（环境工程专业论文）畜禽废水胁迫对芦苇生理特性的影响.pdf

摘要 植物正常生长时，其体内物质代谢系统足处于动态平衡的。当植物遭受逆境胁迫 时，就会启动自身防御系统进行保护，以适应不良环境的影响，但是这种保护作用是 有限的，当胁迫时间过长或胁迫强度过大，超过植物自身所能忍受的范围时，其防御 系统就会相应地减弱，植物就会受到伤害。植物的逆境胁迫是当今研究的热点之一， 未经处理的畜禽废水对植物来说无疑是一种富营养化逆境胁迫。本文运用自然条件模 拟实验，研究了两种浓度畜禽废水胁迫对芦苇生理特性的影响，旨在了解植物在畜禽 废水富营养胁迫下的作用机理，同时为湿地植物净化畜禽废水提供理论依据。其实验 结果如下： ( 1 ) 实验所采用的两种浓度畜禽废水，它们对芦苇( p h r a g m i t e sa u s t r a l i s ( c a v ) t r i n e xs t e u d e l ) 的生理特性的影响相似，但胁迫强度不同，各生理指标在长时间连续胁迫 下的变化幅度为高浓度畜禽废水大于中浓度畜禽废水。人工湿地试验地中生长的芦 苇，除m d a 含量和s o d 活性较演江河河心滩清水中自然生长状态下生长的芦苇低 外，其余生理指标均明显较高 ( 2 ) 在两种浓度畜禽废水胁迫下其s o d 活性均明显上升；p o d 活性在胁迫初 始时急速下降，到中后期则逐步恢复到胁迫前的水平；c a t 活性则在整个处理期间 逐渐下降p o d 活性的变化趋势说明胁迫初期芦苇受到的伤害较大，随着胁迫时间 的延长，芦苇对畜禽废水的胁迫逐渐产生适应性。s o d 活性明显上升说明芦苇在畜 禽废水胁迫下其体内产生了大量的o i ，要消除o i 带来的危害必然会生成产物h 2 0 2 ， 而p o d 和c a t 活性的变化趋势说明p o d 和c a t 并未能起到因消除o i 带来的危害 而产生的h 2 0 2 的作用，胁迫未能导致其抗氧化酶系统启动，因此推测芦苇体内存在 另一种保护机制消除h 2 0 2 累积带来的危害，这种保护机制可能是一些非酶促活性氧 清除系统。 ( 3 ) 总叶绿素含量在两种浓度畜禽废水胁迫下都呈现缓慢下降的趋势。而叶绿 素a ，b 值在畜禽废水胁迫下则均呈现上升趋势，恰好与总叶绿素含量的下降趋势相反a 叶绿素a ，b 值上升则是因为在畜禽废水胁迫下，叶绿素a 含量相对稳定，而叶绿素b 含量下降幅度较大，从而导致叶绿素a ，b 值上升的缘故。表明叶绿素a b 值主要是由 叶绿素b 的变化引起的。 ( 4 ) 两种浓度畜禽废水胁迫均促使芦苇根系活力明显上升、游离脯氨酸含量在 急速下降后稳定在一个较低水平、m d a 含量稳中有降、电解质渗漏现象不明显。根 系活力上升有利于芦苇抵抗胁迫带来的危害，增加抗氧化能力，是对胁迫条件的一种 积极反应，在长达近一个月的胁迫中芦苇根系活力仍然维持在一个较高水平说明芦苇 对畜禽废水胁迫产生了一定的适应性；试验中脯氨酸含量下降说明芦苇并未能够启动 脯氮酸含量的累积机制来增强对畜禽废水胁迫的抗逆性，在一定程度上增加了对芦苇 的伤害程度。m d a 是膜脂过氧化的重要产物，m d a 降低显示了芦苇在畜禽废水污染 胁迫下，细胞膜系统并未遭受大的破坏，细胞膜脂过氧化作用较小。质膜透性的表现 较为复杂，高浓度畜禽废水胁迫下芦苇质膜透性表现为反复下降上升，中浓度畜禽废 水胁迫下芦苇质膜透性表现为先下降后上升，到处理结束时仍极显著低于初始状态 ( p 茎 叶片。 细胞不同部分铅含量的大小顺序为细胞间隙 细胞壁 液泡 细胞质。在根部和叶片中， 均以活性较低的醋酸可提取态铅和盐酸可提取态铅占优势。在铅胁迫下，从芦苇根和 叶片中检测出一些铅结合蛋白。另外，铅除诱导芦苇合成种新的不结合铅的蛋白质 外，还导致种分子量大约为7 2 0 0 0 的蛋白质消失。吴玉辉等【5 8 l 对稻草制浆造纸废水 对芦苇的生长的影响进行了研究。结果表明，在稻草制浆造纸废水灌溉桶栽芦苇试验 基础上，芦苇的生长增产效果显著。芦苇对造纸废水的适应能力较强，c o d c ， 4 0 0 0 m g l 的废水可用于灌溉，但采用地下茎移栽的，初期宜用清水灌溉，2 个月后 再实行污灌。 8 3 材料与方法 3 1 废水来源及成份 四川农业大学污水处理厂，位于四川农业大学教学科研园，主要处理园中养殖区 排放的猪、牛、羊、鸡、鸭等畜禽废水。从养殖区中排放的畜禽废水由输送管道输送 至污水处理厂后，顺次通过粗格栅一细格栅一调节池一气浮池一a b r 厌氧池- - - , c a s s 池一人工湿地一生物氧化塘，以进一步去除畜禽废水中的细小悬浮颗粒物及有机n 、 p 等污染物质，达标废水排入溃江河支流。试验所用原浓度畜禽废水就取自经由粗格 栅简单除去粗大物理杂质后的出水，其水质指标如表1 所示。 表1 畜禽废水的成分及其含量 t a b l e lc o n s t i t u e n t sa n dc o n t e n t so fl i v e s t o c kw a s t e w a t e r 3 2 试验材料和污染处理 试验所用污染胁迫材料选用四川农业大学污水处理厂人工湿地试验地中生长情 况良好且大小一致的成年芦苇植株( 其湿地水质指标见表1 ) 。人工湿地试验地是从 人工湿地中独立分割出来的一块区域。与人工湿地经受相同的c a s s 池出水处理，为 期】年以上，其间距为】m ，高1 ：8 - 2 m ，地上部生物量约6 - 7 k g 丛采用自然条件下 模拟实验的方法，用两种不同浓度畜禽废水原浓度畜禽废水( 以下简称高浓度畜 禽废水) 及经原浓度畜禽废水稀释一倍后的畜禽废水( 以下简称中浓度畜禽废水) 对 其进行浇灌胁迫，每天浇灌3 4 次，始终保持供试芦苇材料2 4 小时处于淹水胁迫状 态。处理对照以非胁迫状态下( 0 d ) 人工湿地试验地芦苇材料作对照，并以自然状态 芦苇材料作比较对照，自然状态芦苇材料取自四川农业大学附近溃江河河心滩( 其水 质指标见表1 ) ，湿地芦苇即自此移栽。 3 3 样品采集与测定 9 芦苇叶片取相同叶位、长势和大小一致的新鲜叶片，根尖取自芦苇基部，所取用 材料用湿纱布包裹后立即送入实验室分析测试。每隔三天采样测定一次，重复三次， 共采样7 次。 试验日期为2 0 0 6 年4 月底至6 月初。 3 4 试验方法 3 4 1 根系活力的测定 参照李合生等胪卅的方法，采用t i c 法，以g ( g f w h ) 表示。7 2 2 分光光度计于 波长4 8 5 n m 下比色后计算根系活力。其测定步骤和计算方法如下： ( 1 ) t 1 标准曲线制作：取0 4 t i c 溶液0 2 5 m l 放入1 0 m l 容量瓶中，加少 许n a 2 s 2 0 4 粉，摇匀后立即产生红色的三本甲腊。再用乙酸乙酯定容至刻度，摇匀a 然后分别取此液o 2 5 m l 、o 5 0 r a l 、1 0 0 m l 、i 5 0 m l 、2 0 0 m l 置1 0 m l 容量瓶中，用 乙酸乙酯定容至刻度，即得到含t t c2 5 1 t g 、5 0 p g 、l o o i x g 、1 5 0 1 , t g 、2 0 0 1 x g 的标准比 色系列，以空白作参比，在4 8 5 n m 波长下测定吸光度，绘制标准曲线。 ( 2 ) 分别称取o 5 9 芦苇的新鲜根尖3 份于5 0 m l 小烧杯中，加入1 1 1 5m m o l l 的 磷酸缓冲液( p h7 0 ) 和o 4 的t t c 溶液的等量混合液1 0 m l ，把根充分浸没在溶液 内，在3 7 ( 2 下暗保温1 3 h ，此后加入i m o i l 的硫酸溶液2m l ，以停止反应。( 与此 同时做一空白实验，先加硫酸，再加根样品，其溶液浓度、操作步骤同上) 。 ( 3 ) 把根取出，吸干水分后与乙酸乙酯3 4 m l 和少量石英砂一起在研钵内磨 碎，以提出三本甲膳( 1 r f ) 。将红色提取液移入试管中，并用少量乙酸乙酯把残渣 洗涤二三次，皆移入试管，最后加乙酸乙酯总量为l o m l ，用分光光度计在波长4 8 5 n m 下比色，以空白试验作参比测出吸光度，查标准曲线，即可求出四氮唑还原量。 ( 4 ) 结果计算：四氮唑还原强度按下式计算： 单位根鲜重的四氮唑还原强度= 罢：! ： ；需【- t g ( g f w h ) 】 3 4 2 丙二醛( m d a ) 含量的测定 参照熊庆娥等【删的方法，采用硫代巴比妥酸( t b a ) 法，以p m o l g f w 表示。7 2 2 分光光度计于波长4 5 0 r i m 、5 3 2 n m 、和6 0 0 r i m 下比色后计算丙二醛含量。其测定步骤 和计算方法如下： ( 1 ) 称取新鲜的洗净擦干的芦苇叶片0 5 1 9 ，剪碎后放入研钵中，加5 t c a i o ( 三氯乙酸) 溶液6 m l ，再加入少量石英砂，研磨成匀浆后在3 0 0 0 r m i n 下离心1 0 m i n 。 ( 2 ) 取离心后的上清夜2 m l ，加o 6 7 的t b a ( 硫代巴比妥酸) 溶液2 m l ，混 合后在1 0 0 水浴上煮沸3 0 m i n ，冷却后再离心一次。 ( 3 ) 用l e m 的比色杯分别测定上清液在4 5 0 n m ，5 3 2 n m ，6 0 0 r i m 处的吸光度值。 空白对照为3 m lt c a + l m lt b a 。 ( 4 ) 结果计算：m d a 浓度q x m o l l ) 按以下公式计算： c = 6 4 5 ( a 5 3 2 - a 6 0 0 ) - 0 5 6 a 4 5 0 计算出m d a 浓度后，再按下式进一步计算单位鲜重组织中的m d a 含量： m d a 的含量：c xv 忑x 孑l o - s 【“m 。i g f w f “ 式中：c 为提取液中m d a 的浓度，r t m o l l ；v 为提取液的体积，m l ；f w 为样 品鲜重，g 。 3 4 3 质膜透性( m p ) 的测定 参照熊庆娥等 6 0 l 的方法，以相对电导率的大小来表示质膜透性，相对电导率= ( 处 理电导率煮沸电导率) x 1 0 0 。电导率测定所用仪器为d d s 1 l a 型电导率仪。其测 定步骤和结果计算如下： ( 1 ) 取芦苇叶片用去离子水冲洗3 - , - 4 次。用洁净滤纸吸去表面水分，用手术剪 避开主脉剪取1 0 x 5 m m 叶片3 0 片。 ( 2 ) 将叶片放入2 0 m l 玻璃注射器内，吸取1 0 m l 去离子水，堵住注射器口进 行抽气1 0 m i n ，以抽出细胞间隙的空气，当缓慢放入空气时，水即渗入细胞间隙，叶 片变成半透明状，沉入水下。 ( 3 ) 抽完气连叶片和去离子水一同倒入5 0 m l 小烧杯中，室温下浸提l h ( 整个 过程不要用手接触材料，以防污染) ，其间要多次摇动小烧杯。 ( 4 ) 1 h 后将各烧杯充分摇匀，用电导率仪测其初电导值( s i ) 。 ( 5 ) 测毕，将各烧杯中叶片和去离子水一同倒入2 0 m l 具塞刻度试管中，置沸 水浴中1 5 m i n ，以杀死植物组织，取出试管后用自来水冷却至室温，并在室温下平衡 1 0 r a i n ，摇动，测其终电导值( s 2 ) 。 ( 6 ) 结果计算：相对电导度( l ) = 睾1 0 0 6 2 3 4 4 游离脯氨酸( p r o ) 含量的测定 参照李合生等跏的方法，采用酸性茚三酮法，以p g 萨w 表示。7 2 2 分光光度计 于波长5 2 0 姗下比色后计算游离脯氨酸含量。其测定步骤和计算方法如下： 1 标准曲线的绘制 ( 1 ) 在分析天平上精确称取2 5 m g 脯氨酸，倒入小烧杯内，用少量蒸馏水溶解， 然后倒入2 5 0 m l 容量瓶中，加蒸馏水定容至刻度，此标准液中每毫升含脯氨酸1 0 0 “g 。 ( 2 ) 系列脯氨酸浓度的配制。取6 个5 0m l 容量瓶，分别盛入脯氨酸原液0 5 m l 、 1 o m l 、1 5 m l 、2 o i n l 、2 5 m l 、及3 o m l ，用蒸馏水定容至刻度，摇匀，各瓶的脯 氨酸浓度分别为l p 咖l 、2 p g ，m l 、3 肛g m l 、4 p g ，m l 、5 斗g m l 及6 p 咖l 。 ( 3 ) 取6 支2 0 i t l l 具塞刻度试管，分别吸取2 r n l 系列标准浓度的脯氨酸溶液及 2 r i l l 冰醋酸和2 m l 酸性茚三酮溶液，每管在沸水浴中加热3 0 m m ( 加热时在1 0 0 0 m l 的烧杯底放一只烂线手套，试管放在手套上，以防止试管与烧杯底直接接触引起爆沸， 使试管破裂) 。 ( 4 ) 冷却后各试管准确加入4 n 1 l 甲苯，振荡3 0 s ，静置l o l i l i n ，使色素全部转 入甲苯溶液。 ( 5 ) 用长皮头滴管轻轻吸取各管上层脯氨酸甲苯溶液至比色杯中，以甲苯溶液 为空白对照，于5 2 0 m 波长处进行比色。 ( 6 ) 标准曲线的绘制：先求出吸光度值( y ) 依脯氨酸浓度( x ) 而变的回归方 程式，再按回归方程式绘制标准曲线，计算2 i i l l 测定液中脯氨酸的含量( 肛g r 1 1 l ) 。 2 样品的测定 ( 1 ) 脯氨酸的提取：准确称取不同处理的待测叶片各0 5 9 ，分别置入研钵中， 然后向研钵中分别加入6 m l3 的硫基水杨酸溶液( 注：先加3 m l ，研磨好后再加3 m l 以方便转移) 和少量石英砂，研磨成匀浆，在沸水中提取l o m m ( 提取过程中要经常 摇动) ，冷却后在3 0 0 0 r m m 下离心5 r n i n ，上清液即为脯氨酸的提取液。 ( 2 ) 吸取上清液2 m l 于另一干净带玻璃塞试管中，加入2 n 1 l 冰醋酸及2 m l 酸 性茚三酮试剂，在沸水中加热3 0 m i n ，溶液即为红色。 ( 3 ) 冷却后加入4 i r l l 甲苯，摇荡3 0 s 后静置l o m i n ，取上层液体于1 0 m l 离心 管中，在3 0 0 0 d m i n 下离心5 m i n 。 ( 4 ) 最后用吸管轻轻吸取上层脯氨酸红色甲苯溶液于比色杯中，以甲苯为空白 对照，在分光光度计上5 2 0 m 波长处比色，求得吸光度值。 3 结果结算 根据回归方程计算出( 或从标准曲线上查出) 2 m l 测定液中脯氨酸的浓度x ( 峙，2 m l ) ，然后计算样品中脯氨酸含量。计算公式如下： 6 x x 一 单位鲜重样品的脯氨酸含量2 稃面百￥2 i x1 0 0 p g g r w 】 3 4 5 叶绿素含量的测定 参照李合生等删的方法，采用酒精提取法，以m g g r w 表示，u n i c o7 2 0 2 b 型 分光光度计于波长6 6 5 n m 、6 4 9 n m 、和4 7 0 r i m 下比色后计算叶绿素含量。其测定步骤 和计算方法如下： ( i ) 称取新鲜的洗净擦干的芦苇叶片( 去中脉) 0 3 - - - 0 5 9 ，剪碎后放人研钵中， 加少量石英砂和碳酸钙粉及2 3 m l 9 5 乙醇，研磨成匀浆，再加乙醇l o m l 。继续研 磨至组织变白。暗处静置约1 0 m i n ( 2 ) 取滤纸一张，置漏斗中，用乙醇润湿，沿玻棒把提取液倒入漏斗中，过滤 到2 5m l 棕色容量瓶中，用少量乙酵冲洗研钵、研棒及残渣数次，最后连同残渣一 起倒入漏斗中。 ( 3 ) 用滴管吸取乙醇，将滤纸上的叶绿体色素全部洗入容量瓶中，直至滤纸和 残渣中无绿色为止。最后定容至2 5 m l 。摇匀。并保存在暗处备用待测。( 同时做一 个重复) 。 ( 4 ) 取光径i c m 的比色杯，注入上述色素提取液，用9 5 乙醇作空白对照，在 波长6 6 5 n m ，6 4 9 n m ，4 7 0 n t o 下测定吸光度。 ( 5 ) 结果计算：分别按公式( 1 ) 、( 2 ) 计算叶绿体色素a 和b 的浓度( m g m l ) 。 ( 1 ) 、( 2 ) 式相加即得叶绿素总浓度。 c a = 1 3 9 5 a s s r 6 8 8 a 6 4 9 ( 1 ) c b = 2 4 9 6 a 6 4 9 - 7 3 2 a 6 6 5 ( 2 ) 求得色素的浓度后，再按下式计算组织中单位鲜重的各色素的含量： 叶绿体色素的含量= 鱼重堕鲨窒号警黧摹篓幽【m g g f w 3 4 6 过氧化氢酶( c a = r ) 活性的测定 参照李合生等1 5 9 】的方法，采用高锰酸钾滴定法，以每克鲜重样品i r a i n 内分解 h 2 0 2 的毫克数表示其酶活性，单位用m g ( g f w m i n ) 表示。其测定步骤和计算方法如 f ： ( 1 ) 酶液提取：取芦苇叶片0 5 l g 加入p h 7 8 的磷酸缓冲液3 m l ，研磨成匀浆， 转移至2 5 m l 容量瓶中，用该缓冲液冲洗研钵，并将冲洗液转移至容量瓶中，用同一 缓冲液定容，4 0 0 0 r r a i n 离心1 5 m i n ，上清液即为过氧化氢酶的粗提液。 ( 2 ) 取5 0 m l 三角瓶4 个( 两个测定，另两个为对照) ，测定瓶加入酶液2 5 m l , 对照加入煮死酶液2 5 m l ，再加入2 5 m lo 1 m o l l 的h 2 0 2 ，同时计时，于3 0 c 恒温 水浴中保温1 0 m i n ，立即加入1 0 h 2 s 0 42 5 m l 以停止反应。 ( 3 ) 用o 1 m o l l k m n 0 4 标准溶液滴定，至出现粉红色( 在3 0 m i n 内不消失) 。 ( 4 ) 结果计算：酶活性用每克鲜重样品l m i n 内分解h 2 0 2 的毫克数表示： ( a - 趴争1 7 过氧化氢酶活性= _ - 二一【m g ( g m i n ) 】wx f 式中：a 为对照k m n o 。滴定毫升数；b 为酶反应后k m n 0 4 滴定毫升数；v t 为 提取酶液总量，m l ：v s 为反应时所用酶液量，m l ；w 为样品鲜重，g ；t 为反应时 间，m i m1 7 为l m l o 1 m o l l k m n 0 4 ，相当于1 7 m g h 2 0 2 。 3 4 7 过氧化物酶( p o d ) 活性的测定 参照张志良掣6 1 1 的方法，采用愈创木酚法，以每分钟内a 4 7 0 变化o 0 1 为一个过 氧化物酶活性单位，用a a 4 7 0 ( m i n g f w ) 表示。7 2 2 分光光度计于波长4 7 0 n m 下比色 后计算p o d 活性。其测定步骤和计算方法如下： ( 1 ) 酶液的制备：称取新鲜的洗净擦干的芦苇叶片0 5 - 1 9 ，剪碎后放入研钵中， 加少量石英砂和适量o 0 5 m o l l 磷酸缓冲液( p h5 5 ) 研磨成匀浆。然后将匀浆全部 转入离心管中，于3 0 0 0 r m i n 下离心1 5 r a i n ，将上清液转入2 5 m l 容量瓶中，沉淀用 5 m l 磷酸缓冲液再提取两次，上清液并入容量瓶中，定容至刻度，低温下保存备用。 ( 2 ) 过氧化物酶活性测定：测定时的酶活性反应体系包括：2 9 m lo 0 5 m o l l 的 磷酸缓冲液( p h5 5 ) ；1 0 m l 2 h z 0 2 ；1 0 m l 0 0 5 m o l l 愈创木酚和0 1 m l 酶液。用 加热煮沸2 0 r a i n 的酶液为对照，反应酶液在加入酶液后，迅速在4 7 0 n m 波长下比色， 每隔l m i n 记录一次吸光度值，共记录5 次，然后以每分钟内吸光度值变化o 0 1 为1 个酶活性单位( u ) 。 ( 3 ) 结果计算：以每分钟内7 0 变化o 0 1 为一个过氧化物酶活性单位( u ) 。 过氧化物酶活性= 7 i ；：君备i u ( m i n g f w ) 】 1 4 式中：7 0 为反应时间内吸光度的变化；f w 为芦苇叶片鲜重，g ；t 为反应时 间，m i n ；v r 为提取液总体积，m l ；v s 为测定时取用酶液体积，m l 。 3 4 8 超氧化物歧化酶( s o d ) 活性的测定 参照邹琦等眦1 的方法，采用氮蓝四唑( n b t ) 法，以抑制n b t 光化还原的5 0 为一个酶活性单位，用u g f w 表示。u n i c o7 2 0 2 b 型分光光度计于波长5 6 0 n m 下比 色后计算s o d 活性。其测定步骤和计算方法如下： ( 1 ) 酶液提取：称取新鲜的洗净擦干的芦苇叶片( 去叶脉) o 5 1 9 ，剪碎后放入 预冷的研钵中，加入l m l 预冷的0 0 5 m o l l 磷酸缓冲液( p h7 8 ) 研磨成浆，然后再 加缓冲液使其终体积为5 m l ( 先加3 m l 研磨，再加2 m l 冲洗研钵) 。取1 5 m l 于 3 0 0 0 r r a i n 下离心1 0 r a i n ，上清夜即为s o d 提取液。 ( 2 ) 显色反应：取5 m l 指形管4 支，2 支为测定管，2 支为对照管，按表2 加 入各溶液： 表2 显色反应试济用量 t a b l e 2d o s a g eo f c o l o r - p r o d u c i n gr e a g e n ti nt h ee x p e r i m e n t 混匀后将1 支对照管置于暗处，其他各管在4 0 0 0i x 日光下反应2 0 m i n ( 要求 各管受光情况一致，温度高时时间缩短，低时延长) ( 3 ) s o d 活性测定与计算：至反应结束后，以不照光的对照管作空白，分别测 定其他各管的吸光度。 ( 4 ) 结果计算：已知s o d 活性单位以抑制n b t 光化还原的5 0 为一个酶活性 单位表示，按下式计算s