（食品科学专业论文）酸奶高产酸能力生产菌株的诱变选育.pdf

摘要f 菌种豹性能直接关系到酸奶度量的好坏，筛选出产酸力、感观、粘度等性能指标优一良的菌种，对生产高质量的酸奶意义重大。本试验以生产酸奶的两种常用乳酸菌保加利亚乳杆菌和嗜热链球菌的多个菌株为试验菌株，以诱变方法，筛选其首要特性产酸能力强的菌株。、首先从酸奶常用的两种菌种的众多菌株中筛选出t m l l l s 和b 3 作为出发菌株，它们的产酸力高于其它菌株。分别为5 7 6 56t 和5 4 4 3 。t 。由于发酵剂菌种产生的糖代谢酶，b 一半乳糖昔酶是胞内酶，通过对渗透压破壁和不同浓度的氯仿和甲苯两种有机溶剂破壁方法的比较，以及破壁所需温度和时间的研究，确定采用5 氯仿，4 5 ( 2 保温8 1 2 h 对菌体进行破壁，d 一半乳糖苷酶的活力采用a o a c提出的标准进行测定。菌体细胞在酸奶制品发酵过程中始终产生b 一半乳糖昔酶，并且随发酵时间的延长酶活力逐渐上升，乳糖经d 一半乳糖苷酶的分解产生乳酸，酸乳的p h 逐渐降低。对这两株菌采用紫外线和亚硝基胍进行诱变。确定t m l l l s 紫外线照射剂量为1s o s ，并得到一株产酸力为5 7 8 56t 的菌株，比原菌株产酸力提高了3 0 5 ，和n t g的诱变剂量是o 3 9 l 处理6 0 r a i n ，得到菌株产酸力为5 8 0 2 t ，较出发菌株提高了6 5 2 ，继续以紫外线和亚硝基胍复合诱变进行了3 轮，最终得到产酸力达8 3 6 6 。t 的诱变株t m l l l 一s - u v - n ，较出发菌株提高了3 0 “。选择b - 3 紫外线照射剂量1 2 0 s ，得到一株产酸度为5 5 9 6 。t 的菌株，比原菌株产酸力提高了2 引，经n t g 诱变剂量0 3 9 l 处理6 0 m i n ，得到一株产酸能力为5 7 8 3 。t 的菌株，较出发菌株提高了6 2 6 ，把b 3 通过3 次紫外和亚硝基胍复合诱变选育终于筛选到l 株产酸达8 2 6 5 。t 的诱变株b 3 - u v - n ，较出发菌株提高了3 0 0 3 。( 分别采用b 3 u v - n 和t m l l l - s - u v - n 两诱变菌株进行酸奶制作，其凝乳时间较出发菌株明显缩短，粘度有所提高，组织状态较好。，关键词酸奶：目g 埭；p 一半乳糖苷酶；诱变：育种(m u t a t i o ns c r e e n i n gh i g ha c i d p r o d u c i n ga c t i v i t ys t a i ni ny o g u r tm a n u f a c t u r ea b s t r a c tl a c t i ca c i db a c t e r i as t a r t e rp l a yai m p o r t a n tr o l ei ny o g u r tm a n u f a c t u r ei n d u s t r y t h ep e r f o r m a n c eo fl a c t i ca c i db a c t e r i as t a r t e re f f e c tt h eq u a l i t yo f y o g u r td i r e c t l y i ti si m p o r t a n tt oi r e p r o v et h et a s t eo fy o g u r tt os c r e e no u tf i n es t r a i nw h i c hh a se x c e l l e n tc h a r a c t e r so fa c i d - p r o d u c i n ga n ds t i m e p r o d u c ；x t g t h i se x p e r i m e n te m p l o ym u t a t i o ns c r e e r d n gs e l e c to u th i g ha c i d p r o d u c i n gb a c t e r i af r o ms t r e p t o c o c c u st h e r m o p h i l u s ( st ) a n dl a c t o b a c i l l u sb u l g a r i c u s ( l b 1 f i r s t l ys e l e c tt w os t a i n s ：t m l l1 一sa n db 3f r a ms ta n dlb s t a r ts t a i nt h ea c i d - p r o d u c i n ga b i l i t yo ft h et w os t r a i nw a sh i g h e rt h a no t h e r s t h ef i n a la c i d i t yo fy o g u r tf e r m e mb yt h et w ob a c t e r i aw a s5 7 6 5 ta n d5 4 4 3 丁r e s p e c t i v e l y b e c a u s et h eb g a l a c t o s i d a s ep r o d u c eb ys t a r t e ri sae n d o e n z y m ei tm u s ta b s t r a c ta f t e rt h ee e l lw a l lb r o k e n t h i se x p e r i m e n tc o m p a r et h ed i f f e r e n tm e t h o do fe e l lw a l lb r o k e na n dr e s e a r c ho f ft h ei n f l u e n c eo ft e m p e r a t u r ea n dt i m eo nc o n d i t i o no fe e l lw a l lb r o k e nt h eo p t i m u mc o n d i t i o r lo fe e l lw a l lb r e a ki s4 5 c h l o r o f o r m 4 s 9 r e s e r v a t i o n8 1 2h o u r s t h ea c t i v i t yo fb g a l a c t o s i d a s ew a sm e n s u r a t eb yt h em e t h o dp r o v i d e db ya o a c t h es l a r t e rc a r lp r o d u c eb g a l a c t o s i d a s et h r o u g h o u tt h ep r o c e s so fy o g u r tm a k i n g w i t i ly o g u r tf e r m e n te x t e n dt h ea c t i v i t yo ft h ee n z y m eg e th i g h e r l a c t o s ei nt h em i l kw a sd e c o m p o s eb ybg a l a c t o s i d a s ea n dt h ep hv i i u ew a sd e c r e a s eg r a d u a l l y 、u l t m v i e l e ta n d n t g w e r ee m p l o y e d l o m u t a t e t m l l l 一s a n db 一) f r i s t l yt m l l l ，s _ a 5e x p o s e di nu l t r a v i o l e t1 5 0 so b t a i n i n gan e ws t a i nt h ea c i d p r o d u c i n ga b i l i t yo ft h en e ws t a i nc a nr e a c h5 7 8 5 。ti n c r e a s e3 0 5 t h e nb e f o r e w h e nt m l l l sw a sd i s p o s e db y3 9 ln t g6 0 r a i n sc a no b t a i nan e ws t a i nw h i c ha b i l i t yo fa c i d - p r o d u c i n gc a nr e a c h5 8 0 2 。ti n c r e a s i n g6 。5 2 t h e nb e f o r e t h e nd i s p o s e dt h ep e ws t a i n 姆u v + n t gf o u rt i m e so b t a i n i n gan e ws t a i nt m l11 s uv _ nw h i c ha c i d p r o d u c i n gc a nr e a c h8 3 6 6 。ti n c r e a s o3 0 6 4 t h a nb e f o r e s e c o n d l yb - 3w a se x p o s e di nu l t r a v i o l e t1 2 0 so b t a i n i n gan e ws t a i nw h i c ha c i d - p r o d u c i n ga b i l i t yc a nr e a c h5 5 9 6 。ti n c r e a s e2 8 1 w h e nb - 3w a sd i s p o s e db y3 9 ln t g6 0 m i n sc a no b t a i n i n gan e ws t a i nw h i c ha c i d p r o d u c i n gc a nr e a c h5 78 3 。ti n c r e j l s e6 2 6 ，t h e nd i s p o s e dt h en e ws t a i nb yu v + n t gf o o rt i m e so b t a i n i n gen e ws t a i nb ，3 u v i _ nw h i c ha c i d - p r o d u c i n gc a nr e a c h8 2 6 5 。ti n c r e a s e3 0 0 3 e m p l o y e dt h en e ws t a i n sb - 3 一u v na n d1 m l ll - s u v - nt om a n u f a c t u r ey o g u r t t h ec o a g u l a t i o nt i m ew a ss h o r t e ro b v i o u s l y , t h et e x t u r ew a sf i n ea n dt h ev i s c o s i t yw a si m p r o v e dm a s t e rc a n d i d a t e ：m ac h u n l im a i o r ：f o o ds c i e n c es u p e r v i s o r ：p r o f z h a n gl a n w e ik e yw o r d sy o g u ma c i d i t y ；b - g a l a c t o s i d a s e ；m u t a t i o n ；s c r e e r i n gh l前言1 前言1 1 发酵乳酸乳多是以鲜牛奶为原料，经乳酸菌发酵转化得到的一种酸性适中的凝聚半固状奶制品( 沈辉，2 0 0 0 ) ，在销售前必须保持微生物活性，不得含有任何致病菌。它具有与液体奶完全不同的芳香风味和爽口感。1 1 1 发酵乳的功能由于菌株的协同发酵及风味物质的添加形成了酸乳独特的口味。嗜好性和对人体的健康作用，使得近2 0 多年来，全世界发酵乳的消费量逐渐增大，已形成多种风味物料和不同菌株联合作用的形态万千、功能各异的乳制品系列。乳酸菌发酵乳的保健作用主要体现在它能通过胃，并在肠道定植的活性细菌体本身的作用；不能通过胃，而被胃酸杀灭的细菌体细胞壁成分；乳酸菌代谢产物；原料乳中固有的和被乳酸菌分解的成分实现的。随着近年来对肠道内微生态环境的研究的不断深入，在肠道内定植的益生菌群的抗病、防衰等作用受到人们的极大关注，出现了以双歧杆菌和嗜酸乳杆菌为发酵剂的功能性发酵乳制品。乳酸菌的保健作用主要表现在以下一些方面：1 1 对胃肠道菌群的调节作用。健康人体中肠内菌群相当稳定，但可能因食物、药物、环境等因素影响而变化。发酵乳中的乳酸菌可以达到排除致病菌、维持肠道菌群平衡的作用。它利用营养及上皮细胞的吸附竞争作用，以防止致病菌在肠道的定植，或者由于大量乳酸菌的存在，形成生物膜造成屏蔽作用而防止致病菌接近上皮细胞；乳酸菌产生的有机酸降低肠道p h 值，抑制嗜碱性病原菌的生长，对嗜酸性微生物有利，促进厌氧菌丛的生长：或产生抑菌素、抗生素及脱结合型的胆酸等抑制致病菌的生长( 贾士杰，2 0 0 0 ) ：乳酸菌还能促进肠道的蠕动，具有整肠作用。2 1 增强乳营养成分的吸收。乳糖是乳制品中存在的主要碳水化合物，乳糖摄入人体后，经小肠乳糖酶作用，分解成葡萄糖和半乳糖。乳酸菌含有乳糖酶，可以分解乳中的乳糖，作为重要营养物质被吸收( 董开发，2 0 0 0 ) 酸奶中蛋白质的消化吸收率是牛乳中蛋白质的两倍。基于这种事实，酸奶3 h 的消化吸收性能至少是牛乳6 h 的7 0 ( 顾瑞霞，2 0 0 0 ) 。游离氨基酸约比牛奶增加4 倍，多肽类也增多，从而容易受消化酶作用，易于吸收( 骆承庠，1 9 9 6 ) 。脂肪球小。易于消化：低级脂肪酸高而容易代谢：必需脂肪酸含量较多，胆固醇和脂肪代谢优丁- 牛乳( 张延利1 9 9 7 ) 。3 ) 提高矿物质的吸收。乳糖及其分解产物乳酸对于钙、磷吸收利用有重要作用：l g a r a s h i等人对含有乳清钙、乳果糖和长双歧杆菌发酵乳的分析表明，其中钙的含量为o 0 1 能明显提高股骨骨骼特性( 折断能和折断力) ，提高对乳清钙的吸收率。同样半乳糖低聚糖也能提高钙的吸收率。摄入低聚糖后，能在较低肠段促进挥发性脂肪酸的产生，从而使可溶性钙浓度提高，钙的吸收率也提高，使骨骼结构得到了改善。o d a 等人采用血红蛋白再生方法测定了铁生物可利用性，认为发酵乳比脱脂乳的铁生物利用率高。东北农业大学工学硕士学位论文也有人报道乳杆菌菌株也是重要的潜在有机硒源。4 ) 对机体免疫系统的促进。乳酸菌及其酶的作用，分解乳中物质，使乳成分更有利于消化吸收促进消化道功能的改善，进而提高身体各部分器官的免疫力( 刘屹峰，2 0 0 2 ) ：抗肿瘤免疫反应中，巨噬细胞的杀瘤作用具有重要的意义。许多研究结果表明，乳酸菡及其发酵产品，均能激活机体的免疫系统，特别是巨噬细胞、n k 细胞和b 淋巴细胞，而对t 细胞本身无直接作用。v e s e l y 等人对鼠的饲喂试验发现，活菌和热处理的酸奶，至1 5 天均能提高鼠的i g g 2 。和i g m 的活性。网状内皮细胞吞噬作用活性增强。来自于乳酸苗发酵乳或医疗制剂的外源乳酸茵比肠道周有乳酸菌具有更强的免疫促进作用，而且混合菌种比单一菌株的促进作用强。5 ) 对肿瘤的抑制作用。一些乳酸菌能耐受胃部不利条件而到达肠道。它代谢产生的乳酸、醋酸等有机酸，及一些细菌素。抑制有害微生物的生长，促进胃肠蠕动，减少致癌物质与上皮细胞的接触以抑制粘膜上皮细胞的再生形成不乖j 于粪便酶作用的环境。粪便酶能催化致癌前体物质向致癌物质转化，乳酸菌对这酶有抑隶4 作用。乳酸菌诱导n o ( 一氧化氮) 的产生，n o 在哺乳动物机体的物质代谢、信息传递以及防御疾病等方面起重要作用，目前很多证据表明，n o 的诱导合成是活化的巨噬细胞杀伤肿瘤细胞的主要机制之一。一些研究表明，一些乳酸菌可通过抗宪变作用以达到抗肿瘤的目的。致癌作用是通过具有致痔物诱导细胞突变开始的，乳酸菌可抑制细胞的突变。h o s o n o 报道了德氏乳杆菌保加利亚亚种、乳酸乳杆菌乳酸亚种制作的发酵乳，对4 - 硝基喹啉- n o x i d e 以及大肠埃希氏杆菌b r w p 2 t r p h e r 的诱导的突变作用具有抑制活性。乳酸菌参加或干扰肿瘤细胞物质的代谢途径。6 ) 发酵乳还具有降胆固醇作用、控制内毒素、延缓机体衰老、抗辐射等保健功效。7 ) 它不含或微含乳糖，对因缺乏乳糖酶而对牛奶过敏的人群更有益处。1 1 2 发酵乳的发酵机理酸乳品种繁多但是其制作过程和发酵的机理是共同的。嗜热链球菌和保加利亚乳杆菌是生产酸奶的常用菌。液体奶发酵凝乳的原理主要是由于在温度适宜时，食用微生物在液体奶中生长、繁殖、发酵，在茵体乳糖酶的作用下分解乳糖为葡萄糖和半乳糖并进一步分解产生乳酸，使得奶液的酸度缓慢增加，p h 值逐渐降低，钙盐的溶解度逐渐增蠢日；这些变化使得奶液中蛋白质( 主要是酪蛋白) 大分子中天冬胺酸残基和谷胺酸残基等的酸性离子化功能减弱，进而引起蛋白质分子表面活性鸵降低，蛋白质分子形成微小的亚胶体分子团，使得液体奶粘度增加；亚胶体分子团受到奶液中磷酸钙的作用而相互连接形成胶体分子团：胶体分子团再缓慢聚集成均质的水食蛋白质网络半固状凝乳-即为酸乳( 沈辉2 0 0 0 ) 。发酵酸乳的制作，经历杀菌、微生物接种、发酵凝乳、终止发酵、冷藏、包装等过程其中以微生物接种和发酵凝乳过程较为重要。菌种的性能直接关系到酸乳的质量。1 2 乳酸菌产酸机理酸奶中的酸度主要来源于乳酸菌将乳中的乳糖发酵分解成的乳酸。乳酸可降低胃的p h 值，促进乳蛋白质的消化吸收，抑制砀追内有害菌的生长，有益入体的健康。另外酸奶的酸度能增进产品的风味。增加人们的食欲。酸奶的最佳酸度在8 0 1 2 0 。t 之间，消费者可根据个人的不同口味选择不同酸度的酸奶。1 2 1 乳糖的代谢途径乳酸菌发酵可分为同型乳酸发酵和异型乳酸发酵，同型乳酸发酵乳糖只产生乳酸，异型乳酸发酵乳糖除产生乳酸外，还生成乙醇，二氧化碳等物质。德氏乳杆菌保加利亚亚种、唾液链球苗嗜热亚种是生产酸奶的常用菌，研究表明，乳糖的代谢途径在粪链球菌、乳链球菌、金黄色葡萄球菌和乳酪乳杆菌等是相同的，乳糖是通过依赖磷酸烯醇式丙酮酸( p e p ) 的磷酸转移酶系统( p t s ) 和渗透酶系统( p e r m e a s e )代谢途径，p e p ：p t s 系统由酶1 1 ( e i i l a c t o s e ) 、外膜蛋白酶i i i ( f a c t o r l l l l a c t o s e ) 组成，乳糖在体内积累后，先磷酸化然后由磷酸一b 一半乳糖苷酶( p b - g a l ) 水解，产生d 一葡萄糖和d 一半乳糖一6 一磷酸，葡萄糖的代谢通过糖酵解途径，而半乳糖一6 一磷酸则通过d 一塔格糖一6 一磷酸途径代谢。渗透酶系统是将乳糖转运到细胞膜内，再由e 一半乳糖苷酶水鳞为半乳糖和葡萄糖( 冉雪琴2 0 0 3 ) 。德氏乳杆菌保加利亚亚种和唾液链球茁嗜热亚种通过一半乳糖苷酶的途径对乳糖进行代谢。对二菌株研究表明，此二菌株对乳糖的代谢方式为同型乳酸发酵，乳糖经透膜酶被转运到细胞内，经e 一半乳糖昔酶催化，产生葡萄糖和半乳糖葡萄糖经糖酵解途径生成乳酸和能量；而半乳糖不被利用被排除细胞外( 孟昭赫，1 9 9 3 ) 。保加承j 亚乳秆菌与嗜热链球菌的乳藉代谢机制见图1 - 1 。乳糖| 乳透膜酶乳糖b g a l a c t o s i d a so 予细胞半乳塘囤卜1l b 、s t 菌乳糖的代谢机制f i g i 1t h em e t a b o l i cm e e h a n i s mo f l b ds to nl a c t o s e嗜热链球菌和保加利亚乳酸杆菌的口一半乳糖苷酶的活性范围分别为1 4 5 - - 2 3 5 u g培养物和0 - 44 5 u l g 培养物。已经证实乳酸杆菌产生大量的b - 半乳塘苷酶和极少或者没有b 一磷酸半乳糖苷酶。然面，嗜温链球菌主要利用0 一磷酸半乳糖苷酶。因而极少占有或没有1 3 一半乳糖苷酶。相比之下已有报告称嗜热链球菌不是拥有等量的二种酶，就是b一半乳糖苷酶高于8 一磷酸半乳糖苷酶的量( b a 弗林得。1 9 9 4 ) 。31 2 2 乳酸菌发酵乳糖产酸的机制乳品发酵的首要目的是产生乳酸，并以此降低p h 值而抑制许多腐败微生物的生长，赋予产品特异酸味，形成凝胶状态。乳酸的产生是在2 5 种以上的复合酶体系的共同作h j下分解乳糖产生( 吕加平，2 0 0 2 ) 。这一途径主要是产生能量，而乳酸只是种副产品t有关糖发酵的调控机制研究较多，为改良菌株打下了一定基础。乳糖代谢基因的表达调控在这些微生物中是相当复杂的。法国人，j a c o b 和m o n o d对大肠杆菌的乳糖操纵子现象提出了乳糖操纵子学说，并且近年来有研究表明，嗜热链球菌、保加利亚乳杆菌都存在类似乳糖操纵子的结构( h e r m a n ，r e 1 9 8 6 k l i s e r om1 9 8 9 ) ，乳糖操纵子学说有助于更好的研究乳酸菌的乳糖代谢机制。e c o l i 的d n a 上有关乳糖操纵子的结构包括：调节产生有活性的阻遏蛋白，它能结合操纵基因( 0 ) ，阻止r n a 聚合酶的基因i通过，不能转录。诱导物乳糖可以跟它结合，使其失活，不能结合操纵或r基因( 或从操纵基因上掉下来) ，转录得以正常进行。控制启动子( p ) ：r n a 聚合酶的驻地操纵基因( o ) ：能被有活性的阻遏蛋白结合，阻止r n a 聚合酶的通过，元件不能转录。结构z ：产生半乳糖苷酶( l a c t z )y ：产生透性酶( l a c t y )基因x ：产生转乙酰酶( l a c t x )乳糖操纵子模型的作用机理是培养基中不含有乳糖时，调节基因产生的阻遏蛋白有活性，它能结合操纵基因( o ) 。使操纵基因关闭，阻止r n a 聚合酶的通过不能转录，即t 3 半乳糖苷酶不能转译生成，培养基q ，j n - j * g 糖时，乳糖作为诱导物与阻遏蛋白结合，使其失活，不能结合操纵基因( 或从操纵基因上掉下来) ，使操纵基因开启，转录得以正常进行，即转译生成b 一半乳糖苷酶分解乳糖。1 2 3 酸奶常用两种菌株的b 一半乳糖苷酶一般特性b 一半乳糖苷酶催化1 3 一半乳糖苷类化合物中1 3 一半乳糖苷键，使其发生水解断裂，除能使乳糖分解生成半乳糖和葡萄塘外，还具有转半乳糖苷的作用。已知b 一半乳糖营酶的活性位点有两个功能团：硫氢基和眯唑基，其中硫氢基可作为广义酸使半乳稽苷的氧原子质子化，眯唑基可作为亲核试剂进攻半乳糖分子的第一个碳原子上的亲核中- t l , ( 王璋，1 9 9 0 ) 。在乳糖发酵过程中，1 3 一半乳糖苷酶的性质非常重要。保加利亚乳杆菌的b 一半乳糖苷酶最适温度是5 0 ，最适p h 值为7 0 ，分子量约为1 5 9 k d ，其活性在5 5 c 时被完全抑制，同时也被金属离子( 如a f ，h 9 2 + ) 所抑制：在p h 值为3 5 时，此酶的活性非常低，表现为乳糖不能被利用。嗜热链球菌的p 一半乳糖苷酶晟适温度是5 t c ，最适p h4前言值为6 6 7 0 ，分子量约为6 0 0 0k d ，其活性被金属离子a f ，h 9 2 + ，c u ”所抑制( r a m a n a r d u t a s m 1 9 8 1 ) 。1 3 菌株的诱变筛选酸奶质量的好坏决定于菌种的性能。筛选出产酸力、感观、粘度等性能指标优良的菌种，对生产高质量的酸奶意义重大。对乳酸菌进行诱变，筛选高性能菌株的报道并不多。采用经紫外线( u v ) ，硫酸二乙酯( d e s ) ，弧硝基胍( n t g ) 复合诱变从乳酸菌中筛选出一株超氧化物歧化酶( s o d )产鬣较高的菌株( 迟乃玉。2 0 0 1 ) 。对乳酸菌进行诱变筛选高产酸性能菌株并未见报道。控制乳酸生成的基因主要位于染色体上，对乳链球菌c ：及n 组菌株的研究表明( d o n a l sl b ，1 9 7 4 ：m i c h a e lj g ，1 9 8 0 ：w o l f e tw 1 9 8 4 ) ，分解乳糖的b 一半乳苷酶基因位于质粒上，乳糖代谢由质粒控制。冉雪琴等( 1 9 9 8 ) 以紫外线和溴乙锭对乳链球菌6 0 3 0 和6 0 2 5 菌株诱变，筛选出乳糖代谢障碍突变体，经质粒d n a 检测和s o u t h c m 印迹杂交分析，证实乳链球菌乳糖代谢能力的丧失与含有乳塘代谢基因的大质粒有关。乳耱代谢中的酶基因上产生了胸腺嘧啶二聚体，突变的部位和数量不同对乳糖利用能力的影响不同。控制乳酸生成的部分基因已被克隆，通过基因工程来提高产酸率很有前途，但由于合成乳酸基因十分复杂，目前还不十分清楚，所以通过基因工程改良菌种的这一途径是艰难的( c o l l i n s m a ，1 9 9 2 ) 。而通过筛选、驯化及生长促进因子的选择来提高产酸力仍不失为一种行之有效的方法( 吕加平，2 0 0 2 ) 。生产酸乳制品乳酸菌菌株的筛选不能像其他生产乳酸的乳酸菌的筛选，产酸力越高越好。产酸力虽是一个重要指标，但需依据消费者的1 2 1 味来选择适度的产酸力，而且更要注重产品的风味和组织状态，应能使制品的风味和组织结构良好。因此菌株的筛选要进行综合指标的考查。诱变育种是利用物理或化学诱变剂处理均匀分散的微生物细胞群，促进其突变率大幅度提高，然后采用简便、快速和高效的筛选方法，从中挑选少数符合育种目的的突变株，以供生产实践或科学研究用( 贾慧娟，2 0 0 2 ) 。当前发酵工业和其他生产单位所使用的高产菌株几乎都是通过诱变育种而大大提高了生产性能的菌株。诱变育种除能提高产量外，还可达到改善产品质量、扩大品种和简化生产工艺等目的。诱变育种具有方法简单、育种速度快、可以在短期内使微生物某些特性得到大幅度的改良，并可不断满足生产发展所提出的新要求，故仍是目前被广泛使用的主要育种方法之一。本试验选择诱变育种。筛选满足生产要求的优良乳酸菌。1 3 1 诱变剂在人工的物理化学诱变因素作用下菌株的突变率得以大大提高。把能诱发基因突变，并使突变率提高到超过自发突变水平的物理或化学因子称为诱变剂。诱变剂有物理因素如紫外线、x 射线、y 射线、快中子；化学因素如碱基类似物、5 氟尿嘧啶、烷化荆等。在物理诱变剂中紫外线使用最广。诱变高产突变株有很优异的效果方法简单、快速、效果明显的优点：在化学诱变剂中，亚硝基胍对每一细胞可有诱发一次至多次的效力，故有“超级诱变剂”之称。本试验采用紫外线和亚硝基胍作为诱变剂。1 3 2 诱变育种机理i 3 2 1 紫外线诱变机理紫外线是一种最常用的简便而有效的物理诱变剂它是波长短于紫色可见光而又紧接紫色光的射线，波长范围是1 3 “3 0 0 n m 其最有效作用波长2 6 0 n m ，目前诱变处理常使用2 0 w 的紫外灯，诱变作用较好。紫外线诱变所需设备包括在暗室中装有带稳压装置的2 0 w 紫外灯，下部装一台电磁搅拌器，灯管悬挂高度离台面2 0 c m ，并安有红灯。紫外线的诱变机理主要是由于它引起d n a 分子结构变化。波长2 6 0 n m 左右紫外线技核酸强烈吸收。引起d n a 变化。紫外线对生物体的作用有箕独特的缝方。它只作甩于细胞的一定部分即细胞核的部分。紫外线引起d n a 结构形式的变化种类很多，包括：1 ) d n a 链或氢键的断裂。d n a 链的断裂破坏了核糖和磷酸间的键联。而氢键的断裂使两条链分离：2 ) d n a 分子内或分子问的交联；3 ) 核酸与蛋白质的交联；4 ) 胞嘧啶的水合作用；5 ) 形成胸腺嘧啶二聚体。嘧啶对紫外线要比嘌呤敏感一百倍，经紫外线照射后，易形成折叠式结构胸腺疃啶二聚体。鹅艨磕睫二聚体的形式有在寓一链中阊韵，也有在两链之间的。二聚体的出现会减弱双链问氢键的作用，引起d n a 双链结构扭曲变形，阻碍碱基间的正常配对，从而引起突变或死亡。这是紫外线引起突变的一个主要原因。紫外线诱变的缺点是易光复活，光复活在自然界是一个比较普遍的现象，经紫外线照射后有两种形式的光复活。一种是直接光复活，即经过可见光照射后大部分损伤可以恢复，甚至看来已显示死亡的细菌也复活了。c l a u d 指出，这种光复活作用是通过光激活酶而发生的，而这种酶可以使胸腺睦啶的二聚体解开而重新成为单体，使d n a分予恢复正常，故其突变性质很不稳定，易在菌种传代和外界因素刺激的条件下恢复原来的性状，另一种复活是间接复活，也叫黑暗复活，认为细胞在黑暗中减慢了大分子合成的过程，这样更有利于某些细菌能够产生恢复紫外损伤的d n a 的酶，而这种酶的产生是不需要可见光的，它包括由特殊的棱酸酶把含有胸腺嘧啶二聚体的d n a 链形成单链、切断二聚体、修复、复制而形成新的d n a 的双螺旋。对于有光复活作用的苗，照射以后必须避免把菌悬液放在长波紫外光和短波可见光中。紫外线诱变剂量的测定可以分直接法和间接法两种。直接法需使用特殊的物理计量仪才能测定，测定照射的绝对量。单位以尔格平方毫米袭示。在菌种诱变中不需要测定绝对剂量。问接法测定有两种方法一种是以时闻作为相对剂量单位：另一种是用致死6率作为相对剂量单位。实际工作中多采用固定紫外线的功率( 一般用2 0 w ) 和灯与皿之间的距离( 一般2 0 c m ) ，而以时间作为相对剂量单位，因此剂量就和照射的时间成正比关系。有人认为应采用高剂量照射，可造成菌体致死率在9 0 - - 9 9 9 时的剂量是合适的，这样能获得较高的正突变率，并且淘汰了大部分菌体减轻了筛选工作的负担。许多人倾向于选用低剂量( 致死率在8 0 一9 0 ) ，他们认为低剂量处理能提高正突变率，而负突变较多的出现在偏高的剂量中( 李浪，1 9 9 4 ) 。紫外线照射为求照射均匀，照射前先开灯预热2 0 m i n ，使光波稳定。放菌悬液的培养皿底要平整，要有摇动或电磁搅拌设备。为防止菌体光复活，照射后操作须在红灯下进行，将处理后的菌悬液进行增殖培养期间，可用黑纸包住。1 3 2 2 亚硝基胍诱变机理n 甲基n 硝基- n 一亚硝基胍，( n m e t h y l - n7 - n i t r o - n n i t r o s o g u a n i d i n e ) ，简称m n n g 或n t g ，是已知的较有效的诱变剂之一，在适宜条件下，能在较小的死亡率下得到较大的突变率。n t g 的浓度和突变比例之间的关系是复杂的，在0 1 1 0 m g m l 间的不同浓度下可得到不同种类突变体的最高产量。它是与一个或多个核苷酸碱基直接起化学作用的诱变剂。当n t g 在p h 低于5 5 5 的条件下会形成h n 0 2 ，而h n 0 2 本身是个诱变剂，n t g在碱性条件下会形成重氮甲烷( d i a z o m e t h a n e ，c h 2 n 2 ) ，它是引起致死和变异的主要原因，它的效应很可能是重氮甲烷对d n a 的烷化作用引起来的。在p h 6 时两者均不产生，此时的诱变效应可能是由于n t g 本身对核蛋白体引起的变化所致( 微生物诱变育种编写组，1 9 7 3 ) 。在可见光下，n t g 会放出n o ，使颜色由土黄色变为黄绿色，所以须避光保存。亚硝基胍的使用方法是配制一定浓度的亚硝基胍溶液，需现用现配，将处于对数生长期的细菌菌体用缓冲液做成悬浮液，细菌悬浮浓度约为1 0 0 1 07 个m l ；加入n t g 溶液，使最后作用浓度为0 1 1 0 9 l ：在菌体生长温度保温若干时间，适当稀释铺皿。本实验采用单因素诱变后将二者结合复合诱变，不断提高菌株的产酸能力。1 4 乳糖酶活力测定在乳糖发酵过程中，菌株的1 3 一半乳糖苷酶的活性是非常重要，直接关系到产酸力。菌株产乳糖酶，最关键的检测数据为乳糖酶活力。测定乳糖酶活力的方法有几种：根据反应过程中溶液旋光值的变化计算反应速度；采用葡萄糖氧化酶一过氧化氢酶一色素原测定反应中生成的葡萄糖的量，也可以计算反应的速度；根据反应过程中还原糖量的变化计算反应速度这个方法由于乳糖也是还原糖因而反应体系具有高的空白值，给测定带来很大困难：采用一种生色的化合物作为底物，经乳糖酶催化水解后，就转变成一种有色物质，于是很容易用分光光度计测定反应的速度。目前邻一硝基酚b d 半乳糖苷是乳糖酶最佳的生色底物这不仅是因为用分光光度法能非常方便的测定酶催化反应的速度，而且还由于在底物浓度低于使酶饱和的水平时的反应速度相当于采用乳糖作7为底物的3 0 0 倍( 王璋，1 9 9 0 ) 。当然也有资料报道，o n p g 和乳糖作为底物时是有差黝的( k i m s h ，1 9 9 7 )酶的主要指标是其活性，一般用“单位”表示。这与酶可以催化的作用物数量有关。就整个行业来说，有很多种技术方法用于铡定酶的活性，所以要直接比较酶的活性，就要说明所采用的方法。关于乳糖酶活力的描述并没有统一的标准，很多生产乳糖酶制剂的厂家出售产品时以不同的自身测定方法为基础定义降解酶活单位，a o a c 用酶显色定量方法测定工业酶制备中的中性乳糖酶活性，使乳糖酶制品可以在相同单位定义和相同方法下进行比较，以n l u 表示乳糖酶的活性，其定义为在实验室条件下，每分钟从培养基邻一硝基酚一b o - 吡喃半乳糖营中释放出l3 r e t o o l 邻一硝基苯酚量( a d r i a t x u s ，j f 9 9 9 ) 。p r o m a g e 公司推出了b 一半乳糖苷酶酶活力测试系统，用b 一半乳糖苷酶对照载体转染镪胞后。可用一半乳糖苷酶酶活力泓试系统直接、方便地测试一半乳糖替酶酶活力。微生物产生的乳糖酶是胞内酶，传统的方法需破壁获得乳糖酶，破碎微生物细胞的方法很多，如自溶法、机器破碎法、冻融法、超声波破壁法等，每种方法需经比较来采用。可采用现代生物拄术和膜技术，在一定的温度和p h 条件下，对细胞进行渗透性处理一定时间，改变细胞壁和细胞膜的通透性，使细胞的乳糖酶表现活力大大增加，底物及水解产物更易于进出细胞，进行透性化细胞乳糖酶的生产。也有采用基因重组方1 法将酶自行分泌胞外，外源新乳糖酶基因于宿主毕赤酵母中得到高效表达，其表达产物乳糖酶分泌于胞外。1 5 酸奶缓解乳糖不耐症作用利用发酵乳中活菌所具有的内源性b 一半乳糖苷酶来分解乳糖，有利于机体吸收，对因缺乏乳耱酶而对牛奶过敏的人群有很大益处。人体内能够分解肠腔内乳糖的酶只有位于小肠粘膜刷状缘的乳糖酶。可将乳糖分解成葡葡糖和半乳糖等单糖，才能在小肠内吸收。乳糖酶缺乏就是指小肠粘膜刷状缘的乳糖酶的活性低下，发酵乳能够改善乳糖不耐症的代谢障碍，1 5 1 乳糖吸收障碍和乳糖不耐症牛奶中的主要碳水化合物是乳糖，它是由半乳糖和葡萄糖通过b 一1 ，4 一糖苷键构成的双糖，在牛奶中的含量为4 5 4 7 ，占牛乳中总糖量的9 9 8 。在正常情况下，这些乳糖应该在人体小肠内乳糖酶酌作用下，水解成葡萄糖私半乳糖后吸收并进入血液，乳糖吸收障碍和乳糖的不耐症主要是由于小肠粘膜上乳糖酶活力较低所致。有乳糖不耐症的人摄入牛奶等含乳糖食物后，由于体内缺乏内源性乳糖酶，而不能将乳糖消化吸收，由于乳糖得不到水解，小肠内乳糖浓度的提高，使得渗透压增高，从而导致进入肠腔内水分含量提高，其产生的症状是腹部压力增高，气涨急性腹痛和腹泻。因此，在慢性腹泻或其他非特殊的腹部症状的情况下。将怀疑乳糖的吸收障碍t世界上至少有9 0 的成年人有不同程度的乳糖酶缺乏症，成年人仅保留了初始乳糖酶活力的5 0 一1 0 。婴儿体内乳糖酶活力平均为每克蛋白质2 9 个酶单位，耐受乳糖酶的8前言人为1 7 个酶单位，乳耱酶缺乏的成年人为3 个酶单位。乳糖酶的缺乏似乎并不取决于年龄平性别。乳糖吸收障碍和乳糖酶缺乏定义如下( 顾瑞霞，2 0 0 0 ) ：1 ) 假如乳耱酶活力真正较低，或者酶活力试验每克粘膜酶活力低于2 个单位，则摄入标准乳糖后( 每公斤体重2 9 ，最大5 0 9 ) ，就会出现低血耱曲线，血糖含量提高很少或仅提高到2 5 r a g i o o m l ；2 ) 由于乳糖酶活力低，从而降低乳糖的吸收；3 、乳糖酶活力低的人，摄入标准的或较低的乳糖水溶液后，出现乳糖不耐症的临床症状：4 ) 由于乳中乳糖含量在临床上表现为乳糖酶活力较低的人，摄入通常量后的几个小时后出现。1 5 2 乳糖酶缺乏发生人群乳糖不耐症在世界范围内是一种多发疾病，易发人群很有特点，主要有以下几种情况( 骆承庠，2 0 0 1 ) ：1 ) 正常的成年人。这是最常见的、最主要的乳糖不耐症群体，这种情况主要是由于遗传原因。世界上至少9 0 的成年人有不同程度的乳糖不耐症，成年人体内的乳糖酶活力仅为婴儿时的5 - - 1 0 ，婴儿体内乳精酶的活力平均为2 9 u g 蛋白质，耐受乳糖成年人为1 7u g 蛋白质，乳糖酶缺乏的成年人仅为3u g 蛋白质。家族患病遗传研究发现，乳糖酶的缺乏是遗传的。2 ) 由于很稀有的先天性疾病，有些人在刚出生时就缺乏乳糖酶活性，这将导致严重的肠胃系统失调。如果不能及时供应无乳糖的食品，这将是致命的。3 ) 有一种人群，其不正常的低乳糖酶活性是由于早产造成的，其乳糖酶活性通常在至二月又完全恢复。4 ) 具有一种蛋白质热值吸收障碍症的严重营养不足的儿童，其乳糖酶活性在一个时期内会暂时消失。5 ) 由于肠道手术，其乳糖酶活性会暂时消失一个月或更长。1 5 3 乳糖不耐症的不良后果全脂牛奶中约3 0 的热量和脱脂奶中的6 0 热量是由乳糖提供的，个别人由于乳糖不耐症，而不能充分利用这种能量，万一身体的能量需要不能完全得到满足，蛋白质就不能作为构成人体蛋白的单元，而将被用于满足能量需要；对于乳糖不耐症的病人来说，乳糖不能吸收，它就会被肠道微生物作为一种碳水化合物的来源，由此导致的肠胃系统失调，并造成有价值的蛋白质和矿物质的损失( 高亚滨，1 9 9 7 ) 。由于乳糖吸收不良，会影响到对牛乳中钙的吸收，同时半乳糖能促进脑甙和粘多糖的生成，而这两种营养物质是婴幼儿大脑发育的必要成分。有乳糖不耐症的幼儿，如不能锝到充足的半乳糖，可能影响其智力发育。9东北农业大学工学硕士学位沦文鼍鼍置曩皇e m , i _ _ 田量_ 墨，_ _ 墨田_ 曩_ e ! 曼! j _ 墨置詈曼曼詈! ! 摹曩i1 5 4 酸乳对乳糖酶缺乏和乳糖不耐受的作用机制酸乳通常是牛乳中按种了德氏乳杆菌保加利亚亚种和嗜热链球菌经一定时间和温度发酵后得到的半溺体的乳翩品。酸乳中乳酸菌含量常为 1 0 。个，m l p h 为3 9 46经发酵后的酸乳与牛- y l l 较，在营养价值方面有了更迸一步的提高。发酵乳通过降低产品中乳糖含量或通过乳酸菌提高胃肠区域的消化吸收性能来改善乳糖的耐受性。乳糖酶的缺乏通常是相对的，不能因乳糖吸收障碍。丽不食用含乳糖食物，对乳糖吸收障碍患者，食入正常量的乳和乳制品不会引起任何不适感。如每日饮用2 5 0 m l 乳不仅能满足人们平衡膳食营养需要，而且不会产生任何不良反应。乳糖酶缺乏患者，大量摄取发酵乳，不会出现与乳糖不耐症有关的症状发生。发酵乳与低脂乳相比，其乳糖含量仅为后者的一半( 分别为2 4 - 2 6 和5 ) 。乳豹乳酸萄发酵，具有降低乳糖吸收障碍和乳祷不耐症作用。我们知道，乳中不含有乳糖酶，但酸奶发酵微生物德氏乳杆菌保加利亚亚种和唾液链球菌嗜热亚种具有乳糖酶的活性，乳酸菌均具有乳糖酶活性。但嗜温性乳酸菌，如乳酸乳球菌、乳脂乳球菌的1 3 一半乳糖苷酶活性技低。唾液链球苗嗜热亚种产生的乳糖酶活性是德氏乳杆菌保加剥亚亚种的3 倍。在酸奶生产中乳糖酶的矮性，随着发酵的进行括性逐濒增高。 l 糖酶结合在细菌细胞膜上，酸奶菌种在模拟胃消化系统中培养时，该酶会释放，且活性得到提高。因此饮用发酵乳不必担心乳糖吸收障碍。在发酵乳制作过程中。因乳酸菌的利用，部分乳糖被代谢，并产生乳酸、半乳糖( 0 2 0 3 ) 、葡萄糖( 痕量) ，最终在人体内进一步代咐而加以利用。含有乳酸菌的乳制品可以帮助乳糖不耐受患者消化乳糖，这是由于乳酸菌在发酵过程中可以产生乳错酶2 0 - 3 0 的乳糖被乳酸茵中b 一半乳糖苷酶分解，乳糖含量较鲜乳明显下降，易于消化吸收。酸乳稠密、粘度大，可延长胃排空和胃肠转运时间使小肠乳糖酶和酸乳中乳杆菌有更多时间分解乳糖，酸乳中含有活的乳酸菌，当随同酸奶摄入人体其代谢产物日一半乳糖营酶可增加小肠乳糖酶水平，缝续进行乳糖分解作用。每天饮用酸乳拓，i 周后，机体肠道菌群可发生有意改变，乳杆菌等益生菌增多，从而改善机体对乳糖的消化能力( j i a n gt 1 9 9 6 ；何梅tt 9 9 9 ) 。人们尚未发现营养价值高同时又经济实惠的可代替乳制品食品，采取措施预防控制乳糖不耐受很有必要。如：避免食用乳制品，但乳制品是良好钙质的主要来源，因此机体很难获得充足的钙质；食用不舍或含极微量乳糖的乳秘品，此方法是可行的，但这类食品含大量的饱和脂肪和热能，食入过多对机体有害；目前市场上出现了特殊的乳制品如低乳糖乳制品、乳糖酶添加剂或口服乳糖酶制剂。这些产品价格昂贵，并且国外有研究发现乳糖酶制剂的作用并不都完全一致：限制一天中乳糖总量多次食用。此外乳制品与肉和含脂舫的食物一同摄入也可减少不耐受症状，这一方法较易为人们接受，但由于需记录全天乳制品的摄入量使该方法受到一定的限制；以发酵乳尤其是酸乳代替鲜乳能同时改善乳稽消化不良和乳糖不耐受，食用方便，无特殊要求，目前最为人们青睬。利用发酵乳中活菌所具有的内源性b 一半乳糖苷酶来分解乳糖利于机体吸收是一条简单1 0前言易行的解决办法( 汪川。1 9 9 9 ) 有对照研究表明乳糖不耐受者能更好地耐受和吸收含有等量乳糖的活菌酸奶( g i l l i l a n ds e ，1 9 8 3 ) ，因为这种酸奶中含有的活菌具有内源性e 一半乳糖苷酶能分解乳话利于机体吸收。m i c h e l e a s 等( 1 9 9 5 ) 研究表明活菌酸奶能显著减轻症状。他提出这是因为活菌酸奶能延迟产物氢峰值浓度出现的时间和降低氢呼气曲线的上升斜率。j i a n g t 等( 1 9 9 6 )研究发现：含有用乳糖培养基筛选的双歧杆菌的活菌牛奶能降低氢呼气量并减轻症状，这可能是由于双歧杆菌的乳糖诱导现象。g i l l i l a n d ( 1 9 8 3 ) 研究发现。乳酸菌可将胆酸解离成动物可以