（有机化学专业论文）ahas酶突变体系的建立及其研究.pdf

摘要 由于不断地向植物中是施加除草剂或是作用机理相同的除草剂的反复使用， 导致杂草种群对除草剂产生了抗药性，给防治和生产管理增加了难度。从大量所 研究的高等植物的抗性生物型中所得到的a h a s 酶基因序列表明，一般来说， 存在五个不连续的高度保留的抗性区域，这些区域中的氨基酸置换可能会产生抗 性，这些突变使a h a s 酶对除草剂的抑制作用不敏感。除了实验室的筛选外， 所有杂草中建立在靶标基础上的对a h a s 酶抑制剂的抗性都是由这五个保留区 中任意某个基因突变所引起的。 为了找到杂草中建立在靶标a l i a s 酶基础上的对a l i a s 酶抑制荆的抗性根 源，开发出新的农药体系克服杂草的抗药性，我们利用m e g a p r i m e r p c r 基因定点 突变技术，在e c o l i a h a s1 1 酶的五个不连续高度保留区域a e 区中分别引入了 w 4 6 4 a 、w 4 6 4 f 、w 4 6 4 l 、w 4 6 4 q 、w 4 6 4 y ：m 4 6 0 a 、m 4 6 0 f 、m 4 6 0 l 、m 4 6 0 q 、 m 4 6 0 n ：a 1 0 8 l 、a l o s q ；v 9 9 l 、v 9 9 y ；a 2 6 l 、a 2 6 p 、a 2 6 q 、a 2 6 y 基因 点突变。通过p c r 电泳分析、重组质粒的双酶切分析及测序鉴定，确证构建成 功了十八个e c o l i a h a s i i 酶突变体。通过对e c o l i a h a s i i 野生型及突变酶动 力学性质的测定可以发现它们对于底物( p y m v a t e ) 及三种辅助因子( f a d 、t h d p 、 m f + ) 有着截然不同的特征常数，这些位点上氨基酸的突变很可能引起了a h a s 酶局部构象的改变，构象上的改变导致了与三种辅助因子特征常数的上的差异。 此外，也通过e c o l ia h a s1 1 野生型及突变酶对两种咪唑啉酮类除草剂和1 1 种磺酰脲类除草剂敏感性的研究，比较不同的突变酶对于同种除草剂敏感性的差 别。研究发现不同的突变体对不同结构的抑制剂敏感性是不一样的，对所测试的 磺酰脲和咪唑啉酮除草剂都表现出抗性。这可能是由于除草剂结合在野生型的 a h a s 酶的底物进出的通道处，和这个通道上的氨基酸侧链形成了很强的相互 作用，因为除草剂阻止了底物的进出，所以a h a s 酶的活性就受到了抑制；但是 如果这个通道处的某个氨基酸发生突变后，除草剂和这个通道上的氨基酸侧链形 成的很强相互作用受到破坏，不能阻止底物的进出，a h a s 酶的活性就不能受 到抑制，因而对除草剂就表现出了抗性。 利用上述的抗性酶体系，研究这些抗性酶体系的分子作用机制，对于弄清楚 农药的抗性，指导新农药的创制具有积极作用。 关键词：乙酰乳酸( 羟基酸) 合成酶，定点突变，突变体，抗性 4 a b s t r a c t a c e t o h y d r o x y a c i ds y n t h a s e ( a r i a s o ra l s ，e c4 1 3 1 8 ) ，c a t a l y z e st h e f i r s t - s t e pi nt h eb i o s y n t h e s i so ft h eb r a n c h e d c h a i na m i n oa c i d b e i n gt h et a r g e to f s e v e r a lc o m m e r c i a lh e r b i c i d e s ( s u l f o n y l u r e a ，i m i d a z o l i n o n e ，t f i a z o l o p y f i m i d i n ea n d p y r i m i d i n y lo x y b e n z o a t eh e r b i c i d e s ) ，i th a sr e c e i v e dm u c ha t t e n t i o ne s p e c i a l l yi nl a s t 2 0t o3 0y e a r s h o w e v e r , t h el a r g es c a l ea d o p t i o na n do f t e np e r s i s t e n tu s eo ft h e s e h e r b i c i d e sh a sl e dt ot h e a p p e a r a n c e o fw e e d b i o t y p e s r e s i s t a n tt ot h e a h a s i n h i b i t i n gh e r b i c i d e s a n di ti sf o u n dt h a tt h er e s i s t a n c em e c h a n i s mm o s t l yi sa c h a n g ei nt h et a r g e ts i t ee n z y m ea li a s 。e s c h e r i c h i ac o l ic o n t a i n st h r e ei s o e n z y m e s a n dt h i ss t u d yc o n c e r n si s o e n z y m e1 1 ，t h em o s th e r b i c i d e - s e n s i t i v eo ft h ee c o l i f o i t r l s t a r g e ts i t e b a s e da h a sr e s i s t a n c ei sd u et op o i n tm u t a t i o n st h a to c c u rw i t h i n d i s c r e t ec o n s e r v e dd o m a i n so ft h ea h a sg e n e t oi n v e s t i g a t et h ei n t e r a c t i o no f v a r i o u sm u t a t i o nf o r m so fa h a sw i t hh e r b i c i d e sa n ds t u d yt h em e c h a n i s mo f h e r b i c i d er e s i s t a n c e ，as e r i e so fm u t a t e da h a si s o e n z y m ei i ( w 4 6 4 a ，w 4 6 4 e w 4 6 4 l , w 4 6 4 0 ，w 4 6 4 y ；m 4 6 0 a , m 4 6 0 em 4 6 0 乙m 4 6 0 q ，m 4 6 0 n ；a 1 0 8 l ， a 1 0 8 q ；v 9 9 lv 9 9y ，a 2 6 l a 2 6 e , a 2 6 q ，a 2 6 y ) ，m a i n l yo nt h er e s i d u e sl o c a t e d c l o s e dt ot h ep r o p o s e di n h i b i t o rb i n d i n gs i t e ，w e r ed e s i g n e da n dc o n s t r u c t e db y m e g a p r i m e rm e t h o dh e r e i n p c re l e c t r o p h o r e s i sa n dd n as e q u e n c i n gs h o w e dt h a t t h ed e s i g n e dt h e s em u t a t i o n so fe c o l ia h a si ia r es u c c e s s f u l l yc o n s t r u c t e d t h e s e m u t a t i o n sh a v ed i f f e r e n tk i n e t i cp r o p e r t i e so nd i f f e r e n te n z y m ec o f a c t o r sc o m p a r e dt o t h a to ft h ew i l dt y p e s o m ed i f f e r e n c e sf m mw i l dt y p ei ni n h i b i t i o nc o n s t a n t ( 瞄) w e r e o b s e r v e d ，a n dm u t a g e n e s i sh a v es i g n i f i c a n t e f f e c to ns o m es u l f o n y l u r e a sa n d i m i d a z o l i n o n e ，w h i c hs h o w e dad e c r e a s em a g n i t u d ei nt h es e n s i t i v i t yo fa h a si it o i n h i b i t i o n ，h o w e v e r ，r e p l a c e m e n t sh a v es m a l le f f e c t so n t h ea c t i v i t yo rs t a b i l i t yo ft h e e n z y m e - a d v a n t a g eo fr e s e a r c h i n ga l i a si im u t a t i o n si s i t sp o s s i b l eu s ei nc o n s t r u c t i o n o fn e wh e r b i c i d et os o m er e s i s t a n c ew e e db i o t y p e so rt r a n s g e n i c ，h e r b i c i d e r e s i s t a n c e c r o pp l a n t s k e y w o r d s ：a c e t o l a c t a t es y n t h a s e a l s 】o ra c e t o h y d r o x y a c i ds y n t h a s ef a h a s 、 s i t e d i r e c t e dm u t a g e n e s i s 、m u t a t i o n 、r e s i s t a n c e 5 第一章前言 1 1 除草剂研究的历史 第一章前言 杂草是农业生产的一大灾害，它与作物争肥、争光、争地，造成农作物产量 和品质的下降，成了农业生产的严重问题。化学除草不仅可以有效的控制杂草的 危害，增加农作物的产量，改善农作物的品质，而且还可以把人们从繁重的农业 劳动中解放出来，大大提高劳动生产率。在目前作物耕作体系中，自然生成或人 工合成化学药物的使用几乎是无法避免的。这些农用化学物质中除草剂在市场上 居首要的地位，据估计至1 9 8 8 年来国际农药市场上除草剂已接近4 4 ，此经济 诱因促使除革剂的研发仍是各大农药企业的重点工作之一。 用于防除农田、耕地、草场及其它非耕地杂草的化学药剂，统称为除草剂。 目前已有几百个化合物可作为除草剂。除草剂必须经过植物吸收( a b s o r p t i o n ) 、传 导m a n s l o c a t i o n ) 、然后到达作用靶标( t a r g e ts i t e ) ，产生作用造成植物死亡。除草 剂进入植物体内后可以被积存在细胞壁或胞液( v a c u o l e ) r p ，或者在抵达作用位置 之前被代谢成不具毒性的分子。 除草剂的选择性即是来自不同植物所具有上述过程的差异性。除草剂分子抵 达作用靶标后，除草剂主要影响的或者是特定的位置，特定的酶或者是特定的过 程，称为作用机甫r j ( m e c h a n i s mo f a c t i o n ) 。作用型式( m o d eo f a c t i o n ) 则包括植物 受除草剂影响的整个反应。除草剂生理和生物化学发展到现在，许多除草剂的作 用机制都己经清楚( 表1 ) 。 八十年代以后开发的a c c a s e ( 乙酰辅酶a 羧化酶) 抑制剂，a h a s ( z , 酰乳酸合 成酶) 抑制剂和e p s p s ( 烯醇丙酮酸莽草酸磷酸合成酶) 抑制剂，有的是动物对它们 有很强的代谢能力，有的是它们所抑制的是植物特有的酶，因此对动物的安全性 很高。 目前除草剂的开发研究主要是采用传统的随机筛选方法，从整株植物水平来 评价化合物对植物的药害及其对作物的选择性。多年来，人们通过对化合物的随 机筛选找到了许多具有不同作物机制的除草剂。有意思的是，通过随机筛选发现 的除草剂，无论其化学结构如何，都是通过作用关键步骤而发挥除草作用的。通 过对除草剂作用机制的研究，阐明了许多除草剂的作用靶标，表1 - 1 就是按作用 靶标对除草剂进行分类。 第一章前言 光合作用 电子传递( p s l od 。蛋白 电子传递( p s l ) 电子传递分流器 三嗪类( 莠去津、西玛津、扑草净) ， 三嗪酮类( 嗪草酮) ，尿嘧啶类( 丁 溴啶、特氯啶) 哒嗪酮类( 氯草敏) ， 脲类( 氯麦隆、异丙隆、敌草隆) ， 苯胺基甲酸酯类( 甜菜灵) 尿嘧啶类，联吡啶类( 百草枯、敌 草快) 脂类合成脂肪酸合成 乙酰c o a 箍化酶芳氧基苯氧丙酸类( 禾草灵、吡氟 ( a c a t s e ) 禾草灵) ，环己烯二酎类( 稀草酮、 2 第一章前言 从表1 - 1 可以看出，除草剂的作用原理包括阻碍光合作用、干扰氨基酸合成 和脂类合成、干扰色素合成、扰乱激素作用、破坏输导组织、影响氮素代谢、影 响细胞分裂、伸长和分化等。无论是那种除草剂，都必须进入植物体内一个或更 多的敏感部位，在足够的浓度下引起植物正常的生理生化过程发生紊乱，抑制生 长发育，最后失去平衡而死。植物体内各种生理生化过程是相互关联、协调一致 的，除草剂干扰了某一过程，必然导致其它过程的失调。因此，一般说来，除草 剂的作用都是多方面的。但不同除草剂的作用往往有一种或几种是主要的或原发 的，而其它作用是次级的，是由原发作用引起的。 3 第一章前言 从靶标酶的角度对除草剂进行研究，可以建立一些生理生化指标，而通过这 些指标不仅为化合物的筛选提供了依据，对于指导正确使用除草剂，鉴别由除草 剂引起的作物药害症状和防除草剂药害都有着重要的意义。而且随着除草剂作用 机制的阐明，更有利于对抗性的研究，并为耐药性作物的开发提供了前提条件。 除草剂对作物及杂草间产生选择性，达到“苗活草死”的效果，是由一系列 因素决定的。表观上具有相同功能的酶在生物体间作用的不同、植物的分化代谢、 植物本身的构造以及动植物体系间的差异等等对除草剂选择性的产生都具有非 常重要的作用。从作用机理的角度研究除草剂，能全面、综合地考虑各种因素， 更有助于设计、合成出高活性、高选择性的新型除草剂。 在植物体内具有什么特点的生物酶能够成为除草剂的作用靶标呢? 从己知 的例子中，人们已总结出理想作用靶标的一些标准：( 1 ) 良好的靶标应该在动植 物间有着很好的潜在的选择性：( 2 1 理想作用靶标在生物合成中的作用应该比较 突出，最好是在决速步中的酶；( 3 ) 抑制靶酶的活性达到6 0 8 0 时就可以产生植 物毒性，最好是通过多种复合影响产生毒性；( 4 ) 酶的失活应该是不可逆的；( 5 ) 一个好的作用靶酶应该是对它的抑制可以产生有毒底物的积累，并且底物的积累 不能减弱酶的失活；( 6 ) 如果从酶的角度来进行除草剂的开发设计，它必须非常 容易得到，从机理或潜在结构数据进行除草剂的分子设计，并且应该避免以复杂 的高电荷或高亲酯性物质作为底物的酶，因为以这些物质为基础而设计的除草剂 非常难被植物吸收。 这些准则的确立为新的靶酶的开发提供了广阔的机遇与天地! 但是这些准则 是相当不完善的，带有很大的人为主张因素。因此，在靶酶的确定以及由此对除 草剂化学的优化，还有大量的工作有待于进一步的进行。随着除草剂作用机理研 究的进一步深入以及基因工程的发展，从基因的角度去确定潜在靶酶或许是更加 有效、更加科学的方法。 1 2 除草剂抗性 1 2 1 抗性的产生 回顾除草剂的发展历程，自2 , 4 d 从1 9 4 6 年开始使用以来，除草剂工业已有 5 0 多年的发展史，迄今已成功地开发出了一大批选择性除草剂。除草剂作为现代 农业生产体系的重要组分，是农田除草技术中最可靠、最经济的手段。当前，主 4 第一章前言 要农作物的杂草治理仍然以选择性除草剂为主，但由于不断地向植物中施加除草 剂或是作用机理相同的除草剂的反复使用，导致杂草种群对除草剂产生了抗药 性，给防治和生产管理增加了难度。 最早的抗性杂草是h i l t o n ( 1 9 5 7 ) 和s w i t z e r ( 1 9 5 7 ) 分刖所报道的鸭砣草 ( d a y f l o w e r ，c o m m e 矗n ad i f f u s a ) 和野生胡萝h ( w i l dc a r r o t ) ( d a u c u sc a r o t a ) 能麴抗 2 ，4 d 的例子。但是在抗性杂草的研究上常被引用为最早的抗性杂草的例子却是 r y a n ( 1 9 7 0 ) 所报道的抗三嗪类的普通的千光草( c o m m o ng r o u n d s e l ) ( s e n e c i o v u l g a r i s ) 。原因在于r y a n 所报道的三嗪类抗性远高于前面两个例子。 在抗三嗪类的普通的千光草被报道以后，从1 9 7 0 到1 9 7 7 年之间，平均每年 有一个抗性杂草被发现。之后，抗性杂草被发现的速度增加，从1 9 7 8 年起平均每 年发现9 个新的抗性杂草。到1 9 8 3 年为止，抗三嗪类的杂草占抗性杂草6 7 ；抗 液态联吡啶的占1 3 ；抗合成的植物激素的占1 2 ，以及抗其它除草剂的杂草 占8 ( h e a p ，1 9 9 7 ) 。在1 9 7 0 年代晚期和1 9 8 0 年代早期新型的除草剂进入市场 后，抗性杂草发生的比例有了改变。在1 9 8 4 年到1 9 9 7 年之间新发生的抗三嗪类 的杂草仅占1 5 。同一时期抗a h a s 抑制剂类除草剂占2 8 ，抗液态联吡啶的占 1 5 ，抗苯基尿素类胺类的占1 2 ，抗a c c a s e 抑制剂类的占1 1 ，抗合成的植物 激素的占5 ，抗二硝基苯胺的占4 ，和抗其它型除草剂的1 0 ( h e a p ，1 9 9 7 ) ( 见 n 1 1 、。 y e a r 图1 - 1 全球除草剂抗性杂草山现的变化图( 摘e 1 p a t r i c kj t r a n e la n d t e r r y r w r i g h t , 2 0 0 2 ) 根据美国杂草学会( w e e ds c i e n c es o c i e t yo f a m e r i c a ) 所属除草剂抗性委员会 ( h e r b i c i d e r e s i s t a n c ea c t i o n c o m m i t t e e ) 所执行的2 0 0 2 年国际抗性杂草调查 拳奄墨竹琶蕾釜*芷葛缸五毫=z 第一章前言 ( i n t e r n a t i o n a ls u r v e yo fh e r b i c i d e r e s i s t a n tw e e d s ) 资料显示共有2 5 8 个抗性生物型 发生在5 3 个国家，共有1 5 6 种杂草对一种或多种除草剂有抗性( h r a c ，2 0 0 2 ) 。一 个抗性生物型是以该杂草对一除草剂家族来归类例如抗三嗪类的反枝苋 ( a m a r a n t h u sr e t r o f l e x u s ) 出现在1 0 个国家是被记录为一个抗生物型，而抗a h a s 抑制剂的反枝苋则视为另一个抗性生物型。在所有的抗性生物型中，2 7 9 抗 a h a s 抑制剂，2 4 4 抗三嗪类，1 0 9 抗a c c a s e 抑制剂类，8 1 抗液态联吡啶， 以及8 1 抗合成的植物激素类等。 选择性是除草剂的一个非常重要的特性，它规范除草剂的使用范围。无选择 性的除草剂可由施用的方式获得选择性而能在作物田中施用，扩大除草剂的使用 范围。如果就植物本身来讨论选择性，则植物对除草剂的耐性( t o l e r a n c e ) 是决定 除草剂能否使用的最重要因素。在抗性杂草受到广泛注意以后，除草剂耐性和除 草剂抗性常常不易划清界限。 事实上，很多抗性杂草被发现的时候都没有找到敏感性( s u s c e p t i b l e ) l 勺杂草做 为对照，只能以同属( g e n u s ) 或形念类似的当地杂草做为对照，然而这与抗性杂草 的定义并不相符合。美国杂草学会有关除草剂抗性的定义如下( w s s a ，1 9 9 8 ) ： 除草剂抗。i 牛( h e r b i c i d er e s i s t a n c e ) 是一植物可遗传的能力，当植物暴露在能杀死野 生型( w i l dt y p e ) 植物的除草剂剂量下仍能生存和繁殖后代的能力。这种能力可以 是自然发生或是诱导而柬的。除草剂耐一l 生( h e r b i c i d et o l e r a n c e ) 是一种植物可遗传 的能力。植物在接受除草剂处理后，仍能生存和繁殖后代，这能力不是由筛选 ( s e l e c t i o n ) 或遗传的操作( g e n e t i cm a n i p u l a t i o n ) n 百来，是自然发生的能力。也就是 说，不是以敏感性杂草作为对照所报道的抗性杂草，其对该除草剂到底是与生俱 来的耐性，或是后来诱发的抗性，还需要再探讨。作物对除草剂的耐性必须高于 杂草，而抗性的发生不论是在杂草或作物上，对于能麴忍受的除草剂剂量理论上 远高于耐性植物能麴忍受的剂量。 在清楚除草剂的作用机制以后，造成杂草对除草剂的不同耐性和抗性可从除 草剂进入植物体内后分几个阶段来探讨。吸收( a b s o r p t i o n ) ：植物的根对同一种 除草剂没有差异性的吸收，植物的叶片则会因叶片的年龄、表皮上的脱层和织毛 ( t f i c h o m e s ) 或环境的因素而影响除草剂的吸收。传导( t r a n s l o c a t i o n ) ：除草剂进入 植物体内后，不同植物可能有差异性的传导，有些植物能把除草剂积存在细胞壁 或液胞中。代谢( m e t a b o l i s m ) ：差异性的吸收和传导可能影响植物对除草剂的耐 性，但是自然界中区别杂草对除草剂的耐性和敏感性是以差异性的代谢为主要机 制。 第一章前言 除草剂的抗性可分为交互抗性( c r o s sr e s i s t a n c e ) 和多重抗性( m u l t i p l e r e s i s t a n c e ) 。交互抗性是指植物具有对同一家族的除草剂或不同家族但同一作用 机制的除草剂的抗性。交互抗性通常是指单一的抗性机制。多重抗性是指植物具 有对不同作用机制除草剂的抗性。多重抗性通常是指两种或两种以上的抗性机 制。造成除草剂抗性的主要原因，通过研究发现绝大多数为靶酶结构改变和加速 的细胞色素p 4 5 0 代谢解毒除草剂所产生的。 1 2 2a h a s 概述 过去的几十年中，除草剂化学中最重要的领域就是a h a s 抑制类除草剂发 明。这类除草剂所抑制的关键酶为乙酰乳酸( 羟基酸) 合成酶( a c e t o l a c t a t e s y n t h a s e ，a l s ；a c e t o h y d r o x y a c i ds y n t h a s e ，a h a s ：e c4 1 3 1 8 ) ，此酶控制 了支链氨基酸生物合成途径中的第一步反应( 见图1 - 2 ) 。 c 一，：一2 ：。， f。苏氨 u 3 c c h 2 一e c 0 0 ，2 - 酮丁酸 c h 3 1n n h 一 c h 。y t z c o o 2 一己酰一2 一羟基丁畦 ， ，c h 3 c 一。1 c h _ 2s h 蠡3 。二羟基3 。甲基戊 i午h 3 、c 一。! 。_ c ， 88 。 f ”a c 盒连：l ，+ d o o 亮氯酸 缬氨醴 异亮氨蕾 图1 - 2 支链氨基酸的合成途径t d ( t h r e o n i n ed e a m i n a s e ) ，苏氨酸脱氧酶；k a r i ( k e t o l a c i d r e d u a o - i s o m e r a s e ) ，酮醇一酸还原异构酶；d h ( d i h y d r o x y a c i dd e h y d r a t a s e ) ，二羟酸脱水酶； t a ( t r a n s a m i n a s e ) , 氨基转移酶；i p m s ( 2 - i s o p r o p y l m a l a t es y n t h a s e ) ，2 一异丙基苹果酸合成酶； i p m i f i s o p r o p y l m a l a t ei s o m c r a s e ) ，异丙基苹果酸异构酶；i p m d ( 3 一i s o p r o p y l m a l a t e d e h y d r o g e n a s e ) ，3 - 异丙基苹果酸脱水酶。 第一章前言 在微生物和植物中，缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸是经过一个很普遍的途径被 合成的。这个途径的一个显著特征是形成缬氨酸和异亮氨酸时用了一个平行的步 骤。这些平行的步骤涉及到四种酶，即合成代谢a h a s 酶、酮醇酸还原异构酶、 二羟基酸脱水酶和转氨酶。每一个酶都催化两个稍微有点不同的反应。这些氨基 酸的共同前体是中心的新陈代谢的丙酮酸，由此形成系列由丙酮酸衍生出来的 氨基酸。另外异亮氨酸的合成也需要第二个前体，2 酮丁酸。2 酮丁酸是苏氨酸 经苏氨酸脱氨酶催化脱氨得到的。 a h a s 酶催化这些平行步骤中的第一步反应。这步是很关键性的一步，因为 它催化的系列反应将决定碳流动到支链氨基酸的程度。这些反应涉及到丙酮酸 的不可逆脱羧和它的乙醛部分与第二个丙酮酸分子缩合生成2 乙酰乳酸，或和一 分子的2 酮丁酸形成2 一乙酰一2 羟基丁酸。每一个产物在随后的三个反应中进一步 转化，经过酮醇酸还原异构酶、二羟基酸脱水酶和一个转氨酶催化分别形成缬 氨酸或异亮氨酸。至于亮氨酸的生成，还需要另外四个酶，并且用缬氨酸的前体 - - 2 一酮异戊酸作为合成的起点。 a h a s 酶与焦磷酸硫胺素结合，催化生物合成支链氨基酸( 缬氨酸、亮氨酸、 异亮氨酸1 的第一步反应，即在亮氨酸、缬氨酸的生物合成中催化两分子丙酮酸 缩合生成乙酰乳酸和二氧化碳；在异亮氨酸生物合成中催化一分子丙酮酸和一分 子2 丁酮酸缩合生成2 乙酰基一2 羟基丁酸和二氧化碳( 反应方程式见图1 - 3 ) 。 o oo i l 2c h 3 3 一c 0 0 h 些oc h 3 - - c “- - c l - - c o o h 十c o s c c 0 0 h + 1 c h a o o9 h ，3 一oh+一a 隅一g c o o h 璺垒墨- l c h 3 一c h 2 - - f i c o c i - 1 3 + coch c o o h c h23 3 c 一 + 一a 如一c c o o h - l c h 3 一 一 3 + 2 c o o h 闰1 - 3a h a s 催化生物合成支链氨基酸( 缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸) 的第一步反应方程式 支链氨基酸是植物体内不可缺少的物质，是植物体内蛋白质合成的重 要成分。支链氨基酸的生物合成受阻，将导致蛋白质合成的停止，使d n a 和其他有丝分裂必不可少的物质的合成被破坏( r o s t ，1 9 8 4 ) ，导致植物根、茎、 叶的生长受到抑制，从而使植物生长严重受损直至死亡。除草剂正是通过 对酶的抑制来发挥其除草活性的。许多商业和实验性的除草剂都是以这条途径 上的酶作为靶标的( s i n g ha n ds h a n e r ，1 9 9 5 ) 。 8 第一章前言 在细菌、真菌、藻类和植物中可以找到a h a s 酶。不同来源的a h a s 酶的生 物结构是不同的。从肠细菌中得到的a h a s 酶已经从基因和生物化学方面进行了 广泛研究。在大肠杆菌( e c o l i ) 和鼠伤寒杆菌 t y p h i m u r i u m ) 中，至少有三种同功 酶得到了证明，被命名为a h a si 、a l i a s1 i 、a h a s1 1 1 ；分别用i l v b n ( w e ke t a 1 ，1 9 8 5 ) 、i l v g m e d a ( l a w t h e r e ta 1 ，1 9 8 7 ) 、i l v l h ( s q u i r e se t 口，1 9 8 3 0 操纵子编码 ( 见表1 2 ) 几乎所有的a h a s 酶都是由两种类型的亚基组成的，即由分子量大约为 6 0 k d a 的大亚基即催化亚基和分子量大约为9 1 7 k d a 的小亚基即调控亚基组成。 小亚基的甲硫氨酸起始密码子正好在大亚基终止子密码子的下游或者与终止子 密码子重叠。这两个亚基对于a h a s 酶实现完全活性来说是必需的。三个同功酶 中分子量大约为6 0 k d a 的大亚基的一级序列非常相似。每一对大约有4 0 的氨基 酸序列是相同的。 表1 - 2 大肠杆菌( e c o l i ) 三种同功酶的组成 类型a l i a s 组成分子量( k d a ) a h a s in v b 6 0 4 l l v n 1 1 1 a h a s i i v g5 9 3 l l v m 9 7 a h a s i l li l v l6 1 8 v h1 7 5 虽然对植物和真菌a l i a s 酶的四级结构不太清楚，但它们也是由催化亚基 和调控亚基组成的。人们已经在大肠杆菌、酵母菌中发现了多达6 种的a h a s 同工酶，并提取与纯化了同工酶a h a si 和a h a si i ，其中a l i a s1 i 对除草剂的 敏感性最强。 a h a s 重要的一个特性是需要f a d ( n a v i n a d e n i n ed i n u c l e o t i d e ，黄素酰嘌呤 二核苷酸) 的参与，这是因为f a d 能防止羟乙基焦磷酸硫胺素中间产物质子化； 在a h a s 反应中离不开t h d p ( t h i a m i np y r o p h o s p h a t e ，焦磷酸硫胺素1 ( f a d 和 t h d p 的结构见附录3 ) ，因为它能活化缩合反应中所必需的中间产物；此外，为 使酶全部活化，还需要有金属离子，其中以m 9 2 + 与m n 2 + 最为有效，当有这两种 离子存在时，形成了一个束缚口袋( b i n d i n g p o c k e t ) 。这个束缚区域很大，包括除 草剂的离子区域、疏水部分和缺电子杂环部分，除草剂的杂环部分与酶的醌结合 第一章前言 部位相互作用( 见图1 4 和图1 5 ) 。 图1 - 4 在y e a s t a h a s 的二聚体界面上的n l d p 、图1 - 5 a h a s 和除草剂一灭草烟( i m a z a p ”) f a d 的黄素环、m 矿+ 的位置和位点 的相互作用( 摘自p a n g e t a l ，2 0 0 2 ) 1 2 3a h a s 抑制类除草剂 a h a s 酶蛋白的合成受细胞核的控制，在叶绿体中表现其活性。一旦此酶的 活性受到除草剂抑制，则使支链氨基酸不能合成，渐使植物死亡。现已研制开发 的化学试剂中有1 5 种已被归化作为a h a s 抑制剂( s a a r i ，1 9 9 4 ) ，被分为四大类： 磺酰脲类( s u l f o n y l u r e a s ，s o ) ，咪唑啉酮类( i m i d a z o l i n o n e ，i m ) ，三唑嘧啶类 ( t r i a z o l o p y f i m i d i n e ，t p ) 及嘧啶水杨酸类( p y r i m i d i n y lo x y b e n z o a t e ，p b ) 除草剂。 其中很多化合物已经商品化，在许多不同作物及地区广泛推广使用，这些抑制剂 均具有选择性强、除草谱广、使用剂量低、对哺乳动物毒性小和对环境友好等特 点。 1 2 3 1 磺酰脲类抑制剂 l e v i t t 等在合成一系列磺酰脲类化合物后，总结了此类化合物的结构特征。 它的结构模式可分为芳环、脲桥和杂环三部分( 见图1 6 ) 。磺酰脲除草剂的基本 结构是x s 0 2 n h c o n h y ，这里x 通常是一个有取代基的苯基官能团，y 是 可以取代的嘧啶或三唑环。l e v i t t 认为：( 1 1 在苯环邻位引入各种取代基均可增强 活性，许多吸电子基和给电子基都是活性基团，且吸电子基比给电子基更为有利。 ( 2 ) 许多含氮杂环均有活性，但以含嘧啶2 基或1 , 3 ，5 三嗪2 一基的磺酰脲活性最 高。在所有杂环中，杂环部分应满足胍系，对胍桥来说间位的两个位置上都有取 1 0 第一章前言 代基。( 3 ) 具有无修饰脲桥的磺酰脲活性最高。 r = = 母 q 沪吼n h c 0 n h 啶嘧磺隆 图1 - 6 磺酰脲除草剂的结构特征氓、x 、y 代表不同的取代基) 及磺酰脲类除草剂的典型代表氯磺隆和啶嘧磺隆 磺酰脲除草剂的活性相当的高，最典型的农田应用是1 卜1 0 0 公顷。这么 高的能力反跌在离体实验中对a h a s 酶的抑制作用。这些实验通常要求除草剂的 浓度在n m 级。而且它们对动物的毒性很低，最高l d 5 0 值为氯磺隆对老鼠是6 9 k g 体重。对植物有高杀伤力而对动物毒性非常低，这些特点使磺酰脲成为很安全的 除草剂。而且它在土壤中通过非酶催化的水解反应和微生物降解的结合，很快降 解( b r o w na n dk e a r n e y 1 9 9 1 ) 。 1 2 3 2 眯唑琳酮类抑制剂 眯唑啉酮类化台物是丙酮酸的非竞争抑制剂，它与磺酰脲类不同之处在于它 与酶的结合点不与第二个丙酮酸的结合点相重叠，因此可能存在其它作用机制。 眯唑啉酮类除草剂含有一个4 一异丙基一4 一甲基5 一氧代一2 眯唑啉2 基的核单元，在 2 位和一个芳香性环( 通常是异环) 体系相连。这个家族的典型成员在图1 ，7 中列 出。 眯唑啉酮类化合物的使用范围是1 0 0 - - - 1 0 0 0 戢顷。眯唑啉酮比磺酰脲的能 力低t l o 倍。这个差别不能完全由a h a s 酶的不同的敏感性来解释。眯唑啉酮 抑制剂的使用浓度通常要求在u m 级别。昧唑啉酮除草剂可被植物茎叶及根系迅 速吸收，在木质部或韧皮部传导。因此它的有效性可能来自于易吸收、低的新陈 代谢作用和土壤保留这些特点的结合。它们对动物的毒性和磺酰脲的相似。 西 第一章前言 灭草喹 灭草烟 咪草烟 图1 7 典型的眯唑啉酮除草荆的结构 1 2 3 _ 3 三唑嘧啶类抑制剂 三唑并嘧啶类除草剂是继磺酰脲和咪唑啉酮类除草剂之后，由美国陶氏益农 公( d o we l a n c oc o m p a n y ) 发现的新的一类超高效除草剂，其活性和磺酰脲类除 草剂相当，用药量大约为3 0 克公顷，它的作用靶标仍然是乙酰乳酸合成酶 ( j o h n k i n g ，g m ，1 9 9 2 ) 。在图1 - 8 ( 1 ) 的三唑嘧啶磺酰胺( k l e s c h i c ke ta l ，1 9 9 0 ) ， r l 和r 2 位置是吸电子取代基，比如n 0 2 、c f 3 、喊c l ，比给电子基团更有活性。 在r 3 和r s 是烷基( 如甲基) 或烷氧基( 如甲氧基) 取代基比h a l o 或h a l o a l l y l 基团对 a h a s 的抑制水平更高。后来又合成了一些新的三唑嘧啶磺酰胺，比如用喹啉衍 生物代替了芳香环( 图1 8 ( 2 ) ) 。图4 给出的例子中都是在 l 毛n m 浓度范围对a h a s 酶 有抑制作用的。 r 2 r 1 o ，n 吖n v r 5 椭飞一 r 。 r 3 ( 1 ) t r i a z o l o p y r i m i d i n es u l f o a n i l i d e( 2 ) q u i n o l i n e l i n k e dt r i a z o l o p y r i m i d i n es u l f o a n i l i d e 图1 8 三唑嘧啶磺酰胺类除草剂的典型代表 1 2 3 4 嘧啶基水杨酸类抑制剂 嘧啶基水杨酸类除草剂是日本组合化学公司( k u m i mc h e m i c a li n d u s t r y ) 近年 来开发成功的一类新型a l i a s 抑制剂，此类除草剂以其超高效、广谱、低毒、低残 c 吼 1 ：广肌 n n o i s 0n h 第一章前言 留、高选择性和良好的环境相容性，而备受关注。嘧啶基水杨酸类( 图1 - 9 ( 3 ) ) 通常 有一个羧酸基或乙醛基部分作为y 取代基，而在z 位置的基团是烷基、烷氧基或 h a l o 基团。桥原子x 在真正的嘧啶水杨酸中是一个氧原子，尽管它可以被s 原子替 代。正如嘧啶基硫代苯酸锌( t h i o b e n z o a t e ) 除草剂嘧硫草醚( p y r i t h i o b a c ) = c o o h ，z = c 1 ) ，对玉米a h a s 是一个高效除草剂( w r i g h ta n dp e n n e r ，1 9 9 8 ) 。 z p y r i m i d y io x y b e n z o a t e 图1 9 嘧啶基水杨酸类除草剂的结构特征 抑制a h a s 酶的除草剂干涉了微生物组织和高等植物的生长。植物死亡需 要几周的时间。首先是分生组织枯死，然后是成熟组织缓慢坏死( s h a n e r , 1 9 9 1 ) 。 s c h e e l 曾报道在应用了抑制剂后，支链氨基酸的衰竭造成了这些变化( s c h e e la n d c a s i d a ，1 9 8 5 ) 。但r o y u e l a 在2 0 0 0 年报道，支链氨基酸的浓度并没有降低。随着 除草剂的应用，生理变化包括生理毒素a h a s 底物2 一酮丁酸盐或衍生物的累积 ( l a r o s s a , 1 9 8 7 ；r h o d e s , 1 9 8 7 ) ，氨基酸含量的不平衡( h i f g e n , 1 9 9 5 ) ，d n a 合成 和细胞分裂的抑f # i j ( s t i d h a m ，1 9 9 1 ) ，吸收易位作用的减少等( ma n dv a n d e nb o r n ， 1 9 9 6 ) 。对于除草剂引起的生长抑制和植物死亡的解释有两个，一是由于吸收易 位的抑制导致分生组织急需碳；二是由于a h a s 酶催化的反应被阻止了，造成 底物( 丙酮酸或2 酮丁酸) 的累积。 最近有一篇文献报道，使用除草剂一灭草烟后，叶子中的碳水化合物的累积 并没有造成根生长的抑制。在根部发现了丙酮酸的短暂性累积现象，这与丙酮酸 脱羧酶、乙醇脱氢酶和乳酸脱氢酶等的活性提高是一致的。即a h a s 酶活性的 破坏，伴随着发酵活性的提高；而发酵活性的提高可能与生长抑制和植物死亡有 关( g a s t o n ，2 0 0 2 ) 。除草剂导致生长阻滞的直接原因还不清楚，但它可能并不主要 是由于2 一酮丁酸盐的累积。除草剂的影响可以通过补充加入氨基酸来逆转 ( c h a l e f fa n dm a u v a i s ，1 9 8 4 ；l a r o s s aa n ds c h l o s s ，1 9 8 4 ；r a y ，1 9 8 4 ) 。 叱 c c 0 o 1 0 倍) 。在商 业用的玉米突变株i c l 8 5 3 2 i t 中也发现了相同的突变。 在拟南芥的相关位点( a 1 2 2 v ) 的相似突变用高度纯化的重组酶进行了广泛研 究( c h a n ga n dd u g 翻e b y ，1 9 9 8 ) 。这个纯化的拟南芥a 1 2 2 v 突变酶与野生型a h a s 酶的催化亚基相比较，是不稳定的，比活性降低了4 倍，但丙酮酸的k r a 值未受影 响，三个辅助因子的亲合性降低了5 2 0 倍。这个突变株对咪唑啉酮有1 0 0 0 倍的抗 性，对磺酰服只产生微弱的抗性f 最高至：l j 4 倍) ，对磺酰脲的微弱抗性与所观察到 的ec o l i a h a si i 等价突变的情况是相似的。然而，正如前面提到的，后者并没 有对咪唑啉酮显示出抗性。但这并不奇怪，因为细菌酶自然性地对咪唑啉酮( r a 第一章前言 值在m m 范围) 比真核酶更有抗性。c h o n g 等人报道了对烟草的相关位点a 1 2 2 t 进行的突变对l o n d a x ( 一种磺酰脲)