（光学工程专业论文）非共焦微球激光诱导荧光检测实验系统的研究.pdf

摘要 y $ 8 1 3 m 本论文主要研究一种对流过微流控芯片通道的微球进行计数的非共焦型激 光诱导荧光检测系统。 用红光荧光染料对直径约5 6 o n 聚丙烯酰胺球基进行染色，用绿光荧光染料 对另一种球基进行染色。利用带有两种荧光染色剂的微球进行生物分析，生化反 应将在悬浮于液体中的球基上进行。反应结束后，通过激光诱导荧光( e l f ) 检测 微球上携带的两种荧光，对微球进行计数来完成坐化分析。用这种方法进行生化 分析，消耗试样少、分析速度快，而操作相比传统方式大为简化。 本论文研究这种微流控生化分析系统的激光诱导荧光检测部分。作为该系统 的第阶段研究工作，本课题进行了以下工作：1 非共焦型l i f 检测系统的总体 结构设计。2 设计耦合装置将激发光耦合入单模光纤，采用单模光纤引导和入射 5 3 2 n m 和6 3 5 n m 两种激发光。3 设计了对荧光分光、滤波和探测的荧光探测装置。 详细讨论了提高荧光采集效率和信噪比的措施，制作了探测机构、光电倍增管的 高压供电电路和前置放大器。4 对绿光荧光试剂进行了l i f 检测实验，在分析实 验数据的基础了给出了检测系统的优化配置。5 对后续研究工作提出了改进意 见。 关键词：微流控芯片、微球、激光诱导荧光检测、非共焦、单模光纤 来经作者、导师弼意 勿全文公布 a b s t r a c t t h i s p a p e rm a i n l ys t u d y an o n - c o n f o c a ll a s e ri n d u c e d f l u o r e s c e n c e ( l i f ) d e t e c t i o ns y s t e m ，w h i c hi su s e dt oc o u n tm i c r o b a l lf l o w e di n t ot h ec h a n n e lo ft h e m i c r o f l u i d i cc h i p o n ek i n do f m i c r o b a l l ( d i a m e t e ro f5 6 p m ) i sd y e du s i n gr e df l u o r e s c e n td y e ， t h eo t h e ri s d y e du s i n gg r e e nf l u o r e s c e n td y e t h o s eo fm i c r o b a l lw i t hd i f f e r e n t f l u o r e s c e n td y ec a l lb eu s e di nb i o c h e m i c a la n a l y s e sa n db i o l o g ym o l e c u l e sw i l lr e a c t o nt h em i c r o b a l l w h e nt h eb i o l o g yr e a c t i o ni sf i n i s h e dw e t a k el i fd e t e c t i o no nt h e m i c r o b a l la n dc o u n to nt h em i c r o b a l la t t a c h e dw i t ht w ok i n do ff l u o r e s c e n td y e b y c o u n t i n gt h en u m b e ro ft h em i c r o b a l lw ec a l lc o m p l e t et h eb i o c h e m i c a la n a l y s e s t h i sm e t h o dc a r lh e l pu st of i n i s hb i o c h e m i c a la n a l y s e sw i t hl e s sr e a g e n t ，b u tm o r e s i m p l eo p e r a t i o na n dh i g he f f i c i e n c y w es t u a yl i fd e t e c t i o no ft h em i c r o f l u i d i cb i o c h e m i c a la n a l y s e s s y s t e m t h e w o r k sw eh a v ed o n ea sb e l o w ：t h ed e s i g no fw h o l es t r u c t u r eo ft h en o n c o n f o c a ll i f d e t e c t i o ns y s t e m ；t h ed e s i g no ft h ed e v i c et o c o u p l ee x c i t a t e dl i g h ti n t ot h es m f , t r a n s p o r t5 3 2 u m a n d6 3 5 m nl a s e rd i r e c tt ot h ed e t e c t i o na r e a ；d e s i g n i n gt h ed e v i c et o d i v i d e ，f i l t e ra n dd e t e c tt h ef l u o r e s c e n c es i g n a l d i s c u s st h em e t h o dt oi m p r o v et h e e f f i c i e n c yo fc o l l e c t i n gs i g n a la n ds i g n a l - n o i s er a t i o n m a k et h es e t u po fd e t e c t i o n d e v i c e ，h i g hv o l t a g es u p p l yo fp m t a n dl o w n o i s ep r e a m p l i f i e r ；d o i n gl i fd e t e c t i o n e x p e r i m e n tt og r e e nf l u o r e s c e n td y e w eg o tt h eo p t i m i z a t i o no fd e t e c t i o nd e v i c e b a s e do nt h e e x p e r i m e n t sr e s u l t ；g i v i n gi m p r o v i n g a d v i c ef o rf u t u r er e s e a r c h k e y w o r d s ：m i r c o f l u i d i c c h i p ；m i c r o - b a l l ；l a s e r i n d u c ef l u o r e s c e n c e n o n c o n f o e a l ；s i g n a l - m o d eo p t i c a lf i b r e 第啦绪论 新i ：大学顶f ：学缸电文 第一章绪论 1 1 微流控芯片的基本知识 1 1 1 微型全分析系统的概念 2 0 世纪9 0 年代初，瑞士c i b a g e i g y 公司的m a n z 和w i d m e r 首次提出微型全 分析系统( m i n i a t u r i z e dt o t a la n a l y s i ss y s t e m ，b t t a s ) 的概念以来，经历了发展初 期的冷落与彷徨，在短短的十余年中已发展为当前世界上最前沿的科技领域之 一。自2 0 0 2 年开始，u 1 a s 己被列入美国分析化学每两年一次的综述中，这 标志着它作为分析化学的一个独立领域，已被学术界所承认，且将以微流控芯片 系统( m i c r o f l u i d i cc h i ps y s t e m ) 作为其主要的发展方向。这些都预示着u 1 1 a s 将 进入了一个更迅猛发展的新时期【1 1 。 “t a s 目的是通过化学分析设备的微型化与集成话，最大限度地把分析实验 室地功能转移到便携地分析设备中，甚至集成到方寸大小的芯片上。由于这种特 征，本领域的一个更为通俗的名称“芯片实验室”( l a b o n a 。c h i p ，l o c ) 已经被 r 益广泛接收。在分析系统微型化、集成化的基础上，l r t t a s 的最终目标是实现 分析实验室的“个人化”、“家用化”，从而是分析科学及分析仪器从化学实验室 解放出来，进入千家万户。微流控芯片是t t a s 中当前最为活跃的领域和发展前 沿；它最集中地体现了将分析实验室的功能转移到芯片上的思想，其未来的发展 将对上述目标的实现起到至为关键的作用。 i _ t t a s 是一个高度科学交叉的领域，它即依赖于许多分析技术的发展，又依 赖于微加工技术的支持与发展，同时还依赖于应用对象( 目前主要是生命科学) 的发展和融入。除此之外，材料、电子、光学仪器、计算机等科学领域的发展与 介入也是叮1 a s 不断取得进展与成功所不可或缺的条件。i t t a s 作为一门新科学， 它的发展即需要强大、先进的技术支持，更需要先进的理论指导。l a t a s 再发展 中还需要中还需要更多的基础理论来更深入地理解和掌握物质再微米尺度流动 状态下的行为，列入微米通道中的传质、导热、吸附及微区反应规律等。这些都 对相关的理论研究提出了新的挑战。 1 - 1 2 微流控全分析系统及微流控分析芯片发展简史 1 a t a s 的出现在现代分析科学与分析仪器的发展中有器历史必然性、回顾4 0 余年的发展历史会看到分析系统的自动化、微型化趋势早在2 0 世纪5 0 年代后期、 第一章绪论 浙大学蚓i ：带似地文 6 0 年代初期即已出现，其发展动力主要来自环境即材料科学的发展中对更多、 更准、更快地获取物质成分信息的需要。 s k e g g s 创始的间隔式连续流动分析( s e g m e n t e dc o n t i n u o u s f l o w a n a l y s i s ，s c f a ) 是这个时期发展地有代表性地成功范例，s c f a 突破了传统分析 化学以玻璃器皿和量器为主要操作工具的操作模式，把分析化学转移到有液体连 续流动的管道中1 2 。s c f a 地观念是对分析化学，甚至是对整个化学实验室操作 技术的革命性贡献。s c f a 虽然在溶液分析自动化中取得了成功，但分析设备并 不能微型化，试样、试剂消耗量相比传统的分析化学也没有改观。1 9 7 5 年r u z i c k a 与h a n s e n 提出了流动注射分析( f l o wi n j e c t i o na n a l y s i s ，f i a ) 的概念，f i a 利用 细管道( 啪( 1 5 ) 假定激光开始照射之前处于激发态的粒子数可以忽略，则式( i - - 4 ) 的解为 ：( 。= j 瓦焉。一e x p 卜( 2 w + $ 2 1 + a 2 1 ) ，】 f 【。，r 】 ( 1 6 ) 这结果表明，激光作用开始后，上能级粒子数开始随t 呈指数增长，并于作用 终了时刻f - ，时达到最大信 ( 1 7 ) 在这段时间内，两能级粒子数满足关系 n 2 ( t ) ( n o 2 n i ( f )f 【0 ，f l 】 即这期间激光与物质相互作用以受激吸收为主。 从物质受到激发到开始产生荧光有一个时间延迟r d ，通常激光脉冲都很短， 以致r c q ，因而，在激发过程中基本没有荧光产生。激光脉冲结束后，n ：( f ) 随 时间的变化规律由方程( 5 ) 决定，荧光开始发射后有 n 2 ( f ) = n 2 ( r d ) e x p 一( s 2 l + “2 i ) ( r o ) 】( ，幻) ( 1 8 ) 因为。也很小，从f l 到r d 期间n 2 ( ，) 变化不大，v 2 ( 勺) 可以用式( i - - 7 ) 近似，于是 2 ( f ) = 面矿焘1 一e x p _ 1 ( 2 + 岛l + 爿2 e x p _ ( 岛i + a 2 1 ) ( f 一勺) 】 ( 1 9 ) 荧光发射结束时，粒子几乎全部返回基态，此时再次有n ：z0 。故在荧光发 射期能跃迁到上能级数粒子数减少为 z = 万老”e x p 【_ ( 2 鼢州：1 ) f m ( 1 - - 1 0 ) 如果s ：“a ：，则可以近似认为上能级每减少一个粒子，即产生一个荧光光子， 则荧光光子总数为 n o = 1 3 , n 2 = j 面焉 l e x p 卜( ，r + $ 2 1 + a z t ) f l j j ( 1 - - 1 1 ) 即受激吸收越强，q 越大，荧光越强，对于a 2 ，则存在一个由超越方程 ( 2 w + s 2 l + 爿2 1 ) r l = e x p ( 2 w + s 2 l + a 2 1 ) 1 】一1( 1 一1 2 ) 所决定地最佳值。 1 2 3l i f 在微流控芯片上应用 由于l i f 检测器具有极高的灵敏度、良好的选择性、较宽的线性范围等优点， 因此微流控芯片分析系统中，l 1 f 检测器成为一种应用最早、并且至今仍然应用 较多的光学检测器。 1 l i f 检测器分类 根据激发光源的不同，l i f 检测器可以分为以普通激光器作为激发光源和以 半导体激光器( l d ) 作为激发光源两类，见表( 1 1 ) 。根据其光学系统不同，可 以分为非共聚焦和共聚焦l i f 系统两类，见表( 1 2 ) 。 表( 1 1 ) 典型激光器与半导体激光器的比较 波长光束体积功耗可用荧光价格 试剂 典型激光可选择的高斯光束体积高，泵浦方一l ：作波段高 器波欧多，尤发散角小式复杂，- i ：可用试剂 其在可见方向性好作电压商多 光波段 半导体激大部分工厄米一高 小 低，注入电一般物质 相对低廉 光器 作于红外斯光束发流泵浦：【均不产生 波段，可见散角人，方作电压低荧光，可j = i 光波段l d向性差可与集成试剂少 不易获得 电路兼容 表( 1 2 ) 共聚焦型和非共聚焦型的对比 结构灵敏度理论应用 共聚焦型 结构复杂，精度要 易滤除激光和共聚焦显微术已有商品化的 ( c o n f o c a l )求高，体积大杂散光，信噪比理论成熟。可_ l = l j微流控芯片都 高，检测限易于资料详实采_ l l = 都采川共 提高聚焦型。 非共聚焦型 结构简单，易于实信噪比较著，检如何提高信噪研究阶段 ( n o n c o n f现微型化测限不易提高比有待研究 o c a l ) 2 微流控芯片上的l i f 的研究成果 ( 1 ) 共焦型检测研究成果 共焦型l i f 检测器通常由共聚焦荧光显微镜作为光学系统，主要由二色镜 ( d i c h r o i cm i r r o r ) 、聚焦透镜和干涉滤光片等构成，激光束经过扩束准直，由二 色镜反射并由显微镜聚焦到芯片的检测区域，激发产生的荧光经过二色镜透射 ( 同时阻挡反射的激发光) ，并由与显微镜同轴且共焦的显微目镜聚焦，再经过 干涉滤光片和针孔进一步滤除干扰光后成像在光电倍增管上进行检测。共焦型 l i f 检测器的结构如图1 3 所示。 1 m i c r o s c o p eo b j n v e ( 显微物镜) 2 d i e h r o i cm i r r o r ( 喇) 3 , b e a me x p a n d e k 嬲) 4 t u b el e n s ( 目镜) 5 p i n h o i e ( 针孔) 6 c ec h j p ( 芯片) 7 f i l e t r l ，2 ，3 ( 干涉滤光片) 8 p m t ( 光电倍增管) 图1 - - 3o c v r i k 采心的共焦型l i f 检测装置示意幽 1 9 9 8 年加拿大的a l b e r t a 大学的o c v i r k 等人采用优化设计的共焦荧光检测方 第一啦结论 案。使用4 0 倍，n a 0 6 ，工作距离3 7 m m 的物镜聚焦成直径1 2 m 光斑。采用不 同直径的针孔( p i n h o l e ) ，达到的光学切片能量( s e c t i o n i n gp o w e r ) 和探针容积 ( d e t e c t o r p r o b ev o l u m e s ) 分另为( 1 0 0u m ，1 8 t a m ，0 1 p l ；2 0 0 u m ，2 0 u m ，0 6 p l ；4 0 0 u m ，2 6 u m ，1 7 p l ；6 0 0 u m ，3 6 u m ，2 4 p 1 ) 。以4 8 8 n m 氩离子激光器为光源，在玻璃 芯片通道内连续流动模式下，探测3 0 0 f m 的荧光素得到的信噪比为6 1 ，此检测 限为当时最低的。同时在毛细管区带电泳模式下，对荧光的检测限( l i m i to f d e t e c t i o n ，l o d ) 为1 p m o l l 湘当于5 7 0 分子水平1 1 6 。系统的针孔直径最优值为 4 0 0um ，最小激发光功率为3 7 5 m w 。 1 9 9 9 年加拿大的j i a n g 等人采用6 3 5 n m 波长，1 1 2 m w 的红光半导体激光器， c y 一5 荧光染色剂，p m t 作为荧光检测元件，在微流控毛细管电泳芯片上构成共 焦型高灵敏l i f 检测器。使用此检测器，对染料c y 5 的浓度检测限可以达到 9 p m o l l ，相当于9 0 0 个分子的水平。同时，j i a n g 等人得出的针孔直径优化值为 4 0 0pm ( 此时信噪比最大) ，探针容积为】6 p l ，。这一优化配置值和o c v i r k 等人 得出的结论几乎相同表明同时也证明了w i l s o n 关于共焦显微镜的理论同样适用 于微流控芯片上的共焦型l i f 检测器m i 。 为了进一步提高l i f 检测器灵敏度从而降低检测限，达到超高灵敏的荧光检 测，采用光子计数技术是个有效的办法。f i s t e r 等人采用单光子雪崩二极管 ( s p a d ) 作为光检测元件和罗丹明b 检测的浓度检测限分别达到 1 7 x 1 0 1 5 m o l l 和8 5 1 0 。5 m o l l l ，实现了小分子物质的超高灵敏度检测。 提高l i f 的检测灵敏度的方法还有双光子激发荧光检测( t w o p h o t o ne x c i t e d f l u o r e s c e n td e t e c t i o n ) 技术。双光子激发荧光检测过程中，被测物质的分子同时 吸收两个光子而被激发到高激发态，然后经由处于高激发态与基态之间的第三能 级，向基态跃迁而发射荧光，由于双光子激发荧光需要存在这个第= - - , 日u t b 级，所以 提高了检测的选择性。双光子激发产生的荧光在紫外区，较易消除散射光的干扰， 背景噪声可降低到光电倍增管等光电检测元件的暗电流水平，因此检测的噪声极 低。大大提高了检测的信噪比。双光子吸收是一弱跃迁过程，产生荧光信号的强 度与入射的激发光功率的平方成正比，采用较大功率的激光器作为激发光光源可 以提高检测的灵敏度。但是采用双光子激发荧光检测技术，需要一些较为复杂和 精密的仪器设备。z u g e l 等人采用平均功率1 2 0 m w 、波长5 8 0 n m 的燃料激光器 作为激发光源，共焦的荧光显微镜作为光学平台，时间相关的单光子计数器作为 荧光检测部件，构成了双光子激发荧光检测器，他们采用这样的检测器首次在芯 片上实现了双光子激发荧光检测荧光素标记的1 3 一萘胺，其检测限为 6 x 1 0 一m o l l 。 ( 2 ) 非共焦型l i f 检测研究成果 用于微流控毛细管电泳芯片的典型l i f 检测器结构见图1 4 。 9 厂 i _ j 3 1 激光器2 聚焦透镜3 反射镜l4 微流控芯片5 采集物镜6 反射7 针孔 8 带通滤光片9 光电倍增管 图1 4 非共焦型l i f 检测器结构示意幽 在此中构造的非共焦l i f 检测方案中，激光束经过透镜聚光和反射镜反射， 以适当的入射角度照射芯片的检测区域，激发产生的荧光经物镜收集后会聚，并 由滤光片滤除激发光和其它杂散光后，用光电倍增管等光检测元件进行检测。这 种l i f 检测器的特点是结构简单，易微型化，但激发光和杂散光的干扰较大，导 致检测的信噪比较差。为了提高检测信噪比，必须优化激光束的入射角度和荧光 信号的收集角度。荧光信号的收集光轴角度与芯片平面相垂直时荧光的收集效率 最高，而激发光束垂直于芯片平面入射到芯片通道可以得到最大的激发效率。另 一方面，荧光信号的收集角度与激发光束正交( 9 0o ) 时，进入光电倍增管的激 发光最小。因此，通常使激发光与芯片平面成4 5o 夹角且垂直于通道的方向入射 到检测区域，产生的荧光信号则在与激发光成1 3 5o 央角的方向上进行收集。 1 9 9 6 年，j a c o b s o n 等人较早就采用了非共焦型l i f 检测系统如图( 1 - - 4 ) 第帮绪论 浙人学r c ai ：学竹沧文 作为微流控芯片分析系统的检测器，他们以5 1 4 5 r i m 的氩离子激光器作为激发光 源，对经1 1 1 m m 长度芯片通道分离的罗丹明b 和荧光黄进行了测定，以3 5 1 1 n m 的氩离子激光器激发，对三种不同分子量的香豆晶进行了芯片上分离和检测，后 来他们又以5 1 4 5 n m 的氩离子激光器为激发光源，在电泳通道长度为6 7 r i m 的芯 片上完成了d n a 限制片断的分离和检测 1 8 1 。 另一种更简化的非共焦检测方案入图1 5 所示 图1 5 使用光纤的非共焦检测方案 这种非共焦l i f 检测方案用多模光纤传送激发光到微流控芯片的检测区，在 此光纤的出纤端有球透镜，可把激发光准直在检测区的流体上。在与传送激发光 光纤垂直方向安装另一条光纤用来采集荧光信号，在这条光纤的入射端同样有球 透镜用来更加有效的收集来自检测区的荧光信号。显而易见，此方案的最大优点 是光学系统结构简单，尺寸小，成本低廉，且易与微流控芯片集成实现ut a s 的模块化设计。该方案的缺点如果激光器到光纤的耦合效率不易提高，且光纤的 对准要求高，如果光纤轴线偏离通道的中心，将导致信号采集效率大大下降。 2 0 0 2 年s c a n 等人采用图i 一5 所示的方案进行毛细管流动注射分析( c a p i l l a r y f l o wi n j e c t i o na n a l y s i s ，c f i a ) ，实验中分别采用2 6 6 n m 的n d ：y a g 激光器和4 7 0 r i m 的蓝光l e d ，出纤光功率为0 5 m w ，分别对不同流速的荧光素进行激发，激光诱 导的荧光检测限达到0 3 p p b ，采用l e d 的检测限达到8 2 p p b ”l 。 。 雄章结论 浙托火学碰i 二学位沦文 1 3 本课题主要研究内容及目标 微流控芯片上的激光诱导荧光检测器的研制工作是一项庞大的工作，它包括 了光学、电子、计算机软硬件、m e m s 、分析化学甚至医学等诸多领域的内容， 属于一个多学科交叉的项目，且许多内容是该学科的前沿领域，可供借鉴的资料 不多。在短时间内对相关的各个方面都进行研究，进而完成一个用于流控芯片上 的完整、实用的l i f 检测系统是不现实的。因此结合我的专业特点和本人的技术 特长，本人的研究重点和研究所要达到的目标是以下几个方面。 ( 1 ) 提出能微球l i f 检测总体方案。对此方案加以阐明，论证该方案的可 行性 ( 2 ) 设计激发光激发方式。ut a s 的一个重要指标是系统的微型化，微型 化的! - tt a s 才具有适用价值。要实现微型化，就激发模块来讲要在保证足够的激 发光能量的前提下，首先简化入射光学系统结构以减小体积，其次要使满足要求 的激发光功率最小以减小功耗。 ( 3 ) 设计荧光采集光路。ut a s 的一个主要特点是消耗的试剂量小，检测 灵敏度高。要满足这一要求，必须合理设计荧光采集光路，为提高检测灵敏度， 从而降低检测限，就要提高荧光信号的信噪比。为此，就要合理设计光路以滤除 激发光、杂散光、噪声荧光，同时使荧光信号的损失最小。 ( 4 ) 光电倍增管高压供电电路、前置放大、预处理电路的设计。微流控芯 片上激发出的荧光信号十分微弱，要提高检测限，就要在探测器电路环节抑制探 测器和电路的噪声，同时不失真的放大荧光信号到可以进行数字处理的程度。 参考文献 1 】方肇伦等。微流控分析芯片。科学出版社。2 0 0 3 年2 月第一版。 【2 s k e g g sl a m ，c f 汛砌啦! 9 5 7 , 2 7 ：3 1 1 f 3 r u z i c k aj ，h a n s e n eh a n a lc h i m a c t a 1 9 7 5 , 7 8 j j 4 5 4 r u z i c k aj ，h a n s e ne h a n a l c h i m a c t a 1 9 8 4 , 1 6 1 ：1 【5 m a n za ，f e t t i n g e rjc v e r p o o r t eem j ，l u d ih ，w i d m e rhm ，h a r r i s o nd j t r e n d sa n a lc h e m 1 9 9 l ，1 0 ：1 4 4 【6 j a c o b s o nsc ，h e r g e n r o e d e rr ，k o u t n ylb ，w a r m a c kr j ，r m s e yj m a n a l c h e m 1 9 9 4 ，6 6 ：11 0 7 ；i ；豪蛴硷浙大学碰士学位论兑 【7 w o o l e ya t m a t h i e sra ，a n a lc h e m 1 9 9 5 ，6 7 ：3 6 7 6 8 k h e t e r p a li ，m a t h i e sr a a n a l c h e m 1 9 9 9 ，7 1 ：3 1 a 【9 q i nd ，x i ay r o g e r sja ，j a c k m a nrj , z h a ox m ，w h i t e s i d e sgm ，m i c r o s y s t e m t e c h n o l o g y i n c h e m i s t r y a n d z i f e s c i e n c e e d s m a n za ，b e c k e r h s p r i n g e r , b e r l i n 1 9 9 9 1 0 s c h w a r zma ，h a u s e r pc l a bo na c h 驷2 0 0 1 ，1 ：1 1 1 b u m s m a ，j o h n s o n b n ，b r a h m a s a n d r as n ，h a n d i q u e k s c i e n c e 1 9 9 8 【1 2 c h a b i n y eml ，c h i udt ，m c d o n a l djc a n a lc h e m 2 0 0 1 ，7 3 ：4 4 9 1 【1 3 林炳承。毛细管电泳导论，科学出版社( 北京) ，1 9 9 6 【1 4 】张国威，王兆民。激光光谱学，北京理工大学出版社，1 9 8 9 。 1 5 】阁吉祥。激光诱导荧光机理研究，北京理工大学学报，2 0 0 0 。 1 6 】g r e g o ro c v i r k ，t h o m p s o nt a n g a n dd j e dh a r r i s o n 。a n a l y s t 1 9 9 8 ，1 2 3 ：1 4 2 9 17 g u i f e n gj i a n g ，s a i da t t i y a ，g r e g o r o c v i r k ，w i l l i a m e b i o s e n s o r s b i o e l e c t r o n i c s1 4 ( 2 0 0 0 ) 8 6 1 8 6 9 。 1 8 j a c o b s o nsc ，r a m s e y jm a n a l c h e m 1 9 9 6 ，6 8 ：7 2 0 1 9 s e a nj ，h a r t ，r e n e ed ，j i j i ，a n a lc h e m j u l y2 0 0 2 9 辩二二尊l i f 实验方案设计 浙门，大学伽l ：学n j e 文 第二章l i f 实验方案设计 2 1 检测对象模型 由抗体、抗原或半抗原参加的反应称为免疫反应，基于免疫反应的分析方法 称为免疫分析法。由于抗体对相应的抗原具有识别和结合的双重功能，所以抗体 能有选择地与抗原结合而不与其他物质结合。由于其极高地特异性和敏感性，免 疫分析法被广泛地应用于临床诊断和生化研究中，例如，踏实测定血液中微量地 肿瘤标记物所不可缺少地一项技术。但是常规免疫分析时问长、设备复杂，而且 试剂消耗量大。因此它在临床监护方面地应用受到了一定地限制。微流控芯片免 疫分析方法，由于具有分析速度快、消耗试剂量少、操作简单、设备便携等特点， 能够大大改善常规免疫测定的分析性能。 免疫反应可以分为均相免疫反应和非均相免疫反应两种类型。非均相免疫反 应是指将抗原( 或抗体) 固定在固相载体表面，通过特异免疫反应，将所需的抗 体( 或抗原) 结合在固相表面形成抗原抗体复合物的反应。非均相免疫反应后， 通过简单的清洗，即可实现抗原航体复合物与游离的抗原、抗体间的物理分离， 而且非均相免疫反应能使抗原或抗体从稀溶液中浓缩至固相载体表面，具有富集 作用。因此，利用非均相免疫反应的分析方法具有更低的检测限和更高的灵敏度 。 第一步引入微珠 第二步免疫反应第三步进入检测区 幽2 - - 1 微流控芯片上实现的非免疫均相反鹿示意图 以免疫均相反应为例( 如图2 1 所示) ，将微球( 本实验中为聚丙烯酰股球 基，直径约5 6 o n ) 作为固相载体，微球浸有荧光试剂，一种微球带有红光试剂， 另一种带有绿光试剂。使带有不同荧光试剂微球分别与抗原、抗体结合，接着使 两种微球混合，免疫反应就会在悬浮于液体中的微球上进行，反应结束后，带红 光试剂的微球的抗原将按一定规则结合被绿光染色的抗体，这样在球基上发生免 疫反应的微球将同时带有红光和绿光两种荧光试剂。使微珠依次通道上的检测区 第一章l i f 实验方案设计浙打火学琐：i ：学证沧文 l i f 检测，微流控芯片的流体驱动方式和检测区的几何尺寸保证微珠能够排成一 条直线依次通过检测区。微球通过检测区时，有两种波长( 5 3 2 n m 6 3 5 n m ) 的激 发光聚焦在检测区，分别激发出两种不同波长的荧光( 峰值波长5 7 5 n m ，6 7 0 r i m ) ， 6 7 0 n m 的荧光是红光微球的分类信号( 指示抗原类型) ，由a p d 探测器接收，对 依次通过检测区的微珠进行计数和编号识别。5 7 5 n m 的荧光信号为报告信号( 指 示浓度) 由另个光电倍增管接收，在检测过程中只有与红光荧光信号同时出现 的绿色荧光信号才被记录下来，作为计数识别标志。同时将这两个信号送入p c 进行数据处理。微球法l i f 检测原理框图如图2 2 所示。 5 3 2 n m 激光器窄 信计 带 n 兀”失1 a 可号算 入射激发 滤 雪崩光斗处 机 斗 光 1 色电管理数 微流控芯l 荧光镜 片绿光报 f 片f 2 n n _ 分 告信号 据 分 光 窄 光电倍 信 斗 析 i 入射激发 带 增管 号 滤处 光理 6 3 5 n m 激光器 片 图( 2 2 ) 微球法l i f 检测原理框图 2 1 实验总体设计方案的选型 在绪论一章中已经讲过，l i f 检测系统按照光学系统的组成可以分为共焦型 和非共焦型两种类型。本实验系统根据给定检测模型，决定选用非共焦型方案。 不采用共焦型方案的理由如下： ( 1 ) 待测信号是光强信号，不需要成像和层析。 如前一小节对检测对象模型的描述，高分子微球能够结合抗原或抗体，且在 分析中微球以一定速度依次通过检测区，l i f 检测系统要对通过检测区且能激发 出要求荧光信号的微球进行计数。要保证检测系统正确计数，首先通过检测区的 微球能被激发出足够强的荧光信号，若采用共焦型方案( 见图2 - - 3 ) 。一根据共焦 原理，共焦显微镜只接收样本焦面的发射( 散射) 信号，而滤除样本非焦面反射 2 ! 三苎_ 坐2 塑! 堑壅垦塑一 塑! ! 查羔墼! ：芏竺竺苎 ( 散射) 信号，实现轴向层析。通过改变样本中照明光束聚焦的位黄。获得样本 的一系列层面的光学切片二维图像，进而实现样本三维立体图像重建。本检测系 统要获取的荧光的强度信号，不需要进行成像，采用共焦型检测系统将使系统变 得相当复杂。 一 、噔雹体7篙射镜：轴向响 觥镜踱 图2 - - 3 反射式共焦显微镜的光路图f “。利用反射镜的轴向扫描演示光学层析原理。其轴向响 应越窄，则三维成像的轴向分辨率越高。 ( 2 ) 对微流控芯片控制要求苛刻，同时使检测系统复杂 其次微球通过检测微球的直径约为5 6 um ，且在“鞘流”传送下通过检测区。 根据共焦原理，高斯光束聚焦在焦面的光斑大小为 w 2 ( z ) 2 w 2 ( 2 = o ) 1 + 南1 2 】 式中z 为物体离开焦面的距离，w 是波长为 的激光束腰半径。例如对于5 3 2 n m 激发光，用4 9 m m 焦距的会聚物镜，在焦面所成的l e 2 幅度处的高斯光束腰直 径约为1 0 tm 。而微流控芯片通道宽度通常都在5 0 1 0 0 , u m 左右，微球的尺寸相 比通道宽度要小的多，若微球偏离通道中心，激发光斑不能会聚在微球上，就会 造成漏计数。如图2 4 所示。 同时共焦层析能力用轴向响应全宽半高( f w h m ) 时轴向的离焦量z 来表示， 2 2 薷二距l i f 实验方案设计浙门：火学删i ：学位论文 根据o c v i r k t 3 i 等人的实验，选用4 0 0 t t m 直径的针孑l ，可以获得最大的信噪比， 此时血= 1 8um ，当离焦量在此范围内时，信噪比近似线性变化。微球必须在 通过检测区时，在微流控深度方向必须处在一定范围内，否则会造成信噪比的恶 化。从上面的讨论不难看出虽然共焦型检测系统灵敏度高，但是在以计数为主的 微球检测系统中，使用共焦型不但使检测系统复杂化，而且对于微流控芯片的控 制性能也有很高的要求。所以本实验系统不采用共焦方案。 微 球 一 ( a ) 准确聚焦 激发光 一 ( b ) 微球偏离光 斑，淄计数 图2 4 采用共焦型检测时漏计数示意例 ( 俯视图) 2 3 实验系统总体方案 图2 - 5 非兆焦微球l i f 检测系统原理幽 第一二卓l i f 实验方案啦计 浙“人学硪f 学位沦文 检测系统的工作原理图如图2 5 两种波长的激光耦合入单模光纤内，激 发光通过光纤传输，出纤端贴近微流控芯片的检测区，出纤的激发光入射到检测 区。当带有荧光素的微球通过检测区时就会激发出两种峰值波长的荧光，两种荧 光由物镜进行收集，并在探测器前的针孔上成像。二色镜在此方案中作为分光元 件，透过5 7 5 n m 的荧光信号，反射6 7 0 h m 的荧光信号。透射的荧光在进入光电倍 增管之前，要先通过针孔滤除激发光、杂散光和噪声荧光信号，然后通过窄带滤 光片进一步滤除干扰光，最后进入光电倍增管。光电倍增管i l f ! | 应荧光信号，产生 光电流，送入低噪声前置放大器进行放大，最后变换成计算机能够处理的信号送 入计算机进行数据分析。a p d 的信号处理电路完成信号放大和计数功能，最后同 样送入计算机进行分析。 激发光入射部分采用单模光纤传送激发光，激发光通过耦合装罱耦合入光纤 中，光纤的出光一端固定在微流控芯片中。出纤的激发光直接入射到检测区。采用 单模光纤传送激发光有几个优点，一是可以简化光路设计，大大减小检测系统的 体积。二是单模光纤芯径只有9 um 左右，如果是光纤的出光端足够靠近检测区， 就可以免去激发光的聚焦环节。三是光纤传输激发光，可以使激发光和荧光收集 方向正交，理论上这是最优的配置，可以使荧光的采集效率最高。 荧光采集光路以二色镜作为分光元件是因为二色镜对波长具有选择性，同时 光强的损耗也非常小。这与共焦型显微镜中使用二色镜主要用来反射入射激发光 和阻挡反射激发光有很大的不同，而且在共焦型检测系统中还要使用带通滤光片 进一步减小噪声光。在本检测系统中，之所以只用滤光片滤除噪声光，是因为激 发光和荧光采集光路垂直，能进入到荧光采集光路的激发光比共焦型l i f 检测系 统中的大大减少，所以可以只用滤光片来滤除噪声光。针孔的位置和大小也是要 考虑的重要因素。 信号处理部分包括两个模块。一个是雪崩二极管( a p d ) 检测模块，a p d 的 灵敏度虽然低于光电倍增管，但是a p d 工作电压较低( 可以在5 0 v 以下) ，工作 电压低就易于其它元件集成而且a p d 的工作噪声小，同时，在本检测系统中，a p d 主要作计数之用，采用高灵敏度的a p d 可以胜任。另一个是光电倍增管( p m t ) 检测模块，p m t 的检测灵敏度极高，高灵敏度的p m t 可以进行光子计数，因此用 于荧光探测是合适的。使用p m t 要注意控制工作电压、温度，还要有良好的屏 珂! 一驻l i f 实验方案醴计 浙7 i 大学碗l 学他电史 蔽和低噪声的放大电路才能发挥p m t 的性能。p m t 是电子真空器件，对微弱光信 号的放大要通过一系列的高压倍增极进行电子的倍增，因此需要的的工作电压很 高( 可以高达1 5 0 0 v ) ，提高工作电压虽然可以提高响应度，但是也会增大暗电 流，对高压供电电路的设计必须考虑噪声增加的问题。温度的升高也会增加暗电 流，采用温度补偿( 根据温度变化控制供电电压) 是一个可行的办法。p m t 的信号 放大电路同样重要，不佳的前置电路会使信噪比大大降低。 在本论文的第三章中，将对该实验方案的各主要功能模块作详细的分析。 参考文献 【l 】方肇伦等。微流控分析芯片。科学出版社。2 0 0 3 年2 月第一版。 2 m 顾。共焦显微术的三维成像原理。新时代出版社。2 0 0 0 年1 月第一版。 3 】g r e g o ro c v i r k ，t h o m p s o nt a n g a n dd 。j e dh a r r i s o n a n a l y s t 1 9 9 8 ，1 2 3 ：1 4 2 9 第三章实验系统各单元 浙江人学颂l j 学位论文 第三章实验系统各单元 3 1 激发光引入单元 3 1 1 激发光的引入方式 如何引入激发光，是l i f 检测系统首先要考虑的问题。激发光引入单元的设 计主要考虑以下几点 ( 1 ) 激光器的要求。首先激光器要有要有稳定的功率输出，激光输出功率 直接影响l i f 检测灵敏度，输出功率越稳定，荧光输出就越稳定。其次激光器波 长选择也同样重要，使用6 3 5 n m 的激发光，虽然可用的荧光试剂少，但是在此波 段能够激发出荧光的物质也少，这样可以降低噪声荧光。另外，水的r a m a n 散射 谱带在2 7 0 2 n m 一3 2 2 5 n m 和6 0 6 0 6 n m 处。另外两个较弱的谱带在4 5 4 5 n m 和 6 0 9 7 n m 处。因此，可以通过选择激光器的激发波长或荧光试剂使荧光发射谱带 避开水的r a m a n 散射谱带【l 】。最后，为找出优化激发光功率，激光器的光功率 应该是可调节的。 ( 2 ) 有效入射到待检测荧光素的激发光能量。根据1 2 2 对l i f 机理的 讨论可知，根据( 1 1 1 ) 式入射到荧光素上激发光越强，则受激吸收越强，荧 光的发射速率就越快。即为获得足够的s n ，入射到荧光素上的激发光能量有一 个下限。随着激发光能量的增强，荧光信号也会增强，s n 随之增加。但是过强 的激发光会漂白( b l e a c h ) 荧光素，导致荧光饱和和荧光物质分解，同时非荧光 素发射的噪声荧光却会增加，此时s n 会减小。因此，对l i f 的激发光入射单元 存在一个使s n 最大的激发光功率( o p t i m i z e de x c i t a t i o np o w e r ) 。 ( 3 ) 优化入射光和荧光采集方向的角度。为使进入荧光采集单元的噪声尽 可能的小，除了要合理选择激光器的波长，选用输出功率稳定的激光器外，在非 共焦型检测系统中，还要优化入射激发光和荧光收集的角度。几种常见的入射光 和荧光采集的方向关系如图3 - 1 所示。从理论上说，检测区的荧光素被入射光激 发后，荧光可以在各个方向上观察到，但是方式( 1 ) ( 2 ) 入射光总有一部分透 射过检测区，会有一部分进入探测器，会降低探测灵敏度。采用方式(