（食品科学专业论文）β葡聚糖酶的定向进化及热稳定性研究.pdf

浙江大学博士学位论文摘要 摘要 b 一葡聚糖酶是重要的工业用酶，可有效消除谷物p - 葡聚糖在酿造和饲料工业中产生的负面影 响。与国外相比，我国对口一葡聚糖酶的研究起步较晚，且研制的0 葡聚糖酶的热稳定性普遍较差， 不能满足现代啤酒糖化工艺和颗粒饲料造粒的温度要求，因此提高b 一葡聚糖酶的热稳定性具有非 常重要的意义。本课题以大肠杆菌表达系统克隆和重组表达了b 葡聚糖酶基因：建立了高通量筛 选耐热d 一葡聚糖酶的方法；以克隆的b 葡聚糖酶基因为起始材料，通过设计的定向进化策略和建 立的筛选手段提高野生型b 葡聚糖酶的热稳定性；检验所构建的热稳定性重组菌株的遗传稳定 性；对热稳定性突变株e g s 2 的发酵条件进行优化；筛选并优化出提高b 葡聚糖酶热稳定性的复 合保护剂：估算了热稳定性b 葡聚糖酶的储藏寿命。主要研究结果如下： 从b a c i l l u ss u b t i l i s z j f 1 a 5 中克隆了大小为8 4 9 b p 的b ，葡聚糖酶基因。通过序列比对，该基因 编码的氨基酸序列与b o r r i s sr 、s u n ，j 和h i d e t o s h i 发表的b - 葡聚糖酶的氨基酸序列分别有1 3 氨基酸的替换。b 葡聚糖酶基因经b a m h l 和h i n d l l i 双酶切后与用同样限制性内切酶切割的载体 p e t 2 8 a ( + ) 进行重组表达，得到了2 7 k d 的有活性的p 葡聚糖酶。对酶在宿主细胞中的位置进行 测定，结果显示：1 3 - 葡聚糖酶不仅分泌至细胞外，而且也存在于细胞内和周质空问。发酵上清液 经硫酸氢盐析沉淀和d e a ec e l l u l o s e5 2 离子交换柱层析，纯化的b 一葡聚糖酶经s d s p a g e 电泳 鉴定，纯化产品为单一条带，分子量约2 7 k d 。纯化的p 一葡聚糖酶的热学性质研究表明：b 葡聚 糖酶的t m 值为6 25 ，最适反应温度为5 5 。 本研究将定位膜转印和肉眼可见的平板筛选策略相结合，通过对影响菌落生长、酶的表达和 转印成功率的各因素的优化，建立了高通量筛选耐高温b - 葡聚糖酶的方法。结果显示：每个l b 平板( 直径9 0 m m ) 用4 p 12 0 0 m g m l | p t g ；i p t g 要预先涂在l b 平板上：菌落密度约为1 0 0 个， 平板：菌落培养时间为3 79 c ，15 小时；完全钝化野生型酶的条件为1 0 0 2 小时。对该方法的稳 定性考察结果显示：该方法的重现性为1 0 0 ，假阳性率为0 1 6 ，假阴性率为】2 2 2 。与其它 高通量筛选方法相比，以滤膜为基础的高通量筛选方法存在许多优点，如透明圈清晰，假阳性率 较低，筛选通量高，操作简便，费用低等。该方法作为一种固相酶筛选方法，在鉴别热稳定性和 低温下催化活性同时得到提高的变异体时非常有效。 为了提高b 葡聚糖酶的热稳定性，利用体外定向进化技术对编码b 葡聚糖酶的基因进行改 造。设计的定向进化策略包括一轮的随机突变和一轮的d n a 改组。应用建立的高通量筛选方法 筛选热稳定性突变体，最终获得e g s i 和e g s 2 两株热稳定性突变体。通过对野生酶和突变酶的 d n a 序列和酶学性质分析发现：e g s l 和e g s 2 分别有四个和五个氨基酸替换：这些氨基酸替换 使e g s l 和e g s 2 突变酶的t m 值分别比野生酶的t m 值( 6 25 ) 提高了3 和5 c ，达到了6 5 5 - 和6 7 5 c ；突变酶的最适反应温度也提高了5 。c ；两个突变酶对地衣多糖的水解能力分别被提高 2 8 和降低2 16 ；对地衣多糖的亲和力与野生型的一致，未见改变；在酶的最适p h 值上，野 生酶和e g s l 突变酶为6 5 ，而e g s 2 突变酶为7 0 ；在酶的p h 值稳定性方面，野生型和突变型8 一 葡聚糖酶都有较宽的p h 稳定范围，在p h6 0 8 5 的范围内放置4 8h ，1 3 - 葡聚糖酶仍保持8 0 以 上的酶活力。这一结果说明了定向进化在提高酶的热稳定性方面是比较有效的。 v l i i 浙江大学博士学位论文摘蔓 遗传稳定性检验结果表明：e g s l 和e g s 2 突变株传代5 0 次后，质粒稳定性良好，重组表达的 目的产物活性保持恒定，说明突变株的遗传稳定性良好。 通过摇瓶发酵分析，突变株e g s 2 最佳生长条件为：装液量4 0 m l ，接种量1 5 ，初始p h 值 为6 5 7 0 。在此条件下，菌体生长6 小时后进入稳定期。分别用i p t g 和乳糖作为诱导剂，对适 于菌体生长和目的产物表达的条件进行优化，结果显示：1 p t g 和乳糖都可以作为重组工程菌的 诱导剂i 乳糖的诱导效果稍好于i p t g 的诱导效果；i p t g 浓度对菌体生物量和目的产物表达量影 响不大，而乳糖浓度对菌体生物量和目的产物表达量的影响较大。温度对目的产物在上清液中的 积累影响较大，对菌体生物量的影响不大。合适的i p t g 诱导条件为：诱导时间，4 小时；诱导 剂浓度，0i m m o l l ：诱导温度，3 4 。c 。合适的乳糖诱导条件为：诱导时间，4 小时：诱导剂浓度， 1 0 m m o l l ；诱导温度，3 2 。 通过单冈素实验，筛选出能提高b 一葡聚糖酶热稳定性的保护剂，并设计正交实验优化复合保 护剂组成。结果表明白蛋白，明胶和c a c l 2 2 h 2 0 都能明显提高b 葡聚糖酶的稳定性；复合保护 剂配方为：o 8 ( w v ) 自蛋白，2 ( w v ) 明胶，1m m o l lc a c | 2 2 h 2 0o 含保护剂的口葡聚糖 酶的t m 值比不含保护剂的酶的t m 值高4 。c ，加保护剂和未加保护剂的酶液在3 62 。c 下的热降 解速度分别为0 0 3 9 8 和0 0 8 4 ，这说明保护剂对酶的热稳定性和储存稳定性都起到了较好的保护 作用。 利用加速实验估算了b 葡聚糖酶在不同温度下的储存寿命。选择的实验温度为2 8 。c ，3 6 2 。c ， 4 5 。c 。将盛有6 葡聚糖酶的样品瓶放入不同温度的水浴中，不同时问取样并测定b 葡聚糖酶活性。 实验数据的统计处理结果得出：b 葡聚糖酶在4 5 。c ，3 6 2 和2 80 c 活性损失l o 所需时间为1 3 6 d ， 43 7 d 和2 0 0 9 d 。活性损失5 0 所需时间为8 5 d ， 2 5 4 7 d ，1 0 4 9 d 。由寿命估算曲线估算出b 一葡 聚糖酶在2 5 ，2 0 ，1 5 ，4 c 和0 时，活性损失1 0 需要的时间分别为3 0 7 d ，6 7 o d ，1 4 59 d ， 22 1 年，41 4 年：活性损失5 0 所需时间为1 5 4 0d ，3 1 6 0d ，6 4 8d ，3 1 5 4d 。从加速实验的结果可 以看出b 葡聚糖酶的稳定性可以满足储存的需要。加速实验可以在较短时间内估算出b 葡聚糖酶 的储存寿命。 关键词：定向进化；易错p c r ：d n a 改组；热稳定性；b 一葡聚糖酶；高通量筛选；突变体 库：发酵条件；保护剂；加速实验：储存稳定性 x 浙江大学博士学位论文a b s t r a c t a b s t r a c t 1 3 - g l u c a n a s ei s a l l i m p o r t a n ti n d u s t r i a le n z y m ea n di so f t e na d d e dt or e d u c en e g m i v ee f f e c to f p - g l u c a ni nb r e w i n ga n df e e d s t u f fi n d u s t r i e s ，b u tt h es t u d y o nt h ep g l u c a n a s eb e g a nl a t ea n dt h e t h e r m o s t a b i l i t yo f1 3 - g l u c a n a s ew a sp o o rw h e nc o m p a r e dw i t hf o r e i g ns t u d i e s t h ep o o rt h e r m o s t a b i l i t y o f l 3 - g l u c a n a s ed o e sn o ts a t i s f yt h et e m p e r a t u r er e q u i r e m e n to f m a l t i n ga n df e e d s t u f f p r e p a r a t i o n ，s oi ti s s i g n i f i c a n tt oi m p r o v et h et h e r m o s t a b i l i t yo fb g l u c a n a s e t h i sp r o j e c ti sa i m e da tt h ef o l l o w i n ga s p e c t s ： m o l e c u l a rc l o n i n ga n de x p r e s s i o no f1 3 - g l u c a n a s eg e n ei ne c o i l ；t h ed e v e l o p m e n to fh i g h - t h r o u g h p u t s c r e e n i n gm e t h o df o rt h e r m o s t a b l ep g l u c a n a s e ；e n h a n c i n gt h et h e r m o s t a b i l i t yo f1 3 - g l u c a n a s eb y d i r e c t e de v o l u t i o na n ds c r e e n i n gw i t ht h ed e v e l o p e dm e t h o d ；c h e c k i n gt h eg e n e t i cs t a b i l i t yo ft h e t h e r m o s t a b l em u t a n t s ；o p t i m i z i n gt h ef e r m e n t a t i o nc o n d i t i o n so fm u t a n te g s 2 ；s c r e e n i n ga n d o p t i m i z i n gt h ec o m p l e xp r o t e c t i v ea g e n tf o r1 3 - g l u c a n a s e ；e v a l u a t i n gt h es t o r a g ep e r i o do f1 3 - g l u c a n a s e b ya c c e l e r a t e ds t o r a g et e s t t h em a i nr e s u l t sa r cs h o w na sf o l l o w i n g ： t h ee n d o - b - g l u c a n a s eg e n ef r o mb a c i l l u ss u b t i l i sz j f i a 5w a sc l o n e dt h eo b t a i n e d8 4 9 b pd n a f r a g m e n tw a si n s e r t e di n t ot h ev e c t o rp e t 2 8 a ( 十) t h es e q u e n c eh o m o l o g ya n a l y s i ss h o w e dt h a tt h e d e d u c e da m i n oa c i d si no p e n r e a d i n gf r a m eh a d1 3a m i n oa c i d ss u b s t i t u t i o n sc o m p a r e dw i t ho t h e r a m i n oa c i d ss e q u e n c eo f1 3 - g l u c a n a s ed e t e r m i n e db yb o r r i s sr ，s u n ，j ，h i d e t o s h i ，r e s p e c t i v e l y w h e n t h es t r a i nw a si n d u c e db yi p t g ，i tp r o d u c e d2 7 k dp r o t e i na n da c c u m u l a t e dt h ee n z y m ei nt h e e x t r a c e l l u l a r ，p e r i p l a s m i ca n di n t r a c e l l u l a rs p a c e t h ee n z y m ew a ss a l t e do u tf r o mt h eb r o t hu s i n g ( n h 4 ) 2 s 0 4a n dp u r i f i e dw i t hd e a ec e l l u l o s e5 2 o n ec l e a rb a n dw a ss h o w no nt h es d s p a g ea n dt h e m o l e c u l a rw e i g h tw a sa b o u t2 7 k d t h ee n z y m ep r o p e r t i e sw e r em e a s u r e d t h er e s u l t si n d i c a t e dt h a tt h e m e l t i n gt e m p e r a t u r e ( t i t l ) o ft h ee n z y m ei s6 2 5 ；t h eo p t i m a lt e m p e r a t u r e ( t o m ) o fe n z y m ea c t i v i t yi s 5 5 t h ed i r e c t e d s i t em e m b r a n et r a n s f e r r i n ga n dv i s u a ls c r e e n i n gm e t h o db a s e do np l a t ew e r eu s e d ， a n dt h ef a c t o r s ，w h i c ha f f e c tb a c t e r i u mg r o w t h ，e n z y m ee x p r e s s i o na n dt h es u c c e s sr a t eo fm e m b r a n e t r a n s f e r r i n g ，w e r eo p t i m i z e dt od e v e l o pt h eh i g ht h r o u g h p u ts c r e e n i n gm e t h o df o rt h e r m os t a b l e 1 3 - 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p u ts c r e e n i n gm e t h o d t h r o u g hm u t a t i o na n ds c r e e n i n g ，t h et w o m u t a n t s ，i e ，e g s la n de g s 2 ，h a df o u ra n df i v ea m i n oa c i ds u b s t i t u t i o n s ，r e s p e c t i v e l yt h e s e s u b s t i t u t i o n sr e s u l t e di na ni n c r e a s ei nm e l t i n gt e m p e r a t u r ef r o mt m 26 2 5 cf o rt h ew i l d t y p ee n z y m e t ot m = 6 5 5 f o rt h em u t a n te g s la n d6 7 5 f o rt h em u t a n te g s 2 t h eo p t i m u mt e m p e r a t u r eo ft h e t w om u t a n t sw e r ea l s oi n c r e a s e db y5 h o w e v e r ，t h et w om u t a n te n z y m e sh a do p p o s i t ea p p r o a c h e st o p r o d u c er e d u c i n gs u g a rf r o ml i c h e n i nw i t he i t h e rm u c hh i g h e r ( 2 8 ) f o rt h ef o r m e ro rm u c hl o w e r ( 21 6 ) f o rt h el a t t e ri nc o m p a r i s o nw i t ht h e i rp a r e n t a le n z y m et h ea f f i n i t i e so f t h et w om u t a n t sf o rt h e l i c h e n l nw e r eb a s i c a l l yu n c h a n g e d t h eo p t i m u r np hw e r e6 5f o rt h ee g s la n dw i l d - 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g l u c a n a s ew e r es c r e e n e dt h r o t l g hs i n g l e f a c t o re x p e r i m e n t s ；t h e o r t h o g o n a le x p e r i m e n tw a su s e dt oo p t i m i z et h eb e s tc o m b i n a t i o no fd i f f e r e n tp r o t e c t i v ea g e n t t h e r e s u l t si n d i c a t e dt h a tt h ea l b u m i n ，g l u t i na n dc a c l 2 2 h z oc o u l de n h a n c et h ee n z y m et h e r m o s t a b i l i t y ； t h ec o m p l e xp r o t e c t i v ea g e n tc o n s i s t e do f0 8 a l b u m i n ，2 g l u t i na n d1m m o l lc a c l 22 h 2 0 t h e t mo fe n z y m ew a si m p r o v e db y4 w h e n1 3 - g l u c a n a s ec o n t a i n e dt h ec o m p l e xp r o t e c t i v ea g e n tt h e t h e r m a ld e g r a d a t i o nr a t ew a s - o 0 3 9 8f o re n z y m ew i t hp r o t e c t i v ea g e n ta n d 一0 0 8 4f o re n z y m ew i t hn o p r o t e c t i v ea g e n ta t3 62 。c t h er e s u l t si n d i c a t e dt h a tt h ec o m p l e xp r o t e c t i v ea g e n tc o u l de f f e c t i v e l y e n h a n c et h et h e r m os t a b i l i t ya n ds t o r a g es t a b i l i t yo f l 3 - g l u c a n a s e t h ea c c e l e r a t e ds t o r a g et e s tw a sc a r d e do u tt oe s t i m a t et h es h e l fl i f eo f1 3 - g l u c a n a s ea td i f f e r e n t t e m p e r a t u r e s t h es a m p l e sw e r ek e p ti nw a t e rb a t ha t2 8 c ，3 6 2 。c ，4 5 ，a n dt h e i ra c t i v i t i e sw e r e d e t e r m i n e da td i f f e r e n tt i m e t h er e s u l t so fs t a t i s t i c a lt r e a t m e n to fd a t as h o w e dt h a tt h ea c t i v i t yo f 1 3 - g l u c a n a s ed e c r e a s e db yl o a f t e r13 6 d ，43 7 d ，2 00 9 d ，3 07 d ，6 7 o d ，1 4 5 9 d ，2 2 l y , 41 4 ya n dd e c r e a s e d x i 浙江大学博上学位论文 a b s t r a c t b y5 0 a f t e r8 5 d ，2 54 7 d ，1 0 4 9 d ，1 5 4 0d ，3 1 60d ，6 4 8d ，3 1 5 4d ，w h e nt h e yw e r ek e p ta t4 5 。c ，3 6 2 c 2 8 。c ，2 5 ，2 06 c ，1 5 c 4 a n d0 ，r e s p e c t i v e l y t h er e s u l t si n d i c a t e dt h a tt h es t a b i l i t yo f l 3 - g l u c a n a s e w a sc o m p e t e n tf o rt h es t o r a g er e q u i r e m e n t ，a n dt h ea c c e l e r a t e ds t o r a g et e s tc o u l de s t i m a t et h es h e l fl i f e o f1 3 - g l u c a n a s ei ns h o r tp e r i o d k e y w o r d s ：d i r e c t e de v o l u t i o n ，e r r o r p r o n ep o l y m e r a s ec h a i nr e a c t i o n ，d n as h u f f l i n g ，t h e r m os t a b i l i t y p - g l u c a n a s e ，h i g h - t h r o u g h p u ts c r e e n i n g ，m u t a n tl i b r a r i e s ，f e r m e n t a t i o nc o n d i t i o n s ， p r o t e c t i v ea g e n t ，a c c e l e r a t e ds t o r a g et e s t ，s t o r a g es t a b i l i t y 浙江大学博士学位论文 第一章文献综述 1b 一葡聚糖酶的研究概况 1 11 3 - 葡聚糖酶的分布 第一章文献综述 1 3 - 1 ，3 - 1 ，4 一葡聚糖( 简称1 3 - 葡聚糖) 是由】2 0 0 个以上的1 3 - d 一葡萄糖残基通过1 3 1 ，3 和b 1 ，4 糖苷 键以一定的比例连接而成的线形分子。在大麦、燕麦、高粱、大米和小麦等谷物的胚乳细胞壁中 的含量尤其丰富。在不同谷物的b 葡聚糖中，两种糖苷键型的比例和寡糖单元的长度有所不同。 如，8 5 以上的大麦1 3 葡聚糖是由单一b 1 ，3 一糖苷键间隔的纤维三糖和纤维四糖所组成。其余15 似乎是由单一b 1 ，3 键分割的由4 、5 、8 或更多个连续的p 一】，4 键组成的较大片段( s t o n ee ta 4 1 9 9 2 ； p a r r i s he td t l 9 6 0 ；w o o d w a r de la l ，1 9 8 3 ) 。1 3 - 葡聚糖独特的分子结构使其能以高分子形式溶于水， 形成的溶液黏度较高，给工业生产带来诸多问题，如，大麦中高含量的b 葡聚糖( 4 0 8 o ) 可 造成麦汁和啤酒粘度增加，致使麦汁过滤困难、得率降低，并可引起啤酒的非生物性浑浊，影响 啤酒的稳定性和质量( 何国庆等，1 9 9 2 ) ；以大麦等谷物作能量饲料，由于单胃动物肠胃中不具有降 解谷物类1 3 葡聚糖的酶系，高分子量的b 葡聚糖引起畜禽胃液黏度增加，阻碍单胃动物对养分的 吸收，谷物的饲用价值降低，p 葡聚糖是饲料的抗营养 习t - ( s t o n ee t 口1 9 9 2 ；w h i t ee ta , 1 9 8 3 ) 。p 葡聚糖酶是饲料工业和啤酒行业中广泛使用的一种酶，它可以水解大麦中b 葡聚糖成为较小的聚 合物，从而降低了b 葡聚糖对啤酒和饲料行业所造成的问题。但内源性的b 葡聚糖酶的热稳定性 差，在6 5 ( 2 糖化5 m i n ，酶活性仅存l ，不能有效降解麦汁中游离的b 葡聚糖。而且随着大麦含 量的增加和糖化温度的提高，这一问题愈发严重( t h o m s e ne ta l l 9 8 8 ) 。目前发现多种微生物能产 生专一性降解混合键型1 3 一葡聚糖的p 葡聚糖酶，主要为细菌中的芽孢杆菌。产b 葡聚糖酶的细菌 有枯草芽孢杆菌( r s u b t i l i s ) ( c a n t w e l le t a f ，1 9 8 3 ；g o s a l b e se t a t , 1 9 9 i ；s u z u k ie t a l l 9 7 6 ；汤兴俊、 何国庆，2 0 0 2 ) 、浸麻芽孢杆菌m a c e r a n s ) ( h e n ge la l ，1 9 9 7 ；b o r r i s se ta l , 1 9 9 0 ) 、地表形芽孢杆菌 ( 口n c h e n i f o r m i s ) ( l l o b e r a se t 口 1 9 9 1 1 、解淀粉芽孢杆菌l ba m y l o l i q u e f a e i e n s ) ( h o f e m e i s t e re l 甜，1 9 8 6 ) 、多粘芽孢杆菌( b p o l y m y x a ) ( g o s a l b e se t a l , 1 9 9 1 ) 、短芽孢杆菌( bb r e v i s ) ( l o u w e la l ，1 9 9 3 ) 、短小芽孢杆菌( r p u m i l u s ) ( s u z u k ie l 口1 9 7 6 ) 、产琥珀酸拟杆菌( b a c t e r o i d e s s u c e i n o g e n s ) ( i r v i ne t a l ，1 9 9 8 ；t e a t h e re ta l ，1 9 9 0 ；e r f l ee ta l , 1 9 8 8 ) 、牛链球菌( s t r e p t o c o c c u s6 d v 西) f e k i n c ie ta l ，1 9 9 7 ) 、热纤梭菌( c t o s t r i d i u mt h e r m o c e l l u m ) ( s c h i m m i n ge ta 4 1 9 9 1 ) 等，来源于微生 物和麦芽的b 一葡聚糖酶具有相似的底物专一性，其中芽孢杆菌9 - 葡聚糖酶的热稳定性高于麦芽内 源酶和真菌i + 1 3 葡聚糖酶。 1 2b 一葡聚糖酶的酶学性质 芽孢杆菌o 一葡聚糖酶是有一条蛋白多肽链折叠而成，其分子量在2 5 3 0 k d a 之间、等电点( p 1 ) 在7 5 9 1 之间，最适p h 大多接近中性，在6 0 75 之间( 除了bb r e v i s 产酶的p h 为9 ，嗜碱性芽孢 杆菌n 1 3 7 的酶在p h7 - 1 2 范围内仍维持8 0 以上的酶活性) 。酶的最适反应温度分别为4 5 ( 多 l 浙江大学博士学位论文 第一章文献综述 粘芽孢杆菌b p o l y m y x a ) ( b o r r i s se t 以1 9 8 1 ) 、5 5 ( 枯草芽孢杆菌bs u b t i l i s 、淀粉芽孢杆菌 b a m y l o 加u e f a c i e n s 、地衣芽孢杆菌b l i c h e n i f o m 妇) ( o l s e ne l a l ，1 9 9 1 ；l l o b e r a se t a l ，1 9 8 8 ) 和6 5 ( 浸麻芽孢杆菌b m a c e r a n s 、短芽孢杆菌bb r e v i s 、嗜碱性芽孢杆菌n 1 3 7 ) ( l o u we l a l , 1 9 9 3 ； t a b e m e r oe l a l ，1 9 9 4 ) 。酶的特异活性( 一定条件下从大麦1 3 一葡聚糖释放的还原糖的量，以葡萄糖 计) 在1 2 0 0 4 5 0 0 p m o lm i n 。m g 。之间。以大麦b 葡聚糖和地衣多糖为底物时的k m 值分别在12 - 1 5 m gm l 。1 和o 8 2 0m gm l 。虽然非芽孢杆菌b 葡聚糖酶经常因具有额外的不同功能结构域而比芽 孢杆菌b 葡聚糖酶大，但其生化特性与芽孢杆菌p ，葡聚糖酶相似：r f l a v o f a c i e n s ( 9 0 k d a ) ( f l i n te t a f ，1 9 9 3 ) ，c t _ t h e r m o c e l l u m ( 3 8 k d a ，p h o m 6 6 1 0 0 ，t o p , 8 0 。c ) ( s c h i m m i n g e ta t , 1 9 9 1 ) ，f s u c c i n o g e n e s ( 3 7 k d a ，p h 。m6 0 ，t 。p i5 0 。c ) ( e r f ee t a l l 9 8 8 ) 。在真菌地衣多糖中，o r p i n o m y c e s