ，2 5 c 。草甘膦酸在2 5 c ，p h 5 7 9 时贮存3 2 d 稳定；三甲基硫盐在2 5 ，p h 7 9 时可贮存3 2 d 稳定。草甘膦具有 强酸性，它难溶于常见的有机溶剂，易溶于水，草甘膦酸在水中溶解度( 2 5 ) ， p h 7 时为1 6 ，7 0 0 m g l ，p h 2 5 时为1 1 ，6 0 0 m g l ；草甘膦异丙胺盐p h 7 时为 9 0 0 ，0 0 0 m g l ；p h 4 0 6 时为7 8 6 ，0 0 0 m g l ；草甘膦酸三甲基硫盐p h 7 时为 4 3 0 0 0 ，0 0 0 m g l ( 古同照，1 9 9 7 ；浦惠明等，2 0 0 2 ) 。 革甘膦是优良的芽后灭生性除草剂，不仅可以防除狗尾草等大多数一年生杂 草，而且具有良好的内吸传导性能，对许多难以杀灭的多年生深根恶性杂草，如 百芽、莎草( 香附子) 、狼尾草、剪股颖，旋花属，香蒲属等多年生草本也显示 出非常显著防除效果，主要用于农田、果园、茶桑、橡胶园、甘蔗园、森林和防 火隔离带、边境防火道，以及铁路机场、仓库、河道、公路的除草和草原改良( 任 不凡，1 9 9 8 ；华小梅，1 9 9 6 ) 。草甘瞵自上世纪7 0 年代中期商品化以来，由于 具有卓越的除草性能，应用范围不断扩大，再加上近年来在抗草甘膦作物方面的 研究和推广取得了很大的进展，抗草甘膦作物的创制一直成为农业生物技术研究 的重点，至今已取得了一系列抗草甘膦作物，它们是大豆、棉花、玉米、油菜、 甜菜、烟草、花生、小麦、向日葵、马铃薯、水稻、番茄、苜蓿、百脉根、黑麦 草、杨树等从而推动了全球草甘膦消费量稳步提高。据有关报道，1 9 9 4 年全球 草甘膦消费量为4 2 5 万t ，1 9 9 7 年达到7 4 万t ，2 0 0 0 年达到1 3 0 万t ，2 0 0 2 年达到1 8 万t ，2 0 0 4 年突破4 0 万t 。由于草甘膦对动物的低毒性而在世界性范 围内作为一种环境友好性农药被广泛接受，可它毕竟具有一定毒性，由于使用量 的逐年增大和不合理使用于作物、蔬菜和果品中，势必对环境造成污染，残留于 食品中的草甘膦也对人类的健康不利。由草甘膦引起水污染，植被破坏，牲畜中 毒的案件也在逐年增加( 高德霖等，2 0 0 3 ) 。 4 沈阳农业大学硕士学位论文 检测技术的不断改进，分析仪器灵敏度的不断提高，使人们对农产品有害物 质污染情况有了更深入的了解。美国、欧盟、日本、澳大利亚等发达国家为了保 障农产品安全，加强国际竞争地位，建立了比较完善的农业标准体系，基本实现 了按标准生产、加工、流通的从“农田到餐桌”全过程标准化管理。日本肯定列 表现行标准中规定草甘膦最大残留限量，其中大米0 1 p p m ，玉米1 o p p m ，黄豆 2 0 p p m 。加拿大发布草甘膦最大残留限量，其中燕麦片( 不包括粉) 3 5p p m ，黄 豆2 0p p m ，大麦和小麦片( 不包括粉) 及燕麦1 5p p m 。美国制定草甘膦最大残 留限量，其中稻米1 5 o p p m ，小麦草料1 0 o p p m ，小麦秆1 0 o p p m ，米麸3 0 o p p m ， 米壳及类似产品为2 5 o p p m ，粮谷类1 5 组( 不包括大麦、大田玉米、高粱谷、 燕麦、稻谷及小麦) 为0 1 p p m 。我国已经制定出食品中草甘膦最大残留限量标 准( g b1 4 9 6 8 9 4 ) ，其中甘蔗为2 o m g k g ，水果为0 1 m g k g ，但是至今还尚无 测定草甘膦残留的标准分析方法。 1 。2 国内外草甘膦残留分析方法 从2 0 世纪7 0 年代以来，有关草甘膦残留分析方法在国外已有部分报道，国 内只见几篇文献，主要是在地表水和地下水中的分析方法，而在食品及农产品中 残留分析方法的报道很少。这些研究都普遍认为草甘膦极性强、可溶于水，不溶 于大多数有机溶剂，因此，从样品中提取及定量测定其残留量很困难。草甘膦化 学结构与自然界存在的氨基酸、氨基糖的相似性，使得测定其在谷物、动物产品 中的残留变得更加困难，经常需要使用冗长繁琐的净化程序。有关分析草甘膦的 方法有很多，目前主要采用的检测方法有液相色谱法、气相色谱法、毛细管电泳 法，分光光度法、离子色谱法等( 吴春先等，2 0 0 2 ) 。 1 2 1 气相色谱法 气相色谱法主要适于挥发性和沸点较低物质的测定。草甘膦的不挥发性使得 在分析之前必须首先进行衍生化，使其具有挥发性能够利用气相色谱进行分析。 p h i l i pl a l f e r n e s s 等( 2 0 0 1 ) 将七氟丁醇( h f b ) 与三氟乙酸酐( t f a a ) 的混 合物加入到反应瓶，将样品提取液转移到衍生试剂中。9 2 c 9 7 反应1 h ，生 成沸点和极性都较低的酯类的物质。h i r o y u k ik a t a o k a 等( 1 9 9 6 ) 在样品提取 液中加入4 一氨基丁基膦酸( a b p ) ，并用调节p h 1 0 ，加入异丙基氯甲酸酯，剧 烈混合l o s ，再调节p h l 2 ，再用二乙基醚去除过量的试剂。含水层用n a c l 饱 5 第一章前言 和，再用叔丁醇的二乙基醚提取2 次，醚提取物用沸腾的重氮甲烷甲基化。 n t s u n o d a ( 1 9 9 3 ) 使用n 一甲基一n 一叔丁基二甲基硅三氟乙酰胺( m t b s f t a ) 衍生 试剂，将草甘膦衍生成叔丁基二甲硅烷基衍生物，二甲基硅衍生物比三甲基硅衍 生物更稳定，利于保存。z b i g n i e mh k u d z i n 等( 2 0 0 2 ) 在测定河水中的草甘膦 时，将河水浓缩至干，残留物溶解在三氟乙酸中，再加入三氟乙酸酐，在油浴中 加热搅动，l o m i n 后，加入三甲基原甲酸酯，在1 0 0 c 下搅拌1 5 h 。s kk o n a r 等( 1 9 9 0 ) 在蒸干的提取残留物中加入三氟乙酸酐与三氟乙醇，放到硅油浴中反 应。e 1 i s a b e tb o r j e s s o n 等( 2 0 0 0 ) 将蒸干样品溶解在酸性甲醇水溶液中，n ： 气吹于，加入三氟乙酸酐与三氟乙醇，1 0 0 衍生l h 。国内楼正云等( 2 0 0 4 ) 衍 生时，同样使用三氟乙酸酐与三氟乙醇，反应条件1 0 0 ，l h ，冷却后蒸于，加 入乙酸乙酯定容。裴茂清等( 2 0 0 4 ) 将草甘膦提取液在8 0 下加热挥干，冷却， 加入丙酸酐和甲醇，在微波炉中火条件下使其反应3 0 m i n 。 色谱柱的选择标准依据被衍生产物的化学性质，草甘膦一般的衍生反应包括 酯化与酰化，产物为非极性化合物，所以一般所用的色谱柱为中等极性至非极性。 p h i l i pl a l f e r n e s s 等( 2 0 0 1 ) 使用d u r a b o n d 5 6 2 5 熔化硅柱( 柱长3 0 m ，直径 0 2 5 r a m ) ，h i r o y u k ik a t a o k a 等( 1 9 9 6 ) 用d b 一1 7 ( 1 5 m x 0 5 3 m m ) 与o v 一1 ( 2 5 m 0 2 5 m m ) 熔硅毛细管柱，n t s u n o d a ( 1 9 9 3 ) 用色谱柱d b - 1 熔硅毛细管柱( 3 0 m x 0 2 4 m m ) ，s kk o n a r ( 1 9 9 0 ) 等使用玻璃柱2 0 s e ( 1 8 m 3 m m ) ，e 1 i s a b e t b o r j e s s o n 等( 2 0 0 0 ) 使用h p 一5 毛细管柱( 3 0 m 0 3 2 m m ) ，楼正云( 2 0 0 4 ) 用 p e g - 2 m ( 1 5 m 0 5 3 m m ) 裴茂清等( 2 0 0 4 ) 用d b - 5 m s ( 气质联用) 与d b 一5 ( 气谱 与检测器联用) ，均成功分离检测了草甘膦衍生产物。 由于草甘膦这种化合物本身含有n 、p 两种元素，在选择检测器时，可以首 选氮磷检测器( n p d ) ，比如s kk o n a r 等( 1 9 9 0 ) 使用n p d 测定了草甘膦的三氟 乙酸酐、三氟乙醇的衍生物；另外也可以选择火焰光度检测器( f p d ) ，比如 h i r o y u k i 等( 1 9 9 6 ) 利用f p d 测定了河水、土壤、胡萝p 中的革甘膦残留量； 也可以选择通用型的检测器一氢火焰离子化检测器，n z s u n o d a ( 1 9 9 3 ) 就是选择 了f i d 分析草甘膦；当用三氟乙酸酐与三氟乙醇( 或七氟丁醇) 做衍生试剂时， 由于衍生物中含有氟原子，所以电子捕获检测器会对其产生很高的灵敏度，楼正 云等( 2 0 0 4 ) 就是利用e c d 进行草甘膦残留分析的。利用质谱进行草甘膦分析的 沈阳农业大学硕士学位论文 有部分文献报道，p h i l i pl a l f e r n e s s ( 2 0 0 1 ) 、h i r o y u k i ( 1 9 9 6 ) 、n t s u n o d a ( 1 9 9 3 ) 、z b i g n i e mh k u d z i n ( 2 0 0 2 ) 、e l i s a b e tb o r j e s s o n ( 2 0 0 0 ) 等均采用 了气相色谱一质谱联用的方法解决了草甘膦残留分析的问题。 气相色谱法检测草甘膦的前处理方法比较繁琐，草甘膦提取剂为水，其衍生 反应也是在水溶液中完成的，最后还要用有机溶剂萃取，整个过程繁琐且回收率 低。 1 2 2 液相色谱法 由于草甘膦本身不具有生色团与荧光团，在进行液相色谱分析之前必须进行 紫外或荧光衍生，由于紫外检测器的灵敏度较低，国外大多数使用荧光检测器 ( f l d ) 测定草甘膦。用液相色谱测定草甘膦残留量通常采用方法为：柱后衍 生法；柱前衍生法。固相萃取高效液相色谱荧光检测器这种方法能很好的分 析很多样品，而且灵敏度比紫外吸收检测器高1 0 0 倍，选择性也较高( 黄俨， 2 0 0 6 ；李红燕，2 0 0 4 ) 。 1 2 2 1 柱后衍生液相色谱法 所有分析方法中涉及离线净化、浓缩与衍生，然后在色谱分析的方法较多， 然而近年来，自动在线监测微量污染物的装置表现出了优越性，它可以完全自动 化的测定水中痕量草甘膦及其代谢物残留量。 j p a t s i a 等( 2 0 0 1 ) 在线离子交换固相萃取、离子交换柱后荧光衍生液相 色谱法自动测定了水中的痕量草甘膦残留量，洗脱液为5m o l l k h ：p 0 4 色谱纯水 溶液，p h 用正磷酸调到1 9 ，流速0 5 m l m i n 。激发与发射波长为3 3 0 h m 、4 6 5 n m 。 m p a b d u l l a h 等( 1 9 9 5 ) 测定水中的草甘膦时，同样使用了柱后荧光衍生方法， 色谱柱为离子交换柱( p r p x 4 0 0 ) ，流动相0 0 0 5 m 0 1 l k h 2 p o 。缓冲溶液，分离后 的草甘膦在氧化溶液与邻苯二甲醛一巯基乙醇溶液中反应后，激发光与发射光波 长分别为3 4 0 n m 与4 5 5h i l l 。j e n n i f e rs 等( 1 9 9 7 ) 利用t r i s ( 2 ，2 一b i p y r i d y l ) r u t h e n i u m ( 1 i ) ( r u ( b p y ) 3 2 + ) 电致化学发光( e c l ) 检测离子交换 高效液相色谱法测定了草甘膦及其结构相似化合物，研究了p h 对电致化学发光 发射强度的影响。结果表明，在强碱性的p h 范围内灵敏度最高。国内侯占伟等 ( 2 0 0 3 ) 采用离子交换液相色谱法分离，经柱后衍生以荧光检测器定性检测样品 中的草甘膦。y u ky 等( 1 9 9 0 ) 测定环境水中草甘膦及其代谢物时，用阴离子交 7 第一章前言 换柱净化，用l o m l o 2 m o l lp h 5 0 柠檬酸钾洗脱，柱后荧光衍生直接液相色谱 法测定。 柱后衍生技术实现了自动在线监测，但柱后衍生对液相色谱仪的配置要求较 高，需要柱后衍生反应系统，而且自由性比较差。 1 2 2 2 柱前衍生液相色谱法 柱前衍生化是应用最为广泛的一种衍生技术，自由性大，离线更利于优化反 应条件。在色谱分离前，样品组分经过特定的化学反应，使之转变为荧光衍生物 进而进行色谱分离测定，该方法的优点表现在以下几方面：通常不考虑衍生化 反应的动力学，直到衍生反应完全；为了使衍生反应及衍生产率获得最佳效果， 可以任意选定衍生化条件；柱前衍生化反应的溶剂不必与分离时的流动相配 伍；衍生化的副产物可进行预处理以降低或消除其干扰( 张晓彤，2 0 0 0 ) 。 e a h o g e n d o o r n 等( 1 9 9 4 ) 用f m o c c l 衍生试剂、大体积进样与双柱液相 色谱法成功的分析了环境水与土壤中的草甘膦残留量。在收集液中加入2 0 0 u l ， p h = 9 0 1 2 5 m o l l 硼酸盐缓冲溶液与f m o c - c l 乙腈溶液，反应1 5 m i n 后，吸取1 o m l 反应液，并加入1 5 m lp h = 9 ，0 0 2 5 m 0 1 l 硼酸盐缓冲溶液稀释。所使用的第一柱 装有5 u mh y p e r s i lo d s ( 3 0 4 6 m mi d ) ，第二柱为a d s o r b o s p h e r en h 2 ( 2 5 0 x 4 6 m mi d ) ，第一柱与第二柱流动相为乙腈+ o 0 5 m o l l p h = 5 5 的磷酸盐水溶 液( 3 5 + 6 5 ，v v ) ，p h 用l m o l l 的k o h 调节，洗脱流动相由乙腈+ 水( 6 5 + 3 5 ， v v ) 组成，用于分析间第一柱的清洗。f e l i xh e r n a n d e z 等( 2 0 0 3 ) 也研究发 展了一种柱前荧光衍生的方法迅速测定了橄榄与其它植物样品中的草甘膦残留 量。用水与二氯甲烷提取后，除去橄榄油，提取物与f m o c - - c 1 反应后，直接注入 到双柱色谱系统，柱一为o d s - 2 ，柱二为n h 。柱一与柱二的流动相均为p h 5 5 的乙腈+ 0 0 5 m o l l 磷酸缓冲液= 3 5 + 6 5 ( v v ) 。j v s a n c h o 等( 1 9 9 6 ) 也使用了 同样的方法测定了环境水中草甘膦等。t v n e d e l k o s k a 等( 2 0 0 4 ) 在测定水与 植物样品中的草甘膦时，用聚合氨基柱替代了硅氨基柱，这篇论文在柱前f m o c c l 衍生后对水、植物分别采用单、双氨基柱分离后，找到了一个灵敏度高的草甘膦 测定方法。在测定水样时，使用单一聚合氨基柱，流动相p h l o 的乙腈+ 5 0 m m o l l 磷酸缓冲液= 5 5 + 4 5 ( v v ) 。 柱前衍生液相色谱法操作简便，而且荧光检测器选择性和灵敏度都较高。前 沈阳农业大学硕士学位论文 人应用此方法检测草甘膦多数采用双柱系统，这样有助于标样峰与杂峰更好的分 离，但操作繁琐，使用一根色谱柱更加简便易行。 1 2 3 其他方法 1 2 3 1 离子色谱法( 1 c ) 自1 9 世纪7 0 年代中期离子色谱法出现以来，它就成为测定离子型物质的有 用工具，亲水性物质能够被快速方便的测定，草甘膦是一种氨基酸、能够强电离 的磷酸类物质。y a nz h u 等研究了一种利用离子色谱系统测定草甘膦的方法。 离子色谱一冷凝成核光散射检测( 6 i nc h r o m a t o g r a p h y c o n d e n s a t i o n n u c l e a t i o nl i g h ts c a t t e r i n gd e t e c t i o n 简称i c c n l s d ) 法被成功地直接应 用于革甘膦及其代谢物的测定。p a o l op a s t o r e 等( 1 9 9 0 ) 利用高效离子色谱一 紫外可见检测器测定了草甘膦及其代谢物。 1 2 3 2 毛细管电泳( c e ) s a r a hy c h a n g 等( 2 0 0 2 ) 利用毛细管电泳一间接荧光测定方法同时测定了 草甘膦及其代谢物氨甲基磷酸。 1 2 3 3 吸光光度法 在酸性介质中，草甘膦与过量的n 0 2 一反应，生成稳定的亚硝基化合物，而过 量部分的n 0 2 氧化i 一成i 。，i ：与可溶性淀粉生成蓝色络合物，该络合物的最大吸 收波长为5 5 0 h m ，草甘膦在0 3 7 5 m g l 4 5 0 m g l 范围内与吸光度a 成线性关系。 董文庚等即利用此方法测定了草甘膦生产废水中的草甘膦，于波长5 5 0 n m 处测量 溶液吸光度( 韦莹军，2 0 0 5 ) 。 这几种方法灵敏度较低，而且操作繁琐，最低检出限达不到要求，不适合复 杂成分的样品检测。 1 3 色谱分析中的数据处理 由色谱分析获得的数据要经过适当的方法进行处理后才能得出比较直观的 结果，而对于某种检测方法是否可靠还要对分析结果进行一些理化指标的计算来 验证。 物质的定性分析是确定样品中的一些未知组分是什么物质，在色谱分析中的 定性主要依据保留值，色谱定性的方法很多，常用的方法有利用已知标准物的 保留值直接对照进行定性分析；利用文献值对照进行定性分析；根据保留值 9 第一章前言 规律进行定性分析；与质谱、红外光谱或核磁共振仪等结合进行定性分析。其 中第一种方法最为常用，在有标准品的前提下，该方法是最简单易行的，将未知 物和标样在同一色谱条件下进行分析，得出色谱图后进行比较对照，如果标准物 质的保留值与被测物质中某色谱峰的保留值一致，可判断二者可能为同一物质， 物质的定量分析就是要确定样品中某一组分的准确含量。它是根据检测器对 溶质产生的响应信号与溶质的量成正比的原理，通过色谱图上的峰高或峰面积， 计算样品中溶质的含量。色谱定量常用的方法有外标法；内标法；归一化 法。其中最为简单常用的是外标法即校准曲线法，用待测组分的纯物质配制成系 列不同含量的标准溶液，在一定的色谱条件下测定相对应标样的峰高或峰面积， 将系列标准曲线的浓度作为横坐标，相应的峰面积或峰高作为纵坐标，绘制标准 曲线，在同样条件下测得被测组分的响应值，再从曲线上查得相应的含量，此法 操作简单，计算方便，不需要测量校正因子( 周艳明，2 0 0 1 ；王运浩，2 0 0 3 ) 。 1 4 系统适用性分析 当色谱过程接近理想条件和分配系数值恒定时j 流出曲线应为高斯曲线，应 具有集中性、有序性、对称性的特点，色谱峰形的好坏，直接影响到定性及定量 分析，因此，要对色谱峰进行系统适用性分析，以便判断该检测条件是否进行定 性及定量分析。评价系统适用性的指标有容量因子、色谱峰分散程度、理论塔板 数、精密度等。 容量因子也叫分配比，它是衡量色谱柱对被分离组分保留能力的重要参数。 它是指在一定温度和压力下，组分在两相间分配达平衡时分配在固定相和流动相 中的质量比。k 值越大，说明组分在固定相中的量越多，相当于柱的容量大。在 h p l c 分析中一般将k 值控制在2 5 之间，在这个范围内分辨率随k 值的增加而 增加。当k 值超过5 时，k 值的增加将使色谱时间大大延长而分辨率增加有限。 因此，容量因子k 在5 左右时分辨率最佳。 色谱峰分散程度用标准偏差。值衡量，o 越小，曲线中部升高得越高，两侧 下降越快，分散程度就越小，色谱峰形就越好，有利于定量分析：反之对定量分 析不利。由于色谱峰标准偏差不易计算，因此常用o = w 4 来代替标准偏差，其 中w 为色谱峰宽。 理论塔板数是色谱理论中一个重要参数，理论塔板数表示色谱分离系统的效 沈阳农业大学硕士学位论文 率高低。理论塔板数与色谱标准偏差有关，o 越小，理论塔板数越大，系统的分 离效能越高。 r 理论塔板数n - - - - ( ) 2 ，其中t r 为保留时间，o 为色谱峰的标准偏差。 精密度表现所测数据重现性的好坏，以偏差表示，偏差是用来衡量数据值偏 离算术平均值的程度，偏差越小，这些值偏离平均值就越少，精密度就越好，反 之亦然。偏差通常使用的是标准偏差s 和相对标准偏差r s i 弼6 ，r s d 又称变异系 数。 ( j 簟- - i ) 21 s s 。广百二五 2r 阳。i 其中n 为测定次数，x 为测定平均值 1 5 方法的可靠性分析 检测方法的可靠性分析，就是对实验所采用的检测方法是否完全达到了预期 目的，或证明由检测方法误差而导致试验结果判断错误的概率是否在允许范围之 内，而进行的科学证明。检测方法的可行性鉴定以验证参数表示。在制定农药残 留检测方法标准时，可通过这些参数证明所建立的检测方法是否适当。 检测方法适当与否可通过验证参数进行评价，最典型的检测方法验证参数 有：灵敏度、准确度、精密度、不确定度。 灵敏度以最低检出限表示，最低检出限是指分析方法在准确的试验条件下可 以检测的样品中待测物的最低浓度或含量。最低检出限的值越低，则灵敏度越高。 最低检出限根据检测目的、待测物和样本种类不同而要求不同。若检测某 食品中农药残留量的目的是为了与规定的最高残留量( m r l ) 比较，以判断 是否超标，决定能否投入市场，则要求最低检出浓度低于m r l 值一个数量级 ( 1 0 倍) 即可。若规定的m r l 值很低时，则最低检出浓度至少应与m r l 相同。 如果检测目的是研究某农药在食品、饲料、土壤、水和大气中污染程度， 以及消解规律等，则要求的最低检出浓度要低得多。 精密度是衡量可行性的另一个指标，表现所测数据重现性的好坏，以偏差表 示，通常使用的是标准偏差s 和相对标准偏差r s d 。用一种方法对同一组试样 进行多次重复测定，其测定结果之间的偏差程度即为方法的精密度或精确 度，是衡量测定值重现性的重要指标。偏差程度与测定次数、平均测定值 第章前言 有关。偏差程度还与试样中农药残留量有关，含量愈高则偏差愈小，要求 标准偏差愈小，反之，含量愈低，偏差愈大，要求标准偏差愈大。 准确度也是用来衡量可靠性的指标，表示所测定值接近真值的程度，常用加 标回收率来衡量。加标回收的方法是指在样品中加入一定量的标准品，然后按照 所确定样品处理及检测方法，测定并计算被测物质的量。计算出来的测定值与实 际加入量之比，即为回收率。回收率越接近1 0 0 ，定量分析结果的准确度就越 高。精确度和准确度是评价分析方法和分析结果的基础，对理想的分析结果，既 要求精确度好，又要求准确度高。 不确定度是指测量结果相关联的参数，表征合理地赋予被测量值的分散性， 它是被测量客观值在某一量值范围内的一个评定，是判定测量结果质量高低的依 据。它对于制定农兽药使用标准限量、建立具有有效的质量保证和质量控制的实 验室管理系统具有重要意义。另外也要通过图谱分析来考察前处理方法对于杂质 的净化效果和该h p l c 检测条件下标样与杂质的分离效果。评定不确定度的方法： a 类和b 类评定方法，a 类评定方法是由一系列观测值计算统计方差的估计值， 直接得出不确定度分量的标准不确定度，属于后验的方法，即进行实验后才能得 到有关不确定度信息的方法；b 类评定方法是利用有关信息，通过引用或假定的 被测量或影响量的分布计算被测量或分量的标准不确定度，属于先验的方法，即 在进行试验前就已得知不确定度信息的方法。 1 6 本课题研究的目的和意义 我国至今尚无测定粮谷中草甘膦残留量的标准分析方法，因此，本课题研究 目的即是建立一种可靠、灵敏、简便的检测粮谷中草甘膦残留量的分析方法，为 食品安全质量监控提供技术依据与支撑。虽然国内外已有部分草甘膦检测分析的 方法，但均存在着一些局限性，如回收率低、灵敏度达不到要求、不适合复杂样 品的分析等缺陷。本课题的研究是为了建立适合粮谷类复杂样品的前处理方法和 满足国家标准分析方法的检测条件。通过试验建立的粮谷中草甘膦残留检测方法 可以可提供给相关部门用于对食品安全的监测，为制定国家分析方法标准提 供依据，从而为提高农产品质量贡献力量。 沈阳农业大学硕士学位论文 第二章材料与方法 2 1 材料与仪器 2 1 1 试验材料 柠檬酸：优级纯，天津科密欧化学试剂有限公司 柠檬酸钠：优级纯，天津科密欧化学试剂有限公司 四棚酸钠：优级纯，天津科密欧化学试剂有限公司 磷酸二氢钾：优级纯，天津科密欧化学试剂有限公司 草甘膦纯品( g l y p h o s a t e ) ：美国a c c u s t a n d a r d ，纯度 9 0 氯甲酸- 9 - 芴甲酯( f m o c - c i ) ：上海达瑞精细化学品有限公司 乙腈：色谱纯，美国飞世尔科学世界公司 甲醇：色谱纯，美国飞世尔科学世界公司 纯净水：杭州娃哈哈集团有限公司 三氯甲烷：分析纯，北京化工厂 石油谜：分析纯，北京化工厂 柠檬酸缓冲溶液：0 i m o l l 柠檬酸钠+ 0 1 m o l l 柠檬酸( 4 + 1 ) ，p h6 0 c 1 8 固相萃取柱：s p e p a kc a r t r i d g e sw a t e r s 公司 阳离子交换固相萃取柱：0 a s i sm c xs o r b e n t 超滤膜：0 4 5 u mw a t e r s 公司 大豆，玉米，大米，小米，荞麦，高梁：市场随即购买 2 1 2 仪器设备 安捷伦一1 1 0 0 液相色谱仪( 配荧光检测器) ：安捷伦科技有限公司 色谱柱：强碱性阴离子交换色谱柱( s c x ) ，4 6 m m x2 5 0 m m ，迪马公司 f 8 5 0 荧光分光光度计：日本日立公司 a n k et d l 一4 0 b 型离心机：上海飞亚医药公司 k q - 3 0 0 d e 型医用数控超声波清洗器：江苏省昆山市超声仪器有限公司 s h z d ( i i i ) 型循环水式真空减压装置：河南巩义英峪予华仪器厂 z k 高速自控组织捣碎机：江苏省盐城市龙冈科学仪器厂 s a r t o r i u s l 6 0 2 电子天平：德国制造 涡流混合器：北京金紫光科技发展有限公司 第一章材料与方法 2 2 试验方法 本试验主要分三部分： 色谱条件的优化研究，主要探讨了不同色谱分离条件对草甘膦的保留时 间、容量因子、色谱峰标准偏差和理论塔板数的影响，选择了灵敏度较高的检测 器和检测波长，并对分析方法进行了验证。 样品的前处理方法研究，优化了样品提取和净化的各关键环节，选择合适 的衍生试剂，优化了衍生反应条件； 对所建立的残留检测方法进行可靠性分析，通过灵敏度、精密度、准确度 和不确定度来考察方法的可靠性。 研究技术路线见图2 1 网 l 路线i 色谱 条件 样品的 前处理 可嚣 钉析 渤相栌柱蠊嬲隧羽l 嚣li 嚣| | 馏俨度伊度伊艘憾i l 咖波长i 【法验证ii 提取l i 净化il 衍生| i| il ijl 定度 缓冲 溶液、 流动槽 配l 匕 缓冲溶 液p h 豁l 黧l 鼗l 篡 标准lu 提取lu 同相l l j 拚生反 曲线ii 方注鼍ji 孳取ji 废条件 耩密 图2 1 研究技术路线 f i g u r 2 1t h ee x p e ri m e n tt e o h n i q u er o u t e 2 2 1 色谱条件的建立 色谱条件包括色谱柱、流动相、检测器和检测波长。样品的分离过程是利用 样品与流动相、固定相三者之间的作用完成分离，所以流动相和色谱柱的选择是 至关重要的，恰当的选择流动相和色谱柱能够提高柱效、缩短分析时间，但在提 高柱效和缩短分析时间的同时也要考虑定性和定量的准确性。在建立色谱条件之 前首先要配制草甘膦标准溶液。 2 2 1 1 草甘膦标准溶液的配制 标准储备液的配制：准确称取草甘膦标准品1 0 0 m g 用纯净水定容到1 0 0 0 m l 沈阳农业大学硕士学位论文 容量瓶中，制成l o o u g m l 的标准储备溶液。 标准工作溶液的制备：用微量移液器量取标准储备液，置于l o m l 容 量瓶中，用水定容，得到浓度为5 0 p g m l 、l o p g m l 、5 “g m l 、l 肛g m l 、 0 5 肛g m l 、0 1 h g m l 、0 0 5 垤m l 、0 o l p g m l 、0 0 0 5 p g m l 、0 0 0 1 h g m l 的标准工作溶液，在5 c 下的冰箱内保存。 2 2 1 2 色谱柱的选择 因草甘膦衍生产物是极性化合物，带有一个羧基和一个磷酸基团，在溶液中 易电离出氢离子，而形成阴离子。氯甲酸- 9 - 芴甲酯( f m 0 c 吒l ) 是荧光类物质， 在这里作为荧光衍生试剂。阴离子交换树脂含有季胺基 一n ( c h 3 ) 。o h 、胺基 ( n h 。) 或亚胺基( n h z ) 等碱性基团。它们在水中能电离出氢氧根离子，可 与各种阴离子起交换作用，其交换原理为r - n ( c h 3 ) 。o h + h - f 卜_ n ( c h 3 ) 3 r + h 2 0 ，根据此