（食品科学专业论文）鲜蛋沙门氏菌的分离鉴定及生物学特性研究.pdf

摘要 沙门氏菌是肠杆菌科中威胁畜禽产品安全的重要病原菌之一，广泛存在于肉类、 禽类、蛋类或其他动物性食品中。本试验从呼和浩特采集的5 0 份鸡蛋样品中分离沙 门氏菌，采用传统分类方法，从菌体形态特征和生理生化特性水平进行鉴定，以了解 鸡蛋被沙门氏菌污染的情况，同时从鸡肠道内和鸡饲料内进行分离，了解产蛋过程中 沙门氏菌的分布情况。对分离的菌株进行3 0 、3 7 、4 0 生长模型分析，了解在 不同温度下菌数随时间的变化趋势。对菌株在6 0 、7 5 下的失活曲线进行分析， 了解其菌数随时间是否呈直线型下降。并了解在营养缺乏时沙门氏菌形成生物被膜的 情况，为内蒙古带壳鸡蛋中沙门氏菌安全性评估提供有利依据。结果表明，沙门氏菌 生长的最适n a c l 浓度范围为0 5 - - - 一3 ，最适p h 值范围为6 0 一- 9 0 ，最适生长温度 范围为2 5 4 0 。生长模型分析结果表明，3 0 营养肉汤中沙门氏菌的生长曲线 用r i c h a r d s 模型拟合较好。其回归模型为： 上o g n t2 石万面8 7 4 赢7 2 2 8 两2 3 7 c 营养肉汤中沙门氏菌的生长趋线用m m f 模型拟合较好。其回归模型为： ， 3 8 11 6 9 5 1 7 1 3 8 0 9 6 + 8 5 2 8 8 2 7 t 4 8 7 0 0 5 8 5 l o g n t2 2 6 8 5 瑟82 6 7 i 1 4 5 7 丽f 一 + ”5 4 0 c 营养肉汤中沙门氏菌的生长曲线用m m f 模型拟合较好。其回归模型为： ， 一一1 4 0 2 6 1 9 8 5 7 6 2 4 l2 4 + 9 0 7 1 8 5 3 8 t 2 “3 7 3 蔼 l o g n t 2 历i 函页7 丽赢一 温度失活模型表明，沙门氏菌分离株在6 0 和7 5 营养肉汤中其菌数的对数值随时 间呈线性下降，且l i n e a r 方程拟合情况较好。沙门氏菌在1 一4 d 生物被膜内活菌数呈 上升趋势，第4 d 达到最大值。随培养天数的增加，生物量显著增加，到7 d 时几乎覆 盖整个载体表面。外膜蛋白s d s p a g e 分析表明，该菌主要蛋白微孔蛋白( p o r i n ) 位于3 6 - - 4 1k d a 之间，另外在2 5k d a 与1 4k d a 附近显示多条次要蛋白带。 关键词：沙门氏菌；鸡蛋；分离鉴定；生物学特性；生长模型：生物被膜 i s o l a t i o na n di d e n t i f i c a t i o no f s a l m o n e l l af r o me g g sa n d b i o l o g i c a lc h a r a c t e r i s t i c s a b s t r a c t s a l m o n e l l ar e s i d i n gi nm e a t , p o u l t r y ，e g g sa n do t h e ra n i m a lf o o di so n eo fi m p o r t a n t p a t h o g e n i cb a c t e r i at h r e a t e n e dl i v e s t o c kp r o d u c t si ne n t e r o b a c t e r i a e e a e t ou n d e r s t a n dt h e c o n d i t i o no fc o n t a m i n a n te g g sb ys a l m o n e l l a , s a l m o n e l l a 、；l ，a ss e p a r a t e df r o me g g sb y t r a d i t i o n a lm e t h o da n di d e n t i f i c a t e do nt h a l l u sm o r p h o l o g i cc h a r a c t e r i s t i c sa n db i o l o g i c a l c h a r a c t e r i s t i c s m e a n w h i l e ，s a l m o n e l l aw a ss e p a r a t e df r o mc h i c k e ni n t e s t i n ea n dc h i c k e n f e e d st ou n d e r s t a n dt h ed i s t r i b u t i o no fs a l m o n e l l a g r o w t hm o d e lo fs e p a r a t e ds t r a i no f f3 0 、3 7 、4 0 a n di n a c t i v a t i o nc u r v e so n6 0 、7 5 w e r em a d et op r o v i d ep r o o f f o r s a l m o n e l l as a f e t ya s s e s s m e n t i ti ss h e l w e dt h a to p t i m a ln a c lc o n c e n t r a t i o nw a s0 5 3 p hw a s6 0 - - 9 0 g r o w t ht e m p e r a t u r er a n g ew a s2 5 - 4 0 g r o w t hm o d e lr e s u l t s s h o w e dt h a tg r o w t hm o d e 2o fs a l m o n e l l a0 n3 0 w a sf i n i n gf o rm o d e lr i c h a r d sa n d r e g r e s s i o nm o d e lw a s ： 舭2 石丽8 赢7 4 7 2 砸2 8 2 g r o w t hm o d e lo fs a l m o n e l l ao n3 7 cw a sf i t t i n gf o rm o d e l 吼伍a n dr e g r e s s i o nm o d e l w a s ： ，一3 8 1 1 6 9 5 1 7 1 3 8 0 9 6 + 8 5 2 8 8 2 7 x t 4 舢0 5 8 5 俐。2 6 8 5 8 磊2 6 再7 蕊矿一 。 + ，4 3 7 伽5 g r o w t hm o d e lo fs a l m o n e l l ao n4 0 c w a sf i t t i n gf o rm o d e lm m fa n dr e g r e s s i o nm o d e l w a s ， 1 4 0 2 6 1 9 8 5 7 6 2 4 12 4 + 9 0 7 1 8 5 3 8 f 2 6 4 3 7 3 7 8 三刑2 百万面丽i 丽两广一 i n a c t i v a t i o nc u r v e sr e s u l t ss h o w e dt h a tl o gv a l u eo fs a l m o n e l l ao n6 0 a n d7 5 w e r e l i n e a r l yd e c l i n e dw i t ht i m ei n c r e a s e da n di n a c t i v a t i o nc u r v e sw a sf i t t i n gf o rm o d e ll i n e a r v i a b l ec o u n ti nb i o f i l mo fs a l m o n e l l ai n c r e a s e dd u r i n g1 - - 4 d a y sa n dr e a c ht h em a x i m a l v a l u eu n t i lt h ef o r t hd a y , a n dm o s t l yc o v e rt h ew h o l es u r f a c eo nt h es e v e n t hd a y s d s p a ( 拒r e s u l t ss h o w e dp o r i nw h i c hi st h em a i np r o t e i nh a sm a j o rb a n d sa t4 1 - 3 6k d a a n ds e c o n d a r yb a n d sa t2 5 ，14k d a k e yw o r d ：s a l m o n e l l a ；e g g s ：i s o l a t i o n ；i d e n t i f i c a t i o n ；b i o l o g i c a lc h a r a c t e r i s t i c s ；g r o w t h m o d e l ；b i o f i l m o ir e c t e db y - p r o f y i nw e n z h e n g a p pl ic a n tf o rb a s t e rd e g r e e ：l iuxia o c h u a n ( f o o ds c i e n c e ) ( c o l l e g eo f f o o ds c i e n c ea n de n g i n e e r i n g , i n n e rm o n g o l i a a g r i c u l t u r eu n i v e r s i t y , h u h h o t0 1 0 0 1 8 ，c h i n a ) 图1 图2 图3 图4 图5 图6 图7 图8 图9 图1 0 图l l 图1 2 图1 3 图1 4 图1 5 图1 6 图1 7 图1 8 图1 9 图2 1 图2 2 表1 表2 表3 表4 表5 表6 表7 表8 插图和附表清单 n a c l 浓度对沙门氏菌生长的影响1 7 p h 值对沙门氏菌生长的影响1 7 温度对沙门氏菌的影响1 8 g o m p e r t z 方程拟合的3 0 营养肉汤中沙门氏菌的生长曲线1 9 l o g i s t i c 方程拟合的3 0 营养肉汤中沙门氏菌的生长曲线1 9 r i c h a r d s 方程拟合的3 0 营养肉汤中沙门氏菌的生长曲线2 0 m m f 方程拟合的3 0 营养肉汤中沙门氏菌的生长曲线一2 0 g o m p e r t z 方程拟合的3 7 营养肉汤中沙门氏菌的生长曲线2 2 l o g i s t i c 方程拟合的3 7 营养肉汤中沙门氏菌的生长曲线2 2 r i c h a r d s 方程拟合的3 7 营养肉汤中沙门氏菌的生长曲线2 3 m m f 方程拟合的3 7 营养肉汤中沙门氏菌的生长曲线2 3 g o m p e r t z 方程拟合的4 0 营养肉汤中沙门氏菌的生长曲线2 5 l o g i s t i c 方程拟合的4 0 营养肉汤中沙门氏菌的生长曲线2 5 r i c h a r d s 方程拟合的4 0 营养肉汤中沙门氏菌的生长曲线2 6 m m f 方程拟合的4 0 营养肉汤中沙门氏菌的生长曲线2 6 6 0 营养肉汤中沙门氏菌的失活曲线2 8 l i n e a r 方程拟合的6 0 营养肉汤中沙门氏菌的失活曲线2 8 7 5 营养肉汤中沙门氏菌的失活曲线2 9 l i n e a r 方程拟合的7 5 营养肉汤中沙门氏菌的失活曲线3 0 牛血清蛋白标准曲线3 2 o m p s 的s d s p a g e 图谱分析3 2 考马斯亮蓝测定蛋白质浓度1 3 鸡蛋中三糖铁琼脂和尿素酶琼脂菌株筛选1 4 鸡蛋中可疑菌株生化试验结果1 4 鸡肠道中三糖铁琼脂和尿素酶琼脂菌株筛选1 5 鸡肠道中可疑菌株生化试验结果1 6 3 0 营养肉汤中沙门氏菌的生长模型拟合参数2 l 3 7 营养肉汤中沙门氏菌的生长模型拟合参数2 4 4 0 营养肉汤中沙门氏菌的生长模型拟合参数2 7 内蒙古农业大学 研究生学位论文独创声明 本人申明所呈交的学位论文是我本人在导师指导下进行的研究 工作及取得的研究成果据我所知，除了文中特别加以标注和致谢阿 地方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包 含为获得我校或其他教育机构的学位或证书而使用过的材料，与我一 同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说 明并表示谢意 申请学位论文与资料若有不实之处，本人承担一切相关责任 论文作者签名：迎经1 日期：立型：兰：7 7 if 内蒙古农业大学研究生学位论文版权使用授权书 本人完全了解内蒙古农业大学有关保护知识产权的规定，即：研 究生在攻读学位期闻论文工作的知识产权单位属内蒙古农业大学本 人保证毕业离校后，发表论文或使用论文工作成果时署名单位为内蒙 古农业大学，且导师为通讯作者，通讯作者单位亦署名为内蒙古农业 大学学校有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的多印件和电 子文档，允许论文被查阅和借阒学校可以公布学位论文的全部或部 分内容( 保密内容除外) ，采用影印，缩印或其他手段保存论文 内蒙古农业大学硕士学位论文 1 引言 1 。1 沙门氏菌概述 1 1 1 沙门氏菌的生理生化特性 沙门氏菌( s a l m o n e l l a ) 是肠杆菌科中的一个属，大小为l - 3 x o 5 - l g m ，革兰 氏阴性，兼性厌氧，非芽孢短杆菌。大多数有周身鞭毛，能运动；猪霍乱沙门氏菌 ( s g a l l i n a r u m ) 和鸡白痢沙门氏菌( s p u l l o r u m ) 没有运动性。对营养要求不高，在 普通培养基上即可生长，在液体培养基中呈均匀混浊生长。它们的最佳生长温度大约 为3 7 c ，最低生长温度为5 c ，最适p h 为6 8 - - 7 8 。沙门氏菌能发酵葡萄糖产酸产 气，可以代谢甘露醇、麦芽糖和卫芽醇，但不能代谢乳糖和蔗糖，大多数产生硫化氢， 不液化明胶，不分解尿素，不产生吲哚，v p 试验阴性，有赖氨酸脱羧酶n 。 1 1 2 沙门氏菌的抵抗力 沙门氏菌具有中等程度的抵抗力，在培养基上可以存活2 - 3 周，由于没有芽孢， 它们对热相对敏感，6 0 、1 5 - 2 0r a i n ( d 6 2 8 ：o 0 6r a i n ) 即可被杀死，1 0 0 立即死 亡。在禽舍内，3 7 可存活2 周，在5 的石炭酸中，5m i n 死亡。对于低温的抵抗 力较强，细菌培养物在一1 0 1 1 5 天后尚能生长。在水中存活2 3 周，在动物尸体 内可存活1 0 0 天，在干燥的泥和砂子内可生存2 - - 3 个月，在干燥的排泄物中可以保 持生命力达4 年之久。在含2 9 食盐的腌肉盐水中，在6 1 2 的条件下，能生存4 8 个月，一般常用的消毒药品对沙门氏茵均有杀伤能力，但不易彻底消灭。随着抗菌 药物耐药菌株日益增多，对药物的敏感性越来越低。目前，大多数菌株能抵抗青霉素、 链霉素、土霉素、磺胺类药物等，对庆大霉素、氯霉素、呋喃唑酮等有较高的敏感性 【2 】。 1 1 3 沙门氏菌的抗原结构 沙门氏菌主要有o 和h 两种抗原。少数菌具有表面抗原，功能与大肠杆菌的k 抗原相似，般认为与毒力有关，故称、，i 抗原。o 抗原为脂多糖，性质稳定，能耐 1 0 0 达数小时，不被乙醇或o 1 石炭酸破坏。决定0 抗原特异性的是脂多糖中的多 糖侧链部分，以1 、2 、3 等阿拉倍数字表示。0 抗原刺激机体主要产生l g m 抗体。h 抗原为蛋白质，对热不稳定，6 0 经1 5r a i n 或乙醇处理被破坏。具有鞭毛的细菌经 甲醇溶液固定后，其o 抗原全部被h 抗原遮盖，而不能与相应抗o 抗体反应。h 抗 原的特异性取决于多肽链上氨基酸的排列顺序和空间构型。沙门氏菌的h 抗原有两 种，称为第1 相和第2 相。第1 相特异性高，又称特异相，用a 、b 、c 等表示，第2 相特异性低，为数种沙门氏菌所共有，也称非特异相，用l 、2 、3 等表示。具有第1 相和第2 相h 抗原的细菌称为双相菌，仅有一相者称单相菌。每一组沙门氏菌根据h 抗原不同，可迸一步分种或型。h 抗原刺激机体主要产生lgg 抗体。抗原与毒力 2 鲜蛋沙门氏蓖的分离鉴定及生物学特性钓研究 有关，由聚m 乙酰d 半乳糖胺糖醛酸组成。不稳定，经6 0 加热、石炭酸处理或 人工传代培养易破坏或丢失。抗原存在于细菌表面，可阻止o 抗原与其相应抗体 的反应。抗原的抗原性弱也3 1 。 1 2 沙门氏菌的危害 1 2 1 对畜禽产品的危害 沙门氏菌广泛分布于自然界，是对入类和动物健康有极大危害的一类致病菌。由 它引起的疾病主要分为两大类：一类是伤寒和副伤寒，另一类是急性肠胃炎，其中鼠 伤寒沙门氏菌( s t y p h i m u r i u m ) 、猪霍乱沙门氏菌、肠炎沙门氏菌( s e n t e r i t i s ) 等污 染畜产品，进而引起人类沙门氏菌食物中毒的主要致病菌。据世界卫生组织总干事 g r oh a r l e nb r u n d f l a n d 博士的报告，1 9 8 5 年以来，在世界范围内，由沙门氏菌引起 的已确诊的人类患病人数显著增加，在一些欧洲国家己增加五倍。在我国内陆地区， 由沙门氏菌引起的食物中毒屡居首位。据资料统计，在我国细菌性食物中毒中，有 7 0 , - - - 8 0 是由沙门氏菌引起，雨在引起沙门氏菌中毒的食品中，约9 0 是肉、蛋、 奶等畜禽产品。肉、蛋、奶等畜禽产品中含有多种丰富的营养成分，非常适宜于沙门 氏菌的生长繁殖，人们一旦摄入了含有大量沙门氏菌( 1 0 5 - 1 0 6 c f u g ) 的畜产品，就会 引起细菌性感染，进而在毒素的作用下发生食物中毒。据英国公共卫生实验室服务部 门近期宣称，近三年中，一批由西班牙进口到英国的鸡蛋因含有沙门氏菌，造成英国 有史以来最严重的疾病感染，仅在2 0 0 2 年9 月份，就有至少2 5 0 名英国人因食用了 这种鸡蛋而感染上沙门氏菌肠炎，目前已导致2 人死亡，1 0 人住院治疗。由此可见， 沙门氏菌等微生物污染已对我们的食品安全构成了主要的威胁。 沙门氏菌广泛存在于猪、牛、羊和家禽以及鸟类、鼠类等各种动物的肠道、内脏 及周围环境中。据调查国内屠宰猪禽中几乎都不同程度地存在沙门氏菌带染现象，其 中猪的阳性检出率达1 0 7 - 3 4 8 ，鸡的阳性室可达3 0 - - 5 0 ，鸭的检出率更高。 国内外已有大量资料证实畜禽的肉、乳、蛋有被沙门氏菌污染的现象。1 9 7 0 年荷兰 报道，屠宰猪的带染率达3 0 1 ，并发现最常见的1 5 型沙门氏茵。日本报道屠宰猪 的沙门氏菌污染检出率：胴体3 3 、分割后的四肢肉7 1 1 。美国哥伦市零售鸡 肉沙门氏菌污染率从1 9 5 0 年的0 9 上升到1 9 8 7 年的4 3 。据报道沈阳市个体经销 的猪肉的带菌率为1 2 9 。1 9 8 9 年1 9 9 1 年陕西省十城市农贸市场鲜销猪肉沙门氏 菌阳性检出率为1 6 0 3 。水产品、乳及乳制品都可检出沙门氏菌。沙门氏菌对动物 性食品的污染已成为公共卫生上一个重要课题，其污染途径一是内源性污染，另一是 外源性污染即在屠宰加工时污染或在贮存、运输、销售过程中受到环境污染。引起沙 门氏菌食物中毒的食品主要是肉类及其制品，特别是急宰动物，其次是蛋、奶、鱼、 虾等。1 9 5 3 年瑞典一次大规模沙门氏茵食物中毒，致使7 7 1 7 人发病，死亡9 0 人。 1 9 7 3 年美国共发生细菌性食物中毒6 7 0 起，沙门氏菌食物中毒6 2 起，占第三位。7 0 内蒙古农业大学硕士学位论文 3 年代中后期美国加拿大食源病中约有4 0 系沙门氏菌引起。美国1 9 7 8 年 1 9 8 8 年平 均有7 4 0 0 0 0 病例。国内沙门氏菌食物中毒也屡见不鲜，据山东省济宁市卫生站报道 1 9 7 9 年1 9 8 9 年济宁市发生了沙门氏菌食物中毒6 6 起，占细菌性食物中毒的4 4 9 ， 中毒人数2 7 2 9 人，占5 4 3 ，死亡4 人。1 9 9 0 年内蒙某地2 2 人因吃病猪肉而发生 1 8 人沙门氏菌食物中毒，发病率8 1 8 ，死亡1 人。遵化县1 9 8 6 年1 9 9 1 年发生 食物中毒2 起，中毒人数3 1 人。牡丹江市城区1 9 7 2 年 - 1 9 9 2 年因食用肉及肉制品 而发生食物中毒1 0 起，占细菌性食物中毒的5 0 ，中毒人数7 0 7 人，占6 3 ，0 7 t 霹。 鉴于沙门氏菌对人类健康的严重危害，目前世界各国政府对畜产品中沙门氏菌的 限量标准均制定出非常严格的规定，包括欧盟委员会、食品法典委员会( c a c ) 、国际 食品微生物规格委员会( i c m s f ) 和美、英、法、日及我国等3 0 多个国际权威机构和 国家发布的食品微生物的限量标准中，对肉、蛋、奶类畜产品中沙门氏菌的规定均为 不得检出，为所有微生物限量标准中的最严格级。 1 2 ，2 对禽蛋的危害 蛋类由于营养丰富，且适于微生物的生长，所以蛋类容易受到污染，最典型的是 沙门氏菌引起的污染。我国是禽蛋生产与消费的大国，2 0 0 0 年年产量2 2 4 3 3 万吨， 超过世界总产量的4 0 ，全国人均1 8 1 埏，超过发达国家水平。其中禽蛋产量的8 5 为鸡蛋，鸡蛋消费在我国食品消费中占重要地位嘲。 沙门氏菌引起的沙门氏菌病无论在发达国家还是发展中国家都是最频繁报导的 食源性疾病之一。据卫生部中毒年报报道1 9 9 1 年 - 1 9 9 6 年我国由蛋类引起的食物中 毒为1 6 6 起，中毒人数4 2 0 7 入。 研究发现，对天然或人工感染沙门氏菌的母鸡所生产的鸡蛋，污染部位主要存在 于蛋清与蛋黄膜。蛋清中所含的抑菌物质不利于细菌的生长，而蛋黄中的营养物质可 以使细菌快速生长繁殖。鸡蛋内细菌的生长依赖于蛋黄膜通透性的增加。随着保存时 间的增加，蛋黄膜开始在分子水平发生变化，这种变化使得污染蛋内的沙门氏菌得到 生长所需的蛋黄膜内的营养物质。除非蛋黄膜通透性已经发生了变化，否则，污染鸡 蛋里的沙门氏菌菌量几乎很小或不发生变化，这一时期称为迟滞期。一旦蛋黄膜的通 透性足够使沙门氏菌生长，鸡蛋内的细菌就会繁殖。此外，沙门氏菌从外界侵入肛门， 然后再卵巢内定居繁殖，在蛋壳形成之前导致了蛋的沙门氏菌污染，从而在蛋黄中能 够分离到沙门氏菌。受污染的无精蛋会导致蛋制品污染，受精蛋则导致孵化出的小鸡 呈现全身性的慢性感染，从而造成后代蛋制品的污染口一。 1 2 3 对人体的危害 在世界各地的食物中毒中，沙门氏菌引起的中毒病例占第一或第二位。沙门氏菌 食物中毒是一类常见且危害性较大的细菌性食物中毒。该菌引起的食物中毒全年皆可 4 鲜蛋沙门氏菌的分离鉴定及生物学特性的研究 发生，但主要发生于夏季炎热季节，特别是6 - 9 月份，气温高、细菌易于繁殖，发病 率最高。沙门氏菌食物中毒和隐性感染者可摊菌数周至数月，也可成为传染源。传播 方式主要为摄入染菌而未煮透的食物或饮料，手指接触及苍蝇媒介亦可传播，污染水 源可引起暴发流行。人群普遍易感，感染后因菌种、菌量和宿主免疫状态不同可出现 不同的症状。婴幼儿发病较多，老年和有消耗性慢性疾病者容易感染。胃肠道感染后 抗体消失较快，无牢固的免疫力。沙门氏菌在食物中大量繁殖的同时，死亡的菌体裂 解后释出内毒素。若此种食物未经合理烹调，食物即有大量活菌和内毒素侵入人体， 从而引起胃肠道炎症反应和全身中毒症状。由于严重泻吐，大多数病原菌及毒素被迅 速排出体外，少数瘸原菌则从肠壁侵入血流而引起菌血症。病变一般局限于胃肠道， 主要有粘膜充血、水肿及点状出血等病理改变，严重者可有散在溃疡咖。 沙门氏茵食物中毒主要呈现急性胃肠炎症状，约占7 0 ，起病急骤，潜伏期6 7 2 d 时，一般为1 2 2 4 d 时。病初表现头痛、恶心、面色苍白、出冷汗，以后出现呕 吐、腹痛、腹泻、体温上升n 3 8 - 4 0 ，大便呈稀水样，量多，粪质很少或无，有 时带脓血，大便每_ 匿数次至数十次，重病者呈现寒战、惊厥、抽搐和昏迷等，甚至发 生脱水、酸中毒、循环衰竭而死亡。近年来，由鼠伤寒沙门氏菌引起的肠炎发病率逐 渐增高，且病情较重，细菌的耐药性较强。病人大多以发热和腹泻起病，大便为绿色 粘液或脓血便，具有腥臭味。成人高热较少，熟程较短，但腹痛及里急后重多见。儿 童则高热较久，大便性状多种多样，时常伴有呕吐和脱水。婴幼儿病死率较高。一般 于发病2 - - 3 日后急性中毒胃肠炎症状消失，病人即恢复健康，死亡率较低。其中毒 机理一般认为，沙门氏菌侵入机体引起全身感染，当沙门氏菌在肠系膜淋巴结和网状 内皮细胞被破坏，释放出毒力较强的内毒素，因此，沙门氏菌食物中毒一般认为是属 于感染型食物中毒，它分为两个过程，即感染过程和中毒过程。近年来发现，某些沙 门氏菌如鼠伤寒沙门氏菌能产生肠毒素，并证明该肠毒素可导致腹泻。 败血症型常见于儿童或原有慢性疾病者。有急起的高热、寒战、出汗及程度不等 的胃肠症状，少数可无胃肠道症状。热型不规则，持续1 3 周不等。如有化脓性并发 症，热程可迁延数月，并有肝脾肿大，偶有黄疸。此型常见致病菌为猪霍乱沙门氏菌 和丙型副伤寒杆菌。 类伤寒型表现类似轻型伤寒，但其病程短，症状较轻。有持续发热、全身倦怠、 腹痛、腹泻、相对缓脉，皮疹少见。此型常见致病菌为猪霍乱沙门氏菌和鼠伤寒沙门 氏菌。此外，尚有类感冒型、类霍乱型，并有相应的临床表现。 1 3 畜禽产品中沙门氏菌的检测方法 沙门氏茵是一类分型非常复杂的细菌，目前，在全世界范围内己知的血清型已超 过2 0 0 0 个，我国现己发现有2 1 6 个。对畜产品中沙门氏菌的检测具有周期较长、程 序较复杂、所需试剂繁多等特点，但随着科学技术的日薪月异，特别是免疫学、生物 内蒙古农业大学硕士学位论文 5 化学、分子生物学等的不断发展和成果运用，人们现已创建了不少快速、简便、特异、 敏感且适用的对沙门氏菌的检测方法，目前正逐步运用于畜产品安全的检测工作中。 常规检测方法为g b t4 7 8 9 乒2 0 0 3 ，该法是目前国家规定的对畜产品中沙门氏 菌的标准检测方法n h 幻。它主要是根据沙门氏菌生物特征，采取前增菌、选择性增菌、 分离培养、生化鉴定和血清分型五个步骤进行。在具体实践中用此方法检测畜产品中 的沙门氏菌时，应注意根据不同的样品采取不同的检测步骤。对沙门氏菌污染较轻或 在加工过程中使沙门氏菌处于不活跃状态的畜产品，为了能够分离出沙门氏菌，必须 经过前增菌培养，使畜产品中的沙门氏菌恢复活力；对于未经加工的生鲜畜产品，则 不必进行前增菌培养，直接进行选择性增菌，使沙门氏菌得以增殖，而使大多数的其 它菌受到抑制，再进行分离，可以提高沙门氏菌的检出率。 目前，包括我国在内的许多国家对沙门氏菌的检验普遍采用传统培养方法，报告 检验结果大致需4 - 5 天，加之检验方法繁琐、费时费力，不仅成为检验部门的一项沉 重负担，而且越来越不能满足日益发展的国际贸易的需要。上世纪5 0 年代以来，为了 寻求快速、准确、简便、微量的检验方法，国内外学者进行了大量的研究，从以传统 方法为基础发展到以免疫学为基础的或以分子生物学为基础的快速检测方法，并在实 践检验中不断取得新进展。 1 4 畜禽产品中沙门氏菌污染的控制 畜禽产品中的沙门氏菌污染一般分为内源性污染和外源性污染两个方面“甜。所谓 内源性污染，是指活畜禽已经患有沙门氏菌病，如猪副伤寒、牛肠炎、鸡白痢等，这 些患病畜禽不但其血液、内脏、肌肉中均可能含有大量的沙门氏菌，甚至在其卵中也 可能会含有沙门氏菌，如鸡蛋。健康的鸡所产的蛋中是不含沙门氏菌的，但蛋鸡一旦 感染了沙门氏菌病，蛋壳形成前，经卵巢污染，产卵时污染，其体内的沙门氏菌就可 能进入蛋内。外源性污染则是指畜产品在屠宰、加工、运输、储藏和销售过程中，受 到污水、粪便、加工工具等的污染而感染沙门氏菌。因此，要有效控制畜产品中沙门 氏菌的污染，就必须针对其污染源，有区别地采取不同的监控措旖。 对沙门氏菌污染的控制，应把污染控制的焦点放在其首要环节一养殖场，从源头 上确保畜产晶不受沙门氏菌的污染n 帕。在这方面瑞典是一个很好的例子，过去十年来， 瑞典设法将畜禽类中的沙门氏菌消除，从而有效地避免了畜产品中沙门氏菌的污染。 他们的做法是建立良好的畜禽生活环境，对养殖场的环境卫生、畜体卫生、饮水和饲 料卫生等所有环节进行严格控制，保证畜禽饲养的环境能有效防止沙门氏菌的传播。 据我国四川省近年来对全省动物性饲料原料的抽检结果，该省的动物性饲料原料中， 沙门氏菌的检出率高达2 0 - - 3 0 。这充分说明，饲料和饮水等是造成畜产品沙门氏 菌内源性污染的重要因素。其次，应加强对畜产品加工、流通环节的监管。要求生产 加工企业严格遵循畜产品安全生产技术规程，降低生产加工过程中沙门氏菌污染的危 6 鲜蛋沙门氏葱的分离鉴定及生物学特性的研究 险，对上市前的畜产品进行强制性抽检，确保受污染的畜产品不能进入市场。三是严 格执行有关畜产品安全的法律法规，以法律的手段来约束整个畜产品生产链所有参与 者的行为，尽量避免引起由沙门氏菌污染的畜产品而引起食物中毒的发生。总之，在 畜产品生产的整个链环中，对养殖、加工、销售等各个环节应全面推行h a c c p ( 危 害分析关键控制点) 系统管理，即以沙门氏菌的流行病学为开端，沿着畜产品生产链 一直追溯到养殖场实行全面控制，并将控制的重点放在对人类健康的直接危害上。只 有这样，才能确保畜产品在到达消费者时是安全的，实现，健康畜禽一安全畜产品一 健康人类”的最终目标。 1 ，5 沙门氏菌生物被膜 1 5 1 生物被膜 生物被膜( b i o f i l m ) 国内也有学者翻译为细菌生物膜，是指细菌粘附于接触表面， 分泌多糖基质、纤维蛋白、脂质蛋白等，将其自身包绕其中而形成的大量细菌聚集膜 样物n 刀。除了水和细菌外，生物被膜还可含有细菌分泌的大分子多聚物、吸附的营 养物质和代谢产物及细菌裂解产物等。因此，生物被膜中存在各种主要的生物大分子 如蛋白质、多糖、d n a 、r n a 、肽聚糖、脂和磷脂等物质。多糖基质通常是指多糖 蛋白复合物，也包括由周边沉淀的有机物和无机物等。广义的生物被膜还包括真菌、 原生动物及多种生物复合形成的生物膜。据有关专家估计，其中约6 5 人类细菌性感 染是由生物被膜引起的n 懿。 生物被膜的概念及形成生物被膜是细菌为适应自然环、有利于生存而特有的生命 现象n 砒。任何细菌条件成熟时都可以形成细菌生物被膜；细菌生物被膜的形成是一个 动态过程，可用一个发育环的形成进行描述一。( 1 ) 游走细菌接受环境中的营养信 号，通过鞭毛或其他附着结构识别并牢固地附着于固体表面；( 2 ) 细菌在附着的调节 膜生长、分裂和繁殖，并不断有其它游走细菌继续附着，最终导致附着位点的细菌生 长空间极度拥挤，有毒的代谢产物堆积，细菌得不到充足的营养。( 3 ) 细菌在竞争压 力下启动细胞闻信号系统，产生细胞间信号，并在信号系统调节下，一边分泌胞外多 糖，一边在固体表面轻轻移动，最终胞外多糖粘结单个细菌形成多细胞蘑菇样和柱状 亚单位，多个亚单位形成成熟的细菌生物被膜涩棚1 。( 4 ) 从细菌生物被膜脱离的游走 细菌可以再次粘附，生长分裂，分化形成新的细菌生物被膜，形成细菌一细菌生物被 膜游走细菌细菌生物被膜的循环往复。一些大块的膜从生物膜上分离，造成食品 的污染，或者在生产线上形成新的生物膜。 生物被膜的存在具有普遍性。在自然界、某些工业生产环境( 如食品工业和废水 处理) 以及人和动物的体内外，绝大多数细菌是附着在有生命或无生命物体的表面， 以生物被膜方式存在，而不是以浮游( p l a n k t o n i c ) 方式存在。生物被膜的形成是细 菌为适应自然环境而采取的一种生存策略。当营养物质缺乏时，微生物易粘附于含有 内蒙古农业大学硕士学位论文 7 机物质的加工设备表面，形成生物被膜。生物被膜中的细菌无论其形态结构、生理、 生化特性还是对抗菌药物的敏感性都与普通浮游生长的细菌有显著的不同。生物被膜 中的细菌被厚厚的多聚糖包绕，不易获得养分和氧气，代谢比较低，细菌处于休眠状 态，不进行频繁的细胞分裂，往往体积较小，对抗生素亦不敏感，但遇到适宜的环境， 它们就会迅速繁殖。 1 5 2 沙门氏菌生物被膜研究进展 随着对细菌致病机制的深入了解，发现生物被膜细菌对抗生素和宿主免疫防御机 制的抗性很强，从而导致严重的临床问题，尤其是慢性和难治疗的感染性疾病，因此， 开始重视对生物被膜的研究。2 0 世纪3 0 年代中期，g i b b o u n s 和v a nh o u t e 等对牙斑 菌生物被膜细菌和龋齿的关系做了大量研究阱，为深入了解生物被膜细菌在健康和疾 病中的作用奠定了基础。生物被膜研究涉及微生物学、免疫学、分子生物学、材料科 学和数学等多学科，其真正作为一个独立学科发展起来始于2 0 世纪7 0 年末。1 9 8 2 年，c o s t e r t o n 证明了细菌在异物上具有粘附性，并得出粘附性与结合的牢固程度取 决于细菌表面的生化特性及惰性表面的物理化学性质的结论；1 9 8 7 年他又提出了水 兵们致病性问题嘲。9 0 年代后，随着相关学科的发展及对生物被膜细菌在医学上重 要性的认识，生物被膜研究得到迅速发展。1 9 9 0 年，蒙大拿州立大学建立了世界上 第一个生物被膜工程中心。近几年，美国国立卫生研究所( n i h ) 也为此投入大量研究 资金。目前，国内外越来越多的学者从事生物被膜研究，以期了解生物被膜形成的分 子机制、生理生化特点及其调控机理等，其目的为控制生物被膜的相关感染。 1 6 沙门氏菌外膜蛋白的结构与功能 外膜是革兰氏阴性细菌特有的结构，是一层曲折呈波浪状的结构，厚度约为8 1 0n m ，占细胞壁干重8 0 ，其结构类似细胞膜，是典型非对称性的磷酸脂双层结构， 由脂质双层、微孔蛋白、脂蛋白、脂多糖( l p s ) 组成嘲，包围着整个细菌，成为病 原体的分界屏障，其功能除保护屏障外，还有保障物质运输，阻止多种物质透过等作 用。其在宿主一寄生关系的结构上起着重要的作用。 外膜蛋白( o u t e rm e m b r a n ep r o t e i n s ，o m p s ) 指嵌合在脂多糖和磷脂层外膜上的 蛋白。有2 0 余种，但大多数外膜蛋白的功能还不清楚。其中的脂蛋白是一种通过共 价键使外膜层牢固地连接在肽聚糖内壁层上的蛋白，相对分子量约为7 2 0 0k d a 。有 两种蛋白研究的较为清楚，称为孔蛋白( p o r i n s ) 。每个孔蛋白分子是由三个相同相对 分子质量( 3 6 0 0 0k d a ) 蛋白亚基组成的种三聚体跨膜蛋白，中间有l n m 的孔道， 通过孔道的打、关闭可阻止某些抗生素进入外膜层。已知有两种孔蛋白，其一是非特 异性孔蛋白，其充水孔道可通过相对分子质量小于8 0 0 - 9 0 0k d a 的任何亲水性分子， 如双糖、氨基酸、二肽和三肽；另一为特异性孔蛋白，其上存在专一性结合为点，只 8 鲜蛋沙门氏菌的分禹鉴定及生物学特性的研究 允许一种或少数几种相关物质通过，其中最大的孔蛋白可通过相对分子质量较大的物 质，如维生素b 1 2 和核苷酸等。除脂蛋白和孔蛋白外，还有一些外膜蛋白与噬菌体吸 附或细菌素的作用有关口7 1 。 沙门氏菌外膜蛋白是其抗原的重要组成部分，约占外膜全部组成成分的二分之 一，在维持外膜结构，保证物质转运等方面起着重要作用。外膜蛋白位于细菌表面， 具有直接与机体免疫系统接触的机会，有较强的免疫原性，能够诱导机体产生免疫应 答。近年来，o m p s 诱导特异性免疫方应的作用引起了人们的关注嘶绷。 1 7 研究目的及内容 沙门氏菌常存在于肉、禽、蛋类或其他动物性食品中，在适当的温度条件下繁殖 得非常迅速，当人们吃了被沙门氏菌污染的食品后，就会发病，出现急性胃肠炎的临 床症状，这就是人们统称的“食物中毒”，特别是肉、蛋因沙门氏菌污染，而引起的食 物中毒是最常见最普遍的一种。鉴于沙门氏菌对人类的侵害性和分布的广泛性，各国 将沙门氏菌检出与否作为一个重要的卫生指标来控制。本课题主要是从呼和浩特采集 的5 0 份鸡蛋样品中分离沙门氏菌，采利用传统分类方法，从细胞形态特征，表征形 态和生理生化特征水平进行鉴定，了解鸡蛋被沙门氏菌污染的情况，同时从鸡肠道和 鸡饲料中进行分离，了解产蛋过程中沙门氏菌的分布情况。对分离的菌株作3 0 、 3 7 、4 0 c 生长模型分析，了解在不同温度下菌数随时间的变化趋势。对菌株在6 0 、 7 5 下的失活曲线进行分析，了解其菌数随时间是否呈直线型下降。沙门氏菌生物被 膜试验可了解在营养缺乏时蛋壳表面形成生物被膜的情况，为内蒙古带壳鸡蛋中沙门 氏菌危险性评估提供有利依据。外膜蛋白有助于细菌对寄主细胞的吸附，同时有助于 细菌逃逸机体的免疫防御，对分离菌的外膜蛋白研究有助于新型疫苗的研制。 2 材料与方法 2 1 材料 2 1 1 实验标准菌株 肠炎沙门氏菌( 编号：5 0 0 4 0 ) 2 1 2 试验材料 鸡蛋样品：呼和浩特赛罕区市场2 0 份、内蒙古畜牧科学院鸡场3 0 份 蛋鸡：内蒙古畜牧科学院鸡场2 7 只 饲料样品：散养鸡配合饲料，包头希望饲料有限责任公司 2 1 3 培养基 亚硒酸盐胱氨酸增菌液 卫生部北京生物制品研究所 内蒙古农韭大学硕士学位论文 9 亚硫酸铋琼脂培养基 丙二酸钠培养基 细菌生化微量鉴定管 卫生部北京生物制品研究所 江苏宜兴万石试剂厂 杭州天和微生物试剂公司 2 1 4 药品与试剂 沙门氏菌属诊断血清兰州生物制品研究所 三氨基甲烷( 耐s )上海生工生物工程公司 t r i t o nx - 1 0 0 上海生工生物工程公司 牛血清蛋自( b s a ) ( q 1 1 8 2 0 3 0 6 - 2 0 0 1 北京化学试剂公司 标准蛋白质分子量：磷酸化酶( 9 7 ，4 0 0 ) ，牛血清蛋白( 6 6 ，2 0 0 ) ，兔肌动蛋白 ( 4 3 ，0 0 0 ) ，牛碳酸酐酶( 3 1 ，0 0 0 ) ，胰蛋白酶抑制剂( 2 0 ，1 0 0 ) ，鸡蛋清溶菌酶 ( 1 4 ，4 0 0 ) 十二烷基磺酸钠( s d s ) 美国s i g m a 丙烯酰胺 北京化学试剂公司 甲叉双丙烯酰胺 北京化学试剂公司 实验所用的其他常规药品如蛋自胨、氯化钠、牛肉膏、琼脂、磷酸氢二钠、磷酸 二氢钾、葡萄糖、盐酸、戊二醛、氯化钙、对苯二酚、硝酸银、氢氧化钠、冰乙酸、 甘油、甘氨酸、乙醇和丙酮等均为分析纯。 2 1 5 试验仪器 全自动高压灭菌锅h v e 5 0 ，生物洁净工作台b c n - 1 3 6 0 ，生化培养箱h is 一2 5 0 ， 振荡培养箱h z q - x 10 0 ，o l y m p u s 光学显微镜c h 2 0b i m f 2 0 0 ，7 2 2 型分光光度 计，真空冷冻于燥机l a b c o n c ol l 6 s f p y ，离心机l g 7 0 ，2 4a ，超声波破碎仪 g e l 0 0 ，台式高速冷冻离心机8 5 1 0 r ，紫外凝胶成像系统，水平遥床w d 9 4 0 5 b ，电 泳仪电泳槽，酸度计p h s j ，3 f ，万用电热器，快速混匀器s k - 1 ，分析天平，微波炉 胁8 7 5 3 g m ，恒温水域槽等。 2 ，2 试验方法 2 2 1 沙门氏菌分离鉴定 参照g b t4 7 8 9 4 一2 0 d 3 食品卫生微生物学检验沙门氏菌检验的操作程序进 行n 纠钔。 2 2 1 1 蛋壳表面沙门氏菌的分离 无菌条件下用灭菌棉球沾取无菌生理盐水将蛋壳表面擦拭2 3 遍，将棉球放到 1 0m l 无菌的生理盐水中浸泡4 6h ，混匀届取】m l 加入到1 0m l 缓冲蛋白胨( b p ) 1 0 鲜蛋, g f q 氏菌的分离鉴定及生物学特性的研究 培养基中，3 6 4 - 1 培养4h 。取l m lb p 培养液加入到1 0r n l 亚硒酸盐胱氨酸增 菌液( s c ) 中，3 6 4 - 1 培养1 8 - - - 2 4h 。取s c 增菌液一环划线于亚硫酸铋琼脂( b s ) 平板，3 6 4 - 1 培养4 0 - - , 4 8h 。 2 2 1 2 蛋黄内沙门氏菌的分离 清洗鸡蛋外壳后，在8 4 消