（细胞生物学专业论文）两种纳米材料的生物学功能的研究.pdf

摘要 摘要 纳米生物技术将纳米科技和现代生物学相结合，研究纳米材料的特殊生物学 功能并为现代生物学和医学的发展提供全新的技术和观点，具有巨大的发展潜力 和诱人的应用前景。文章从纳米生物科学的领域出发，以纳米材料为研究对象， 探索其特殊的生物学效应及潜在应用价值。 文章第一部分研究了纳米尺度的稀土氧化物对h e l a 细胞的白噬的影响。细 胞自噬是一种降解细胞内物质的动态过程，在生命体发育、分化、组织重构及许 多疾病过程中发挥着重要作用。文中对纳米稀土氧化物提高细胞的自噬水平这一 现象进行了系统性的研究，运用多种层次的检测方法确证了这一现象的细节，并 对自噬通路的完整性进行了初步的探讨，为稀土的生物学应用提供了新的视角。 第二部分主要研究了纳米级的多肽作为载体在基因输运上的作用。我们合成 的一段新型双功能多肽对原代成骨细胞具有良好的转染效果和较高的生物安全 性，在骨组织工程方面具有潜在的应用价值。 关键词：纳米材料稀土氧化物细胞自噬多肽载体基因输运 a b s t r a c t n a n o b i o t e c h n o l o g yi n t e g r a t e sn a n o t e c h n o l o g yw i t hm o d e mb i o l o g y i tp r o v i d e s an e wa s p e c to nt h er e s e a r c ho fb i o f u n c t i o no fn a n o m a t e r i a l sa n di sb e n e f i c mt ot h e d e v e l o p m e n to fb i o m e d i c i n e n a n o b i o t e c h o l o g yh a s a t t r a c t e di n t e n s i v ea t t e n t i o ns i n c e i t sa p p e a r a n c ea n dp r e s e n t e dg r e a tp o t e n t i a l so fa p p l i c a t i o ni nv a r i o u sf i e l d s i nt h ef i r s tp a r tw ei n v e s t i g a t et h ee f f e c to fn a n o - s i z e dr a r ee a r t ho x i d e so nt h e a u t o p h a g yo fh e l ac e l l a u t o p h a g yi s ad y n a m i cp r o c e s sf o rb u l kd e g r a d a t i o no f i n t r a c e l l u l a rp r o t e i n sa n do r g a n e l l e s i tp l a y si m p o r t a n tp a r t si nt h ed e v e l o p m e n t ， d i f f e r e n t i a t i o n ，r e c o n s t i t u t i o no fo r g a n i s ma n dm a n yd i s e a s ep r o c e s s e s h e r ew e s h o w t h ed e t a i l so fa u t o p h a g yi n d u c e db yr a r ee a r t ho x i d en a n o c r y s t a l si nh e l ac e l l sa n d t o o kac o n c i s er e s e a r c ha b o u ta u t o p h a g i cf l u x i nt h es e c o n dp a r tw es h o wn a n o s i z e dp e p t i d ep r o d u c e sa ne f f e c to ng e n e t r a n s f e ra sv e c t o rs y s t e m t h i sa r t i f i c i a lp e p t i d ee f f i c i e n t l yd e l i v e r e dr e p o r t e rg e n e s i n t or a td r i m a r yo s t e o b l a s t i cc e l l sw i t hl o wc y t o t o x i c i t ya n db ep o t e n t i a l l yu t i l i z e di n c l i n i c a la p p l i c a t i o n si nt h ef i e l do fb o n et i s s u ee n g i n e e r i n g k e yw o r d s ：n a n o - m a t e r i a l s ，r a r e e a r t ho x i d e s ，a u t o p h a g y , p e p t i d ev e c t o r ，g e n e t r a n s f e r i i 中国科学技术大学学位论文原创性声明 本人声明所呈交的学位论文，是本人在导师指导下进行研究工作所取得的成 果。除已特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含任何他人已经发表或撰写 过的研究成果。与我一同工作的同志对本研究所做的贡献均已在论文中作了明确 的说明。 作者签名：叠丝： 签字日期：囱塑i 壶：参 中国科学技术大学学位论文授权使用声明 作为申请学位的条件之一，学位论文著作权拥有者授权中国科学技术大学拥 有学位论文的部分使用权，即：学校有权按有关规定向国家有关部门或机构送交 论文的复印件和电子版，允许论文被查阅和借阅，可以将学位论文编入有关数据 库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。本人 提交的电子文档的内容和纸质论文的内容相一致。 保密的学位论文在解密后也遵守此规定。 口公开口保密( 年) 作者签名：刍鱼!导师签名： 签字日期：签字日期： 瀑少2 第l 章绪论 第1 章绪论( 研究背景综述) 1 1 纳米材料的生物学效应研究概述 纳米科技是一门在2 0 世纪8 0 年代末逐渐发展起来的前沿、交叉性新兴科学 技术。纳米科学与信息科学和生命科学并称为2 1 世纪的三大支柱科学领域。当 前，随着纳米技术的产业化，各种形式的纳米材料已经被广泛应用于农业、化学、 电子学、机械加工学和生物医药学等诸多领域。 1 1 1纳米材料的定义 “纳米 ( 姗) 是一个长度单位，1n m = 1 0 呻m 。纳米材料一般是指尺寸至 少有一维在1 - - 1 0 0n m 问的粒子，主要包括原子团簇、纳米颗粒、纳米线、纳米 薄膜、纳米管和纳米固体材料。由于纳米尺度处在原子簇和宏观物体交界的过渡 区域，所以纳米材料具有很多普通宏观材料所不具备的新物理化学特性，包括： ( 1 ) 小尺寸效应：当固体颗粒的尺寸与德布罗意波长相当或更小时，这种 颗粒的周期性边界条件消失，在声、光、电磁、热力学等方面出现一些新的变化， 如熔点降低。 ( 2 ) 表面效应：纳米微粒的表面原子与总原子之比随着纳米微粒尺寸的减 小而大幅度增加，粒子表面结合能随之增加，从而引起纳米微粒性质变化的现象。 ( 3 ) 量子尺寸效应：纳米微粒内部存在不连续的高低能级分子轨道，且轨 道间的间距随纳米微粒的粒径变小而增大，会呈现出系列与宏观物质截然不同 的反常特性，如样品颜色的改变等。 ( 4 ) 宏观量子隧道效应：电子具有粒子性和波动性，具有贯穿势垒的能力， 即隧道效应。而在纳米尺度，宏观物理量也能显示出隧道效应，既宏观量子隧道 效应。 纳米材料的这些基本特性可导致其异常的吸附能力、化学反应能力、分散和 团聚能力等，使纳米材料具有广泛、潜在的应用前景，成为2 l 世纪新材料研究 的热点。 1 1 2 纳米材料在生物医学领域的应用 在生物医学领域，纳米材料的研究和应用正在飞速发展。其主要研究思路可 概括为探索纳米材料或纳米装置对人体细胞、健康、环境等的影响，即从分子、 细胞、器官及整体各个水平，以及群体与环境各个层次研究纳米材料的理化特性 第l 章绪论 和生物效应。目前，纳米生物医学涵盖的领域非常广泛，主要可分为以下几个方 面。 1 1 2 1 成像和诊断 在生物医学成像领域，纳米材料由于具有高亮度、光稳定性、宽吸收光谱等 优点，可与蛋白质、核酸等生物大分子连接，制成生物探针，用于生物学现象和 疾病的检测。譬如碳纳米管( c n t ) 具有独特的近红外荧光发射性质，使其在活 体内的分布可以被非破坏性地成像观测，因此被广泛的用于体内的成像诊断。x u 等人( x u ，h ue ta 1 2 0 0 8 ) 用c y 5 标记的羊抗兔i g g ( a n t i i g g c y 5 ) 固定c n t ， 在荧光显微镜下观察到水溶性c n t 的荧光显影。a lf a r a j 等人( a 1f a r a j ， c i e s l a re ta 1 2 0 0 9 ) 利用核磁共振成像( m r i ) 观察到未加工的以及超纯度的 单壁碳纳米管在大鼠体内的生物扰动。h a r t m a n 等人( h a r t m a na n dw ils o n2 0 0 7 ) 总结了碳纳米结构，包括碳纳米管和富勒烯( c 6 0 ) 等都是一种高性能的磁共振 显影剂，可用于早期肿瘤诊断。 金纳米棒或纳米环具有独特的可调的表面等离子共振特性，并且在近红外区 有散射光谱，使得金纳米探针成为生物医学影像学研究热点。w e i 等人( w e i ，l i a o e ta 1 2 0 0 8 ) 通过体内实验，发现了生物耦合的金纳米环可实现多重靶向性的光 声显影。l i 等人( l i ，d a ye ta 1 2 0 0 8 ) 的研究表明运用生物功能性的金纳米棒 可以实现对肿瘤细胞的双光子显影和光热治疗。t o n g 等人( t o n g ，w e ie ta 1 2 0 0 9 ) 从光学特性、表面接合、光热效应等几方面总结了金纳米棒可以作为生物 显影的造影剂。 量子点( q u a n t u md o t s ，q d s ) 作为一种新型纳米荧光材料，与生物分子相 结合，在多种类型的生物成像研究中较传统的有机荧光素和荧光蛋白而言具有更 加优越的特性，伎研究者能够以一种全新的方法对单个细胞、组织、甚至活动物 的基因、蛋白质和药物靶点进行研究，为疾病机制的阐明和临床诊疗提供有力帮 助。h o s h i n o 阐述了运用生物偶联的荧光量子点可以实现免疫细胞的显影以及对 细胞器的标记( h o s h i n o ，m a n a b ee ta 1 2 0 0 7 ) 。k i m 等人( k i m ，j i a n ge ta 1 2 0 0 8 ) 也对可降解的量子点纳米复合物对活细胞标记及胞质内靶标的显影进行了总结。 p a n 等人( p a na n df e n g2 0 0 9 ) 研究了叶酸修饰的、量子点偶联的纳米复合物对 肿瘤细胞具有良好的靶向和显影作用。 1 1 2 2 药物输运和癌症治疗 在药物输运和癌症治疗领域，纳米载体可以将药物选择性的传输并释放于病 变部位，实现特定位点的靶向性给药；加之纳米载体具有药物缓释、控释等方面 的特点，大大提高了药物的生物利用率，减小了对正常组织的毒副作用，降低了 2 第1 章绪论 治疗成本。 譬如磁性纳米粒子就是一种被广泛应用的药物载体，它具有超顺磁特性和高 的磁饱和度，易受体外磁场控制，具有良好的靶向性( m c c a r t h ya n dw e i s s l e d e r 2 0 0 8 ：p e n g ，q i a ne ta 1 2 0 0 8 ：p o l y a ka n df r i e d m a n2 0 0 9 ) 。w e i 等人( w e i ， h ee ta 1 2 0 0 8 ) 对磁性氧化铁纳米颗粒的生物功能进行了综述，指出氧化铁纳 米颗粒被广泛的应用于药物的靶向运输和疾病的诊断治疗。t s e n g 等人( t s e n g ， l e ee ta 1 2 0 0 7 ) 通过高频磁场使含有超顺磁性纳米颗粒的放射性液体聚集到肿 瘤病灶部位，使局部温度升高，提供了一个高热治疗肿瘤的思路。 树枝型大分子( d e n d r i m e r s ) 是一种新型高分子材料，也似一种典型的纳米 粒子。它具有高度的几何对称性、大量的表面官能团、分子内空腔等特点，使其 极易进入细胞，穿越多种生物屏障并装载某些特定的药物分子。b a i 等人( b a i ， t h o m a se ta 1 2 0 0 7 ) 用阳性d e n d r i m e r s 负载依诺肝素( 一种抗凝血药) ，有效 的抑制了肺部深部静脉血栓的形成。c h e n g 等人( c h e n g ，w a n ge ta 1 2 0 0 8 ) 研 究了d e n d r i m e r s 可以作为多种药物的载体，如非类固醇类抗炎药、抗菌抗病毒 药和抗癌药等。p a l e o s 等人( p a l e o s ，t s i o u r v a se ta 1 2 0 0 8 ) 从d e n d r i m e r s 的设计、合成、控制及诱导释放等几个方面阐述了d e n d r i m e r s 作为载药系统的 整体战略。 1 1 2 3 基因输运和治疗 在基因治疗领域，正常基因通过载体分子导入人体靶细胞以纠正基因缺陷或 发挥治疗作用。因此载体分子的高效性和生物安全性对于基因治疗的成功具有非 常重要的意义。目前，常规的病毒载体虽然具有很高的转染效率，但是可能会给 宿主带来免疫反应、炎症反应等负面影响。而新型的纳米生物材料，如脂质体、 聚乳酸( p l a ) 、聚乙二醇( p e g ) 、壳聚糖等，由于具有良好的生物安全性，可方 便有效地实现基因靶向输运及高效表达，成为基因输运载体的良好介质。k i m 等 人( k i m ，8 a ie ta 1 2 0 0 7 ) 的研究发现羟基化的d e n d r i m e r s 可以作为基因输运 的载体。m c b a i n 等( m c b a i n ，y i ue ta 1 2 0 0 8 ) 总结了磁性纳米颗粒在体内体外 实验中用于基因传输的研究进展。f u 等人( f u ，c h e n ge ta 1 2 0 0 9 ) 对依靠生物 可降解的大分子复合物建立可控释放的基因输运系统进行了阐述。基于纳米生物 材料的基因治疗载体显著提高了细胞的摄取和目的基因的持续表达，这些都是其 他载体所不具备的( p r a b h aa n dl a b h a s e t w a r2 0 0 4 ) 。 1 1 3 纳米材料的生物安全性评估 纳米科技与生物医学的接合和相互渗透，为生物医学领域提高了重大的创新 第1 章绪论 机遇和诱人的市场前景，但是纳米材料的众多未知因素也给其临床应用带来了巨 大的挑战。纳米颗粒在细胞、亚细胞和蛋白质水平对生命体行为产生影响，它们 在一定条件下有可能对人体免疫反应造成的负面影响正在引起人们越来越多的 关注。世界许多国家和科学组织都把对纳米物质的生物安全性评估作为研究的重 要议题。 1 1 3 1 纳米粒子的负面生物效应 一般认为纳米粒子进出细胞的方式有3 种：存在于液体中被细胞所胞饮； 通过受体的胞吞作用，通常是有机基团的纳米粒子：被吞噬进入细胞内部。 在细胞的培养液中，纳米粒子可能以多种形式存在，如单个分散的粒子、几十纳 米的粒子团聚体以及较大的几百纳米的粒子团聚体。因为纳米粒子具有较高的表 面活性，所以粒子本身很容易团聚，对于较大的粒子团聚体，可以认为是通过吞 噬作用进入细胞。进入细胞后，纳米粒子一方面可以直接与大量的生物代谢酶作 用，还可以通过二次氧化或还原的方式产生大量有害自由基团，破坏细胞内有序 结构和正常的代谢功能，如果这些自由基与遗传物质如d n a 、r n a 等结合或反应 则会引起基因突变或遗传信息的错误解读，最终引发细胞的坏死或程序性死亡， 使细胞膜结构中的不饱和脂肪酸氧化以及使蛋白质中巯基氧化并发生蛋白质的 交联、变形，酶的失活等，表现出纳米粒子的负面效应( m c a u l i f f ea n dp e r r y2 0 0 7 ： p r i d g e n ，l a n g e re ta 1 2 0 0 7 ：h a r t m a n ，w i i s o ne ta 1 2 0 0 8 ：j a i n2 0 0 8 ：k i m ， p i a oe ta 1 2 0 0 9 ) 。 1 1 3 2 碳纳米管的生物安全性问题 碳纳米管，包括富勒烯粒子的生物安全性首先引起学术界和产业界的关注。 s h v e d o v a 等人( s h v e d o v a ，c a s t r a n o v ae ta 1 2 0 0 3 ) 用单壁碳纳米管( s w c n t ) 处理人类上皮角质细胞1 8 h 后，可以观察到细胞内自由基形成、过氧化物的聚 积、抗氧化物质的枯竭以及细胞活力的丧失。这些结果提示，未经纯化的碳纳米 管可能会因为加速氧化作用而对皮肤产生一定的毒性。此外c h e n g 等( c h e n g ， c h a ne ta 1 2 0 0 9 ) 在斑马鱼模型中研究了多壁碳纳米管( m w c n t ) 的生物扰动和 长期效应，发现经处理过的斑马鱼胚胎在早期发育时会引发免疫反应，提示纯化 过的多壁碳管在体内也许存在长期的毒性作用。z h u 等人( z h ua n dl i2 0 0 8 ) 探 讨了影响c n t 毒性的原因，包括c n t 的种类、长度、化学修饰、所含的不纯杂质 以及检测毒性的方法等。但是许多研究者都表明，碳纳米管的毒性研究缺少可比 性，甚至有许多自相矛盾的地方，只有通过加强对c n t 毒性的理化机制的研究， 以及实现检测方法和评估标准的统一，才有可能做出对碳纳米管毒性的最终结 论。 4 第1 章绪论 1 1 3 3 树枝型大分子的生物安全性问题 近几年来，树枝型大分子所可能引起的生物安全性问题开始引起研究人员的 重视和更深层次的思考，相关方面的研究报道在迅速增。例如，j e v p r a s e s p h a n t 等( j e v p r a s e s p h a n t ，p e n n ye ta 1 2 0 0 3 ) 发现阳离子d e n d r i m e r s 对c a c o 一2 细 胞的毒性明显比阴离子d e n d r i m e r s 要大，说明树枝型大分子表面高密度的正电 荷可能其是产生细胞毒性的主要的因素之一。s a b i n ef u c h s ( f u c h s ，k a p pe ta 1 2 0 0 4 ) 等通过对人m c f - 7 乳腺癌细胞系的体外细胞毒性试验得出结论， d e n d r i m e r s 本身的结构对细胞毒性的产生没有明显作用，表面基团是毒性产生 的关键因素。已经有很多实验证明表面官能团能够显著影响d e n d r i m e r s 的细胞 毒性，利用表面化学修饰，可以明显降低树枝型大分子的细胞毒性，提高其生物 相容性，同时保持其本身具备的高转染效率。当前用于树枝型大分子表面修饰的 物质主要包括p e g 、环糊精、氨基酸等。 纳米量子点和纳米铁粉等材料也都有相应的关于在生物体内毒性的报告。 1 2 稀土元素的研究概述 1 2 1稀土元素的定义 稀土元素是镧系元素系稀土类元素群的总称，位于元素周期表中i i i b 族，包 含原子序数从5 7 至7 1 的镧l a 、铈c e 、镨p r 、钕n d 、钷p m 、钐s m 、铕e u 、钆 g d 、铽t b 、镝d y 、钬h o 、铒e r 、铥t m 、镱y b 、镥l u ，以及原子序数为2 l 和 3 9 的钪s c 、钇y ，共1 7 个元素。其中，原子序数较小的钪、钇和镧、铈、镨、 钕、钷、钐、铕被称为“轻稀土元素”；原子序数比较大的钆、铽、镝、钬、铒、 铥、镱、镥被称为“重稀土元素 。稀土元素是典型的金属元素，金属活泼性仅 次于碱金属和碱土金属元素，而比其他金属元素活泼。稀土元素能形成化学稳定 的氧化物、卤化物、硫化物等。 “稀土 一词是十八世纪沿用下来的名称，因为当时用于提取这类元素的矿 物比较稀少，而且获得的氧化物难以熔化，也难以溶于水，也很难分离，其外观 酷似“土壤 ，而称之为稀土。今天已经知道稀土元素在自然界中广泛存在。我 国稀土资源丰富，占世界储量的8 0 左右，矿藏的开发和利用与日俱增。 1 2 2 稀土元素在工农业领域的应用 目前稀土元素的应用蓬勃发展，己扩展到科学技术的各个方面，尤其现代一 些新型功能性材料的研制和应用，稀土元素已成为不可缺少的原料。 第l 章绪论 在农业领域，目前发展有稀土农学、稀土土壤学、稀土植物生理学、稀土卫 生毒理学和稀土微量分析学等学科。稀土作为植物的生长、生理调节剂，对农作 物具有增产、改善品质和抗逆性三大特征；同时稀土属低毒物质，对人畜无害， 对环境无污染；合理使用稀土，可使农作物增强抗旱、抗涝和抗倒伏能力。 在有色合金方面应用，稀土对以有色金属为基础的各种合金都有良好的作 用，可以改善合金的物理和机械性能。应用最多的是铝、镁、铜三个系列。 在冶金工业领域，稀土的应用量很大，约占稀土总用量的1 3 。稀土元素容 易与氧和硫生成高熔点且在高温下塑性很小的氧化物、硫化物以及硫氧化合物 等，钢水中加入稀土，可起脱硫脱氧改变夹杂物形态作用，改善钢的常、低温韧 性、断裂性、减少某些钢的热脆性并能改善加热工性和焊接件的牢固性。 在石油化工领域，稀土常用作石油裂化工业中的分子筛裂化催化剂，其特点 是活性高、选择性好、汽油的生产率高。 在玻璃工业领域，稀土在玻璃工业中有三个应用：玻璃着色、玻璃脱色和制 备特种性能的玻璃。用于玻璃着色的稀土氧化物有钕( 粉红色并带有紫色光泽) 、 镨玻璃为绿色( 制造滤光片) 等；二氧化铈可将玻璃中呈黄绿色的二价铁氧化为三 价而脱色，避免了过去使用砷氧化物的毒性，还可以加入氧化钕进行物理脱色； 稀土特种玻璃如铈玻璃( 防辐射玻璃) 、镧玻璃( 光学玻璃) 。 在陶瓷工业领域，稀土可以加入陶瓷和瓷釉之中，减少釉和破裂并使其具有 光泽。稀土更主要用做陶瓷的颜料，由于稀土元素有未充满的4 f 电子，可以吸 收或发射从紫外、可见到红外光区不同波长的光，发射每种光区的范围小，导致 陶瓷的颜色更柔和、纯正，色调新颖，光洁度好。如黄色、紫罗兰色、绿色、桃 红色、橙色、棕色、黑色等。稀土氧化物可以制造耐高温透明陶瓷( 应用于激光 等领域) 、耐高温坩埚( 冶金) 。 1 2 3 稀土在生物医学领域的研究 除了在以上这些传统工业领域的应用，稀土元素在生物医学领域的应用也成 为近些年的研究热点。国内外越来越多的研究成果展示了稀土的生物学效应非常 广泛，具有许多独特的医学价值，是一种非常有潜力的治疗组分。 1 2 3 1 稀土的抗肿瘤作用 稀土的抗肿瘤作用早就引起人们的关注。最初是用其放射性同位素诊断和治 疗癌症，因为稀土对肿瘤组织具有较高的亲和性。近年来，稀土在抗肿瘤的研究 工作有了新的重大突破和进展，主要表现在从分子水平、细胞及亚细胞水平等方 面进行的系统研究都证明稀土元素的抗肿瘤作用。 6 第1 章绪论 s h i 等人( s h ia n dh u a n g2 0 0 5 ) 通过蛋白质组学研究发现，经镧系元素处理 过的b g c - 8 2 3 人胃癌细胞中蛋白质的表达异常，所涉及的蛋白包括调节细胞形 态、基因转录和细胞周期蛋白。结果显示镧系元素改变了癌细胞的蛋白表达进而 影响癌细胞的活性。s h e n 等人( s h e n ，l ie ta 1 2 0 0 8 ) 发现稀土元素l a 在h e p g 2 细胞中结合b i p g r p 7 8 并诱导了非折叠蛋白通路的响应。肖自等( 肖自，1 9 9 7 ) 对轻稀土抑瘤作用机理的研究表明。稀土元素可使癌细胞微管结构发生转变，其 生长能力明显下降，使癌细胞内的钙调素水平下降，抑癌基因p 5 2 、p 2 1 、p 1 6 的水平上升，表明稀土元素的抑癌作用可能是通过使癌细胞恶性程度下降而实现 的。 希夫碱( s c h i f f ) 双键的有机化合物具有一定的抗肿瘤活性，当它与金属离 子形成配合物后抗肿瘤效果明显增强。倪瑾等( 倪瑾，2 0 0 0 ) 利用脉冲电场凝胶 电泳法，观察了s c h i f f 碱稀土配合物对肿瘤细胞d n a 双链断裂及修复的影响。 发现该化合物能够增加辐射导致d n a 双链断裂，并抑制其修复。w a n g 等人( w a n g ， y a n ge ta 1 2 0 0 8 ) 将镧系元素( s m e u ，l a ) 和希夫碱偶联制成配合物，在体 外h e p g 2 细胞中研究发现该复合物有显著的细胞毒作用，抑制了癌细胞的增值。 这些成果表明s c h i f f 碱稀土配合物能提高肿瘤细胞对辐射的敏感性及增强稀 土对肿瘤细胞的毒性，为开发肿瘤抑制剂提供了新的研究方向。 1 2 3 2 稀土的抗菌抗病毒作用 稀土是有效的杀菌剂，市场上就有出售商品名为c e r i f o r m 的硫酸铈钾抗菌 剂。稀土化合物对微生物的生长存在h o r m e s i s 效应，即在低剂量时对生物机体 产生有益反应而高剂量时产生有害反应。如在固体培养条件下l a 2 0 。对土传植物 病原真菌小麦纹枯病菌和水稻纹枯病菌的生长状况就存在h o r m e s i s 效应( 刘庆 都，2 0 0 0 ) 。 般认为，当稀土离子浓度较低时，它们可能与肽聚糖中的c o o h 、c = o 或磷 壁酸中的p = o 、p - o 一作用，形成稀土肽聚糖或稀土磷壁酸配合物，使肽聚糖或磷 壁酸的构象发生部分改变，造成细胞壁松弛，产生一定的空隙，营养物质可通过 细胞壁进入细胞内，使细胞代谢加快，同时，少量的稀土离子通过细胞壁进入细 胞内，使部分参与代谢的酶激活，刺激细菌生长；随着浓度增加，稀土离子与肽 聚糖中的c o o h 、c = o 或磷壁酸中的p = o 、p - o 一作用完全后，使后者的构象发生完 全改变，形成通道，造成细胞内含物的外渗，同时，大量的稀土离子进入细胞， 与细胞内的d n a 、酶、蛋白质等生物分子相互作用，阻碍正常的生理代谢，从而 抑制细胞生长直至完全停止。 在实际应用中，单独使用稀土化合物往往无法满足需要，近年来在临床医药 及新材料开发等领域，研究人员将不同的稀土化合物与其他具有抗菌活性的物质 7 第l 章绪论 进行配位，合成了一系列新型的稀土配合物，它们相对于配体或稀土化合物表现 出更好的抗菌活性，为改善药物的性能，提高药效提供了新的途径。h e 等人( h e ， m ae ta 1 2 0 0 7 ) 用稀土与菲咯啉、苯丁唑啉合成出一种新型三元络合物，在研 究中发现其具有广谱抗菌效果，包括大肠杆菌、金黄色葡萄球菌和白色念珠菌等。 侯安新等人( 侯安新，2 0 0 5 ) 采用微量量热法研究了e r ( n o ) 。及其阳离子型卟啉 配合物对金黄色葡萄球菌生长作用的生物热动力学特征，表明配合物的抗菌活性 优于e r ( n 0 ) 。，说明合成配合物后抗菌活性得到了提高。 1 2 3 3 稀土的抗氧化作用 在体内，自由基的产生和清除存在着动态平衡，过量自由基可对机体生物 大分子等物质引起氧化损伤，对健康带来不良影响，甚至可导致癌症的发生。稀 土的抗氧化作用是通过其与自由基的相互作用以及增强抗氧化酶的活性来实现 的。 活性氧( r o s ) 是造成脂质过氧化损伤和d n a 损伤的初始物，申治国等人 ( 申治国，2 0 0 1 ) 在培养2 4 h 的s d 大鼠肝细胞和v 7 9 细胞培养液中加入不同浓 度的c e c i 。，通过显微荧光术检测细胞内的r o s ，结果显示：铈在低浓度下可使 正常肝细胞和v 7 9 细胞内r o s 浓度显著降低，高浓度组可使正常肝细胞和v 7 9 细胞内r o s 浓度显著增加，这就为低浓度稀土能清除机体内自由基提供了直接 的依据。 稀土配合物可以改善稀土的抗氧化作用，x i 等人( x i ，x ue ta 1 2 0 0 9 ) 将 三种稀土元素( n d ，s m ，e u ) 与配基偶联，发现该复合物可以牢固的结合d n a ， 并且在体外实验中通过分光光度计检测发现该复合物比标准抗氧化剂( 如维生素 c 和甘露醇) 有着更高的抗氧化活性，显示出稀土配合物作为新型抗氧化剂的前 景。 稀土元素的生物学效应谱广泛，剂量一反应关系复杂。在细胞或者整体生物 中，自由基的生成及由此引起的氧化损伤，以及稀土对氧化损伤的抑制效应是 多因素参与的复杂生物过程。稀土元素对抗氧化损伤的影响不仅与稀土的种类有 关，还与稀土的浓度、作用时间有关。研究表明，低剂量稀土可抑制过氧化，高 剂量可促进过氧化，但是当稀土作用到一定的时间时，随着时间的延长其抗氧 化作用逆转为促进氧化，这一规律性目前已比较明确。但是稀土抗氧化的机制还 有待进步探讨。 1 2 3 4 稀土的毒理学 稀土作为一种潜在的生物医学材料，其毒理和生物安全性需要被认真的探 讨。稀土的生物毒性虽比c u 、c d 等重金属低，但它具有累积效应，长期毒害不 8 第1 章绪论 容小觑。 质子激发x 荧光分析测定l a 、g d 及c e 的亚细胞分布结果显示，稀土可以进 入细胞，细胞核内含量最多，其次是细胞膜，胞浆含量较少( 风志慧，2 0 0 1 ) 。 稀土进入细胞首先通过细胞膜，故细胞膜也就成为稀土对细胞发生作用的原初部 位。稀土与模拟细胞膜的研究已有许多报道，如稀土与二棕榈酰磷酯酰胆碱( d p p c ) 等磷酯脂质体的作用位点、作用后构象的变化及相变温度的变化，稀土可增加 d p p c 的有序性，降低其流动性( 倪嘉缵，1 9 9 5 ) 。核磁共振法研究表明，l a 浓度 较高时损伤红细胞膜的完整性，并使双层脂膜发生膜脂相变，从而影响膜上通道 蛋白活性，抑制膜上n a + k + - a t p a s e 活性( 任吉民，1 9 9 5 ) 。 线粒体是真核细胞进行氧化磷酸化产能的部位，稀土对线粒体有很大亲和 力。鼠肝中的线粒体可吸收稀土，引起线粒体肿胀、空泡化、嵴减少或消失，当 稀土浓度增加时，对线粒体脂质过氧化及膜蛋白氧化有明显促进作用。稀土作为 c a 输运的竞争抑制剂进入线粒体，使线粒体膜形态结构改变，引起氧化链紊乱， 如从鼠肝中得到的线粒体由于受高浓度l a 作用，其呼吸链的毗啶核苷酸、黄蛋 白类和所有细胞色素的吸收光谱都发生了不可逆变化( 卢然，2 0 0 2 ) 。稀土引起 线粒体肿胀，使线粒体膜流动性增加及电位下降，膜孔开放释放细胞色素c ，产 生高浓度活性氧，最终导致细胞凋亡( l i u ，y u a ne ta 1 2 0 0 3 ) 。 稀土对d n a 也有损伤作用，一定剂量的稀土可改变d n a 分子结构，对核苷酸 中的磷酸二酯键具有水解断裂作用，导致d n a 分子断裂、损伤，形成单细胞凝胶 电泳时的彗星图像和有丝分裂时残留在细胞核外的微核( 王洋，2 0 0 4 ) 。 细胞与稀土作用时胞内信使物质发生变化，包括游离c a 2 + 、环腺苷酸( c a m p ) 、 环脲苷酸( c g m p ) 、三磷酸肌醇( i p 3 ) 和二酰基甘油( d a g ) 等，也可能是稀土产生毒 害效应的一条途径。譬如稀土离子比钙离子多一个正电荷，与含氧配体结合能力 强，使得稀土可置换出许多酶中的c a 2 + ，从而参与各种酶促反应并影响酶活性( 周 晓波，1 9 9 9 ) 。 细胞是生物体结构和功能的基本单位，稀土进入机体后的最初靶部位是细 胞，阐明稀土对细胞的正负双方面的生物学效应对于稀土未来真正应用于医学或 药学领域是必不可少的。 1 3 细胞自噬的研究概述 细胞的新陈代谢对于维持细胞的内稳态具有非常重要的意义。目前降解细胞 内物质的主要途径有两条：一是泛素一蛋白酶体途径，细胞内半衰期短的蛋白质、 错误折叠或损伤的蛋白质经泛素标记后被输送至蛋白酶体被降解；二是自噬途 9 第1 章绪论 径，细胞内长期存在的蛋白，生物膜以及线粒体、核糖体、内质网和过氧化物酶 体等细胞器依赖于细胞自噬被送至溶酶体内降解。自噬途径在生命体的发育过程 和某些极端环境下表现的尤为重要( k l i o n s k y2 0 0 7 ；m i z u s h i m a2 0 0 7 ) 。 131 自噬的分类 自噬( a u t o p h a g y ) 来源于希腊语，它是真核细胞中普遍存在的一种依赖溶 酶体的物质降解和再循环过程，整个过程受到严格调控。根据底物进入溶酶体途 径的不同可以将哺乳动物细胞中存在的自噬现象分为三类：巨自噬 ( m a c r o a u t o p h a g y ) 微自噬( m i c r o a u t o p h a g y ) 和分子伴侣介导的自噬 ( c h a p e r o n e m e d i a t e da u t o p h a g y ) 。 圈11 不同类型的自噬( 本圈转载自参考文献m i z u s h i m a l e v i n ee ta l2 0 0 砷) 巨自噬：即我们通常说的自噬，细胞质中的材料( 细胞器和或一部分细胞 质) 被包裹进一种特殊的膜结构( p h a g o g h o r e ) 中，p h a g o p h o r e 逐渐融合形成一 个包含待降解物质的闭台双层膜结构的空泡，被称为自噬体( a u t o p h a g o s o m e ) 。 自噬体随后与内涵体( e n d o s o m e ) 或溶酶体( 1 y s o s o m e ) 融合，形成自噬溶酶体 ( a u t o l y s o s o m e ) 。自噬体中的待降解物质以及内层膜结构被溶酶体中的酸性水 解酶降解并释放出去，用于细胞新一轮的物质合成和能量供应。 微自噬：微自噬中也发生相同的包裹过程，但包裹底物的膜结构是自身发生 内陷的溶酶体膜。在该过程中，溶酶体膜自身发生变形，将胞质底物内吞并很快 将其降解。 分子伴侣介导的自噬：在这种自噬中，含有靶序列的底物可被分子伴侣 ( h s c 7 0 ) 识别，所形成的伴侣蛋白一底物复合物可以特异性的与溶酶体膜上受体 第1 章绪论 ( l a m p - 2 a ) 结合，接着再由腔内的二级分子伴侣对底物进行转运，从而实现向 溶酶体内的运输和降解。分子伴侣介导的自噬具有高度的选择性并且只发生在哺 乳动物细胞中。 巨自噬是最常见、研究得也最为透彻的一种自噬类型。我们这里所说的自噬 即指巨自噬。 1 3 2 自噬的发生和调控 事实上所有的细胞都会发生基础水平的自噬来维持细胞自身代谢的平衡，而 在饥饿，生长因子或能量缺乏时，细胞需要自身产生大量营养和能量，这是自噬 水平就会上调。当细胞在发育分化、氧化压力、病毒感染、蛋白聚集等情况下需 要去除自身多余或损伤的细胞器和蛋白时，自噬水平也会上调。因此自噬在细胞 内是受严格调控的。 1 3 2 1 自噬的发生 从2 0 世纪9 0 年代开始以酵母为模式生物来研究自噬相关基因，到目前为止 已发现三十多个，其中近一半在果蝇、哺乳动物等其他物种中也十分保守。2 0 0 3 年，k l i o n s k y 将这些基因统一命名为a t g ，其编码的蛋白为a t g ( k l i o n s k y ，c r e g g e ta 1 2 0 0 3 ) o 在哺乳动物细胞自噬的自噬体形成过程中，主要有两条泛素样蛋白参与加工 修饰的过称，分别是调节自噬蛋白a t g l 2 - a t 9 5 结合系统和l c 3 脂化系统。第一 个泛素样蛋自结合系统中，a t g l 2 先后在a t 9 7 和a t g l o 的催化下和a t 9 5 共价结 合形成复合物，然后再与卷曲的h t g l 6 蛋白结合成同源四聚体的大蛋白复合物。 在这个系统中，a t 9 7 和a t g l o 分别相当于泛素一蛋白酶体途径中的泛素样激酶e 1 和e 2 。l c 3 脂化系统依赖于a t 9 4 和a t 9 3 的活性。a t 9 4 是一个半胱氨酸蛋白酶， 是处理和提呈l c 3 给磷脂酰乙醇胺锚定所必需的。l c 3 - 1 被a t 9 4 剪切后在a t 9 7 和a t 9 3 作用下与磷脂酰肌醇结合。a t g l 2 - a t 9 5 a t g l 6 复合物定位于自噬前体膜 形成和延伸阶段的外表面，在自噬体完全形成前与外膜分离。而l c 3 - 磷脂酰乙 醇胺一直存在于自噬体形成各阶段。a t g l 2 - a t 9 5 结合系统和l c 3 脂化系统并不 是相互独立的，而是紧密联系的。 第1 章绪论 图1 2 自噬发生的分子机制( 本图转载自参考文献犯u s t i a k , p o l l a c ke ta l 2 0 0 8 ) ) 13 22 其他分子的调控 ( 1 ) 正调控： 1 1 1 型p 1 3 k ：p 1 3 k 是催化膜磷酸肌醇肌耱集团3 端磷酸化的酶家族，分为 i 型、i i 型和1 1 1 型。i i i 型p 1 3 k 和8 e c l i n l 在反区高尔基体网结构( t r a n s g o l g i n e t w o r k t g n ) 形成复合物 参与a u t o p h a g o s o m e 的形成( k i h a r a ，k a b e y ae ta 1 2 0 0 1 ) 。p 1 3 k 的抑制剂( 3 - m a ，w o r t m a n i n ) 可干扰或阻断自噬体的形成。 p 5 3 ：p 5 3 可以通过转录调控一种叫d r m ( d a m a g e r e g u l a t e da u t o p h a g y m o d u l a t o r ) 的溶酶体定位的蛋白正调控a u t o p h a g y 。( c r i g h t o n ，w i l k i n s o ne t a 1 2 0 0 6 ) 1 ) h p k 、d r p l 和t r a i l ：o h p k 和d r p 一1 是两个调控细胞凋亡的重要蛋白，依 靠它们自身的激酶活性促进细胞死亡。蛋白t r a i l 也能在表皮细胞中撖活 a u t o p h a g y 。( i n b a l ，b i a l i ke ta l2 0 0 2 ) ( 2 ) 负调控 m t o r ( m a m a l i a nt a r g e to fr a p a m y c i n ) ：它是雷帕霉素r a p a m y c i n 在哺乳 动物细胞内作用的蛋白激酶，在细胞生长调控中起着中心作用。m t o r 激酶能感 受细胞内氨基酸水平和a t p 水平，当营养充足时，m t o r 过磷酸化a t g l 3 ，使其与 a t g l 的结合自力下降；当营养缺乏或用雷帕霉素抑制m t o r 活性时，a t g l 3 迅速 去磷酸化，结合a t g l ，促进自噬。( f e n g z h a n ge ta 1 2 0 0 6 ) i 型p 1 3 k 和a k t ：i 型p 1 3 k 产生p 1 ( 3 ，4 ) p 2 和p i ( 3 ，4 ，5 ) p 3 ，它们能结台 a k t 的白细胞c 激酶底物同源结构域和它的激活蛋白p d k 一1 。当k k t 信号通路被 激活后，自噬将被抑制。相反的，a k t 的一种显性失瓣突变将导致高水平的自噬。 ( s h i n t a n ia n dk i o n s k y2 0 0 4 ) b c l 一2 ：一种著名的抗凋亡、促生存蛋白，还能抑制自噬。b c l 一2 结合到自 噬的正调控蛋白b e c l i n l 上后破坏其和i i i 型p 1 3 k 的复合物，从而负调控自噬。 2 巴 第1 章绪论 ( p a t t i n g r e ，t a s s ae ta 1 2 0 0 5 ) r a s ：r a s 在细胞生长和调控中起着重要的作用，它的活化突变常常导致细 胞的过度增值。r a s 可通过p 1 3 k 通路负调控自噬。( f u r u t a ，h i d a k ae ta 1 2 0 0 4 ) 1 3 。3自噬的检测 2 0 0 8 年在a u t o p h a g y 杂志上刊登了一篇由自噬领域的2 1 4 位专家共同撰写 的论文“g u i d e l i n e sf o rt h eu s ea n di n t e r p r e t a t i o no fa s s a yf o rm o n i t o r i n g a u t o p h a g yi nh i g h e re u k a r y o t e s ”，详细阐述了在高等真核生物中检测自噬的 一系列科学化标准化方法( k li o n s k y ，a b e l i o v i c he ta l 。2 0 0 8 ) 。 1 3 3 1 静态检测( s t e a d ys t a t e ) 透射电子显微镜：透射电子显微镜下超微结构的形态学检测是自噬检测的标 准。在透射电子显微镜下可见损伤的细胞器如线粒体的肿胀变性，其周围出现空 泡状双层膜样结构、双层膜环绕成自噬体的结构、与溶酶体融合形成的自噬溶酶 体的结构，也可见自噬溶酶体内最终不能被降解的残体等。 自噬体膜蛋白的免疫印迹检测：l c 3 蛋白是自噬体的标记蛋白。l c 3 一1 分子 量为1 8