（细胞生物学专业论文）基于creloxp系统诱导删除抗生素基因植物表达载体的构建.pdf

福建农林大学硕士学位论文 摘要 随着转基因作物种植面积的扩大和商业化程度的加深，转基因作物的安全性也 受到了人们的关注。2 0 0 7 年，全球转基因作物种植面积增长率达1 2 ，达到1 1 4 3 亿 h m 2 ( 2 8 2 4 亿英亩) ，种植转基因作物的国家增加到了2 3 个。但是存在于转基因植物 中的具有抗生素或除草剂抗性的标记基因是否会对环境及人类健康有不良影响和损 害引起了广泛关注，因此转基因植物中标记基因的剔除成为亟待解决的问题。 本研究利用c r e d o x p 系统和受化学诱导的g r 系统，将g rl b d 结构域序列与c r e 重组酶基因结合形成融合基因，之后与抗潮霉素标记基因一起插入到两个同向l o x p 位点内，构建形成基于c r e l o x p 系统诱导删除抗生素基因的表达载体。为了稳定整 个载体的结构、防止c r e 重组酶基因在原核生物中表达，将拟南芥隐花色素1 ( c r y l ) 的内含子( i n o n 3 4 6 ) 插入到重组酶基因中。同时为了降低重组酶基因表达产物对植 物的毒害作用，载体构建过程中选用表达量较低的p n o s 来调控重组酶基因。本研究 已完成了基于c r e l o x p 系统受d e x 诱导的抗生素删除载体的构建，从而为进一步获 得标记基因删除的转基因植物提供了可能性，目前载体的功能正在鉴定中。 关键词：c r e l o x p ；标记基因删除；载体构建 福建农林大学硕士学位论文 a bs t r a c t w i t ht h ef a s te n l a r g e m e n to ff i e l da p p l i c a t i o na n di n c r e a s i n gc o m m e r c i a lu s eo f g e n e t i c a l l ym o d i f i e dc r o p s ，t h eg e n e r a lp u b l i ch a v eb e e nc o n c e m i n ga b o u tt h es a f e t yo f t r a n s g e r t i cc r o p s i n2 0 0 7 ，t h ec r o p p i n ga r e ao ft r a n s g e n i cc r o p sh a sb e e nu pt o28 2 4 m i l l i o na c r e sw i t hag r o w t hr a t eo f12p e r c e n t ，a n d2 3c o u n t r i e sh a v em a d eu s eo f t r a n s g e n i cc r o p s h o w e v e r , a st h ec h o s e ns e l e c t a b l e m a r k e rg e n e s ，w h i c kc o n f e r r e s i s t a n c et oc e r t a i ns e l e c t i v ec h e m i c a la g e n t s ，s u c ha sa n t i b i o t i c so rh e r b i c i d e s ，a r e b e c o m i n gap u b l i cf o c u s ，d u e t ot h e i r p o s s i b l ee n v i r o n m e n ta n dh e a l t hh a z a r d ， e l i m i n a t i n gs e l e c t a b l em a r k e rg e n e sf r o mt r a n s g e n i cp l a n t sh a v eb e c o m eas e r i o u s p r o b l e mt ob es o l v e d b a s e do nc r e l o x pr e m o v i n gs y s t e ma n dc h e m i c a l - i n d u c e dg rs y s t e m ，a l li n d u c e d c r e i o x ps e l f - r e m o v i n g - a n t i b i o t i sp l a n te x p r e s s i o nv e c t o rw a sc o n s t r u c t e d t h i sv e c t o r c o n t a i n sas i t e s p e c i f i cc r er e c o m b i n a s eg e n ef u s e dw i t hl i g a n db i n d i n gd o m a i n ( l b d ) s e q u e n c ef r o mag l u c o c o r t i c o i dr e c e p t o rg e n e ，w h i c hw a si n s e r t e di n t ot h et w ol o x ps i t e s o fs a m eo r i e n t a t i o nt o g e t h e rw i t has e l e c t a b l em a r k e rf o rh y g r o m y c i nr e s i s t a n c e t o p r e v e n tc r er e c o m b i n a s ef r o me x p r e s s i n gi np r o k a r y o t e s ，a3 4 6 b pi n t r o no fc r y l f r o ma r a b i d o p s i st h a l i a n aw a si n s e r t e dw i t h i nc r er e c o m b i n a s eg e n e i no r d e rt or e d u c e e x p r e s s i o nl e v e l ，n o p a l i n es y n t h a s eg e n e ( n o s ) p r o m o t e rw a sc h o s e n t h e r e f o r e ，w eh a d c o n s t r u c t e dt h ep l a n tt r a n s f o r m a t i o nv e c t o rw h i c hi si n d u c e db yd e x a m e t h a s o n et o r e m o v ea n t i b i o t i c sg e n eu s i n gc r e l o x ps y s t e m t h ew o r km a yb ea p p l i c a b l ei nf u r t h e r r e s e a r c hi nt h ei n d u c e de x c i s i o no ft h es e l e c t a b l em a r k e rf r o mt r a n s g e n i cp l a n t t h e f u n c t i o n a li d e n t i f i c a t o no ft h ev e c t o ri si np r o g r e s s k e yw o r d s ：c r e l o x pr e c o m b i n a t i o ns y s t e m ；s e l e c t a b l em a r k e rg e n er e m o v i n g ；v e c t o r c o n s t r u c t i o n 独创性声明 本人声明，所呈交的学位( 毕业) 论文，是本人在指导教师的指导下独立完 成的研究成果，并且是自己撰写的。尽我所知，除了文中作了标注和致谢中已作 了答谢的地方外，论文中不包含其他人发表或撰写过的研究成果。与我一同对本 研究做出贡献的同志，都在论文中作了明确的说明并表示了谢意，如被查有侵犯 他人知识产权的行为，由本人承担应有的责任。 学位( 毕业) 论文作者亲笔签名：受灰拇 日期： 论文使用授权的说明 杉 6t ic l 本人完全了解福建农林大学有关保留、使用学位( 毕业) 论文的规定，即学 校有权送交论文的复印件，允许论文被查阅和借阅；学校可以公布论文的全部或 部分内容，可以采用影印、缩印或其他复制手段保存论文。 学位( 毕业) 论文 指导教师亲笔签名 保密，在年后解密可适用本授权书。 口 不保密，本论文属于不保密。 一 期： 期： 移? 。6 冲 l l 2 ”一弋 福建农林大学硕士学位论文 第一章文献综述 1 植物基因工程研究进展 1 1 转基因植物研究与利用现状 自从1 9 8 4 年首次利用农杆菌t i 质粒将外源基因导入烟草获得成功以来，经过二 十多年的发展，转基因技术已在近2 0 0 种植物中获得成功 1 】。转基因植物在提高植物 的农业和园艺价值，作为重要生物大分子的廉价生物反应器，以及研究基因在发育 和在生理生化过程与代谢途径中的作用等方面均充当了核心角色。据i s a a a ( i n t e r n a t i o n a ls e r v i c ef o rt h ea c q u i s i t i o no f a g r i b i o t e c ha p p l i c a t i o n s ) 的c l i v ej a m e s 报告【1 ，2 1 ，2 0 0 7 年全球转基因作物种植面积增长率达1 2 ，即增加l2 3 0 万h m 2 ，达 到1 1 4 3 亿h r n 2 ( 2 8 2 4 亿英亩) 。2 0 0 7 年，种植转基因作物的国家增加到了2 3 个，其 中包括1 2 个发展中国家和1 1 个工业化国家，按照种植面积顺序为美国、阿根廷、巴 西、加拿大、印度、中国、巴拉圭、南非、乌拉圭、菲律宾、澳大利亚、西班牙、 墨西哥、哥伦比亚、智利、法国、洪都拉斯、捷克、葡萄牙、德国、斯洛伐克、罗 马尼亚和波兰，前8 个国家的种植面积都超过了1 0 0 万h m 2 。 我国于1 9 9 9 年启动“国家转基因植物研究与产业化”专项【3 】。通过专项实施， 至u 2 0 0 6 年我国植物重要基因的分离克隆研究取得了重要进展，获得新基因6 1 0 个，其 中包括水稻分蘖基因m o c l 、融合抗基因c r y c i 、隐性抗水稻白叶枯病因x a 5 和x a l 3 等一批具有重要应价值并拥有自主知识产权的新基因4 6 个【3 】。我国还获得了转基因 抗虫、抗病、抗逆、品质改良等水稻、玉米、小麦、棉花、油菜、大豆以及主要林 草等新株系和新品系2 0 9 2 5 份，新品种5 8 个。目前，中国已经广泛种植抗虫的转基因 棉花，大约占全部棉花种植面积的7 0 。我国是世界上第二个有转基因抗虫棉花自 主知识产权的国家，到目前为止国内已有6 0 个多个抗虫棉品种通过审定【3 】。中国科 学家也开发了多种转基因水稻，大田试验显示它们能提高产量和减少杀虫剂使用。 福建农林大学硕士学位论文 据2 0 0 8 年9 月5 日科学杂志新闻报道，中国即将启动一项投资达3 5 亿美元的转基 因作物研究重大专项，以解决这个世界上人口最多的国家的粮食需求。 总之，近年来转基因作物在全球种植面积迅速增长，发现和应用于转基因的新 基因也正在大量增加，转基因也为增加农民收入，减少损失和劳动强度做出了巨大 贡献。 1 2 植物转基因技术研究进展 植物转基因的特点是可以跨越两性生殖障碍，使外源功能基因能够按人类的意 愿在不同生物种类之间转移，以解决农作物生产上存在的问题或生产人类所需要的 新产品。 目前植物转基因应用的技术方法 4 1 主要有农杆菌介导法、基因枪法、电击法、花 粉管通道法、微注射法、p e g 法、激光法等，其中基因枪法和农杆菌介导法是最常 用的两种方法，各种方法具有不同的应用范围和特点，如表1 所示。 丧1 常见檀物转化方法特点比较 近年来在多基因转基因技术、叶绿体转基因技术、无选择标记技术、基因删除 技术等安全转基因技术方法方面也有了一些重要的成就。中山大学基因工程教育部 重点实验室在多基因转化综合改良生物体方面取得了许多成就，构建了大量适合于 多基因转化的载体，获得了一大批整合有多个外源有用目的基因的作物品系或材料 2 福建农林大学硕上学位论文 【5 1 。叶绿体转基因植物作为生物反应器，具有外源蛋白表达量高和环境安全性好等 优点，近年来叶绿体转基因植物作为生物反应器在生产疫苗、药用蛋白及生物可降 解塑料等物质方面的有了较快的发展f 6 1 。近年来国内外在植物无选择标记技术、基 因删除技术等方面取得了也取得也一些研究进展和成果，提高了植物转基因的生物 安全性【7 州。 2 植物基因工程安全性问题 2 1 转基因植物的安全性争论 植物基因工程的迅猛发展将会使人类面临的粮食，能源，环境等问题得到相当 程度的缓解。然而一个不能忽视的问题就是转基因的安全性问题 1 0 。1 4 1 ，转基因食品 是否会对人类产生危害? 应用于转基因的优良基因被杂草俘获，是否会导致生态失 衡? 抗虫作物是否会导致某个食物链的缺失? 国内外对此有很大争议【”】，有人认 为，转基因技术所得到的植株与用常规育种所得到的植株具有“实质等同性”， 不 存在安全问题。如果说有问题，这种风险从常规育种开始就存在。当然更有人认为 转基因作物不安全。特别是1 9 9 8 年转g n a 马铃薯的“普斯陶伊事件”和1 9 9 9 年 转b t 玉米的“斑蝶事件”引起了人们对转基因作物的恐慌与担忧。随着基因的漂 移，人们十分担心这一致死基因在环境中扩散开来。 众多研究者认为，转基因技术的研究方法至少在理论上不能保证转基因农产品 对人体的安全性【1 6 1 7 】。事实上，对植物转基因是否存在安全性问题的讨论早已超出 了其技术的范畴，而成为一个具有普遍意义的社会公共事件，相关的商业机构也面 临着一种前所未有的压力，即必须最大限度地尊重消费者对转基因农产品的知情权 和自主选择权，即消费者必须知道相关的农产品是否包含某些非自然性的成分，只 有这样，才能保证消费者有足够信息和能力进行自由选择【l8 1 。 2 2 转基因植物的潜在风险与生物安全性 转基因植物的潜在风险与生物安全性主要指环境安全和食品安全2 个方面【1 5 】： 福建农林大学硕 二学位论文 在环境安全性方面主要包括以下方面： ( 1 ) 关于生存竞争力。即转基因作物比非转基因作物在农田生态系统中更具竞争优 势，对于那些原本具有杂草特性的作物，如向日葵、油菜、草莓等，抗除草剂基因 的导入可增加其自身杂草化风险【1 9 】。 ( 2 ) 基因漂移问题【2 0 】。是指基因通过花粉等途径在植物种群之间进行扩散。从理 论上说，外源基因通过花粉可能向周边同种作物甚至遗传性状近缘的野生种转移， 使这些生物增加了转基因性状。转基因作物与其近缘野生种间的杂交是转基因漂移 的主要形式。也是转基因作物与其近缘野生种之间基因流动的直接证据【2 1 1 。研究已 经证实1 9 1 ，由于许多农作物如油菜、甜菜、玉米、水稻、小麦、马铃薯、向日葵和 各类蔬菜以及花卉、牧草和树种植物与野生近缘种有较近的亲缘关系，这些植物中 的外源转基因通过天然杂交和基因漂移而逃逸到环境是迟早要发生的，特别是在栽 培作物和其野生近缘种具有共同分布的区域，转基因逃逸到野生种群的可能性更大。 油菜、甘蔗、莴苣、草莓、向日葵、马铃薯以及禾本科作物均有向其近缘野生种的 自发的基因转移。此外，不同属间基因流动也有可能发生，基因漂移可在适当条件 下，低频率发生。 ( 3 ) 对生物多样性的影响【2 0 1 。农田生态系统是一个各类生物相互依存并达成平衡 的系统，当一种或一类生物种群突然消失或增加，会引起其他生物物种群落的变化。 例如种植转基因抗虫棉，棉田中鳞翅目害虫( 靶标害虫) 减少了会造成农田生态系 统和生物群落发生变化。 ( 4 ) 关于抗性治理问题。由于转基因植物能够持续地高水平表达单一的杀虫蛋白， 因此转基因抗虫植物对害虫造成的选择压力甚至比杀虫剂还要高，这种植物的释放 将会加速害虫的抗性变化。如果连年大面积种植同一种抗虫转基因作物，可能造成 抗虫性降低。 在食品安全性方面： 转基因食品的危害因素主要来源于转基因载体、转基因受体、转基因表达产物、 转基因食品的代谢产物等几个方面2 2 1 。目前认为转基因食品对人类产生的危害主 要包括以下3 个方面 2 3 , 2 4 ：( i ) 潜在食物毒性，许多食品本身含有大量的毒性物质和 抗营养因子，转基因食品由于这些物质的富集可能会对人体产生毒害。此外，由于 4 福建农林大学硕士学位论文 基因具有多效性，遗传修饰在打开一种目的基因的同时，也可能提高食品中天然毒 素， 给消费者造成伤害。( i i ) 食物致敏性，由于导入基因的来源及序列或表达的蛋 白质的氨基酸序列可能与已知的致敏源存在同源性，导致过敏发生或产生新的过敏 源。( i i i ) 抗生素的抗性，为促进细胞、组织和转基因植物的转化，在基因转移过程 中大量的使用抗生素标记基因。人体摄入后抗生素抗性标记基因通过水平基因转移 和重组会扩散到很多肠道细菌及病原体中，产生新的病原细菌和病毒，产生抗生素 抗性。转基因食品的外源d n a 不易在肠道内消化，可能被机体细胞摄取并整合到基 因组中，引起细胞突变，这对人类的健康存在着潜在的危害。 3 提高植物转基因安全性的策略 随着转基因作物面积的扩大和大量转基因产品被推向市场，人们对转基因植物 对环境及人类健康等许多方面可能存在的风险的担扰在增加。尽管这些担忧尚未有 明确的科学根据，但如何提高植物转基因的生物安全性，已经成为公众对转基因植 物的认同和接受的重要因素。 3 1 防止外源基因逃逸 由于目前大多数转基因植物的培育采用组成型启动子，使得外源目的基因在所 有组织和器官中均有表达，因此，转基因植物中花粉的散布成为外源基因逃逸( t r a - s g e n i ce s c a p e ) f f 啵渠道之一【2 5 1 。转基因的逃逸【2 1 ( t r a n s g e n i ce s c a p e ) 是指由遗传工 程的方法转移将某一生物有机体的遗传信息( 目标基因) 在生物的个体、种群甚至是 物种之间自发移动的过程。 花粉在不同物种或同种的不同品种之间的交流是可以通过人为措施来控制【2 6 1 。 如在栽种转基因作物品种时，不给转基因作物与非转基因作物品种以及可能产生基 因漂移的近缘野生种以空间和时间上任何传粉的机会。可以通过研究转基因作物和 非转基因品种以及野生近缘种的空间地理分布、开花习性、传粉机制、繁育习性以 t ， 及有关生物学特性的研究来达到避免或降低传粉。转基因作物与相关植物的安全隔 离，是避免和降低转基因逃逸的有效方法，应该得到充分的重视【2 7 】。特别是在转基 福建农林大学硕士学位论文 因作物的环境释放或大田实验阶段，设立转基因作物和相关植物的安全距离尤为重 要。 除了在栽培上的安全隔离防护措施外，科学工作者正在探讨和开发一系列防范 转基因逃逸的分子策略【2 8 】：叶绿体转化法，携带被改变的叶绿体的转基因植物可 避免转基因通过花粉从转基因植物传递到非转基因植物中去，不易造成环境安全问 题 2 9 】；雄性不育法，通过阻断花粉或花药中基因的正常表达而诱导雄性不育，从而 阻断花粉传播的，可以解决与转基因流动相关联的问题【3 0 】：终止子技术，利用 c r e l o x pd n a 特异酶切位点重组系统，在一个特定的发育阶段激活种子里的致死基 因，解决了转基因植物的以种子为媒介的基因转移问题。此外还有染色体组特异性 选择、外源基因删除法等。 3 2 使用安全标记基因 一旦获得转化植株后，特别是在转基因产品的产业化过程中，抗性标记基因的 存在是多余的，甚至是有害的。虽然有的抗性标记基因( 如n p t i i ) 已通过安全性评 价，但还是不能彻底消除人们对于转基因产品的担忧。所以能否有新的更安全的标 记基因代替现有的抗性标记基因成为了人们关心的问题和科学家们研究的热点 3 1 - 3 4 。近年来已研究出一些代替传统抗性标记基因的安全标记基因，这些标记基因 没有抗生素和除草剂抗性，相对来说对生物是安全的。 3 2 1 化合物解毒酶基因 这种标记基因的作用机制和抗性标记基因相似，也属于负筛选( o p p o s i t es e l e c t i o n ) ，标记基因编码产物是酶，可催化对细胞生长有毒的化合物转变成无毒的化合 物，从而使转化细胞能在含有毒化合物的培养基上生长，而非转化细胞被杀死【3 5 1 。 来源于藜科植物的甜菜碱乙醛脱氢酶( b e t a i n ea l d e h y d ed e h y d r o g e n a s e ，b a d h ) 基因编码产物能催化有毒的甜菜碱醛转变成无毒的甜菜碱，从而使转化植株在含有 甜菜碱醛的培养基中正常生长，而非转化植株则被杀死。还由于其催化的终产物甜 菜碱是高等植物天然的渗透调节物质，可提高植物的抗渗透胁迫能力，目前已用于 6 福建农林大学硕士学位论文 提高水稻等作物的抗逆境胁迫能力中。d a n i e l l 3 6 1 等在转化烟草叶绿体基因组试验 中，验证了b a d h 基因作为标记基因优越性，其转化率是壮观霉素( s p c ) 抗性基因 的2 5 倍。利用植物来源的基因作为选择标记基因，可以大大减轻人们对转基因作物 安全性的忧虑。 有研究表明，色氨酸脱羧酶基因( t r y p t o p h a nd e c a r b o x y l a s e ，t d c ) 也可用于标记 基因，原理与甜菜碱醛脱氢酶基因的原理相同，转化的细胞可以将培养基中有毒的 色氨酸类似物的毒性解除，进而存活并发育成完整的个体【3 7 1 。 从一种细菌中分离出的汞离子还原酶基因( m e r c u r i cr e d u c t a s e ，m e r a ) ，其编码 产物可催化离子汞转化单质汞，而单质汞的毒性最低。目前已有将这个基因导入植 物试图修复被污染的土壤和水体的报道。因此，m e r a 基因有潜力作为标记基因应 用到植物转化中。培养基中加入离子状态的汞盐作为选择剂，转化的细胞因具有转 化有毒的汞盐为无毒的单质汞的能力而存活，非转化细胞则毒害而死，从而达到选 择目的 3 8 】。 3 2 2 糖代谢有关基因 近几年根据植物细胞对不同糖类碳源的代谢能力，所发展的利用糖类作为筛选 剂的正筛选系统( p o s i t i v es e l e c t i o n s y s t e m ) ，在安全标记基因方面显示出巨大的应用潜 力。这类标记基因的编码产物是某种糖类的分解代谢酶，转化细胞能利用筛选剂糖 类作为主要碳源，可在筛选培养基上生长扩增，而非转化细胞则处于饥饿状态，生 长被抑制但不被杀死，依此可以区分转化与非转化细胞。已试用于植物转化的此类 标记基因有木糖异构酶【3 9 ( x y l o s ei s o m e r a s e ，x y l a ) 基因和磷酸甘露糖异构酶 ( p h o s p h o m a n n o s ei s o m e r a s e ，p m i ) 基斟4 0 ，4 1 1 。 目前，所用的最好的糖代谢基因体系是用磷酸甘露糖异构酶基因做标记，甘露 糖做选择介质。甘露糖吸收后，被己糖激酶磷酸化成甘露糖6 磷酸，具有磷酸甘露 糖异构酶活性的转化体将其转变为果糖6 磷酸，而非转化体由于没有磷酸甘露糖异 构酶活性而造成磷酸甘露糖积累从而生长受阻。这种系统已经成功应用于玉米转化 上，未成熟胚的转化效率高达3 0 ，并且发育成整合了外源基因的正常植株【4 2 】。 7 福建农林人学硕士学位论文 木糖异构酶基 ：k - 1 ( x y l a ) 选择系统弥补了p m i 基因选择系统的不足，它是用s t r e p o m y c e sm b i g i n o s u s 的木糖异构酶基因做选择标记，木糖做选择介质。木糖异构酶能 催化d 木糖生成d 木酮糖。非转化细胞不能利用d 木糖做为唯一碳源，而转化了 x y l a 基因的细胞则能利用d 木糖做为唯一碳源，在含木糖的培养基上生长。此选择 系统转化土豆的效率比卡那霉素选择系统高约1 0 倍。木糖在食品工业中已广泛应用， 所以植物转化中用木糖做选择标记是安全的 4 0 l 。 此外还有报道来源于大肠肝菌的g u s ( 1 3 一葡萄糖苷酸酶) 基因可作为选择标记， 细胞分裂素的葡萄糖苷酸链生物苄基腺嘌呤作为相应的选择剂【矧。大肠杆菌c 菌株 疗，操纵子同样可以作为选择标记，以核糖醇为碳源的培养基上生长完全可以代替抗 性标记基因应用于植物遗传转化中【4 3 1 。 3 2 3 氨基酸代谢有关基因 生物的某些支链氨基酸的合成都要经过天门冬氨酸的合成途径，如赖氨酸、苏 氨酸、甲硫氨酸和异亮氨酸。其中合成途径中的天门冬氨酸激酶( a s p a r t a t ek i n a s e ， a k ) 受到赖氨酸和苏氨酸的抑制反馈作用，这种作用会导致甲硫氨酸的缺乏。1 o 赖氨酸加苏氨酸的量就可以强烈的抑制大部分植物物种的生长，但来源于细菌的础 基因对这些氨基酸则不敏感，在植物转化中可作为选择标记基因使用，赖氨酸和苏氨 酸作为选择剂。目前该基因在烟草、番茄和大麦的基因转化中已被成功的应用m 】。 合成异亮氨酸最初的一步是转换苏氨酸形成a 酮丁酸。这一反应是由苏氨酸脱 氨酶( t h r e o n i n ed e a m i n a s e ，t d ) 催化的，这是由i l e 反馈调节的。t d 的突变体对i l e 的反馈抑制表现不敏感，导致细胞内积累的i l e 。以前的报告表明，在植物表达野生 型大肠杆菌的t d u v a 突变不敏感i l v a 一4 6 6 基因，能够增加异亮氨酸细胞浓度。i l e 结构类似物，l o 甲基苏氨酸( o m t ) ，在细胞死亡转变和诱导过程中，能够有效地 竞争与i l e 。因此预测可以用来作为一种有效的选择剂在植物工程研究。a e b m e i e r 等【4 5 】研究认为i l v a 基因作为选择标记，相应的o m t 作为选择剂能够有效的筛选烟草 转化体，但其筛选效果不女i n p t l i 作为选择标记，卡那霉素作为选择剂的对照。 福建农林人学硕士学位论文 3 2 4 其他安全标记基因 绿色荧光蛋白基因 绿色荧光蛋白基因( g r e e nf l u o r e s c e n tp r o t e i n ，g f p ) 基因编码的 荧光素蛋白是一种单体蛋白，它在3 9 5 n m 的远紫外光或4 9 0 n m 的蓝光下便可激发出 绿色荧光。把编码该蛋白的基因与目的基因一起导入植物细胞，不需要添加任何底 物或辅助因子，不使用同位素，也不需要测定酶的活性，用专门的仪器检测( 如 f a c s ) ，就能分离转化细胞和非转化细胞。其表达产物对细胞基本上没有毒害作用， 并且不影响细胞的正常生长和功能。g f p 基因已被用于转化甜橙原生质体、云杉花 粉、水稻胚性愈伤组织、甘薯叶肉细胞原生质体和叶片组织 4 6 1 。 i p t 和r o l 基因 农杆菌的激素代谢途径中编码酶的基因也已成功用于转基因植物的 筛选h 7 1 ，但个别基因或其活性必须去除或灭活，以免激素过量而使转化植株出现畸 形。i p t s a r o l 基因的过量表达都会引起植物不定根的增加，通过表型鉴定，就可分离 出转化植株。m a t 载体系统就是利用i p t 或r o l 造成的形态学上的变化作为选择标记。 甜椒类铁氧还蛋白基因将甜椒类铁氧还蛋白基因c d n a 构建在c a m v 3 5 s 启动下， 用胡萝卜软腐欧文氏菌( e r w i n i ac a r o t o v o r a ) 提供筛选压，对兰花分别进行基因枪 和农杆菌介导转化。在没有利用抗生素或除草剂的情况下获得转基因兰花植株。转 化植株对胡萝卜软腐欧文氏菌的抗性得到增强。由于该基因来源于植物本身，所以 在植物无标记转基因具有应用价值。 谷氨酸一卜半醛转氨酶基因 谷氨酸一卜半醛转氨酶基l ：g l ( g l u t a m a t e 1 s e m i a l d e h y d e a m i n o t r a n s f e r a s e ，h e m l ) ，是一个与叶绿素合成有关的酶基因，其编码的产物谷氨酸 一1 半醛转氨酶( g s a a t ) 能催化谷氨酸1 半醛生成6 氨基一y 一酮戊( a m i n o l a e v u l i n i ca c i d ，a l a ) ，它是叶绿素生物合成的第一个中间产物。3 氨基2 ，3 二氢苯甲酸 ( g a b a c u l i n e ) 是一种植物毒素，它能强烈地抑制g s a - a t 的活性使舢a 不能合成， 从而导致叶绿素生物合成发生中断，植物由于缺少叶绿素，将失绿产生白化苗【2 7 】。 大量的文献报道了安全标记基因的转化效率显著高于传统的抗性标记基因，并 且其转化的程序类似于传统的抗性标记，程序简单，技术成熟，应用范围广泛，同 时个别标记基因还可作为目的基因而存在。因而应用安全标记基因对植物的转化意 义更大，实现了转化1 次转移2 个基因的目的。 9 福建农林大学硕士学位论文 3 3 剔除标记法 虽然安全标记基因在能够克服植物转基因安全问题，但从长远看剔除选择标记 基因可能才是解决植物转基因安全问题的最佳方法，因为剔除选择标记基因不仅可 以解决转基因安全问题，而且可以利用同一选择标记连续进行多次转化选择，从而 实现对农作物多个性状的改造，实现综合改良。 3 3 1 共转化系统 共转化法是指通过基因枪或者农杆菌介导分别将构建在不同载体或同一载体的 不同t d n a 区域的标记基因和目的基因共同转化到受体细胞中，由于标记基因和目 的基因可以整合到非连锁位点，后代植株发生分离就可以获得无选择标记的转化植 株。 囹囹 园 ：| 图：共转化体莱 ：目的蘑因；：选择酥记基嘲；l ：t - i 秘a 边界序列 f i g 1 lc o 一“- 曩n ：i o r 矗臣a t i 佣掣暑c e m c o _ 删 ：h i 碉 ；： h b w k e rl e e e 钿o d e c t m e ；l ：a f t o d n a 目前共转化主要有三种方法( 图1 - 1 4 9 】) ：( i a ) 含有目的基因和标记基因的两 个t - d n a 分别导入到不同的农杆菌菌株后共同转化受体；( i - b ) 或者是两个分开的质 粒通过基因枪来共同转化；( i i ) 分别含有目的基因和标记基因两个质粒共同导入到 同一农杆菌菌株；( i i i ) 含有两个t - d n a ( 分别含有目的基因和标记基因) 的单个质粒 通过单一农杆菌介导转化【5 0 ，5 1 1 。此外l u 等【5 2 1 ( 2 0 0 1 ) 以二元载体p w b v e c 8 为骨架构 建了双右边界序列二元载体系统，利用这个系统可以获得含有标记基因和目的基因 l o 福建农林人学硕士学位论文 同时整合或目的基因单独到基因组的整合植株。 目前共转化系统已经被成功应用到包括烟草、水稻、大豆等作物的无标记基因 转基因植株的获得。共转化法中两基因同时整合到受体植物的效率已经达到单一质 粒转化频率。不过，标记基因和目的基因的遗传分离必须经过有性世代才能实现， 这不仅会增加育种时间，而且无法应用于无性繁殖的植物品种。另外，这种系统适 用于那些转化效率高的植物，因此对本身转化效率低的植物应用受到了限制。 3 3 2 转座子系统 在玉米中首先发现的a e d s 转座子系统在许多类植物中也存在。可移动的转座 子系统能分解为不移动的转座酶基因和可移动的末端重复序列，它几乎能在所有异 源植物寄主细胞中自由转座【3 5 1 。有时转座作用并不伴随再次插入而是该转座子丢失 睁3 1 。 基于上述原理，可通过将标记基因置于转座子与重复序y f j d s 之间，转座作用 发生后，标记基因即随转座作用而与目的基因分离或丢失，从而获得无标记基因的 转基因植物。e b i n u m a 等【5 4 】通过将标记基因插入玉米转座子a c 中，获得了无选择标 记的转基因烟草。 虬撇n j 一幽 图卜2 基于a c 转座子的标记基因剔除 f ig 1 2a ct r a n s p o s o n - b a s e de x p e l l i n go fm a k e rg e n e s 、：m , 复r k e r 詈豫e ? a n dg o ：堇雏eo ii n 嚣i l t 转座子途径可以不需要再次转化或杂交引人重组酶。但是该途径也存在一定弊 端效率较低，转座子切除有时并不是精确切除，可能会改变周围基因的结构 5 5 1 。转 座后往往偏向于原来的附近位置重新插人需要有性分离途径，只适用于有性繁殖以 及生活周期短的植物。这些限制了其在标记剔除策略上的应用。 福建农林大学硕士学位论文 3 3 3 染色体内同源重组系统 染色体内同源重组( i n t r a c h r o m o s o m a lh o m o l o g o u sr e c o m b i n a t i o n ，i c r ) 在理论上 只要两条d n a 序列相同或接近，重组就可以在此序列中的任何一点发生。就是在 没有重组酶活性的情况下，将标记基因置于重复序列之间，通过重复序列的同源重 组作用去除标记基因，但自然条件下植物细胞内的i c r 频率很低。目前应用的染色 体内同源重组系统是基于细菌噬菌体的同源重组系统，在e c o l i 基因组中的整合是通 过噬菌体附着序y l j a t t p ( p h a g ea t t e c h m e n t ) 和细菌附着序y u a t t b ( b a c t e r i a l a t t e c h m e n t ) 之间的重组实现的【5 6 】。z u b k o 等【5 7 1 报道应用两个a t t p 位点染色体内同源重组消除选择 标记基因，获得无选择标记的转基因植株。在叶绿体转化烟草中，把标记基因和 重复序列相连，经过培养，标记基因也被切除【5 8 5 9 1 。 i c r 其机理与位点特异性重组相似，但也有其自身的特点：它不需要辅助蛋白 参与，因而不会对植物基因组造成可能的伤害，也省去了遗传分离的环节。 3 3 4 位点特异性同源重组系统 位点特异性重组系统是利用重组酶催化两个短的、特定的d n a 序列间发生重 组，以去除选择标记基因的遗传操作系统。每个重组系统都由2 个主要组分组成：重 组酶和特异性识别位点【6 0 。6 2 】。其基本原理就是将选择标记基因置于特异性识别位点 之内而将目的基因置于其外。当转基因植株同时或分别引入重组酶基因时，重组酶 就会切除、颠倒或交换特异性识别位点内的d n a 片段。目前应用于植物细胞的位点特 异性重组转化系统主要包括三类：来源于噬菌体p l 的c r e l o x p 系统、接合酵母s r 质 粒的r r s 系统和酿酒酵母质粒的f l p f r t s 系统，其中以c r e l o x p 定位重组系统的应 用最为广泛。 通常情况下，位点特异性重组酶系统根据识别位点方向和位置的不同，能够产 生3 种效应【6 3 】，分别为：( i ) 当一对反向识别位点位于目的基因的两端时，在对应重 组酶的作用下，识别位点间的所有基因将发生倒置，即倒位( i n v e r s i o n ) 。( i i ) 当一对 同向识别位点位于目的基因两端时，其相应的重组酶将删除识别位点之间的的所有 外源基因和一个识别位点，最后在基因组中只留下一个识别位点，这就是重组( r e c o 1 2 福建农林大学硕士学位论文 m b i n a t i o n ) 。( i i i ) 如果识别位点分别位于细胞中不同的染色体上，那么在对应重组酶 的作用下，两条染色体可以在识别位点的位置发生染色体片段的互换，产生杂合的 染色体，这种作用就叫作位置互换( t r a n s l o c a t i o n ) 。具体过程见图l 一3 中所示。 i o x p5 a t a a c t t c g t a t a lat g t at g cr r a t a c g a a g t t a t g a a g t t c c t a t t c it c z 4 g a a a g t a t a g g a a c t t c t t g a t g a a a g a 6l 翻c g t t al t j c t t t c a t c a a 3 1 1 ，- l - l - - _ l - l _ 。一 b i a g d i n gs i t e s p a c e r 瑚i n g d i n gl i t e 圈1 - 3 位点转募性重组酶系统工作示意盈 f l 参i 一3as c h e m a t i ci l l u s t r a t i o no fs i t e - s p e d f l cr e c o m b i n a t i o n ” s t e m i r s 系统该系统是从接合糖酵母的p s r 环形质粒中分离出来的。重组酶基因r 表 达时，特异位点r s 发生同源重组，这种重组即可去除两个r s 位点的标记基因o n o u c h i 等畔】用含r 重组酶基因的转化植株与含有标记基因位于r s 位点间的植株进行杂交， 获得了无标记基因的拟南芥转基因植株。 f l p 腰r t s 系统 该系统是源于酿酒酵母2 1 a m 质粒，是创建最早的位点特异系统。 c r e g g 等【6 5 】克隆了酿酒酵母不对称的倒位重复序列( f r t s ) 之间的吨基因，f r t s 是 重组酶f l p 的特异作用位点。将a r g + f r t s 结构d l 入a r g 一酵母中，经筛选得到了a r g + 转化株。经过二次转化将f l p 引入转化子中，又获得t a r g 一的转化子，从而证明 了重组事件的发生。之后，大量的工作表明，该重组系统在果蝇、哺乳动物细胞、 玉米、水稻等多种动植物中都是有效的。 c r e l o x p 系统这一系统是从大肠杆菌噬菌体p l 中获得的。目前，该系统是所有重 组酶系统中用得最广、最完善的转化系统。大肠杆菌p l 噬菌体c r e 基斟6 6 】的3 8 5 k d a 产物( 该产物是一种重组酶，r e c o m b i n a s e ) 能识别并催化l o x p 位点间的重组，l o x p 位 点含3 4 b p ，包括被8 b p 间隔的两个1 3 b p 反向重复，每个反向重复及其临近的4 b p 构成 福建农林大学硕士学位论文 一个c r e 蛋白的结合区，其中间隔区是非对称性的，这种非对称性决定了l o x p 位点 具有方向性，如下图【6 7 】所示： l 2 34 56 7 8 a v t g t a t gc r 蠢队m 易g 圈1 4c r e 耄组酶识别l o i p 位点 f i g 1 4t h el o x ps i t er e c o g n i z e dh - c r er e c o m b i u a s e c r e d n a 复合物的晶体学分析结果表明，在c r e 1 0 x p 复合体中，4 个相同的c r e 亚基结合成一个环形结构并与两个反向平行的l o x p 结合，每个c r e 亚基与两个相邻 的c r e 亚基和l o x p 位点相结合【6 8 1 。研究表明【6 9 c r e 重组酶由两个明显的结构域组成： 较小的n 末端结构域和较大的c 末端结构域，结构域间由一个短链相连。n 末端由 第2 0 至第1 2 0 个氨基酸组成，c 末端由第1 3 2 至第3 4 1 个氨基酸组成。在重组过程中， n 端和序列的识别有关系，c 一端和d n a 的结合及d n a 链的切割有关系。 d a l e 和o w ( 1 9 9 1 ) 利用该系统，通过二次转化获得完全剔除了筛选标记基因的 转基因植株。甄伟【7 0 】等( 2 0 0 1 ) 利用共转化的技术将c r e 基因和g u s 基因侧翼含同 向l o x p 位两种元件同时转化烟草得到转基因植株。 2 0 0 0 年，z u o 等建立了基于人雌激素受体的化学诱导植物基因表达系统x v e ， x v 的序列由细菌l e x a 阻遏物的d n a 结合区x 、v p l 6 的酸性反式激活子区v 和人 的雌激素受体调控区e 融合构建，表达产物可作用于靶启动子c a m v 3 5 s 中的l e x a 操纵子，从而使靶启动子的表达受b 雌二醇的高效诱导和严格控制【7 1 1 。他们将x v e 系统与c r e l o x p 剪切系统结合发展了另一标记基因剔除系统c l x ( c r e l o x pd n a e x c i s i o ns y s t e m ) ，在拟南芥上的研究表明，经p 雌二醇诱导后，c l x 对受体植株标记 基因区( 包括x v e 、重组酶基因c r e 和标记基因n p t i i ) 的切除率达1 0 0 ! 该系统不仅 可精确控制切除时间，而且不依赖于i p t 表型筛选，同时适用于无性繁殖的植物品 种【7 2 1 。 除此以外，目前大量研究集中于利用化学诱导表达启动子和组织特异性肩动子 诱导c r e 重组酶表达在转基因植物中剔除选择标