（食品科学专业论文）酵母菌中海藻糖合成酶基因的克隆及高效表达载体的构建.pdf

吉林农业太学硕士学位论文 酵母菌中海藻糖合成酶基固的克隆及高效表达载体的构建 摘要 海藻糖( t r e h a l o s e ，q d - g l u c o p y r a n o s y l d d - g l u c o p y r a n o s i d e ) 是由两个葡萄 糖分子经半缩醛羟基结合而成的非还原性双糖，合有海藻糖的特殊生物具有脱水条件下 存活多年的性质，其中还有一种被称为隐生生物的生物体内的9 9 的水分被去掉后，竞 仍能保持着获水之后迅速复活的能力。研究表明，除了在脱水条件下生物体积累海藻糖 以外，在高温、高渗透压、重金属及有毒试剂等条件下生物体也合成并积累海藻糖，其 被认为是生物体抵御胁迫环境的应激代谢物。对这一现象的深层次研究表明，海藻糖可 以对生物膜、蛋白质和核酸等生物大分子发挥保护作用，从而使富含这种奇妙化合物的 生命体对外界的恶劣环境表现出独特的生物学特性。 本研究旨在利用基因工程技术，研究磷酸一6 一海藻糖合酶( t p s i ) 基因在大肠杆茵 中的克隆与表迭，对进一步构建海藻糖的高产基因工程菌株打下基础，所以本研究的主 要目标就是，构建一个包含强启动子的高效表达裁体，使磷酸一6 一海藻糖合酶基因在大 肠杆菌中高效表达。 本研究根据g e n e b a n k 发表的酿酒酵母磷酸一6 一海藻糖合酶基因序列，设计了一对引 物，以本实验室分离并诱变所得的一株高产海藻糖酵母茵提取的总r n a 为模板，应用反 转录p c r ( r t p c r ) 的方法，扩增出了t p s i 基因序列。将扩增出的基因与t 栽体连接， 用这个重组质粒转化感受态大肠杆茵d h 5 q ，使目的基因在受体茵中得到了复制，提取 此重组菌的质粒酶切和p c r 鉴定，证明了目的基因已经克隆入该受体大肠杆茵d h 5 仪中， 过夜培养含有重组质粒的阳性茵，加入甘油至终浓度为2 0 保存。经基因测序，得知扩 增基因全长为1 5 0 7 b p ( 其中包括3 端和5 端分别含所设计的限制性酶切位点和保护碱 基共1 9 个) ，实际基因全长1 4 8 8 b p ，舍有起始密码和终止密码，为一完整的开放阅读框 架，编码4 9 6 个氨基酸，该序列与g e n e b a n k 上发表的酿酒酵母t p s i 基因同源性达到 9 9 6 ，拟推导的氨基酸同源性达9 9 6 o 可以进行下一步表达试验。 在进行克隆试验过程中，在提取酵母总r n a 时对当前流行的t r i z o l 一步r n a 提取 法进行了改造，使之更适合于酵母r n a 的提取，且提取的r n a 在纯度和完整性方面大大 吉林农业大学硕士学位论文酵母菌中海藻糖合成酶基因的克隆及高效表达载体的构建 提高。在进行r t p c r 过程中，针对几个对p c r 反应影响比较大的因素设计了正交实验 进行了反应条件的优化，最终确定的各因素加入量分别为t a q 酶1 5 u ，模板1 0 n g ， d n t p ( 1 0 m m o l l l ) i n l ，上、下游引物各6 0 p m o l ，镁离子终浓度为2 5 m m o l l 。反应条件 为9 4 。c ，5 0 s5 8 5 2 9 c ，l m i n 3 0 s7 2 2 ，2 m i n 共3 0 个循环，最后一个循环7 2 3 ，1 0 m i n 。 由t 载体和目的基因构成的重组质粒用b a mh i 和p s ti 双酶切之后，定向插入用 这同样两种酶切的表达载体p u c l 8 中，构建出表达栽体p h y 0 1 ，同样方法用s a ci 和b a m h i 双酶切重组质粒和p e t 一2 8 a 载体，并重新连接，构建出表达载体p h y 0 2 ，两种表达栽 体经p c r 反应和酶切反应鉴定后，都证明目的基因成功与栽体连接。用这两个重新构建 的质粒转化受体茵b l 2 1 ，用i p t g 诱导，成功的表达出了酶蛋白。经过对重组茵的海藻 糖提取定量分析后，证明表达的磷酸一6 一海藻糖合酶具有一定的活性，但要提高产量还 有待进行深入的研究。 综上，本研究为最终构建高产海藻糖的基因工程大肠杆菌的目标打下了坚实的基 础。 关键词：海藻糖磷酸一6 一海藻糖合酶克隆表达表达载体 吉林农业大学硕士学位论文 酵母苗中海藻糖合成酶基因的克隆及高效表达载体的构建 a b s 仃a c t m h a l o s c ( t m h a l o ，d d g l u c o p y r a n o s y l i x - d g l u c o p y r a n o s i d e ) i s ak i n do f i n d e o x i d i z e dd i s a c c h a r i d e c o u p l e dw i t h t w o g l u c o s eb y a ，d - 1 , 1b o n d ，t h o s es p e c i a l c r e a t u r ew h oi n c l u d et r e h a l o s ec a r tl i v ef o rm a n y y e a r sw i t h o u tw a t e r , f o re x a m p l e a 虹n d o f c r e a t u r ew h o s en a l n ei s c r y p t o h i d d e nl i f e c a r ls t i l lm s u m el i f ep r o m p t l ya f t e rr e h y d r a t i o n w h e n9 9 o ft h e i rb o d yw a t e ri s d e h y d r a t i o n s t u d ys h o wt h a tb e s i d e sr e h y d r a t i o n ，h i g h t e m p e r a t u r e ，h i g hp e r v a s i v e ，h e a v y m e t a la n d p o i s o n o u s e t c c a nm a k et h ec r e a t u r e a c c u m u l a t e 扛_ e h a l o s e i tw a st h o u g h tt h a tt r e h a l o s ec o u l dr e s p o n dt os t r e s s i nd e e p l yr e s e a r c h s h o wt h a tt r e h a l o s ec a l lp r o t e c tb i o m a c m m o l 刚e s u c h 船p r o t e i n ，e n z y m e ，n u c l e a ra c i da n d s oo n t h e r e f o r e t h ec r e a t u r et h a ti n c l u d et r e h a l o s e d i s p l a ys p e c i a l f e a n l r ei nh a r s h e n v i r o n m e n t s ， p u r p o s eo ft h i ss t u d yi sc l o n ea n de x p r e s st r e h a l o s e 一6 一p h o s p h a t ep h o s p h a t a s e ( t p s l ) g e n eb yg e n ee n g i n e e f i n g ，w h i c hw i l lb ef o u n d a t i o no fg e n e e n g i n e e r i n gs t r a i nc o n s t r u c t i o n f u r t h e r s om a i ng o a lo ft h i ss t u d yi sb u i l da h i 曲e f f i c i e n tv e c t o rt h a tc a ne x p r e s s t h et p s li n e c ol i s t r a i n w e d e s i g n e dap a i ro fp r i m e ra c c o r d i n gt ot p s 1 s e q u e n c et h a tp u b l i s ho ng e n b a n k a n d u s et h et o t a lr n af r o ms a e c h a r o m y c e sc e r e v i s i a et h a tk e e pi no u rl a b o r a t o r ya st e m p l a t e ， t h e na m p l i f i e da n do b t a i n e dt a r g e tg e n e ( t p s 1 ) t h r o u g hr t - p c r a f t e r w a r dc o n n e c t e dt p s 1 w i t ht - v e c t o r , i r a n s f o r m e de s c h e r i c h ac o l id h 5 口w i t ht h er e c o m b i n a n t p l a s m i d t h et a r g e t g e n e ( t p s l ) w o u l da m p l t r yi nt h er e c e p ts t r a i n t h ei n s e r t i o no ft p s lg e n ei n t ot - v e c t o rw a s c o n f i r m e d b yr e s t r i c t i o na n a l y s i s a n dp c r ，c u l t r u e d p o s i t i v e s t r a i n st h a ti n c l u d et h e r e c o m b i n a n tp l a s m i dw h o l en i g h t a d d e dg l y c e r i n eu n t i li t sc o n c e n t r a t i o ni s2 0 i no r d e rt o c o n s e r v ei t w ek n e wt h a tt h e c l o n i n gg e n ei s1 5 0 7 b p ( i n c l u d er e s t r i c t i o ne n d o n u c l e a s e s e n z y m ep o s i t i o na n dp r o t e c tb a s e ，t o t a la r e1 9 b p ) i nf a c tt h ew h o l eg e n ei s1 4 8 8 b p ，i n c l u d e i n i t i a t i o nc o d o na n dt e r m i n a t i o nc o d o n ，s oi t sf l c o m p l e t eo p e nr e a d i n gf r a m e ，w h i c hc a n t r a n s l a t ei n t o4 9 6a l n i n oa c i d s t h eg e n es e q u e n c ei s 9 9 6 i d e n t i t yt ot p s lp u b l i s h e do n “ 亩林农业大学硕士学位论文酵母茵中海藻糖合成酶基因的克隆及高效表达载体的构建 g e n b a n k t h ed e d u c e da m i n o a c i ds e q u e n c ei sa l s o9 9 6 i d e n t i t yt ot p s ia m i n o - a c i d s e q u e n c e t h e r e f o r e ，w ec o u l de x p r e s s t h eg e n en e x t s t e p i nt h ec l o n i n ge x p e r i m e n t s ，w ei m p r o v et r i z o lm e t h o do ft o t a lr n ai s o l a t i o nw h e n e x t r a c t e dr n af r o ms a c c h a r o m y c e sc e r e v i s i a e t om a k et h em e t h o df i ti nw i t hi t , m o r e o v e r t h er n a p u r i f i c a t i o na n dc o m p l e t m e n tw a se n h a n c e db y t h ea p p r o a c h i nr t - p c r p r o c e s s ， w e d e s i g n e dr a n g ea n a l y s i st oo b t a i na b e t t e rp c rc o n d i t i o n a tl a s tt h ec o n c l u s i o ni sa d d t a q e n z y m e1 5 u ，t e m p l a t e1 0 n g ，d n t p ( 1 0 m m o t l ) l m ，p r i n l e r6 0 p m o le a c h ，m 9 2 十2 5 m m o l l e v e r yr e a c t i o n 。r e a c t i v e c o n d i t i o ni s9 4 。c ，5 0 s 5 8 5 2 。( 3 ，l m i n ，3 0 s7 2 ，2 m i n ，3 0 c y c l e s ，t h el a s tc y c l e ，7 2 。( 2 ，1 0 m i n 。 t h er e c o m b i n a n tp l a s m i dc o n s i s to ft - v e c t o ra n d t a r g e tg e n e w a sc u tb yb a r nma n dp s t i ，t h e ni n s e r tp u c l 8w h oc u tb yt h es a m er e s t r i c t i o ne n d o n u c l e a s e se n z y m e ，w eo b t a i n e d v e c t o rt h a tn a m e d p h y 0 1 m e a n t i m ew e c u tt h er e c o m b i n a n t p l a s m i da n dp e t - 2 8 a w i t hs a ci a n db a m h i ，o b t a i n e dp h y 0 2 v e c t o r t h et w ov e c t o r sw e r ec o n f i r m e db yr e s t r i c t i o na n a l y s i s a n dp c r ，h e n c ew ek n e wt h a tt h ev e c t o r sw e r ec o n s t u c t e ds u c c e s s f u n y m a k et h et w ov e c t o r s t r a n s f o r m b l 2 1 a n d i n d u c e dw i t h m t gt h e n w e g a i n e de x p r e s s i o np r o t e i n a f t e r q u a n t i f i c a t i o no fe x t r a c tl r e h a l o s ef r o mr e c o m b i n a n ts t r a i n ，w ep r o v e dt h a t t h ee x p r e s s i o n p r o t e i nw a s a c t i v e h o w e v e r , i fw ew a n tg e tm o r ep r o t e i nf r o mi t ，i tm u s t b e s t u d y f u r t h e r i na w o r d ，t h i ss t u d ym a k e as t e a d yb a s i sf o rc o n s t r u c t i n gg e n e e n g i n e r r i n ge s c h e r i c h a c o l iw h i c hc a r lp r o d u c e p l e n t yo f t r e h a l o s e k e y w o r d s ：t r e h o l o s e t r e h a l o s e 一6 - p h o s p h a t ep h o s p h a t a s e c l o n e e x p r e s s i o n e x p r e s s i o n v e c t o r 独创性声明 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的 研究成果。据我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其 他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得吉林农业大学或其他教育机 构的学位证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均 己在论文中作了明确的说明并表示谢意。 一签司锈弛一期：少垆月磊 f 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全，解吉林农业大学有关保留、使用学位论文的规定，即 吉林农业大学有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允许 论文被查阅和借阅。本人授权吉林农业大学可以将学位论文的全部或部分内容编 入有关数据库进行检索，可阻采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位 论文。( 保密的学位论文在解密后适用本授权书) 学位论文作者签名三：协 签字日期：卅年石月加 ， 学位论文作者毕业后去向： 工作单位： 通讯地址： 刮咖“咖 ， 学川 签： 峨：口p ；一吣删 6 、f el 曝蝻tf 口| f 亏 j 吉林农业大学硕士学位论文 酵母菌中海藻糖合成酶基因的克隆厦商效表达载体的构建 第一章前言 海藻糖( t r c h a l o s e ，q d g l u c o p y r a n o s y l d - d g l u c o p y r a n o s i d e ) 是由两个葡萄糖分 子经半缩醛羟基结合而成的非还原性双糖，理论上存在三种不同的正位异构体，即仅， a 一型，n ，b 一型，b ，b 一型，但在自然界广泛存在的只有“，o t 一型海藻糖，其余两 种很少见，仅在蜂蜜和王浆中发现了少量d ，b 一型海藻糖( 新海藻糖n e o t r e h a l o s e ) ， 另一种母，p 一型海藻糖也被称做异海藻糖( i s o t r e h a l o s e ) o “海藻糖最早的记录是在 1 9 世纪早期作为麦角菌的成分之一而被提出，后来发现它广泛存在于藻类、细菌、真菌、 昆虫以及无脊椎动物等生物体内“1 ，近年来还发现人体的肾脏也存在海藻糖。含有海藻 糖的这些特殊生物具有脱水条件下存活多年的性质，其中还有一种被称为隐生生命的生 物体内的9 9 的水分被去掉后，竟仍能保持着获水之后迅速复活的能力。1 。研究表明， 除了在脱水条件下生物体积累海藻糖以外，在高温、高渗透压、重金属及有毒试剂等条 件下生物体也合成并积累海藻糖，其被认为是生物体抵御胁迫环境的应激代谢物”1 。 自海藻糖被发现以来，已对其物理化学性质、生理功能及其作用机理、代谢途径 和在食品中的应用等方面进行了较为深入的研究，同时在其分子水平、基因水平即分子 生物学方面的研究也逐渐兴起，许多相关基因已相继被克隆和分析。 1 1 海藻糖的理化性质 海藻糖是由两个葡萄糖分子通过d a ，1 - 1 糖苷键相结合而成，其分子内存在一 种简单的双折轴象对称结构，在水溶液中，两个椅式构象的葡萄糖分子通过糖苷键的氧 原子形成对称的空间结构“。 由于这种对称结构，两个毗哺葡萄糖基不仅在物理上相平衡，而且其化学活性也 相似，所以，海藻糖的化学取代相对简单一些，其理化性质也就相对于其他双糖稳定。 海藻糖对热，酸都非常稳定，是天然双糖中最稳定的糖质，由于其不具有还原性，即使 与氨基酸、蛋白质等混合加热也不会产生美拉德反应。其稳定的理化性质具体可由以下 数据充分表现出来：1 、在酸和碱中的稳定性：在p h 3 5 1 0 ，1 0 0 。c ，2 4 小时条件下， 9 9 残存。2 、水溶液热稳定性：1 2 0 ，9 0 m i n ，不褐变；( 含蛋白质和氨基酸溶液中) 沸水，9 0 m i n ，不褐变。3 、水溶液长期保存稳定性：在3 7 ，1 2 个月，不分解，不褐 变。“1 1 2 海藻糖的生物学功能 海藻糖成为极受注目的天然物质，不仅仅是因为它具有独特的理化性质，更重要的 是它对生物体组织和生物大分子具有非特异性保护作用大量研究表明，某些物种抵御 吉林农业大学硕士学位论文 酵母菌中海藻糖合成酶基因的克隆及高效表达载体的构建 外界恶劣环境如脱水、干旱、高温、冷冻、高渗透压及有毒试剂等，所表现出来的抗逆 耐受力和它们体内存在的海藻糖有直接关系。对这一现象的深层次原因研究表明，海藻 糖可以对生物膜、蛋白质和核酸等生物大分子发挥保护作用，从而使富含这种奇妙化合 物的生命体对外界的恶劣环境表现出独特的生物学特性”1 。 1 2 1 海藻糖对生物抗脱水、冷冻、高渗透等恶劣环境的抵御作用 生物体内的海藻糖最初被认为只是作为一种碳源而被储存，后来发现海藻糖往往 是在环境胁迫的条件下产生，含量可随环境条件变化而变化，是一种应激代谢物，如酿 酒酵母( s a c c h a r o m y c e sc e r e v i s i a e ) 在高温条件或稳定期生长时可在其体内积累海藻 糖，含量可达其细胞干重的1 0 一1 5 ，而在实验室标准生长条件下其体内却没有或很少 积累海藻糖。”3 。研究表明，海藻糖具有在胁迫条件下防止酵母体内蛋白质聚集和帮助 蛋白质正确折叠的功能，这些胁迫条件包括热激、冷冻、解冻、脱水、高压及氧化作用 等。在另一些生物体内海藻糖也起着类似的作用，如海藻糖在大肠杆菌体内的积累可增 强其对环境渗透压的抵抗“，海藻糖存在于植物中则可以提高植物的抗寒、抗盐、抗旱 等能力”“1 ：例如，经海藻糖处理的绿豆幼苗，在干燥和冷冻条件下，其质膜上的 m g “，k + 一a t p a s e 的活性显著提高且耐旱性也增强”。 1 2 2 海藻糖对生物体组织和生物分子的保护及其机理”1 研究者在考察了海藻糖在于燥脱水过程中对生物膜和蛋白质的保护作用后得出了 一些假说，一般都是从分子角度考察海藻糖的作用机理，其原理基本都是与生物分子形 成“分子复合物”“。 1 2 2 1 水替代学说 生物体中的蛋白质、糖、脂肪和其他大分子物质均被一层水膜包围保护着，这层薄 薄的水膜是维持其结构和功能特性不可缺少的物质基础。在于燥过程中，这层水膜逐渐 被除去，导致这些大9 - t 物质发生不可逆的变化，如蛋白质分子的空间结构发生变化等。 据c r o w e 等“的研究表明，从肌肉分离到的肌浆网，在不加海藻糖进行干燥时，其形态发 生改变，重新水化时，转运钙的功能明显丧失，而当存在一定浓度海藻糖时，在相同过程 中其形态几乎不发生改变，转运钙的能力也可以恢复到原有水平。c r o w e 等人认为当蛋白 质的结构水失去时，海藻糖可在干燥生物分子的失水部位以羟基和分子形成氢键，取代 了由水形成的氢键，这使得分子在缺水条件下仍能保持其原有结构，而不丧失活性u ”。 1 2 2 2 玻璃态学说 当干燥时海藻糖紧密地包住相邻近的分子，形成一种糖玻璃体，这是一种无定形的 固体状态。这种非晶体结构的形成导致玻璃基质扩散系数降低，化学反应速度降低，故 在这种结构中分子运动和分子变性反应微弱，能够使生物分子维持一定的空间结构“”。 吉林农业大学硕士学位论文酵母菌中海藻糖合成酶基因的克隆及高效表达载体的构建 1 9 9 2 年c o l a c o 等“”发现海藻糖与生物大分子形成一种类似水晶状的玻璃体结构， 从而在于燥及冷冻时可得到有效保护，这是上述假说的有力证据。 1 2 2 3 优先排阻学说 t i m e s h e f f 等“7 1 提出这一学说，可以用来解释溶液状态的蛋白质的稳定作用。他们 认为海藻糖与其它一些小分子糖类不直接与蛋白质结构相互作用，而是优先与水结合， 使它们从蛋白质分子中的溶剂化层中排除出来，导致酶的溶剂化层半径减少，蛋白质的 表观体积减少，可移动性降低，蛋白质分子结构更趋紧密，构象更稳定，从而抵御外界 极端环境的影响。 据报道，海藻糖的水化体积比蔗糖、麦芽糖、葡萄糖和果糖大2 5 倍，因此，分子 排阻效应更明显，故蛋白质的优化排阻在较低的浓度下就能实现，导致比其它双糖更强 的稳定效果”。 1 3 海藻糖合成途径及其相关基因“” 在不同生物中，海藻糖的生物合成途径并不完全相同，目前至少已发现三种途径。 可以相信，随着研究的深入，新的海藻糖合成途径还有可能在其它物种中发现。 i 3 1o t s a o t s b 途径“” 所谓o t s a o t s b 途径，是指由海藻糖一6 一磷酸合成酶催化尿苷二磷酸( u r i d i n e d i p h o s p h a t e ，u d p ) 葡萄糖和6 一磷酸葡萄糖合成6 一磷酸海藻糖，再在6 一磷酸海藻糖磷酸 酯酶( t r e h a l o s e 一6 一p h o s p h a t ep h o s p h a t a s e ) 作用下生成海藻糖的生物学过程，由于 e c o li 中催化上述反应的两个酶分别由o s t a 和o s t b 基因编码而得名“反应式如下： u d p 一葡萄糖+ 6 一磷酸葡萄糖 海藻糖一6 - 磷酸合成酶 6 一磷酸海藻糖! ：壁竺塑墅鲨竺塑堕，海藻糖+ 磷酸 u d p + 6 一磷酸海藻糖 在酿酒酵母中，海藻糖合成相关酶形成多酶复合体1 。研究者发现，这一复合物至 少包括4 种蛋白t p s i ( 5 6 k d ) ，t p s 2 ( 1 0 2 k d ) ，t p s 3 ( 1 2 3 k d ) ，t s l i ( 1 2 3 k d ) ”，分布在酵母 的第，x 染色体上，前三个基因编码的多肽组成一个复合酶系，其中t p s 3 对 t p s i 、t p s 2 基因起调节作用，t s l i 和t p s 3 同源性很高”，除了对该复合酶系有调节的 作用外可能还具有使该酶系结构稳定的作用。 i 3 1 1t p s l 基因及其功能 t p s i 基因编码的蛋白具有完整的海藻糖一6 一磷酸合成酶功能，b e l l 1 等人分别构建 了组成海藻糖合成酶的四种酵母缺陷株，结果发现，不管两外三个基因以何种方式存在， 吉林农业大学硕士学位论文酵母菌中海藻糖合成酶基因的克隆及高效表达载体的构建 只有当t p s l 存在时才有海藻糖合成酶活性。经过序列分析比较发现，t p s 2 、t p s 3 与 t p s l 基因有高度的同源性”；t p s l 与t p s 2 有4 6 的同源性，t p s i 与t p s 3 有5 4 的 同源性”。虽然复合酶系中其它基因与t p s l 有着很高的同源性，但没有一个基因能代 替t p s i 基因的功能”。研究表明，海藻糖一6 一磷酸合成酶是酵母细胞海藻糖合成途径的 关键酶，t p s i 基因的表达成败直接关系到体内海藻糖的产生与否。“”。2 “。 1 3 3 2t p s 2 、t p s 3 和t s l i 基因及其功能 t p s 2 基因编码6 一磷酸海藻糖磷酸酯酶，在t p s 2 基因缺陷株中，发现有大量的6 一 磷酸海藻糖积累，但是，在所有t p s 2 基因的缺陷株中，仍能积累大量的海藻糖，这说 明在海藻糖合成酶复合体之外还有其它的一些磷酸酯酶能够催化6 一磷酸海藻糖水解“。 因此有人推测t p s 2 蛋白只负责海藻糖合成酶复合体内部的6 一磷酸海藻糖水解活性。”。 这个发现说明我们可以只将t p s i 基因转入大肠杆菌或其他微生物而使其获得产生海藻 糖的能力。 t p s 3 和t s l i 基因的具体功能并不十分明确，但t p s 3 或t s l i 基因的缺失都会造成 海藻糖合成酶复合体稳定性的下降，细胞质中出现游离的t p s i 和t p s 2 。”。 1 3 3 3t p s i 和o s t a 基因的相关性 s t r o m 等人”证明酿酒酵母t p s i 基因与大肠杆菌的o t s a 基因都编码海藻糖合成酶， 二者氨基酸序列有5 4 的同源性，并有3 4 的氨基酸完全相同”。戴秀玉“”“1 等人借助 m u 转座子成功的在细胞内克隆了大肠杆菌海藻糖合成酶o t s b a 基因，转化至大肠杆菌 o t s a 基因缺失株，结果证明转化子能够在高渗培养基中生长，经诱导后细胞内合成一定 数量的海藻糖，从而证明t p s i 基因能够恢复o t s a 基因的功能。 i 3 2t r e y - t r e z 途径 海藻糖生物合成的t r e y t r e z 途径是由麦芽寡糖基海藻糖合成酶 ( m a l t o o l i g o s y l t r e h a l o s es y n t h a s e ，m t s a s e ，t r e y 基因编码) 和麦芽寡糖基海藻糖 水解酶( m a l 七。o l i g o s y l t r e h a l o s et r e h a l o h y d r o l a s e ，m t h a s e ，t r e z 基因编码) 催化 完成。反应式如下： 麦芽糊精! 竺竺二麦芽寡糖基海藻糖 麦芽寡糖基海藻糖丛堡堕生，海藻糖+ 麦芽糊精( 少两个葡萄糖残基) 目前，这一海藻糖合成途径已在许多微生物中被证实，如节杆菌( a r t h r o b a c t e r s p q 3 6 ) ”，根瘤菌( r h i z o b i u ms p m i i ) ”，微黄短杆菌( b r e v i b a c t e r i u m h e l v o l u m ) ”，硫矿硫化叶菌( s u l f o l o b u ss o l f a t a r i c u sk m i ) “”及结核分枝杆菌( m y c o b a c t e r i u m 4 吉林农业大学硕士学位论文 酵母酋中海藻糖合成酶基因的克隆及高效表达载体的构建 t u b e r c u l o s i s ) ”3 等。 1 3 3 i r e s 途径 t r e s 途径则是由t r e s 基因所编码的海藻糖合成酶所催化完成的，作用的底物是 ( m a l t o s e ) ，反应将d d 一1 ，4 糖苷键连接的麦芽糖转化为0 【，0 【一1 ，1 糖苷键连接的 海藻糖。反应式如下： 麦芽糖 海藻糖合成酶 海藻糖 该途径是在脂肪杆菌( p i m e l o b a c t e rs p r 4 8 ) 和水生栖热菌( t h e r m u sa q u a t i c u s ) 两种菌中发现的“3 “。该反应是上述三个海藻糖合成途径中唯一一个具有可逆反应的途 径，即该酶也可以将海藻糖转化为麦芽糖。在结核分枝杆菌中，该酶催化麦芽糖转化为 海藻糖的速率是其逆反应的2 5 倍”1 。 1 9 9 6 年，n i s h i m o t o 等从嗜热细菌t h e r m u sa q u a t i c u sa t c c3 3 9 2 3 中分离并存化 出热稳定的海藻糖合成酶，酶的分子量为1 0 5 k d a ，同年k e i j it s u s a k i 等人”“通过建立 基因组文库的方法对该酶基因全序列进行了测定2 8 9 2 b p 编码了此酶的9 6 3 个氨基 酸残基。 1 3 4 其它途径 除了上述3 种主要的海藻糖生物合成途径外，自然界还可能存在其他未知的途径， 一个例子是日本学者已从担子菌灰树花中发现了一种新的海藻糖合成酶，该酶的底物是 d 一葡萄糖和1 一磷酸葡萄糖“”。 1 4 海藻糖的应用 1 4 1 食品和保健品方面 海藻糖在食品工业中的应用海藻糖具有稳定蛋白质结构及抗干燥的作用“”，化学性 质十分稳定，又不发生美拉德反应，而且海藻糖具非龋齿性。在食品加工中具有广泛的应 用潜力“6 。“1 。活菌制剂是当今保健品的一个热点，它具有改善肠道功能，清除体内垃圾 等功能。目前，利用冻干技术制备双歧杆菌活菌制剂已有成功的报道，活菌保藏期可达 i - 6 个月”“”l ，但双歧杆菌的细胞死亡率很高( 存活率只有5 左右) “。”1 ，为此，田洪 涛等人“”经过研究，表明添加海藻糖复合保护剂的活菌冻干粉在保藏6 0 天( 37 。c ) 后 活菌存活率在4 0 以上。 1 4 2 医学方面 目前利用海藻糖干燥保护的抗体、血小板、酶、病毒、淋巴细胞等生物活性物质无 需冷冻，待复水后均能恢复活力”。葛宇等人“6 1 研究海藻糖对人体重组铜锌s o d 酶的保 吉林农业大学硕士学位论文酵母酋中海藻糖合成酶基因的克隆及高效表达载体的构建 护作用中表明与其它双糖比，海藻糖有最好的抗冷冻、抗脱水能力。g i l l i a n 等”7 1 研究 发现成体胰岛用海藻糖冷却保存的存活率比用d m s o 保存的要高，且胰岛中胰岛素的含 量和分泌能力是未加保护的1 4 倍。海藻糖在植物细胞、动物细胞、人眼晶状体和小鼠 胚胎的冷冻保存方面取得令人满意的结果“”。除此之外，海藻糖还可以代替血浆作为生 物制品的稳定剂，不仅能常温存放，而且还可防止因血源污染引起的乙肝、爱滋病等致 命疾病的传播，保证生物制品的质量和安全性”。 1 4 3 科学研究 分子生物学中所用的许多酶制剂必须添加一定比例的甘油放在低温下保存，否则容 易失活，c a m i l o 等研究d n a 限制性内切酶，d n a 连接酶和d n a 聚合酶在含海藻糖1 0 1 8 的缓冲液中，于3 7 或室温下通风干燥几个星期，还可保存其活性，而且在7 0 。c 下 保存3 5 天后，仍可精确的切断d n a ，这是其它种类的保护剂都达不到的效果“”。这极大 方便了科研试剂的保存。 1 4 4 在作物育种中的应用 现代农业生产迫切须要解决的问题之一就是要通过现代生物技术对农作物品种或 类型进行有效的遗传改良，增强其抗逆性，确保农业生产的持续发展。海藻糖的生物学特 性使其在植物抗逆性遗传改良中具有潜在的应用价值，为植物抗性基因工程的深入开展 提供了良好的物质基础和新的技术思路。 海藻糖具有稳定生物膜结构和提高生物组织对低温、高温、盐碱、干旱等逆境条件 下的抗性”1 6 ”。因此把海藻糖合酶基因导入作物并使其在作物体内表达，可望培育出能 抗旱、抗寒、抗冻、耐盐的作物新品种。已报道，美国科罗拉多医科大学已把酵母菌的 t p s l 基因转入烟草并获得具抗旱型的转基因植株。我国的赵恢武等、戴秀玉等也已相继 分别将t p s 基因和o s t 基因转入烟草，使其耐旱性增强“。荷兰植物生物技术公司把 o s t b a 导入甜菜、马铃薯中，在获得廉价海藻糖的同时，增强了植物的抗旱性和抗寒性。 1 5 海藻糖分子生物学研究进展及本研究的意义 1 5 1 分子生物学研究进展 9 0 年代初，k a s s e n “”等对大肠杆菌海藻糖合成酶基因进行了分子克隆，随后 d e v i r g i l i o “对酵母进行研究，指出完整的合成酶是由分子量为5 6 k d 、1 0 2 k d 和1 2 3 k d 的三个多肽组成的复合物。l o n d e s b o r o u g h 等“7 1 证实t p s i 基因的阻断将导致这两个酶都 失去活性。b e l l 和d e r i r g i l i o 等人的工作表明，这三个基因的表达均受葡萄糖的阻遏。 继大肠杆菌和酵母菌中海藻糖合成酶基因被克隆出来后，海藻糖的其它合成途径的关键 酶基因也相继被克隆出来，如从a r t h r o b a c t e r 和r h i z o b i u m 中分离出来的t r e y 和t r e z 基因，从p i m e l o b a c t e r “”和t h e r m u sa q u a t i c u s “”中分离出来的t r e s 基因。在这些基 6 吉林农业大学硕士学位论文 酵母菌中海藻耱合成酶基因的克隆及高效表达载体的指建 因中，以酵母t p s i 和大肠杆菌o t s b a 基因研究的最多，应用也较广泛。 1 5 2 本研究的意义 海藻糖是自然界广泛分布的一种性质稳定的双糖，存在于多种生物体内，起到抵御 外界恶劣环境的作用。研究表明，外源性的海藻糖与内源性的海藻糖同样能起到对生物 体保护的作用。因而海藻糖在医药、农业、食品、化妆品及轻工等领域均有广阔的应用 前景，对它的研究目前已成为国际上一个受关注的焦点。 长期以来，海藻糖因受到提取工艺的限制，成本高，价格昂贵，国内s i g m a 级的海 藻糖价格达到二、三百美元每克，食品级的海藻糖也要上百元每千克，大量添加到食品 中还不现实。从前人的研究结果来看，海藻糖一6 一磷酸合成酶是酵母细胞海藻糖合成途 径的关键酶，t p s i 基因表达的成功与否直接关系到是否能有海藻糖的产生，因而研究 t p s i 基因在大肠杆菌中的克隆与表达有助于构建海藻糖的高产基因工程菌株，最后降低 海藻糖的生产成本。本研究的主要目标就是，构建一个包含强启动子的高效表达载体， 使t p s i 基因在大肠杆菌中高效表达，并测定海藻糖产量的变化。 吉林农业大学硕士学位论文 酵母曹中海藻糖合成酶基因的克隆及高效表迭载体的构建 第二章材料与方法 2 1 实验材料 2 1 1 菌株与质粒 本实验研究所用菌株及质粒见表1 表1 本研究所用菌种及质粒 t a b l e l s t r a i n sa n dp l a s m i d su s e di nt h e s t u a m 2 1 2 试剂： 所用主要试剂种类见表2 ： 表2 本研究所用试剂、 ! ! 坠! ! ：! ! ! ! ! 苎! ! ! 塑垫! 坐! ! ! 塑 试剂购于 t r l z o l a m v t a q n t p t 载体 d n a 纯化试剂盒 琼脂糖 限制性内切酶，连接酶等 常用化学试剂 上海生工生物公司 p r o m e g a 公司 宝生物生物公司 北京鼎国生物公司 上海生工生物公司 加拿大b b i 生物公司 p r o m e g a 公司 宝生物生物公司 上海生工生物公司 吉林农业大学硕士学位论文 酵母菌中海藻糖合成酶基因的克隆及高效表达载体的构建 2 1 3 引物 引物由上海生工生物公司合成： 上游：t a gg a r c c a t g a c t a c g g a t a a c gc t b a i n h i 下游：c a t c t g c a ( c a t c a g l l r r t t g g t g g c p s t i 2 1 4 培养基 l b 培养基 n a c l ： 琼脂粉： p h ： 酵母培养基：葡萄糖 琼脂粉： 2 1 5 主要仪器设备 恒温震荡器 双恒电泳仪 高速冷冻离心机 高速台式离心机 分析天平 紫外透射仪 恒温培养箱 恒温水浴锅 p c r 热循环仪 2 2 实验方法 1 0 9 l l酵母膏：5 9 l 1 5 9 l ( 固体) 7 0 1 0 9 l 酵母膏：5 9 l 2 0 9 l ( 固体)m g s 0 4 7 h 2 0 d s h 2 3 0 0 d y y 一6 b 型 t l 一1 8 m l g l 6 一w f a l 6 u v 8 5 0 0 s h 0 1 0 h h s y l1 一n i t h e r m a l 蛋白胨：1 0 9 l k h 2 p o i ： 5 9 l 2 g l 江苏太仓市实验设备厂 北京市六一仪器 上海离心机研究所 北京医用离心机厂 上海实验仪器厂有限公司 天美科技有限公司 上海实验仪器厂有限公司 北京市长风仪器仪表公司 德国 2 2 1 实验用品的处理 1 ) 塑料制品的处理 尽可能使用一次性无菌辍料制品已标明r n a s e f r e e 的塑料制品，如没有开封使用 过，可不必再处理。对于国产塑料制品，处理后使用，处理方法如下： 在玻璃烧杯中加入去离子水，加入d e p c ( 焦磷酸二乙酯) 使其终浓度为0 0 1 ( 后文记作d e p c h 2 0 ) 。 将待处理的塑料制品放入一个可高温灭菌的容器中，注入d e p c h ：0 直至塑料制 吉林农业大学硕士学位论文 酵母菌中海藻糖