（环境工程专业论文）Pblt2gt、Cdlt2gt与血清白蛋白相互作用的研究.pdf

摘要 摘要 金属离子与蛋白质结合反应的研究是化学和生命科学研究的前沿领域。血 清白蛋白( s a ) 是哺乳动物血浆中含量最丰富的蛋白质，它能够储存和转运众多 的内源性和外源性物质。铅、镉是两种严重危害人类健康的重金属元素，铅在体 内的蓄积会影响到人的各类器官和组织。因而，研究铅、镉在人体内的存在状态和 转运具有非常重要的意义。铅侵入人体后，人们一直认为p b 2 + 主要与红细胞内的血 红蛋白相结合，因而关于p b z + 与血清白蛋白相互作用的文献报道较少。本文用平衡 透析和紫外光谱法研究了p b 2 + 和c d 2 十与血清白蛋白的相互作用。 用平衡透析法详细研究了模拟生理p h 6 3 条件和蛋白质等电点p h 5 4 条件 下，p b 2 + 与人血清白蛋白( h s a ) 或牛血清白蛋白( b s a ) 的结合平衡，s c a t c h a r d 图分析表明在p h 6 3 和p h 5 4 ，p b 2 + 在b s a 上的强结合位点数分别是1 6 和0 8 个， 弱结合位点分别为6 5 和4 个，p b 2 + 在h s a 上的强结合位点数分别是2 1 和1 1 个， 弱结合位点分别为9 o 和3 4 个，因此p b 2 + 与b s a 或h s a 的相互作用都明显受到 缓冲溶液p h 影响，通过非线性最d - - 乘法拟合b j e r r u m 方程，首次得到了p b 2 + 与h s a 体系和p b 2 + 与b s a 体系的逐级稳定常数，其中k l 、k 2 均明显大于其余 k 值，h i l l 系数分析表明，p b 2 + 与h s a 或b s a 的结合均存在弱负协同效应，使 用差示吸收光谱法研究1 ：1p b 2 + b s a 和l ：1p b 2 + h s a 体系的电荷转移谱带，发 现p b 2 十在白蛋白中的优先配位基团是组氨酸咪嗖基。进一步根据z n 2 + 、c a 2 + 、c u 2 + 与p b 2 + 竞争结合b s a 或h s a 上的强结合位点，推断p b 2 + 在牛血清白蛋白中优先绪 合位点是位点s i t e a 。 生理环境p h ( 7 4 3 ) 条件下，用平衡透析法研究了c d 2 + 与不同浓度的牛血 清白蛋白( b s a ) 的结合平衡。由s c a t c h a r d 图分析表明b s a 与c d 2 + 相互作用有两 类结合部位，通过非线性最i j , - - 乘法拟合b j e r r u m 方程，得到c d ”b s a 体系的 逐级稳定常数值。通过h i l l 系数可以判断c d 2 + 与b s a 的结合产生的协同效应。 通过c d 2 + 与c u “，z n 2 + 或c a 2 + 等竞争结合b s a 的结果，进一步讨论了c d 2 + 在 b s a 中强结合部位的可能位置和配体。 关键词铅；镉：平衡透析：血清白蛋白；相互作用：紫外光谱 河，l 匕科j 支人学硕十学位论文 a bs t r a c t t h es t u d yo fi n t e r a c t i o nb e t w e e nm e t a li o n sa n dp r o t e i n si san e wf r o n t i e ro f c h e m i s t r ya n dl i f es c i e n c e s e r u ma l b u m i n ( s a ) i st h em o s ta b u n d a n tp r o t e i ni n b l oo dp l a s m aa n ds e r v e sa sad e p o tp r o t e i na n dt r a n s p o r tp r o t e i nf o rn u m e r o u s e n d o g e n o u sa n de x o g e n o u sc o m p o u n d s l e a da n dc a d m i u ma r et w ok i n d so fh e a v y m e t a le l e m e n t sw h i c ha r e s e r i o u s l yh a r m f u lt oh u m a nh e a l t h ，t h ea c c u m u l a t i o n o f l e a di nt h eb o d yw i l la f f e c tm a n yo r g a n s ，t i s s u e s ，a n ds y s t e m st h u s ，a sar e s u l t ， t h es t u d yo ft h ee x i s t i n gs t a t ea n dt r a n s f o r m a t i o no fl e a da n dc a d m i u mi nh u m a n b o d yi sv e r yi m p o r t a n t a f t e ri n v a d i n gi n t ot h eb u d y ，p b 2 + i sa l w a y st h o u g h tt o c o m b i n ew i t hh a e m o g l o b i nm a i n l y ，s ot h ed o c u m e n t a lr e p o r ta b o u tt h ei n t e r a c t i o n o fp b 2 + a n ds e r u ma l b u m i ni sr a r e t h ei n t e r a c t i o no fp b 2 + o rc d 2 + a n ds e r u m a l b u m i nh a sb e e ns t u d i e db yt h ee q u i l i b r i u md i a l y s i sa n du v - v i s i b l es p e c t r o m e t r y h e r e t h eb i n d i n go fp b 2 十t oh u m a ns e r u ma l b u m i n ( h s a ) o rb o v i n es e r u ma l b u m i n ( b s a ) a tp h 6 3o rp h 5 4h a sb e e ns t u d i e db ye q u i l i b r i u md i a l y s i s t h er e s u l t sf r o m s c a t c h a r dp l o ts h o w e dt h a tt h e r ee x i s t e d1 6a n do 8s t r o n gb i n d i n g ss i t ew i t h i nb s aa t p h 6 3a n dp h 5 4r e s p e c t i v e l y t h e r ee x i s t e d6 5a n d4w e a kb i n d i n g ss i t e t h e r ee x i s t e d 2 1a n d1 1 s t r o n gb i n d i n g ss i t ew i t h i nh s a a tp h 6 3a n dp h 5 4r e s p e c t i v e l y t h e r e e x i s t e d9 0a n d3 4w e a kb i n d i n g s 。s i t e t h ei n t e r a c t i o nb e t w e e np b 2 + i o n sa n db s ao r h s aw a ss i g n i f i c a n t l yi n f l u e n c e db yp ho fb u f f e rs o l u t i o n t h es u c c e s s i v es t a b i l i t y c o n s t a n t sw h i c ha r er e p o r t e df o rt h ef i r s tt i m ea r eo b t a i n e db yn o nl i n e a rl e a s ts q u a r e m e t h o df i t t i n gb je r r u mf o r m u l a f o rp b 2 + 一b s ao rp b 2 + - h s as y s t e m s ，kla n dk 2a r e o b v i o u s l yg r e a t e rt h a nt h eo t h e r s f h ea n a l y s e so fh i l lp l o ti n d i c a t et h a tt h e r ee x is t sw e a k n e g a t iv ec o o p e r a t iv ee f f e c ti npb ”bs ao rp b 2 + h s as y s t e m s t h ec h a r g et r a n s i t i o n a b s o r p t i o nb a n d so f1 ：1p b 2 + 。b s ao rp b z + - h s as y s t e mh a db e e nf u r t h e rs t u d i e dw i t h d i f f e r e n t i a la b s o r p t i o ns p e c t r u m t h er e s u l t si n d i c a t e dt h a th i s t i d i n ei m i d a z o l en i t r o g e n w a st h ep r e f e r e n t i a lb i n d i n gg r o u p so fp b 2 + i o n si nb s ao rh s a t h er e s u l t so fi ) b 2 十i o n s c o m p e t i n gw i t hz n 2 + o rc u 2 十o rc a 2 。i o n st ob i n dt ot h es t r o n gb i n d i n gs i t ei nbs ao r h s a s u g g e s t e dt h a tt h ep r i m a r yb i n d i n gs i t ef o rp b 2 + i o n sw a ss i t ea i na l b u m i n t h eb i n d i n go fc a + t ob o v i n es e r u ma l b u m i n ( b s a ) a tp h y s i o l o g i c a l ( p h 7 。4 3 ) w e r e s t u d i e d t h es c a t c h a r da n i l y s i si n d i c a t e so b t a i n ss t r o n ga n dw e a kb i n g i n gs i t e sf o r ab s t r a c t c d 2 + 一b s a ，n l eh i l lc o e f f i c i e n t s ，i n d i c a t et h a tt h es t r o n gp o s i t i v ec o o p e r a t i v ee f f e c te x i s t s i nc d 2 + _ b s as y s t e m 。c d 2 + _ b s as y s t e ma r ed e t e r m i n e db yn o n - l i n e a rl e a s t s q u a r em e t h o d f i t t i n gb j e r f u r tf b r m u l a t h ep r o b a b l el o c a t i o na n dc o o r d i n a t e da t o m so f t h es i t e sa r ea l s o s u g g e s t e db a s e d o nt h er e s u l t sc d 2 + c o m p e t i n gw i t hc u 2 + o rz n 2 + o rc a 2 + i o n st ob i n dt o b s a k e y w o r d s l e a d ；c a l i u m ；f q u i l i b r i u md i a l y s i s ；s e r u ma l b u m i n ；i n t e r r a t i o n ； u v - v i s i b l es p e c t r o m e t r y 河北科技大学学位论文原创性声明 本人郑重声明：所呈交的学位论文，是本人在导师的指导下，独立进行研究工 作所取得的成果。对本文的研究做出重要贡献的个人和集体，均已在文中以明确方 式标明。除文中已经注明引用的内容外，本论文不包含任何其他个人或集体已经发 表或撰写过的作品或成果。本人完全意识到本声明的法律结果由本人承担。 学位论文作者签名：程艳砷指导教师签名：幅风秀 。罗年s 月) 了日 舒年s 羁呸日 河北科技大学学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定，同意学校保留 并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文被查阅和借阅。本 人授权河北科技大学可以将本学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检 索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存和汇编本学位论文。 口保密，在一年解密后适用本授权书。 本学位论文属于 口不保密。 ( 请在以上方框内打“”) 学位论文作者签名：径艳坤指导撕签名：拓赡 。( 7 年5 月述日驴夕年j 一月才日 第1 章绪论 第1 章绪论 1 1 引言 血清白蛋白是人和动物血浆中含量最丰富的蛋白质，不同动物的血清白蛋 白在氨基酸组成上稍有差异，但在结构上是相似的，都是只有一个肽链的非球 蛋白，含有约6 0 0 个氨基酸，它在生物内起着血液缓冲剂，维持血液渗透压， 载运等作用。血清白蛋白可与许多金属离子结合，也是药物，脂肪酸，酶，染 料，代谢产物，激素等的运送载体。血浆中自蛋白浓度长期以来一直被时为是 健康和疾病的一个指标。与其他的蛋白质相比，血清白蛋白分子量较小，溶解 性较大，稳定性较好，与各种配基具有亲和性，且易提纯制备。因此，血清白 蛋白是研究高分子蛋白的理化血清白蛋白，能够储存和转运内源性和外源性物 质u i ，能与血清白蛋白结合的物质包括金属离子、维生素、药物、染料和一些 代谢产物，对这些物质在体内的存在状态、转运、分布都起了重要作用。 血清白蛋白具有广泛的结合能力，这些结合物质与白蛋白的结合部位，结 合方式及竞争作用等，已被广泛研究，但是目前能够完全阐述清楚的还不多。 而金属离子与白蛋白的相互作用是研究血清白蛋白相互作用、结合的典型实例， 是处于生命科学与化学之间的一门边缘性研究课题，文献己报道了c u 2 + 【z 】， z n 2 + 3 1 ，稀土离子【4 】等与血清白蛋白的相互作用，研究了它们的结合部位、稳定 常数、配位情况以及对它们协同性的分析，这些对医药、环境等方面具有很高 的实用价值。蛋白质的定量分析是生命科学、食品检验乃临床医学等最常涉及 的内容【5 】。在生命科学及化学的研究上，需要了解各种类型的蛋白质的结构、 性能和形态，与其他物质的结合形式以及反应机理等方面的信息。 铅是一种严重危害人类健康的重金属元素，它可以影响人类的各类器官， 如神经、造血、消化、泌尿、生殖、心血管、内分泌、免疫、骨骼等】。本文 在模拟近似体液条件下，利用平衡透析法研究铅离子与血清白蛋白的相互作用， 得到铅离子在血清白蛋白上的结合位点数，在分子水平上研究铅离子与血清白 蛋白相互作用的机制。镉进入机体后，与蛋白质，肽及脂肪酸等物质的巯基、 氨基和羧基相结合，破坏了酶的活性，使巯基酶失效，机体中毒。镉对机体功能 的影响主要有：对肾脏、骨质的损害、致癌；对肝、肺、睾丸的损伤。镉对人体的 作用主要是毒性作用，因此对镉与血清白蛋白相互作用的研究也有其重要意义。 1 2 血清白蛋白的结构、功能和理化性质 蛋白质分子有不同的结构层次：一级结构，二级结构，超二级结构，结构域， 河北科技大学硕士学位论文 三级结构，四级结构【7 8 】。蛋白质的一级结构是指肽链中的氨基酸序列。一级结构决 定高级结构，决定蛋白质的生物学功能。到7 0 年代末许多研究者才对牛血清白蛋白 ( b s a ) 、人血清白蛋白( h s a ) 、鼠血清白蛋白( r s a ) 的氨基酸序列基本弄清楚。 h s a 是由5 8 5 个氨基酸残基组成的单肽链蛋白质，分子量约为6 6 5 0 0 。h s a 肽链含 有3 5 个半胱氨基酸残基，仅3 4 位上有一个巯基，其余都为二硫键，二硫键中有8 对组成交叉二硫键，只有接近n 端的是一个单个二硫键，二硫键对维系蛋白质空间 结构的稳定性起着重要作用1 9 1 。h s a 含有1 8 个酪氨酸残基( t y r ) 在2 1 4 位上含有 一个色氨酸残基( t r p ) ，n 端为天冬氨酸残基( a s p ) ，c 端为亮氨酸残基( l e u ) 。 b s a 是由5 8 2 个氨基酸残基组成的单肽链蛋白质。其氨基酸序列与h s a 非常类似。 b s a 肽链也含有3 5 个半胱氨酸残基，仅3 4 位上有一个巯基，其余都为二硫键，二 硫键中有8 对组成交叉二硫键，只有接近n 端的是一个单个二硫键。与h s a 不同 的是，b s a 在1 3 4 位及2 1 2 位上都含有一个色氨酸残基( t r p ) ，因此两者的荧光性 质略有不同。蛋白质二级结构是指多肽链骨架中靠氢键维持的局部的有规则的构象， 如a 螺旋、3 1 0 螺旋、n 螺旋、d 折叠、p 转角以及三股螺旋等，还包括无规则卷 曲以及非氢键维系的规则结构和侧链的构象。血清白蛋白氨基酸残基中约4 8 排y 0 为0 t 螺旋，1 5 为p 一折叠【1 0 , 1 1 ，其余卷曲回折成球状分子。蛋白质的三级结构是由 一条多肽链的不同氨基酸侧链间的相互作用形成的稳定结构。蛋白质的四级结构是 指寡聚蛋白中亚基的种类、数目、空间排布以及亚基间的相互作用。 血清白蛋白在生物体中起着血液缓冲剂、维持血液渗透压、载运等作用【l 2 ，j 。 血浆中白蛋白的浓度一直被视为健康与疾病的一个指标。与其它蛋白相比，血清白 蛋白分子量较小，溶解度较大，稳定性较好，与各种配基具有亲和性且易于提成制 备。因此，血清白蛋白是研究高分子蛋白理化性质、生物学功能、体内代谢、临床 应用及遗传变异等方面的理想蛋白质，在生理学和临床上均有重要意义。h s a 在p h 7 4 条件下，具有1 8 个净负电荷；离子强度为0 1 5 时，等电点在4 7 ，在p h8 6 时， 电泳分析得单一区带。a o k i 和f o r s t e r 提出白蛋白存在同分异构体，他们将p h4 5 时电泳图谱的白蛋白称为n 型( n o r m a l ) ， 于n 型之前的白蛋白命名为f 型( f a s t ) ， 即正常型，而将p h 3 5 4 5 条件下电泳 这两种蛋白型体能够可逆的相互转变，f 型蛋白是n 型蛋白的伸展构象，蛋白分子的螺旋倾向于分开，分子变长的膨胀构象， n 型是白蛋白在p h 4 0 时的稳定形式。在p h 8 附近，蛋白转变为另一种膨胀的b 构象： 蛋白质变性通常是指不涉及肽链一级结构断裂而各种次级键乃至二硫键破 坏，导致蛋白质构象( 包括二、三、四级结构) 变化的过程【l4 1 。蛋白质变性时， 自由能的改变一般不太大，平均约为5 0k j t o o l ，相当于3 4 个氢键的破坏。 因变性条件的不同，有的变性是蛋白质的肽链完全丧失天然结构，分子内次级 2 第1 章绪论 键均遭破坏，整个分子被扰乱而伸展；但有时扰乱并不完全，仍保留部分有序 结构。蛋白质变性后，其物理性质( 如溶解度，结晶能力，紫外吸收光谱，荧 光光谱) 和化学性质( 如水解速度，与某些试剂反应的能力等) 以及生物性质 ( 如酶的催化活性，抗体与抗原的专一结合能力等) 都会发生变化。 导致蛋白质变性的因素主要有如下几种： 1 ) 温度 升高温度可以增强原子的波动与旋转。通常蛋白质在5 0 - - 6 0 的溶液中易 于发生热变性，一般仅涉及蛋白质构象中次级键的破坏，甚至在分子内仍保留 j 一些紧密有序的结构区域。但是有些蛋白质经热变性可使二硫键断裂，或在二 硫键之间发生交换反应。由于热变性，构象变化甚至可导致蛋白质分子聚集而 出现凝固，此时变性的逆转就十分困难了。 2 ) p h 一般蛋白质在p h 4 - - 7 的范围内比较稳定，过酸过碱均易导致变性。当p h 低于蛋白质等电点时，蛋白质带正电荷，当p h 高于蛋白质等电点时，带负电荷， 同性电荷相斥，可影响蛋白质构象，特别是对表面电荷分布的影响较大。实际 上p h 还会影响分子内极性基团的带电情况，可以破坏盐键，甚至使某些基团从 分子内部转移到分子表面，从而改变了蛋白质的构象而出现变性。 3 ) 盐 不同的盐对蛋白质的构象有不同的作用。盐解离产生的离子既可作用于蛋 白质中的极性基团，又可与水作用，影响水与蛋白质极性基团的作用，故可直 接或间接改变蛋白质构象的稳定性。但是有些离子可以提高蛋白质构象的稳定 性，如s 0 4 2 ，因其还能降低蛋白质的溶解度，故常用于盐析以分离蛋白质，同 时保存其活性。有些离子会降低蛋白质构象的稳定性，如c a 2 + ，s c n 等，但能 提高蛋白质溶解度而有盐溶作用。 4 ) 有机溶剂 因为有机溶剂的极性及介电常数小于水，导致蛋白质分子中静电排斥加强 而易于影响构象稳定性。重要的是稳定蛋白质构象的疏水作用会由于有机溶剂 使介质的极性减小而破坏，使蛋白质丧失了维持其稳定性的主要作用。 1 3金属与血清白蛋白相互作用的研究进展 金属离子在许多生命过程中发挥关键作用，研究金属离子与蛋白质的结合 作用是生命科学的重要内容，是化学和生命科学研究的前沿领域。从5 0 年代开 始，人们对血清白蛋白与金属离子( 和药物分子等) 的相互作用展开了大量研 究，从化学的角度看，这些研究可分为结构研究与结合平衡研究二个方面，从 3 河北科技大学硕士学位论文 研究手段上看，有紫外可见光谱法、荧光光谱法、平衡透析法、核磁共振法、 电位滴定法、红外光谱法以及圆二色谱法等。 通常人们研究的焦点集中在生命金属元素在模拟生理条件下( p h7 4 3 左 右) 或等电点( p h5 3 左右) 附近与血清白蛋白的结合反应，对c u 2 + 、z n 、 n i 2 + 、c 0 2 + 、c o ”、m n 2 + 、c d 2 + 等研究的较多。国外开展金属离子与血清白蛋白相 互作用的研究较早【15 1 ，多集中在c u 2 + ，z d + 这两种离子的研究，如：1 9 4 8 年，k l o t z 平衡透析和分光光度法研究c u 2 + 与b s a 的相互作用【l 引。1 9 5 2 年，t a n f o r d 用极谱法 研究了p h 对c u 2 十与b s a 结合的影响【1 7 】。1 9 5 7 年，k l o l l e t h o f f 最先报道c u 2 + 在b s a 中的具体结合位置，中性p h 时优先结合位置涉及b s a 的n 一端a s p 一残基n h 2 【1 8 】。 1 9 6 7 年，p e t e r s 等根据滴定和吸收光谱数据等实验事实，首次提出c u ( i i ) 在b s a 分 子中结合部位的结构。b r a d s h a w 等的研究支持p e t e r s 等的结构模型【l 引。1 9 5 2 年， t a n f o r d 根据极谱结果推测：z n 2 + 与b s a 的主要结合位置是h i s 残基上的咪哇基， 弱结合位置是羧基【2 们。k l o t z 根据吸收光谱结果推测z n 2 + 与b s a 结合同时涉及s h 和咪畦基及相邻的羧基。1 9 5 8 年，r a o 研究了c u 2 + ，z n 2 + ，c d 2 + 及n i 2 十与b s a 结合 平衡【2 1 1 。认为z n 2 + 结合位置包括h i s 残基的咪畦基和一个相邻的羧基。1 9 7 9 年， l a k u s h 用电位滴定法和b c - n m r 研究结论支持r a o 的观点。g o u m a k o s 在19 9 1 年 用平衡透析和c - n m r 的方法研究了生理p h 下c d 2 + 及z n 2 + 与h s a 或d s a ( 狗血清 白蛋白) 的作用【2 2 】。s a d l e r 在1 9 9 6 年用c n m r 研究几种p h 下c d 2 + 血清白蛋白的作 用【2 3 1 。 国内进行金属离子与血清白蛋白相互作用的研究起步于8 0 年代初期【2 4 。北京 医科大学的王夔，陈保卫，李荣昌等用电位法，荧光分光光度法研究了c d 2 + 与牛血 清白蛋白的配位平衡和p h 效应 2 5 1 。长春应用化学研究所冯志样，张树功，倪嘉攒 等利用平衡透析法，紫外光谱法等多种手段对稀土与b s a 的结合进行了研究1 2 引。 南开大学周永洽课题组对溶液状态的血清白蛋白和金属离子的作用进行了多年 的研究 2 7 , 2 8 】。用紫外光谱，平衡透析等手段研究了c u 2 + ，z n “，n i 2 + ，c 0 2 + 等与h s a 或b s a 的相互作用。周永洽，胡绪英曾用紫外光谱法和平衡透析法研究了生理p h 条件下n i 2 + 与h s a 或b s a 的结合，有一系列的新奇效应，如滞后效应，减色效应 和别构效应等1 2 引。 广西师范大学生物无机化学研究所梁宏等一直从事有关血清自蛋白的研究。用 平衡透析结合非线性最4 , m 乘法拟合b j e r r l l r l 方程首次报道了c u 2 + ，m n 2 + ，p d 2 + 【3 ， c d 2 + 3 1 】，n i ，c o 与h s a 或b s a 结合的逐级稳定常数，强弱结合部位的数目， 强结合部位可能的位置以及可能参与配l m c t 位的原子。观察到n i 2 + 一血清白蛋白 体系的l m c t 谱带表明，其金属中心结构在低浓度时为四配位n i 2 n 4 0 四方锥结构， 高浓度时为四配位的n i 2 n 4 平面四方平面构型。用紫外光谱观察到n i 2 + 与h s a 或 4 第1 章绪论 b s a 相互作用有显著的滞后效应，用紫外二阶导数光谱研究了h s a 中芳香族氨基 酸残基微环境的变化。影响m n 2 + 与血清白蛋白的结合，在不同浓度时会由五配位的 四方锥构型向四配位的四方平面构型转化。紫外光谱、荧光光谱及平衡透析研究磷 钨杂多酸与h s a 或b s a 的结合平衡【3 2 1 ，同时也展开了两种至多种金属离子与血清 白蛋白组成的二元或多元体系的研究3 3 , 3 4 】，以及纳米二氧化钛【3 5 】、尼古丁【3 6 】与牛血 清白蛋白相互作用的光谱研究，以及血红蛋白与a g 、c d 瓢c d s e 纳米粒子相互作 用及其生物分析应用【3 7 】，运用紫外光谱结合荧光光谱和旋光能力，发现了c 0 2 + 与 h s a 或b s a 结合具有明显滞后效应，诱导白蛋白构象发生了缓慢的a b 转化p 8 1 。 河北师范大学生物无机化学研究所魏永巨【3 9 4 0 】，魏永巨用荧光光谱法和紫外光 谱法详细地研究了稀土离子与血清白蛋白之间的相互作用。湖南师范大学张友玉用 红外光谱法对白蛋白与有机分子进行了研究 4 1 , 4 2 】。张朝红等研究了紫外和圆二色光 谱法研究丁基锡化合物与牛血清白蛋白的相互作用【4 3 1 。 多年的研究表明：金属离子与血清白蛋白的结合一般有较少的强结合位点和较 多的弱结合位点数，其中强结合位点可以分为以下几类： 1 ) n 端三肽链( h s a 为a s p l _ a l a 2 _ h i s 3 ，b s a 为a s p l n l r z h i s 3 公认是c u 2 + 和 n i 2 + 的强结合位点通常金属离子与a s p l 的a - n h 2 和h i s 3 的咪唑基n 及2 个去质子 肽氮( 加上轴向的a s p l 的羧基) 配位，形成平面四边形( 四方锥) 构型，研究表明，第3 位的h i s 至关重要，当它突变成其他的氨基酸残基，如d s a 为g l u l a l a 2 耵，或者 在前面插入了一个氨基酸残基而变成第4 位，如c s a 为a s p i - a j a 2 g l u 3 - h i s 4 时，n 一 端三肽链就会失去对金属离子的强结合力，所以n 端三肽链能够结合金属离子的原 因应该是在于h i s 咪唑基n 的配位能力，还有三肽链的灵活易变，可以折叠围绕金 属离子形成所需的特定空间构型。 2 ) s i t e a 是z n 2 + ，c d 2 + 共有的强结合位点，可能位于血清白蛋白的内部，参与 配位的原子应是h i s l 0 5 ，h i s l 4 6 ，h i s 2 4 7 的咪唑基n 和a s p l 0 7 、a s p l 0 8 、a s p 2 4 9 中1 个 或1 个以上的羧基配体，构型可能为正四面体。 3 ) s i t e b 是c d 2 + 的第2 个强结合位点，可能位于a s p 和g l u 富集的圈环内( 1 0 0 p s ) ， 包括1 个h i s 咪唑基n 和3 个羧基o 。 4 ) s i t e c 是c d 2 + 的第3 个强结合位点，应全部是氧原子，推测r e 3 + ，c 矿，m 矿 及砧3 + 也结合在该位点上，这有待实验进一步证实。 5 ) c y s 3 4 是血清白蛋白中唯一有着自由巯基的残基，它被认为是某些含a u 和 p t 药物的强结合位点。7 对相邻的二硫桥处被认为是h 9 2 + 的结合位置。 6 ) 亲氧原子的金属离子如r e 3 + ，很有可能优先结合在血清白蛋白的 a s p s 6 - g l u 5 7 ，g l u l7 0 - a s p 17 1 ，a s p 3 6 2 a s p 3 6 3 和a s p 5 6 0 a s p 5 6 1 拐角处。 铅是一种严重危害人类健康的重金属元素，铅在体内的蓄积会影响到人的各类 5 河北科技大学硕士学位论文 器官和组织，如中枢神经系统、肾、血细胞和骨骼等蚓。目前，铅对人体的危害尤 其对青少年的危害正日益受到人们的重视。研究表明，在诸多对儿童产生威胁的有 害金属中，铅( p b ) 排在第一位，因而，研究铅在人体内的存在状态和转运具有非常 重要的意义。 1 4 研究方法简介 1 4 1 平衡透析法 平衡透析法是研究在生理条件下金属离子与血清白蛋白的相互作用，是将一定 浓度的血清白蛋白放入透析袋中，浸泡在已知浓度的金属离子溶液中，经过一定时 间，用原子吸收法测定平衡后透析袋外游离金属离子的浓度，进而计算出结合金属 离子的浓度，通过s c a t c h a r d 图求金属离子与血清白蛋白的结合位点和结合常数。 s c a t c h a r d 方法及b j e f r u l f i 方程的非线性最d , - 乘法拟合简介： s e a t c h a r d 方法【4 5 1 是处理生物大分子与金属离子相互作用的常用方法之一。 定义一函数n 。： 公式表示如下： i l c = 结合自蛋白的p b 2 + 浓度血清白蛋白总浓度 ( 1 1 ) n 一表示每摩尔血清白蛋白总浓度平均结合金属离子的数目 如果血清白蛋白上有几个p b 2 + 的结合位置，这些结合位置对p b 2 + 的亲和强 度几乎相同，而且在结合部位之间以及在被结合的离子之间无相互作用，可以 推导出如下方程： n d p b z + = n k 4 一n c k d ( 1 2 ) r l 为b s a 结合p b 2 + 的部位数，k d 为b s a p b 2 + 配合物的解离常数。以r p b 2 + 对r 作图，可求得结合部位数n 和结合常数k d 。 假设生物大分子p 与金属离子m 结合平衡表示为： 累积稳定常数： p + 即m m ，p k f - 尘唑 p 】 m 】 ( 1 3 ) ( 1 4 ) 溶液体系中金属离子的总浓度：t m = m + f 【m ，p 】 ( 1 - 5 ) 生物大分子浓度为：t - - p + e m , p 】 ，掌l 6 ( 1 6 ) 第1 章绪论 昕一背= 嚣 y i g p m i j ，一 lo = 生一 ( 1 7 ) 一 p + yi g p m j 二一o ，= l 用非线性最d x - - 乘法 4 6 , 4 7 】拟和b i e r r u m 方程，可得到金属离子与生物大分子 结合的逐级稳定常数。 1 4 2 紫外光谱法 紫外光谱法研究金属离子强结合位点的配位环境，当金属离子与蛋白质结 合时，蛋白质或其金属离子配合物吸收光谱的强度或谱带位置会发生变化。可 分为2 种情况：1 ) 蛋白质微扰的金属离子配合物的光谱变化：2 ) 金属离子微扰的 蛋白质光谱变化。通过对光谱的比较分析和计算，可以推断金属离子的配位环 境。 1 ) 蛋白质微扰的金属离子光谱变化【4 8 】 通常情况下，许多d 区过渡金属离子与血清白蛋白结合后，在紫外光区显示由 配体向金属离子中心的电荷转移谱带( l m c t ) ，摩尔吸光系数一般在1 0 3 ( l t o o l - i c m 。1 ) 以上，易于观察。由谱带的位置和数目可以推断配位原子及中心构型，并且由l m c t 谱带跃迁能近似公式求出光学电负性等参数。另外，在可见光区能产生较弱的配体 微扰的金属离子d - d 跃迁光谱，虽然试验需要较高的样品浓度，但此光谱也能给出 配位及构型方面的重要信息。 利用紫外光谱可以获得金属离子的核电转移跃迁光谱，在不同配位环境中，金 属离子的核电转移跃迁光谱是不同的，可以根据荷移能量公式进行定量计算： e ( l m c t ，c m q ) = 3 0 0 0 0 ( l ) 一x ( m ) + a o e + as p e ( 1 8 ) 注：e 核电转移跃迁的能量， x ( l 卜为配体的光学电负性， x ( m 卜为金属离子的光学电负性， o e 为能量校正项， s p e 为跃迁前后自旋电子成对能的变化。 根据计算结果推断金属离子的配位环境。 2 ) 金属离子微扰的蛋白质光谱变化 在金属离子的作用下，蛋白质2 7 8i l l t i 附近吸收峰的波长或强度可能发生变化， 由此可以推断生色基团微环境及蛋白质结构的变化。差光谱是研究生物大分子常用 的重要手段，以相同浓度的金属离子为参比的方法可称为金属离子微扰差光谱，即 7 河北科技人学硕士学位论文 测量改变金属离子的量所引起的蛋白质光谱变化。 1 5 本文研究内容及意义 致目前为止，铅、镉对人体的作用主要是毒性作用。铅、镉主要经消化道和呼 吸道侵入人体，也可以经皮肤和其它途径侵入。正常人体含铅1 0 0 一- - 2 0 0g 9 0 9 1 。超 过其含量将对人体健康造成很大影响。铅在体内的积聚会影响到中枢神经系统、血 细胞和肾1 5 0 , 5 1 】，可对造血系统产生影响表现为小红细胞、血红蛋白过少性贫血及轻 度溶血性贫血。表现为血红蛋白的减少，重症患者可出现面色苍白、心悸、气短、 乏力等。铅对神经系统也会产生很大影响，出现大脑水肿，相继出现惊厥、麻痹、 昏迷，甚至引起心、肺衰竭而死亡的现象。铅还可对肾脏系统产生一定的影响，急 性或慢性铅中毒均可影响肾的排泄机制。研究表明，在诸多对儿童产生威胁的有害 金属中，铅( p b ) 排在第一位。因而，研究铅与血清白蛋白的相互作用具有非常重要 的意义。 铅侵入人体后，人们一直认为p b 2 + 主要与红细胞内的血红蛋白相结合【5 2 , 5 3 , 5 4 】， 而关于p b 2 + 与血清白蛋白相互作用的文献报道很少，a y r a n c i 等人使用平衡透析方法 研究p b 2 + 与血清白蛋白的相互作用，研究结果显示铅在牛血清白蛋白上有四个强结 合位点【5 5 】，但是，在研究过程中，没有使用缓冲液恒定p h 和离子强度，而p h 和 离子强度可能会严重影响它们之间的相互作用；吴根华等人根据较为间接的荧光光 谱法研究结果推测，p b 2 + 在牛血清白蛋白上存在二个强结合位点【5 6 】，。与a y r a n c i 等 人的研究结果明显不同。因而，铅与血清白蛋白的相互作用明显有待于进行进一步 的深入研究。 镉( c d 2 + ) 的污染也相当普遍，且对人体毒性很大，即使在低浓度下也有可能 是致癌( 拘1 5 7 , 5 s 】。镉的毒性与镉的浓度及化学形态有关【5 9 1 。镉对机体功能的影响主要 有：对肾脏、骨质的损害、致癌；对肝、肺、睾丸的损伤。c d 2 + 在体内主要与白蛋 白相结合，c d 2 + 与白蛋白的相互作用已经有了较多的研究，但是，文献上关于镉在 白蛋白上的结合位点及镉的配位环境的报道相互矛盾，因此对镉与血清白蛋白相互 作用的研究也有其重要意义。 8 第2 章p b 2 + 与牛血清白蛋白的结合平衡研究 第2 章p b 2 + 与牛血清白蛋白的结合平衡研究 用平衡透析和差示吸收光谱法详细研究了p b 2 + 与牛血清白蛋白( b s a ) 的相互 作用。平衡透析研究结果表明p b 2 * 与b s a 的相互作用明显受到缓冲溶液p h 影响， 在p h 6 3 和p h 5 4 ，p b 2 + 在b s a 上的强结合位点数分别是1 6 和o 8 个，弱结合位点 数分别为6 5 和4 个，通过非线性最d , - 乘法拟合s j e r r u i i l 方程，首次报道了 p b 2 + - b s a 体系的逐级稳定常数值，h i l l 系数表明p b 2 + 与b s a 的结合具有负协同效 应。使用差示吸收光谱法研究1 ：1p b 2 + b s a 体系的电荷转移谱带，发现组氨酸咪唑 基是p b 2 + 在白蛋白中的优先配位基团。进一步根据z n 2 + ，c u 2 + 或c a 2 + 与p b 2 + 竞争 结合b s a 上的强结合位点，推断p b 2 + 在牛血清白蛋白中优先结合位点是位点s i t e a 。 2 1实验部分 2 1 1主要试剂 b s a ，电泳纯，购自北京华美生物工程公司，电泳纯，用前未经迸一步纯化； p b ( n 0 3 ) 2 为优级纯，天津市标准科技有限公司；p h 缓冲剂，天津市标准科技有限公 司；三羟甲基氨基甲烷( h s ) ，生化试剂，天津市光复精细化工研究所；以下试剂 均为分析纯，n a c l ，天津市化学试剂一厂；h c i ，石家庄市华迪化工工贸有限公司； 乙二胺四乙酸二钠( e d t a ) ，上海化学试剂厂；n a h c 0 3 ，开原化学试剂厂；z n ( n 0 3 ) 2 ， 天津市化学试剂三厂；c u c l 2 ，北京红星化工厂；c a c l 6 6 h 2 0 ，天津市福晨化学试剂 厂。 2 1 2 分析仪器 2 5 0 b 生化培养箱，江苏金坛新一佳仪器厂； a a 6 8 0 0 型原子吸收分光光度仪，日本岛津( s h i m a d z u ) 公司； u y 2 5 5 0 型紫外光谱仪，日本岛津s h i m a d z u 公司： a b 2 0 4 。n 电子天平，m e t t l e r - t o l e d o 臼o u ： s y z 1 3 5 型石英亚沸高纯水蒸馏器，江苏金坛市晶玻实验仪器厂： p h s 3 c 酸度计，上海雷磁仪器厂； h y - 2 调速多用震荡器，江苏医疗仪器厂； 2 1 3 透析袋的处理 1 ) 新的透析袋6 用去离子水浸泡两天，用玻棒撑开后，用去离子水煮沸约l o m i n ，使之定型。 9 河北科技大学硕士学位论文 2 ) 将透析袋取出冲洗干净后，注入5 的n a h c 0 3 ，并用5 的n a h c 0 3 煮沸约 1 5m i n ，冷却。 3 ) 将透析袋取出冲洗干净后，注入o 0 5m o l l 嵋的e d t a ( e d t a 用n a o h 调至 p h = 7 0 ) ，并在e d t a 溶液中煮沸约1 5m i n ，冷却。 4 ) 取出透析袋，用去离子水冲洗干净，并放入去离子水中浸泡一天，备用。 注意：不要用手取直接触摸透析袋，以防污染。 2 1 4 主要实验方法 所有溶液都用二次水配制，均含有o 1 0 t o o l l n a c l ，并用o 1m 0 1 l t r i s 。h c l 缓冲剂以保持相同的离子强度和p h = 6 3 ( 士0 0 2 ) ，p h 在p h s 3 c 精密酸度计上测定。 p b ( n 0 3 h 溶液的浓度用e d t a 标定，b s a 使用前新鲜配制，浓度均用光度法在 u v 2 5 5 0 型紫外光谱仪测定，浓度按在2 7 8n m 处( 1m g m l _ 1 ，1c m 光程