（食品科学专业论文）βCD及其衍生物与天然抗氧化剂杨梅素的包合作用研究.pdf

摘要 杨梅素为天然多酚羟基黄酮醇类化合物，具有多种生理活性，来源广泛。目前对它的 研究主要为药理方面，为了真正实现物尽其用，尤其是发挥它在食品领域的抗氧化、防腐 等功效或开发为保健食品都极具研究价值。但由于杨梅素的溶解度低，耐碱性、抗光解能 力差、味苦等缺陷为其应用带来很大局限性。所以，亟待寻求一些有效手段解决这些问题。 因此，进一步改善杨梅素的溶解性、提高其抗氧化性能力及稳定性是非常必要的。 课题对杨梅素的研究包括以下四方面： ，( 1 ) 用荧光光谱法研究了1 3 环糊精及其衍生物与杨梅素的包合作用。结果表明：包 合作用使杨梅素的激发波长红移，荧光强度增强。环糊精与杨梅素生成了摩尔比均为1 ：1 的包结物，包结能力依次为：羟丙基1 3 环糊精 羟乙基1 3 环糊精 甲基1 3 环糊精 1 3 一 环糊精。从热力学角度探讨了影响包结过程的因素，说明包结是自发进行的放热过程，包 结的驱动力主要来自分子内识别的焓变。 ( 2 ) 以红外吸收光谱为检测手段考察羟丙基b 环糊精对杨梅素的包结作用，进一步 证明了羟丙基1 3 。环糊精与杨梅素反应生成了包结物。根据标准曲线测得包结物中杨梅素 的包结量为4 2 0 8 m g g 包结物。 ( 3 ) 以氯酸钾为氧化剂的实验证明包结作用增强了杨梅素的抗氧化能力；铁氰化钾 法证明包结作用提高了杨梅素的还原能力；在油脂自动氧化体系中，包结作用也增强了杨 梅素抑制脂质过氧化的能力；但由于包结作用隐藏了部分具有清除羟基自由基能力的酚羟 基，降低了包结物清除羟基自由基的能力。 ( 4 ) 杨梅素的耐光性差，被羟丙基1 3 环糊精包结后大大增强了其抗光解的能力；短 时间内极性环境下金属离子c 、n a + 、m 9 2 + 、n i - - 1 4 + 、c e + 对杨梅素的稳定性均无显著影响， 而f e 3 + 、a l 3 + 、c u 2 + 则会对杨梅素的稳定性产生破坏性作，提取和应用时应避免接触。 关键词：杨梅素；环糊精：荧光光谱；抗氧化；清除自由基 a b s t r a c t m y r i c e t i n ( m y r ) b e l o n g st oal a r g eg r o u po fn a t u r a l l yf l a v o n o lc o m p o u n d s i th a sm a n y p h y s i o l o g i c a la c t i v i t i e s ，a n di t ss o u r c ei sb r o a d n o wt h er e s e a r c hf o c u s i n go nm ) ，ri sa b o u t p h a r m a c o l o g i c a la s p e c t i ta l s oc a nb eu s e da sn a t u r a la n t i o x i d a n ta n df o o dp r e s e r v a t i v ei nf o o d i n d u s t r yo rb ed e v e l o p e dh e a l t hf o o d h o w e v e r , s i n c es u c ha p p l i c a t i o n sa r eo f t e nl i m i t e db yi t s p o o rw a t e rs o l u b i l i t y , i n s t a b i l i t yt ol i g h ta n da l k a l i ，b i t t e rt a s t ea n do t h e rl i m i t a t i o n ，t h e ni ti sv e r y n e c e s s a r y t os e a r c hag o o dm e t h o dt om e n dt h e s eu n f a v o r a b l ep h y s i c o c h e m i c a lp r o p e r t i e s t h er e s e a r c h e sa b o u tm y ri nt h i st h e s i si n c l u d e df o u ra s p e c t s ： ( 1 ) t h er e s e a r c h e sa b o u tt h ec o m p l e x a t i o nr e a c t i o no fm y rw i t h1 3 - c y c l o d e x t r i n ( b - c d ) a n di t sd e r i v a t i v e s ( m o n o 2 - o - ( 2 一h y d r o x y p r o p y l ) 一d c d ( h p p c d ) ，m o n o 2 一o 一( 2 - h y d r o x y e t h y 1 ) 】一p - c d ( h e - p - c d ) ，a n dh e p t a k i s ( 2 ，6 一d i - m e t h y l ) 一1 3 - c d m - p - c d ) ) u s i n gf l u o r o s p e c t r o m e t r y s p e c t r a r e s u l ts h o w st h a tt h ec o m p l e x a t i o nb e t w e e nm y ra n dc y c l o d e x t r i n s ( c d s ) c o u l dc a u s e t h ef l u o r e s c e n c ee n h a n c e m e n t ，a n dt h em a x i m u me x c i t a t i o nw a v e l e n g t hs l i g h t l ys h i f t e dt o s h o r t e rw a v e l e n g t h t h es t o i c h i o m e t r yr a t i ow a sf o u n dt ob e1 ：1 ，a n df l u o r e s c e n c ee n h a n c e m e n t o fc d sf o l l o w e dt h eo r d e r ：h p p c d h e - p c d d m d c d 1 3 一c d t h ee f f e c to ft e m p e r a t u r e o nt h ef o r m a t i o no fh p - f l - c d m ) ，ri n c l u s i o nc o m p l e xw a sa l s ob e e ne x a m i n e d t h e t h e r m o d y n a m i cm e a s u r e m e n t ss u g g e s tt h a tt h ei n c l u s i v ep r o c e s sw a sa ne x o t h e r m i cr e a c t i o na n d e n t h a l p i cf a v o u r ( 2 ) f o r m a t i o nw a s a l s oe v a l u a t e db yc o m p a r i n gt h ei n f r a r e ds p e c t r ao ft h es o l i dc o m p l e x e s w i t has i m p l ep h y s i c a lm i x t u r ec o n t a i n i n gt h es a m ea m o u n to fm y r e x p e r i m e n t sp r o v i d e dd a t a i n d i c a t i n gt h ef o r m a t i o no fh p 一3 - c d m y rc o m p l e x e s t h ec o n t e n to fm y ri nt h em i c m c a p s u l e s w a s4 3 8m g gh p f l - c d - m y r ( 3 ) a n t i o x i d a n ta c t i v i t yo fm ) rw a se n h a n c e db yf o r m a t i o nw i t hh p f l - c di n a c i d i c p o t a s s i u mc h l o r a t es o l u t i o n t h em e a s u r e m e n t so fr e d u c t i v ea b i l i t yw a si n v e s t i g a t e df r o mt h e f e 3 + 一f e 2 + t r a n s f o r m a t i o n , r e s u l ts h o w st h a tc o m p l e x a t i o nw i t hh p b - c di m p r o v e dt h e r e d u c t i v ec a p a b i l i t yo fm y r t h ea n t i o x i d a n ta c t i v i t yo fm y ra n dh p 一3 - c d m ) ，ri nl i n o l e i ca c i d s y s t e mw a sa l s oi n v e s t i g a t e d t h ec o m p l e x e ss h o w e dah i g h e ra n t i o x i d a n ta c t i v i t yt h e nm m l o w e rh y d r o x y lf r e er a d i c a ls c a v e n g i n ge f f i c a c yo fh p 一3 - c d m y rm i g h tb ec o n t r i b u t i v et o s o m eh y d r o x yg r o u p so fm y ri n s e r t si n t ot h ec a v i t yo fc d s ( 4 ) r e s e a r c hf o u n dt h a tt h eh p 一3 - c d m y r w a sm o r es t a b l et ol i g h tt h a nm y r d u r i n gs h o r t s t o r a g et i m ei nm e t h a n o ls o l u t i o n ，t h em e t a li o nn a m e l yk + 、n a + 、m 9 2 + , n i - 1 4 、a n dc a 2 + h a d n o tn o t a b l ee f f e c to nm y rs t a b i l i t y b u tt h em e t a li o nn a m e l ya l 3 + 、f e 3 + 、a n dc u 2 + d e s t r o y i n g d e s t r o yi t ss t a b i l i t ys h o u l db ea v o i d e d k e y w o r d s ：m y r i c e t i n ；c y c l o d e x t r i n ；f l u o r o s p e c t r o m e t r ys p e c t r a ；a n t i o x i d a n t ；f r e er a d i c a l s c a v e n g i n g 发表论文及学位论文使用授权声明 发表论文及学位论文使用授权声明 一、已发表论文： 1 】王晓云，姜子涛天然抗氧剂二氢杨梅素研究进展 j 】食品研究与开发，2 0 0 7 ，2 8 ( 2 ) ： 1 8 5 - 1 8 8 2 】王晓云，姜子涛，李荣环糊精及其衍生物与天然抗氧化剂杨梅素的包合作用研究 j 食品科学，2 0 0 8 ，2 9 ( 5 ) ：1 2 5 1 2 8 二、学位论文使用授权声明： 学位论文作者同意授权天津商业大学将论文的全部内容或部分内容编入有关数据 库进行检索，并采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编以供查阅或借阅。同意学校 向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘。 4 7 工) 酶岛 2 0 - o 宫o y 第一章前言 第一章前言 1 1 引言 “民以食为天，食以安为先 食品添加剂的安全问题已经成为人们选择食品的重要 因素，安全无毒或基本无毒的天然食品添加剂越来越受到消费者青睐。由于多起合成添加 剂造成的中毒事件发生，使食品消费者对合成添加剂抱有排斥态度。尽管各国政府机构和 学术界对现行食品添加剂品种进行了严格、细致的毒理学研究和评价，制定了相应的法规 和详细的使用标准，来保证消费者的食用安全，但出于对健康的关注，消费者更崇尚以天 然动植物为原料，经加工获得的天然食品添加剂如天然色素、香料、抗氧化剂等成为目前 研究开发的重点。 食品抗氧化剂是一种重要的食品添加剂，它不但可以阻止或延缓食品中的油脂自动氧 化，延长食品的货架寿命期，而且能防止食品因氧化造成的营养损失、褐变和褪色等，从 而保证食品工业生产的最大利润和人民群众的身心健康。长期以来，食品工业主要使用人 工合成的抗氧化剂，如p g 和t b h q 等，但由于人工合成的抗氧化剂具有一定的毒副作用， 有害于人们的身体健康，国外不少发达国家已经明令禁止在食品或部分食品中使用人工合 成抗氧化剂。尽管我国目前对此没有明文禁止，但对其使用量也进行了严格的限制，尤其 是我国加入了w t o ，食品行业不得不与国际接轨，可以预测，在不久的将来，我国亦会 禁止人工合成抗氧化剂在食品中的添加和应用。因此，寻找高效、安全、经济的天然抗氧 化物质己成为食品领域的一个热点。 目前国内外在天然抗氧化剂的研究开发领域主要涉及茶多酚、抗坏血酸( v c ) 、天然q 一生育酚( v e ) 、类黑精类( 氨基化合物和羰基化合物加热后的产物) 、红辣椒提取物、香辛 料提取物、糖醇类、黄酮类抗氧化剂等。其中茶多酚已作为抗氧化剂列入食品添加剂的使 用名单，其具有较强的抗氧化活性。由于黄酮类物质在自然界中广泛存在，具有多种生物 学活性，已成为了研究热点之一。 1 2 杨梅素的国内外研究概况 1 2 1m y r l 驹分布及含量测定 杨梅素( m y r i c e t i n ，m y r ) 又叫杨梅树皮素，是一种天然多酚羟基黄酮醇类化合物，目 前对其提取方法及各种药理学功能已取得一定的研究进展，研究发现其具有良好的抗氧化 第一章前言 能力，因此有望作为一种新型天然抗氧化剂在食品领域得到广泛应用。 m y r a _ 我国主要存在于杨梅属植物的树皮和树叶中，葡萄科植物尤其是蛇葡萄属植物 中的茎叶中、文冠木、绿茶及一些中药材中也有发现【2 1 。杨梅( m y r i a dr u b r i cb i b e ts u c k ) 是原产中国的亚热带果树之一，野生种生长史已有7 0 0 0 多年，人工栽培已有2 0 0 0 多年。我国 产杨梅属( m y r i a dl ) 植物约5 种，主要分布于江苏、浙江、江西、福建、湖南、广西、广 东和台湾等省区，日本、朝鲜也有分布。张莉静【2 】以浙江省宁波慈溪市的杨梅树叶、枝皮、 茎皮及不同生长时间茎皮为原料，用甲醇索氏回流法提取，高效液相色谱法测定m y r 的含 量，发现8 年生杨梅茎皮中m y r 含量高，为正确选用提取m y r 的原料提供了理论依据。蛇葡 萄植物在我国的广东、广西、云南、湖南、湖北及江西等省区有广泛地分布，这类植物的 幼嫩茎叶中也含有少量杨梅素，含量更多的是与其性质极为相似的二氢杨梅素。国内对二 氢杨梅素的提取鉴定方法、化学性质、尤其是在作为食品抗氧化剂和防腐剂使用时的稳定 性做了大量研究，从而为本课题对m ”的研究有很大帮助【1 3 】。 m y r 的测定方法主要有光度法和色谱法，其中高效液相色谱法( h p l c ) 是最有效的方 法。李桂荣【1 4 】等利用反相高效液相色谱法( r p - h p l c ) 分析杨梅叶中的黄酮成分，r p c 1 8 柱 为固定相，甲醇一水一甲酸为流动相，辅之以二极管阵列u v 检测技术，以蒽为内标测定了杨梅 叶中m y r 的含量。这种传统的液相色谱法缺陷是样品前处理时需用有机溶剂对其进行脱脂 处理，操作较麻烦，且会造成m y r a 分损失。近年来固相萃取技术已在分析化学样品前处理 中得到广泛应用。董学畅等【1 5 】在此基础上，研究了用固相萃取预分离，如? l c 测定杨梅树叶 和树皮q b m y r 的方法。用9 0 1 手i 醇加热回流提取，提取液用w a t e r s s e p p a k c l 8 固相萃取小柱预 分离脱脂，以w a t e r sn o v a2 p a k 2 c 1 8 ( 3 9m mx 1 5 0m m ，5a m ) 为色谱柱，0 0 5m o l 嘴酸二氢 钾缓冲溶液和甲醇为流动相，在该色谱条件下，主要的m y r 达到基线分离；用紫外二极管矩 阵检测器检测，作了色谱峰纯度分辨并用紫外光谱图作了辅助定性。回收率为9 5 - - - 1 0 2 ， 相对标准偏差为1 5 也2 。该方法简便快速，结果可靠，为杨梅中m y r 的研究测定提供了方 法。何桂霞【1 6 】等利用薄层扫描法对藤茶中m y r 的含量进行了测定，用硅胶g c m c - n a 做薄 层板，以甲苯：乙酸乙酯：甲酸为展开剂，三氯化铁为显色剂，测得藤茶中杨梅素的含量 为1 7 2 0 o - - - 1 7 8 。该方法虽不如h p l c 法灵敏、准确，但操作简便，费用低。 1 2 2m v r 的结构及理化性质 m v r 在其a 环的5 、7 位，b 环的3 ，47 ，5 位，c 环的3 位共有6 个羟基取代基团，是目前 发现的黄酮醇类化合物中含有羟基取代基较多的一种。其物理性状为黄色针状结晶，分解 点3 2 4 。c - 3 2 6 。c 。溶于甲醇、乙醇、丙酮、微溶于水，难溶于氯仿、石油醚。盐酸镁粉反 2 第一章前言 应呈玫瑰红色，三氯化铁反应呈紫黑色，与三氯化铝反应呈强黄绿色荧光，q 一萘酚反应 阴性，和锆盐一柠檬酸反应出现黄色且不褪色。u v m a a x m e o h 在3 7 6 5i n ( 带i ) ，2 5 4 姗( 带 i i ) 。i r l r n a x k b r c m 1 ：3 3 5 0 ( o h ) ，1 6 4 8 ( c = o ) b 2 , 1 7 1 。 o h h 0 0 h o h 0 h o 图l 一1m y r 的结构 f i g 1 1s 仃u c t u r eo fm y r m o l e c u l e 1 2 3m ) ，r 的药理作用研究现状 ( 1 ) 血小板活化因子( p a f ) 的拮抗作用 陈文梅等【7 】以比浊法测定家兔洗涤血小板( w r p ) 聚集，邻苯二甲醛( o p t ) 荧光法测定 5 - h t 浓度，f u r a - 2 荧光探针测定血小板内游离钙离子浓度。观察m y r 足j f i n d , 板激活因子( p a i l ) 诱导的兔洗涤血小板聚集、5 - h t 释放及血小板内游离钙离子浓度升高的影响。结果表明一 m y r 体外呈浓度依赖性地抑制p a f 诱发的w r p 聚集及5 h t 释放。m y r 抑制w i 心聚集的i c s o 为1 7 5 # m o l l ；抑制5 一h t 释放的i c 5 0 为“1 a n o l 。同时m y r 能明显抑制到心引起的血小板 内游离钙增高。臧宝霞等【1 8 】在此基础上进一步研究t m y r 对p a f 的拮抗作用以及m y r 抑制 p a f 与兔血小板受体特异性结合的作用，试图从细胞及分子水平阐明m y r 抗p a f 作用的机 理。以放射配体结合试验观察 3 h p a f - 与家兔血小板受体特异性结合的作用；以分光光度法 测定p a f 诱发血小板黏附的强度；以f u r a - 2 荧光分光光度法测定兔多形核白细胞( p m n s ) i 为 钙离子浓度。结果表明t m y r 具有抗p a f 作用，为一新的r 虹受体拮抗剂。因此m y r 具有抗 血栓、抗心肌缺血、改善微循环等多方面的心血管药理作用，有望将其开发为活血化瘀类 药物。 ( 2 ) 抑制淋巴细胞的活化增殖反应 俞渝1 9 1 等利用荧光标记的单克隆抗体双染技术，流式细胞仪检测m y r 对小鼠c d 3 + t 细 胞c d 6 9 表达的影响；采用3 h t d r 渗入法检测m y r 对淋巴细胞增殖的影响；采用半定量 r t - p c r 技术从m r n a 水平检测m y r 对i l 2 m r n a 表达的影响；采用e l i s p o t 检i 煲! m y r 对 i f n - - y 分泌的影响。结果发现m ) ，r 能抑制t 细胞早期活化标志c d 6 9 的表达，并能抑制淋巴 细胞增殖反应，同时对淋巴细胞活化后i l 2 m r n a 的表达及硎y 的分泌也有抑制作用。 因此有望将其开发为一种免疫调节药物。 第一章前言 ( 3 ) 降血糖作用 y o s h i k a w am 等【2 0 1 ，在研究抗糖尿病机理药物的机理时发现，m y r 对高血糖小鼠有降血 糖的作用。钟正贤等【2 1 】采用四氧嘧啶所致糖尿病模型、肾上腺素和葡萄糖引起的高血糖小 鼠模型，以及正常小鼠，在口服给药后，测定各模型小鼠的血糖水平。结果发现m y r s 对四氧 嘧啶所致糖尿病小鼠和肾上腺素、葡萄糖引起的高血糖小鼠均有明显的降血糖作用，治疗 效果良好，但对正常小鼠血糖无明显影响。此外，他们在进一步的研究中，发现m y r 对多种 动物模型均具有较好的降血糖作用，可望开发出降血糖药物或者作为糖尿病患者食品添加 剂使用。 ( 4 ) 抗氧化作用 邹耀洪【2 2 】通过从杨梅果核中提取分离到的杨梅素，采用r a n c i m a t 法测定其抗氧化性能， 结果表明其对油脂是优良的抗氧化剂，作用明显强于合成抗氧化齐t j b h t ，可作为天然抗氧 化剂应用于油脂较高的食品保藏上。 ( 5 ) 保肝护肝及解轻度乙醇中毒作用 钟正贤等【2 3 1 采用四氯化碳、d 一半乳糖胺和异硫氰酸萘酯致小鼠急性肝损伤模型，观察 m y r 对肝损伤的保护作用；采用小鼠单核巨噬细胞吞噬和免疫低下小鼠和溶血素试验，观 察m y r 的免疫增强作用。结果证实t m y r 能明显降低四氯化碳、d 一半乳糖胺和异硫氰酸萘 酯致小鼠急性肝损伤模型血清中a l t 、a s t 活性和t - b i l 含量，减轻肝组织的变性和坏死； 并提高单核巨噬细胞吞噬功能和溶血素含量。说明 m y r 具有保肝降酶退黄，增强小鼠非 特异免疫功能和免疫功能低下小鼠体液免疫功能，因而起到保肝作用，为m ) ，r 的临床应用 提供了参考。 浙江民间历来就有用杨梅泡酒的传统，杨梅酒入口绵甜，而且不易醉人。h a s e _ k 1 2 4 等人在进行解除酒精中毒剂实验中发现，用从h d u l c i s q 了提取的m y r 具有解除酒精中毒的效 果，之后在进行机理研究时发现，m y r 能减轻乙醇中毒的原理主要是保护肝脏，减轻乙醇 对肝脏的损伤。 目前，美国f d a 已将m y r 广泛应用于医药、食品、保健品和化妆品。美国保健品药f y i 将m y r 作为添加剂用作治疗、预防关节炎和各种炎症，尤其对妊娠及哺乳期妇女和婴儿更 加适合，由此m y r 有望进一步开发为特殊人群的消炎用药，从而减轻西药抗生素对人体的 毒副作用。宁波有相关药厂已经开始对杨梅进行初步开发和应用。 综上所述，m y r 除具有上述已经验证的药理作用外，还具有抗炎、抗肿瘤、抗突变、 预防龋齿、抗氧化性、消除体内自由基等多种药理活性。在当今推崇绿色和天然产物的时 4 第一章前言 代，鉴于我国在富含m y r 的原料资源上的优势，我们应尽快展开对m y r 的综合研究及开发利 用。 1 3 环糊精的研究现状 环糊精( c y c l o d e x t r i n ，c d s ) 是由环糊精葡萄糖转移酶作用于淀粉所产生的组环状 糊精；由若干个葡萄糖单元以僻1 ，4 糖苷键相结合成互为椅式构象的环状低聚物，整个分子 成锥柱或截项圆锥状花环2 5 1 。含有6 、7 和8 个吡喃葡萄糖单元的环糊精分别叫做a 、p 、和7 环糊精【2 6 】。其结构图如下所示： 图1 - 2 三种环糊糈结构图 f i g 1 - 2t h es t r u c t u r eo fc d sm o l e c u l e c d s 的空腔内排列着配糖氧桥原子，氧原子的非键合电子对指向中心，使空腔内具有 很高的电子云密度，吡喃葡萄糖环c 3 ，c 5 氢原子位于空腔内并覆盖了配糖氧原子，使空 腔内成为疏水空间。而其外部则因为葡萄糖羟基的作用而具有高度的亲水性。c d s 这种特 殊的非极性疏水空腔使它能与一些极性、大小、形状及性质相匹配的客体分子或某些客体 分子的疏水性基团发生包结形成稳定的超分子包合物，并改变客体的物理化学性质。c d s 由于其特殊的分子结构和对某些物质的包结性能，使它在理论研究、化工、农业、食品及 医药等领域有着广阔的应用前景，因而受到人们极大的关注【2 7 捌】。 由于疏水区域及催化活性有限，c d s 在应用上受到一定限制，化学修饰可以很好的弥 j f c d s 本身的不足，由此得到的c d s 衍生物具有更好的包合选择性和更高的化学活性。所 谓修饰就是将c d s 的一级或二级羟基( o h ) 中的一个或两个甚至全部，通过化学反应生成醚 基或酯基等，或进一步转化成其它官能团【3 2 】。在众多的c d s 衍生物中甲基一1 3 一环糊精 ( d m 一零c d ) 和羟丙基一b 一环糊精( h p b - c d ) 被认为是最常用的环糊精衍生物之一。d m f l - c d 是伊c d 羟基的氢原子被甲基取代的产物。h p 一伊c d 是f l - c d 与l ，2 环氧丙烷缩合而成的亲 气 第一章前言 水性衍生物，通过对p c d 的羟丙基化，破坏其分子内氢键，使其水溶性显著提高。b ，c d 的水溶性在室温下约为1 8 5 ( w v ) ，而h p 1 3 c d , 贝u 易溶于水，室温下溶解度 5 0 ( w v ) ， 甚至可以高达7 5 ( w v ) 以上。l i p 1 3 c d 被认为是最有用的c d s 之一，是美国f d a 批准的第 一个可供静脉注射的b c d 衍生物。 1 3 1 伊c d 及其衍生物超分子包合物的研究进展 分子化学是在共价键的基础上建立起来的，而超分子化学是在非共价键分子间作用力 的基础上建立起来的，其目标是控制分子间价键。该论文主要研究b c d 及其衍生物- 与m y r 所形成的超分子包合物。超分子代表了继基本粒子、原子核、原子和分子之后的下一层次 的物质的复杂性。分子间的相互作用形成了各种化学、物理和生物中的高选择性的识别、 变换和易位过程，而这些过程正是在分子匹配的条件下，通过分子间非共价键力的作用， 缔合而成的具有某种特定功能和性质的超分子。对超分子的研究具有重要意义，因为生物 机体的许多复杂结构及其变化都离不开这种弱相互作用，例如底物与蛋白质的作用，酶的 催化过程，遗传密码的复制、翻译、转录以及抗体与抗原的缔合作用掣3 3 1 。 1 3 2c d s 与客体分子的包结反应 能够形成包结物是c d s 最重要的性质之一，在包结物中，被包结的化合物分子常被称为 “客体 ，c d s 分子被称为“主体”。包结物能否形成受内在因素和外在条件的共同影响。 内在因素取决于c d s 和其客体的基本性质，包括：主客体之间的疏水亲酯相互作用、 主客体尺寸之间符合空间匹配效应、氢键的形成与高能水的释放，这四个因素不但影响着 c d s 包结物能否形成，而且还直接影响着包结物的稳定性。即包结物的稳定性也取决于客 体分子基团的性质、空腔尺寸、分子大小及空间构型等。另外，包结物的形成还受反应时 间、反应温度、搅拌( 或超声波震荡) 时间、反应物浓度等外在条件的影响。一般延长反应 时间、搅拌时间、提高c d s 浓度有利于包结物的形成。主客体包结物的形成过程可用下图 表示： + 相互作用 - _ _ - _ l - c d s客体分子包结物 图l ，3c d s 与客体分子包结过程示意图 f i g 1 3c o m p l e x a t i o nr e a c t i o n so fc d sw i t h “g u e s t ”m o l e c u l e 6 第一章前言 o o o 0 o o o o o o oo o o o o c c 0 o o o 图1 _ 4 客体分子取代c d s 高能水示意图 f i g 1 - 4e x t r u s i o no f h i g he n e r g yw a t e rm o l e c u l e sf r o mt h ec a v i t i e so f c d s 为了表征c d s 与客体分子之间结合力的强弱，对包结平衡做出定量的描述及包结反 应的难易程度，就需要测定包结反应的平衡常数、吉布斯自由能、熵变、焓变等热力学常 数。平衡常数k 的测定方法通常有：紫外可见光谱法、核磁共振法、荧光法、相溶解度 法、电化学法、表面张力法及竞争法等。他们各有其优缺点和使用范耐2 5 3 4 1 。在原理上都 是研究包结反应时发生的某些物理或化学性质的变化，如摩尔吸光系数、溶解度、原子的 化学位移和化学反应活性等。 紫外可见光谱法是测定k 的常用方法。其原理是有机客体分子被c d s 包结后，c d s 空腔内的高密度电子云会诱导客体分子的电子发生移动，从而影响有机客体分子的 u v 二s 光谱的变化。影响可以分为两种类型【2 5 】：客体的最大吸收波长没有位移，吸光 度随c d s 浓度的增加呈规律性的增强或减弱；不仅吸光度发生变化，最大波长也有位 移。依据u v - v i s 差光谱h i l d e b r a n d b e n e s i 方程可以计算出客体与c d s 的结合平衡常数。 当客体分子不含发色团或者摩尔吸光系数很小，被c d s 包结后不会影响其吸收光谱时， 可以使用探针来研究这类客体分子与c d s 的包结作用，最为常用的探针有甲基橙和酚酞 ( p p ) 等【3 s 】。简单的u v - v i s 光谱测得的是平衡状态下游离主体或客体和包结物光谱的加 和。随着物理技术的不断发展，配备程序控制单元的分光光度计已能方便、快捷地测定差 谱和导数光谱，对于定量测定包结前后吸光度和波谱峰的变化不大的体系是一个有效的方 法。特别是研究发色团修饰的c d s 识别客体时发生的构象变化，能获得有用的数据。 1 3 3 包结物的制备及表征方法 1 3 3 。1 包结物的制备方法 不同的包结物制备方法，其工艺条件，操作流程存在着或大或小的差别，溶剂选择、 反应温度、用料比例、作用时间等各种因素均对包结物的制备有影响，具体包结物制备的 7 第一章前言 最佳工艺条件有赖于实验探索。通常采用的正交优选设计、均匀设计等先进的实验设计方 法，都能帮助我们较为科学迅速地找出最佳工艺条件。目前通常采用的方法有【3 6 】： ( 1 ) 饱和溶液法 饱和溶液法也称为重结晶或沉淀法，先将c d s $ 1 j 成饱和水溶液，在加入客体，对于水 不溶性客体，可先溶于少量有机溶剂，再注入c d s 饱和水溶液，搅拌直到生成包结物为止。 用适当方式( 如冷藏、浓缩、加沉淀剂等) 使包结物析出，再将得到的固体包结物过滤、洗 涤、干燥即可。 ( 2 ) 超声波法 向c d s 饱和水溶液中加入客体分子，混合后立即用超声波破碎仪或超声波清洗机， 选择合适强度，超声波震荡处理适当时间，以代替搅拌力，将析出的沉淀如饱和溶液法处 理得包结物。此法简便、快捷。 ( 3 ) 研磨法 取c d s ) j i 入水研匀，加入客体分子( 水难溶性者，先溶于少量有机溶剂中) ，置研磨机 中混合研磨成糊状，低温干燥后用适当溶剂洗净干燥即得。 ( 4 ) 浆状法 即c d s 和客体分子不需要溶解，只是在室温条件下通过剧烈搅拌，将它们悬浮于少量 水中。若使用超声波，可促进固相的分散。通常c d s ：h 2 0 为1 ：2 ，在2 c 左右搅拌悬浮液。 客体物质溶于适当的溶剂中后，加入到搅拌好的c d 悬浮液中或将客体物质直接加入至u c d s 悬浮液中。反应混合物在轻油中搅拌4 h - 8 h ，在重油中搅拌1 d 一3 d 。 ( 5 ) 揉捏法 此法的特点是所需的水比浆状法更少。c d s 先与少量的水揉捏混合，然后将计算好配 比的客体分子直接加入，不需要任何溶剂。因为从能量上讲，含原始水的c d s 包结物不如 c d s 与客体包结物有利，c d s 空腔内的水分子需要被客体取代，除此之外，包合物的晶体 结构也发生了变化。由于晶体结构不同，在母体c d s 表面形成的包结物的分子层将从晶体 中溶解，这样一来，c d s 的晶体迅速变得无序，转变成c d s 包结物，水则从膏状的产物中 在空气流中挥发或通过其它干燥方法除去。 ( 6 ) 冷冻干燥法 易溶于水的c d s 包结物，不易结晶沉淀，或在加热干燥时易分解、变色的包结物，可 用冷冻干燥法午燥。冷冻干燥法使包合物外形疏松，溶解性能好，可制成粉针剂。 ( 7 ) 喷雾干燥法 g 第一章前言 如制得的包结物易溶于水，遇热性质稳定，可用喷雾干燥法制备，干燥温度高，受热 时间短，产率较高。 1 3 3 2 包结物的表征方法 人们采用多种手段来研究c d s 与客体分子形成与否，并进而获得有关包结物的性质及 包结常数等大量数据。客体分子进人空腔后，实际上受到一个非极性场的束缚，理化性质 会发生明显变化。仪器检测包结物的原理是利用包结物在形成过程中产生若干物理化学性 质变化，如光学性质、热力学、电化学、溶解度等性质。研究c d s 包结物常在固态和液态 两种状态下进行。用于检测固态包结物形成的手段有很多，例如x 射线衍射、差热分析、 薄层色谱、红外光谱、核磁共振等。对于溶液中主体与客体分子的相互作用，可以用紫外 可见吸收光谱法、荧光法、核磁共振谱、微量量热法、圆二色谱等【3 7 - 3 蜘。普遍常用的方法 有紫外一可见光谱法、荧光法和核磁共振法。 大多数物质在有机溶剂中有强荧光，但在水中无荧光或荧光很弱，将c d s j l ：l 入到它们 水溶液中时，会导致荧光发生或增强。一般来说用荧光法表征包结物的生成应当考虑以下 几方面： ( 1 ) c d s 存在下引起荧光增强，主要原因是增加发射速度常数，减少分子移动自由 度，避免去活碰撞，保持适宜的微环境以及保护激发态不与大体积水分子合猝灭剂接触。 ( 2 ) 选择c d s 空腔尺寸与荧光分子匹配。( 3 ) 荧光增强因子依赖于c d s 的浓度，这是 因为c d s 包结荧光分子处于一种动态平衡，荧光强度随c d s 浓度增加而增强并达到一个 平台，即极限值但此极限值大小与c d s 和生成包结物的溶解度有关。( 4 ) 荧光增强受其 他共存有机分子影响，根据这些有机分子的性质和浓度的不同，明显改变荧光分子与c d s 形成复合体的过程和c d s 内腔的疏水性，同时也影响到复合体的化学量，这些都将最终 影响到荧光发射强度。( 5 ) 对于同时含给、受电子基团的分子，当这种分子内电荷传递( i c t ) 处于低极性的c d s 空腔而减少主要非发射过程时，将导致很大的荧光增强。 核磁共振法的原理是根据在c d s 存在下，底物和c d s 分子上的h 谱化学位移以及底物分 子的光谱一般都要发生变化。而且核磁共振法还可以提供包结物的有关结构方面的信息， 这对于深入研究包结行为是必要的。近年来随着计算机技术的发展，分子模拟也被大量采 用，在推测包结物的结构方面是对核磁共振法的有力补充。 包结物的形成，在某些例子中，也可用红外光谱法来研究。有时由于形成包结物后， c d s 特征带并未发生大的改变，这时候，用红外光谱来研究就受到了限制。理论上讲，由 于客体的包结，在红外谱图上通常会有位移或强度的变化，但由于客体分子的质量小，微 ， o 第一章前言 小的变化在谱图上会表现得不是很明显。用红外光谱研究的包结物，客体大多具有羰基官 能团。对于m y r 的结构来说符合这一特点，因此可以尝试用这种方法来表征包结物的生成。 1 4 本课题的研究目的、意义及主要内容 1 4 1 本课题的研究目的、意义 日益严重的化学合成物质对环境的污染和毒性问题，使得人们对绿色天然食品的需求 越来越迫切。从天然植物中寻求具有各种功效的食品添加剂以代替合成品，消除人们对食 品安全性的忧虑，满足人们追求营养健康的需求成了目前食品工作者的重要任务。黄酮类 物质在天然植物尤其是中草药中广泛存在，因其具有清除自由基、抗氧化、抗血栓、抗肿 瘤、消炎抑菌等多种生物活性而吸引了最近十几年来食品化学、医药和生物学家的研究热 情。 作为一种不可多得的天然活性物质，m y r 广泛存在国内多种植物中，且含量丰富。但 国内对m y r 的研究目前多在药理活性、提取纯化等方面，缺乏对其在食品领域的理论应用 研究。为了对其工业化生产提供有价值的指导，尽快实现其在食品领域的应用，本研究立 足于m y r 与c d s 包合作用的理论研究，以拓宽m y r 的溶解介质范围，增强其抗光解、抗氧化 等特性。在此基础上比较t m y r 与其c d s 包结物的抗氧化性能，为开发出高效、安全保健 的食品抗氧化剂开辟出一条新途径。 1 4 2 本课题的主要研究内容 ( 1 ) 对m y r 样品的结构鉴定，确定研究对象的正确性。荧光光谱法测定不同p h 值对 m y r 稳定性的影响，为其保存及在食品中的具体应用提供有价值的参考，确定m y r 与c d s 包结反应的适宜溶液环境。 ( 2 ) 采用荧光光谱法研究m y r 与c d s 的包结反应，测定反应的平衡常数k ，从而选择 与m y r 包合作用最强 拘c d s 。并从热力学角度深入到分子水平探讨反应的驱动力，为制备 包结物所需能量提供理论依据。 ( 3 ) 制备m y r 与h i 一b c d 的固体包结物，并用红外光谱法进一步鉴定包结物的生成， 用标准曲线法测定包结量。 ( 4 ) 用不同方法研究m y r 与h p 届c d m y r 的抗氧化活性并与常用抗氧化剂作对照， 考察包结作用对m y r 抗氧化活性的影响。并研究了包结前后m y r 抗光解的稳定性及食品 中常见金属离子对m y r 稳定性的影响，为其保存及在食品中的具体应用提供理论指导。 1 0 第二章1 3 - c d 及其衍生物与m y r 的包合作用研究 2 1 引言 第二章1 3 - c d 及其衍生物与m y r 的包合作用研究 黄酮类化合物的强抗氧化活性己被越来越多的实验所证实，由于其具有各种药理作用 且毒副作用小，作为生物抗氧化药物开发是很有潜力的。所以黄酮类化合物主要作为药物 来应用，比较成熟地作为食品抗氧化剂应用的目前市场上也只有茶多酚较为广泛，究其原 因，可能有以下两点：( 1 ) 可能性：黄酮化合物主要从天然植物中提取，而天然植物的成 分复杂，提取物的纯化和精制流程复杂、成本高，工业化难。因此植物黄酮的抗氧化活性 的研究大部分只局限在研究醇提取物、水提取物的抗氧化表现，对起抗氧化作用的黄酮只 做了相应的定性确认，对其结构、性状、溶解性及毒性等更深的研究涉足很少，这就限制 了黄酮的应用。( 2 ) 作用性能：作为食品抗氧剂必须具有足够的溶解度，物理、化学稳定 性，光稳定性，以及具有柔和的香味或无异味，而黄酮的溶解性较低，稳定性差，需要提 高其溶解度，增强稳定性，才能提高其抗氧化性能。 7 0 年代初日本和匈牙利将c d s 应用于食品领域。法国、荷兰、西班牙、意大利和其 他欧洲国家也陆续在食品中使用。美国f d a 批准用3 - c d 脱除胆固醇的食品上市。我国 也批准3 - c d 为食品添加剂，在国标g b 1 2 4 9 3 9 0 中的代码为0 0 0 0 6 。在包合物中，进入 c d s 筒形空腔内部的客体分子可以得到保护，从而表现为抗氧化、抗光照、热稳定性增 加、缓释、增溶等特点。因此c d s 尤其是相对廉价的3 - c d 在食品领域具有广泛应用【3 9 - 4 2 。 ( 1 ) 增强稳定性尤其是在快餐食品中不可缺少的各种芳香、辛辣调味料如肉桂油、苗香 油、芥末油等大多不稳定，易受氧、光或热的作用而分解，使其应用受到很大限制。用 c d s 包结将其微胶囊化，便可大大提高其贮存稳定性和使用方便性。食用香料通常不易 分散和不溶于水，c d s 具有外亲水内疏水的表面活性，本身无毒，耐高温，可使香料溶 解于水且能增强其稳定性。天然色素通常不稳定，可用c d s 包合改善溶解性能，并具有 稳定色素的作用。( 2 ) 提高水溶性由于c d s 具有亲水性和疏水性，可用作油料物和水的 乳化剂。将c d s 用于蛋黄酱、色拉油、调味油中可获得稳定性高的乳化效果。( 3 ) 掩盖 或去除食品中某些有害健康的成分或异味。食品中某