（材料学专业论文）以跨膜蛋白疏水结构域为多肽标签的目标蛋白酶定位研究.pdf

中文摘要蛋白质分离纯化技术推动了对基因工程、分子生物学、免疫学和疾病诊断学等许多新兴学科的发展。随着生命科学和生物技术的不断进步，对于生物大分子分离和纯化的要求也越来越高。蛋白质常存在于复杂的混合体系中，对温度、p h 、机械剪切力、酶等均非常敏感，稳定性较差，易于变性，故用于小分子的分离技术大多并不能直接用来分离蛋白质。本研究探索通过整合蛋白的跨膜结构域与材料表面的疏水相互作用达到蛋白分离的目的。整合蛋白约占各种生物体总蛋白的四分之一以上，这些整合蛋白牢牢嵌入到了脂质膜中，对于保持蛋白的疏水结构及其功能是必不可少的。到目前为止，大多数的整合蛋白的应用都与它们的生理作用有关。然而，事实上整合蛋白的疏水结构也可以进行多功能方面的研究。在本研究中主要选用若干种整合蛋白的跨膜结构域以及全蛋白如枯草芽孢杆菌m r p 操纵子系统中的m r p d 和m r p f 两种蛋白作为疏水蛋白标记结合到目标蛋白如绿色荧光蛋白( g f p ) ，大肠杆菌酸性磷酸酶( e c a p ) 或碱性磷酸酶( p h o a ) ，麦芽糖结合蛋白( m b p ) 等的末端。经研究结果表明，大多数整合蛋白的跨膜结构域作为疏水标记可以起到将目标蛋白锚定在生物体体细胞膜上的作用。在此基础上，本课题进一步研究带有该疏水标记的重组目标蛋白与材料表面的相互作用。一方面选用大肠杆菌酸性磷酸酶( e c a p ) 和大肠杆菌碱性磷酸酶( p h o a ) 作为目标蛋白模型，选用枯草芽孢杆菌m r p d 全蛋白和m r p f 的跨膜结构域作为疏水蛋白标记构建融合蛋白。另一方面，选用以m p e g ( 7 5 0 ) s h 改性后金片表面作为相互作用的材料模型。金片表面本身可与疏水标记进行相互作用，同时，m p e g ( 7 5 0 ) s h 可以排斥非特异性蛋白吸附，对目标蛋白酶活性的保持也可以起到一定的作用。结果表明，目标蛋白酶通过该疏水标记可以成功锚定在金片表面，同时，在一定程度上保持其活性。而不含疏水标记的蛋白则会被洗脱掉，从而达到分离蛋白的目的。该研究为蛋白分离纯化技术提供了一种新的方法和思路。关键词：蛋白分离，整合蛋白，金片表面a b s t r a c tp r o t e i ns e p a r a t i o na n dp u r i f i c a t i o nt e c h n o l o g yp l a y sa ni m p o r t a n tr o l ei np r o m o t i n gt h ed e v e l o p m e n to fg e n e t i ce n g i n e e r i n g ，m o l e c u l a rb i o l o g y , i m m u n o l o g y ,d i s e a s ed i a g n o s t i c s ，a n dm a n yo t h e re m e r g i n gd i s c i p l i n e s t h ed e v e l o p m e n to fl i f es c i e n c e sa n db i o t e c h n o l o g yr e q u i r e sm o r ee f f i c i e n tm e t h o d sa n ds t r a t e g i e sf o rs e p a r a t i o na n dp u r i f i c a t i o no fb i o l o g i c a lm a c r o m o l e c u l e s p r o t e i n so f t e ne x i s ti nac o m p l i c a t e ds y s t e ma n da r es e n s i t i v et oe n v i r o n m e n t a lf a c e t ss u c ha st e m p e r a t u r e ，p h ，m e c h a n i c a ls h e a rs t r e s s ，a n ds oo n t h u s ，m o s tt r a d i t i o n a lt e c h n i q u e sf o rs e p a r a t i o no fs m a l lm o l e c u l e sc a nn o tb ed i r e c t l ya p p l i e di np r o t e i n s i nt h ep r e s e n ts t u d y , w ee x p l o r e dan o v a lm e t h o db a s e do nt h ei n t e r a c t i o no fi n t e g r a lm e m b r a n ep r o t e i n s ( i m p s ) a n dt h eh y d r o p h o b i es u r f a c eo fam a t e r i a lt oi s o l a t ea n ds e p a r a t eat a r g e tp r o t e i n i m p sp o s s e s so v e ro n eq u a r t e ro ft h et o t a lp r o t e i n so fv a r i o u so r g a n i s m s t h e s ei m p sa r ee m b e d d e di nt h el i p i dm e m b r a n ew h i c hi se s s e n t i a lt om a i n t a i nt h eh y d r o p h o b i cs t r u c t u r ea n df u n c t i o no fi m p s u pt od a t e ，m o s ta p p l i c a t i o n so fi m p sa r er e l a t e dt ot h e i rp h y s i o l o g i c a lr o l e s h o w e v e r ，t h eh y d r o p h o b i cs t r u c t u r eo fi m p sc a na l s ob eu t i l i z e df o rm u l t i p u r p o s er e s e a r c h i nt h i ss t u d y , w ei n v e s t i g a t e dt h ep o s s i b i l i t yo fu s i n gt r a n s m e m b r a n ed o m a i n so fi m p sf o ra n c h o r i n gp r o t e i n si nv i v oa n de xv i v o s e v e r a lt r a n s m e m b r a n ed o m a i n sa n di n t a c tp r o t e i n so fi m p sw e r es e le c t e da sh y d r o p h o b i ct a g sa n df u s e dw i t hp r o t e i n sa n de n z y m e ss u c ha sg r e e nf l u o r e s c e n tp r o t e i n ( g f p ) ，e s c h e r i c h i ac o l ia c i dp h o s p h a t a s e ( e c a p )o ra l k a l i n ep h o s p h a t a s e ( p h o a ) ，o rm b p t h er e s u l t sr e v e a l e dt h a tm o s tt r a n s m e m b r a n ed o m a i n so fi m p sb e i n gi n v e s t i g a t e dc a na c ta sh y d r o p h o b i et a g st oa n c h o rp r o t e i n so nl i p i dm e m b r a n e si nv i v o t h es p e c i f i ci n t e r a c t i o n sb e t w e e nh y d r o p h o b i ct a g g e dp r o t e i n sa n da na r t i f i c i a lh y d r o p h o b i cs u r f a c ew e r et e s t e da n dc o n f i r m e d t h er e s u l t si n d i c a t e dt h a tt r a n s m e m b r a n ed o m a i n so fi m p sc a nb eu s e da sh y d r o p h o b i ct a g sf o ra n c h o r i n gp r o t e i n si nr i v ea n de xv i v o t h ei n t e r a c t i o n sb e t w e e nt h eh y d r o p h o b i ct a g g e dp r o t e i n sa n ds u r f a c eo fi im a t e r i a l sw e r ea l s oi n v e s t i g a t e d o nt h eo n eh a n d ，e s c h e r i c h i ac o l ia c i dp h o s p h a t a s e ( e c a p ) a n de s c h e r i c h i ac o l ia l k a l i n ep h o s p h a t a s e ( p h o a ) w e r ec h o s e na st h et a r g e tm o d e lp r o t e i n s ，a n db a c i l l u ss u b t i l i sm r p dw h o l ep r o t e i na n dm r p fh y d r o p h o b i ct r a n s m e m b r a n ed o m a i na sp r o t e i nt a g s o nt h eo t h e rh a n d ，g o l ds u r f a c e sw h i c hw e r em o d i f i e db ym p e g ( 7 5 0 ) 一s hw e r es e l e c t e da st h em o d e lm a t e r i a l s g o l df i l ms u r f a c ei t s e l fc a ni n t e r a c tw i t ht h eh y d r o p h o b i cm a r k e r s ；m e a n w h i l e ，m p e g ( 7 5 0 ) - s hc a nn o to n l yr e s i s tn o n s p e c i f i c p r o t e i na d s o r p t i o n ，b u ta l s op l a yar o l ei nm a i n t a i n i n ga c t i v i t yo ft h et a r g e tp r o t e a s e t h er e s u l t ss h o w e dt h a tt h r o u g ht h eh y d r o p h o b i ct a gt h et a r g e tp r o t e a s ec o u l db es u c c e s s f u l l ya n c h o r e do nt h es u r f a c eo ft h eg o l ds u r f a c e ，a n dt os o m ee x t e n tm a i n t a i ni t sa c t i v i t y t h o s ep r o t e i n sw h i c hd i dn o tc o n t a i nh y d r o p h o b i cm a r k e r sw i l lb ew a s h e do f f , s oa st oa c h i e v et h ep u r p o s eo fs e p a r a t i o no ft a r g e tp r o t e i n s t h i ss t u d yo f f e r san e wa p p r o a c ha n di d e af o rp r o t e i ns e p a r a t i o na n dp u r i f i c a t i o nt e c h n o l o g y k e y w o r d s ：p r o t e i ns e p a r a t i o n , i n t e g r a lm e m b r a n ep r o t e i n s ，g o l ds u r f a c e s i i i缩写m r pn u p cm r p dm r p fg f pe c 埘p h o am b pm p e g ( 7 5 0 ) - o hm p e g ( 7 5 0 ) 一s hi m p ss a m sc 1 8 s hd d mt r i t o n x 1o ol d a op t r q l 8p m a l p 4 xp mt a gd n t p si p t gp c rs d s p a g ee d t aa p sp h x e c a p 】p m a l m r p f 】p h x e c a p m r p d p m a l p h o a - m r p f 】1 8 f 11 8 r 1e c a p r l1 3 i f 4p m a l p h o a 】p m a l p h o a m r p f ( 1h e l i x ) 】d d ta m pl b m 9主要符号表v l中( 英) 文名称m u l t i p l er e s i s t a n c ea n da d a p t a t i o n大肠杆菌核苷酸转运蛋白m u l t i p l er e s i s t a n c ea n da d a p t a t i o ndm u l t i p l er e s i s t a n c ea n da d a p t a t i o nf绿色荧光蛋白大肠杆菌酸性磷酸酶大肠杆菌碱性磷酸酶麦芽糖结合蛋白单甲氧基聚乙二醇单甲氧基巯基聚乙二醇整合膜蛋白自组装单分子层膜十八烷基硫醇十二烷基b e t a - d 麦芽糖苷聚乙二醇辛基苯基醚十二烷基二甲基氧化胺一种质粒载体一种质粒载体p y r o c o c c u sf u r i o s i sd n ap o l y m e r a s et a gd n ap o l y m e r a s e四种核糖核苷酸异丙基b d 硫代半乳糖苷聚合酶链式反应十二烷基磺酸钠聚丙烯酰胺乙二胺四乙酸过硫酸铵带有e c a p 基因的质粒载体带有m r p f 基因的质粒载体e c a p m r p d 重组质粒p h o a m r p f 重组质粒识别质粒p t t q l 8 上位点的引物之一识别质粒p t t q l 8 上位点的引物之一识别e c a p 基因片段上位点的引物之一识别m r p o 基因片段上位点的引物之一带有p h o a 基因的质粒p h o a m r p f ( 1 h e l i x ) 重组质粒2 ，2 x 2 ( 4 氯苯基) 1 ，1 ，1 三氯乙烷氨苄青霉素分别为两种培养基的名称独创性声明本人声明，所呈交的论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得武汉理工大学或其他教育机构的学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示了谢意。签名：丝豳日期：! 弛：圣!学位论文使用授权书本人完全了解武汉理工大学有关保留、使用学位论文的规定，即学校有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文被查阅和借阅。本人授权武汉理工大学可以将本学位论文的全部内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或其他复制手段保存或汇编本学位论文。同时授权经武汉理工大学认可的国家有关机构或论文数据库使用或收录本学位论文，并向社会公众提供信息服务。( 保密的论文在解密后应遵守此规定)研究生( 签名) 他j i i 3导师( 签名) 协- 日期九6武汉理工大学硕士学位论文第一章绪论1 1蛋白质分离的一般方法及其应用前景近年来，蛋白质分离纯化理论与技术的进步对生命科学的发展，尤其是对基因工程、分子生物学、免疫学和疾病诊断学等新兴学科的发展，起到了巨大的推动作用【l 】【2 1 。蛋白质分离纯化技术作为种生物工程下游技术，即从混合体系当中分离纯化出所需要的目标蛋白组分，是当代生物产业当中的核心技术之一。随着生命科学和生物技术的不断进步，对于蛋白质等生物大分子的分离和纯化的要求也越来越高，如要求通过蛋白分离纯化获得高活性和高纯度的蛋白质等【3 1 。由于大部分的蛋白质常存在于复杂的混合体系中，对一些外界因素如p h 、温度、酶、机械剪切力等均非常敏感，且稳定性较差，易于变性或被混合体系中的酶降解等。因此许多用于小分子的分离技术并不能直接用来分离蛋白质。蛋白质的提取与纯化工艺不仅过程相当复杂，且费用通常比较高，一般而言，蛋白质的纯化费用可达到生产成本的一半以上，如一个生物药品的成本约四分之三都花在下游蛋白质分离纯化中【4 】。在组织和细胞中，蛋白质和多肽绝大部分是以多种复杂的形态存在且种类繁多，因此，蛋白分离纯化方法要向前发展，任务仍十分艰巨。迄今为止，还无法依照一套简单现成的方法对目标蛋白进行分离纯化。蛋白质和多肽产物的提取以及分离纯化的基本原则是从复杂的多组分物质中将目标组分分离，尽可能多的获得具有生物学活性的蛋白和多肽产物，同时增加目标产物的纯度和保持其活性【5 】。在纯化的过程中，必须避免目标蛋白和多肽的变性以及被蛋白酶的降解。这就需要在纯化之前首先充分了解和牢固掌握目标蛋白的物理化学及生物学特性，以此来选择合适的单元操作，其中包括选择和处理合适的生物材料，选择适当的纯化条件，如缓冲液、温度、p h 值等，提取纯化目标蛋白以及其定性或定量的鉴定。对目标蛋白的提取和纯化一般包括以下几个步骤：首先是目标蛋白的释放，选择最适宜的目标组织或细胞，使目标蛋白武汉理1 = 人学硕士学位论文尽可能维持天然构象状态下以溶解状态释放。对于带有细胞壁的细菌或植物细胞可采用研磨、超声波破碎、高压细胞破碎等，也可采用酶消化法、低温冰冻等手段消化细胞壁。有时为了使得细胞破碎更加完全，可以先用溶茵酶进行消化后再通过超声波破碎或高压破碎，然后采用适当溶剂抽提。其次是初步纯化，选择适当纯化操作使目标蛋白与杂质分离，在保持活性的前提下使产物浓度及质量有明显提高，该纯化步骤是一个复杂的多级加工过程。最后是进行高度纯化，即在前者的基础上进一步提纯出目标蛋白。主要采用色谱技术如离子交换、亲和色谱、疏水色谱等，这些操作具有高度的选择性，可去除物理化学性质相近的杂质，在蛋白纯化中应用较为广泛。目前用于蛋白分离纯化的常用技术有以下几种：1 ) 沉淀法：沉淀法可分为等电点沉淀法和有机溶剂沉淀法【6 】。a ) 等电点沉淀法，其原理是蛋白质在等电状态时颗粒之间的静电斥力最小，因而溶解度也最小。由于各种蛋白质的等电点有差别，可利用调节溶液的p h 达到某一蛋白质的等电点使之沉淀。此法可与盐析法结合用，当用中性盐加入蛋白质溶液，中性盐对水分子的亲和力大于蛋白质，于是蛋白质分子周围的水化膜层减弱乃至消失，同时，蛋白质表面电荷大量被中和，更加导致蛋白溶解度降低，使蛋白质分子之间聚集而沉淀；b ) 低温有机溶剂沉淀法，其原理是用与水可混溶的有机溶剂如甲醇，乙醇或丙酮等使多数蛋白质溶解度降低并析出，此法分辨力比盐析高，但蛋白质较易变性，故应在低温下进行。2 ) 电泳法：蛋白质在高于或低于其等电点的溶液中是带电的，在电场中能向电场的正极或负极移动。根据电泳过程中支撑物的不同，可分为薄膜电泳、琼脂糖凝胶电泳、s d s p a g e 电泳等。3 ) 透析法：利用透析袋可选择透过小分子的原理把大分子蛋白质与小分子化合物分开的方法。4 层析法【7 1 ：a ) 离子交换层析，利用蛋白质的两性游离性质，在某一特定p h 时，各蛋白质的电荷量及性质不同，故可以通过离子交换层析得以分离。如在阴离子交换层析的过程中，含负电量小的蛋白质首先被洗2武汉理工大学硕士学位论文脱下来：b ) 分子筛，又称凝胶过滤。小分子蛋白质进入孔内，滞留时间长，大分子蛋白质不能进入孔内而径直流出，运用此方法可以将不同分子量大小的蛋白分离开来。5 ) 超速离心：既可以用来分离纯化蛋白质也可以用作测定蛋白质的分子量，不同蛋白质因其密度与形态各不相同而分开。1 2 不稳定蛋白的分离纯化8 】许多具有生物活性的蛋白质，如生物酶等，存在于复杂的环境中，往往是不稳定的蛋白。由于一些用于人类治疗的药物蛋白质和某些用于研究的蛋白质往往需要从这些复杂的体系中分离出高纯度的蛋白质，并且希望在纯化中尽量保持其稳定性，这就涉及到不稳定蛋白的分离纯化【9 】。不稳定蛋白的分离纯化对于生命科学领域的科学家们来说是一项艰巨的任务，特别是在进行基因工程药物蛋白的生产过程中，保持目标蛋白的活性及稳定性是其安全有效的重要保障之一。因此，采取一些合理的措施保护蛋白质的稳定性，对提高不稳定蛋白活性回收率和产品质量，降低生产成本是十分有益的。1 2 1 影响蛋白稳定性和活性的因素 o l1 ) 温度。温度是影响蛋白质稳定的最重要因素，温度越高，蛋白质稳定性越低。对大多数蛋白而言，叫条件下较为稳定，因此在操作过程中，一般都是在冰浴或4 环境下进行。当然，对于嗜热蛋白的纯化可利用加热以除去几乎所有的杂蛋白而不会影响其生物活性。2 ) 蛋白酶。在纯化过程中，不稳定的蛋白质容易被蛋白酶降解。纯化时间和温度是影响目标蛋白可能被降解的两个比较重要的因素。通过缩短纯化时间和降低纯化温度可减少目标蛋白的降解。3 ) 缓冲液。许多分子对蛋白质的结构有稳定效果，在纯化过程中可用于保护不稳定蛋白。如在本实验中测定大肠杆菌酸性磷酸酶( e c a p ) 的活性时，可用g l y e i n e h c l 缓冲液来保持蛋白酶活性。而测定大肠杆菌碱性磷酸酶( p h o a l的活性时，可用z n c l 2 t r i s 缓冲液来保持蛋白酶活性。一般而言，如还原试剂d t t 等可以通过阻止巯基基团被氧化来维持天然蛋白的结构，故也可以3武汉理f 大学硕士学位论文用作纯化缓冲液，但浓度应在一定范围内，否则将减少目标蛋白的二硫键。4 ) p h 值。如果缓冲液的p h 与目标蛋白的等电点一致，蛋白的溶解度会减少，引起聚集。一般要将缓冲液的p h 调节在不影响所纯化蛋白的生物活性的范围内。缓冲液的离子强度不适合时，此时蛋白分子间的斥力不够，也容易导致蛋白沉淀。5 ) 摇动和剪切。蛋白质在摇动和剪切作用下可能变性。摇动或剪切产生了疏水气液界面，将大量的蛋白质的疏水基暴露在空气中并开始聚集。而摇动产生的泡沫使得与空气氧化作用扩大，且泡沫所具有的表面张力对一些蛋白构象具有破坏作用。所以在纯化不稳定蛋白时应避免剧烈搅拌和摇晃。1 2 2 保持蛋白质稳定性的分离纯化的一般方法1 ) 液膜分离液膜分离技术，是一项新兴的高效、快速、节能的分离技术，和固体膜相比，液膜具有传质面积大、选择性高、通量大及传质速率高、富集浓缩倍数高、分离效果好等明显的技术特色【1 1 1 。2 ) 扩张床吸附扩张床吸附技术一般用在不稳定蛋白纯化的开始，在纯化目标蛋白过程中，主要用于有效并快速除去细胞及其碎片。目标蛋白将会被被吸附在层析介质上，可保持目标蛋白的活性【1 2 1 。3 ) 灌注层析灌注层析运用了具有贯穿孔的分离介质，使快速分离纯化生物大分子成为可能。与传统的层析相比大大节约了分离时间，对不稳定蛋白的纯化保持其稳定性比较有利【13 1 。4 ) 色谱复性及同时纯化通过大肠杆菌等表达的蛋白质，有时会以包涵体的形式存在，且目标蛋白已经变性，因此，在纯化回收时需要复性。利用蛋白质的色谱复性及同时纯化技术可缩短纯化时间，并能提高目标蛋白的活性回收率。较为常用的色谱复性有离子交换法、凝胶排阻色谱法、亲和色谱法和疏水色谱法【1 4 】。5 ) 亲和层析亲和层析是一种行之有效的蛋白纯化方法，与以上几种方法对比，可以取得较高的纯化倍数。在纯化过程中，由于蛋白结合到亲和配基上，不仅性质更4武汉理工人学硕士学位论文加稳定，而且得到了浓缩，提高了目标蛋白的活性回收率。这种方法比较适用于不稳定蛋白的纯化，也是目前运用较为广泛的一种蛋白分离的方法【15 1 。除此之外，最近两年有报道通过新型的免疫亲和色谱进行蛋白纯化，也就是将目标蛋白与抗体结合，用特异性抗原识别也能达到纯化蛋白质的目的 1 6 1 。1 2 3 亲和融合系统：在众多蛋白分离方法中，亲和层析运用得最为广泛【1 7 】。通常情况下，亲和融合系统的建立是在目的蛋白或多肽片段的基因上粘接一段理化性质特异的或者专一性强、生物亲和性高的基因片段，后者表达的多肽片段具有标记性功能，所以也被称作纯化标签( p u r i f i c a t i o nt a g ) 或者亲和标签( a f f i n i t yt a go ra f f i n i t yt a i l )1 8 】。在其均一化过程中，亲和层析( a f f i n i t yc h r o m a t o 伊印h y ) 是首选的纯化方法，对此已经有大量的报道【l9 1 。表1 1 ：具有代表性的融合蛋白系统【2 0 】传统的亲和载体大多以葡聚糖凝胶( s e p h a d e x ) 和琼脂糖凝胶( s e p h a r o s e ) 【2 3 1【2 4 】为基质，装入色谱柱中使用。一般情况下，为了避免对亲和载体的污染和色谱柱的堵塞，样品中不能存在固体颗粒，故在纯化前通常需要对细胞裂解液进行过滤、离心等复杂的操作。再加上亲和试剂价格比较昂贵，对p h 值有一定的限制，基质机械性能较低等不足，故在科研和生产应用中都存在一定的困难。近年来逐渐发展起来的磁性金属亲和分离方法【2 1 1 ，选用含有氧化铁的交联琼脂糖凝胶和聚苯乙烯微球等常用的磁化介质( 商品化的磁珠多为此种基质) 。其较好的机械性能、操作简便性、金属亲和纯化的高选择性等优点引起了人们的关注。虽然用以上的亲和融合系统可以达到分离蛋白的目的，但由于特定的亲和5武汉理工火学硕士学位论文标签需要与特定的金属离子结合，故这些方法不具有普遍适用性且成本较高。纯化后的蛋白质，尤其是不稳定蛋白如膜蛋白，一旦从膜上解离下来其活性也很容易丧失。故需要寻求一种更好的纯化方法能适用于多种蛋白质的分离纯化，且分离出的蛋白质活性易于保持。1 3 本课题研究的相关背景本研究试图探索一种新型的蛋白分离的方法，该方法主要利用疏水相互作用，使目标蛋白锚定在经过疏水改性后的材料表面。具体来讲，一方面通过基因操作的方法在目标蛋白的n 端( 氨基端) 或c 端( 羧基端) 引入一种疏水蛋白标记，构建融合蛋白。该疏水蛋白标记本身是一种跨膜蛋白，利用其跨膜结构域可使融合蛋白最终表达定位在细胞膜上。如下图所示，箭头所指处代表目标蛋白，与之相连则是疏水蛋白标记。这样设计的目的在于利用该疏水蛋白标记与疏水材料表面相互作用使得目标蛋白最终锚定在材料表面，以达到分离目标蛋白的目的。图1 1 ：膜蛋白p h o a m r p f 跨膜结构示意图。另一方面，以金片作为研究模型，拟用十八烷基硫醇和m p e g ( 7 5 0 ) s h在金片表面进行自组装来改变金片表面的亲疏水性。具体说来，即利用疏水标记与金片表面的疏水分子链间的相互作用将目标蛋白从混合蛋白体系中分离；另一方面，在金片表面组装的m p e g ( 7 5 0 ) 一s h 本身所具有的排斥非特异性蛋白的性质可起到保持目标蛋白酶活性的目的。设计重组蛋白的同时，可在两种蛋白连接处设计一酶切位点，若以上实验成功的话，最6武汉理工大学硕士学位论文后只需用特定的内切酶将目标蛋白从金片表面切除即可达到分离纯化目标蛋白的目的。1 3 1 大肠杆菌酸性磷酸酶( e c a p ) 幂i ：i 碱性磷酸酶( p h o a )磷酸酶是一种能够将对应底物去磷酸化的酶，即通过水解磷酸单酯将底物分子上的磷酸基团除去，并生成磷酸根离子和自由的羟基。与之相对的是激酶，激酶是磷酸化酶，可以利用能量分子将磷酸基团加到对应底物分子上。酸性磷酸酶( a c i dp h o s p h a t a s e ，a c p ) 广泛分布于机体各种组织细胞内，主要存在于细胞的溶酶体、内质网和胞质内，常作为溶酶体标志酶【2 5 1 。酸性磷酸酶一般存在于人体溶酶体、人体前列腺、酵母菌、大肠杆菌，以及植物酸性磷酸酶等等。在组织老化、核酸和蛋白质代谢活动增加时，酸性磷酸酶活性增强，此外酸性磷酸酶还参与酯类代谢，因此，它在疾病、免疫反应和细胞损伤与修复过程中具有一定的生物学意义。大肠杆菌酸性磷酸酶( e s c h e r i c h i ac o l ip e r i p l a s m i ca c i dp h o s p h a t a s e ，e c a p ) 存在于大肠杆菌膜间隙，功能已知，活性易于用光吸收法测定。其序列和结构已知，n 端和c 端均露于蛋白质外部，易于进行遗传修饰。e c a p 位于大肠杆菌膜间隙，经修饰表达后，一定程度上易于利用疏水标记在膜上定位。碱性磷酸酶( p h o s p h a t a s ea l k a l i n e ，p h o a ) 是一种非特异性磷酸单酯酶【2 6 】【z 7 1 ，主要参与磷酸代谢，可以催化磷酸单酯水解，生成相应的无机磷酸和醇、酚或糖类。碱性磷酸酶广泛存在于各种动物、细菌和真菌中。近几十年，碱性磷酸酶的研究主要集中在其结构、性质及催化活性等方面，其中大肠杆菌碱性磷酸酶最易获得，研究的也最为清楚，因此在研究中得到广泛应用。p h o a 属于分泌型蛋白，主要分布于大肠杆菌细胞的周质空间，p h o a 只有其输出到内膜外到达周质空间时才会显示出其酶活性，而当它留在胞质中时，将不具有酶活性。1 3 2 疏水膜蛋白枯草芽孢杆菌m r p 蛋白系统( m r p d & m r p f )m r p 操纵子是嗜碱菌细胞膜上单价阳离子转运系统。它包含多个基因，这些基因编码的产物组成蛋白复合体，共同完成离子转运功能。m r p 操纵子广泛存在于很多微生物里，与微生物多种耐受性有关2 8 1 。枯草芽孢杆菌m r p 操纵子一共包含七个基因，m r p a 、b 、c 、d 、e 、f 、g 。这七个蛋白都分布于细胞膜上。m r p n a + h + 反向载体属于次级蛋白转运系统，在7武汉理工大学硕士学位论文调节嗜碱菌胞质p h 衡稳方面起关键性作用。这七个基因编码的膜蛋白形成异体蛋白复合体，共同完成细胞离子交换等功能f 2 9 】。“”嚼需萄麟磊毒翻峨嚣端= 斋? 一器= 勰；“：皇嚣：警嚣。船盛= = 裟：品，o _ q 0 一誉警愁誊一嚣譬勰篇蠕：镐”嚼霸蝓晶糊懋誉一瑟羞茹r黧麓溉麓麓基辨m 一图1 - 2 ：m r p 操纵子结构2 9 1m r p d 和m r p f 是枯草芽孢杆菌m r p 操纵子中的两种蛋白。m a p d 蛋白基因长度约为1 4 7 9 b p ，编码长度为5 8 3 个氨基酸的蛋白质，分子量为5 5 k d a 。而m r p r 是七个蛋白中较小的一个，其基因长度约为2 8 2 b p ，编码长度为9 4 个氨基酸的蛋白质，分子量为1 0 k d a 。1 3 3 目标蛋白在细胞膜上的锚定膜蛋白，又称为跨膜蛋白( t r a n s m e m b r a n ep r o t e i n ) 或整合膜蛋白( i n t e g r a lm e m b r a n ep r o t e i n ) ，以非极性氨基酸与脂双分子层的非极性疏水区相互作用而结合在质膜上，参与了细胞中的许多生理过程口“。跨膜蛋白能够通过其疏水跨膜结构域与膜脂相互作用而锚定于细胞膜上。这一疏水结构域一般是跨膜a 螺旋。利用膜蛋白的这一性质，我们可以将一些本来不在膜上表达的目标蛋白锚定到细胞膜上，从而有利于对该蛋白进行分离纯化以及进一步研究脾1 1 3 3 】。目标蛋白在细胞膜上的锚定的方式可分为两类：一类是利用膜蛋白的跨膜结构域与膜脂疏水相互作用来锚定目标蛋白，另一类是利用磷脂酰肌醇与膜脂的共价连接来锚定蛋白质p ”。本实验中所用的是第一类锚定方式，构建目标蛋白与跨膜蛋白或跨膜结构域的融台蛋白，然后利用膜蛋白的跨膜结构域将目标蛋白定位到膜上。融合蛋白有两种不同的含义，一种是通过d n a 重组技术得到的两个基因重组后的表达产物。另一种就是介导两个细胞质膜融合的一组蛋白。本实验所构建的是第一种融合蛋白，即将目标蛋白与疏水蛋白标记的基因进行重组并导入宿主细胞后完成诱导表达，经分离纯化得到实验所需的带有疏水标记的目标蛋武汉理j = 人学硕士学位论文白f 3 5 1 。由于利用蛋白标记的特性通常可以对融合蛋白进行亲和层析等分离提纯，故很多情况下选择融合表达是为了简化重组蛋白的纯化。常见的两种融合表达类型为：一种是融合标签( f u s i o n t a g ) 位于目标蛋白的n 端，这时t a g 可以提供良好表达所必需的信号，帮助提高目标蛋白的表达。缺点是由于在翻译过程中可能出现少量( c 端) 意外中断的不完整的目标蛋白表达产物，这些表达产物在纯化过程中会一起被纯化，导致最终得到的表达产物不纯。另一种是f u s i o nt a g 位于目标蛋白的c 端，这样可以保证只有完整的表达产物才会被纯化【36 1 。本实验设计的是融合标签位于目标蛋白c 端的融合蛋白。利用跨膜蛋白或跨膜结构域结合于膜的特性将目标蛋白锚定于膜。根据锚定的方向不同，又可以分为两种情况。第一种整合膜蛋白是n 端指向胞外，c 端指向胞质，称为i 型跨膜蛋白( 跨膜螺旋) 。第二种方向相反，称为i i 型跨膜蛋白( 跨膜螺旋) 1 37 l 。本研究采用第一类锚定方式中的i 型跨膜蛋白( 跨膜螺旋) 来锚定大肠杆菌酸性磷酸酶e c a p 和碱性磷酸酶p h o a 。具体而言，即在目标蛋白e c a p 和p h o a 的c 端通过基因操作的手段分别引入m r v d 和m r p f 疏水标记，由于这两种疏水蛋白最终表达于细胞膜上，故通过将目标蛋白连接到该疏水蛋白的末端最终可将目标蛋白酶锚定在细胞膜上。1 3 4 自组装方法的发展背景自组装( s e l f - a s s e m b l y ) 是上世纪8 0 年代新兴的一种非常简单的成膜技术，该技术提供了在分子水平上方便地构造理想界面的手段【3 引。与传统的l b 膜相比较，通过自组装得到的自组装单分子层膜( s e l f - a s s e m b l e dm o n o l a y e r s ，s a m s ) 优点在于其有序性与稳定性。该膜是分子通过化学键自发地在固液或气固界面形成的稳定的有序膜，制备方法简便，只需将基体浸入适当的有机溶剂中，成膜分子如硫醇等在材料表面进行自组装，一般约2 4 d x 时后可形成自组装单分子膜，有的组装反应很快，数小时内即可完成。常见的白组装单分子层膜包括多种不同的体系，如有机硫化合物在a u 、a g 、c u 表面的s a m ，脂肪酸类在a 1 2 0 3 或a g表面的s a m ，有机硅烷衍生物在羟基化的表面的s a m ，烃类在硅表面的s a m ，醇和胺类在p t 表面的s a m 等【”】。9武汉理下大学硕士学位论文1 3 5 自组膜的组装机理自组膜作为制备超薄序膜的一种新技术，不仅为研究表面和界面现象提供了一种能在分子水平上精确控制界面性质的理想方法，而且是人工设计并获得特定功能膜材料的有效方法之，从而迅速成为有关学科研究的焦点【4 0 1 。其中最具有代表性和研究最多的体系是含硫化合物特别是硫醇及二硫化物在金基底上的自组膜。a u _ s 键极易自发形成并释放热量，含硫化合物在金表面的自组装成膜是通过极性共价键形成的。硫醇、硫醚或二硫醚衍生物中的s 原子与a u 表面的强烈相互作用遵循软硬酸碱作用原理【4 。形成a l l s 键后，含硫化合物在金表面形成的自组单分子层，具有良好的稳定性、致密性、有序性。图1 - 3 ：金片表面m p e g ( 7 5 0 ) s h 年- f l c l8 s h 自组装示意图【4 2 】在本实验中，m p e g ( 7 5 0 ) s h 与c 1 8 - s h 在金片表面的自组装也是通过将金片：o 燃m p e g ( 7 5 0 ) s h 和c 18 s h 的乙醇溶液中的方法制得【4 3 1 。1 3 6 自组膜在生物方面的应用由于许多药物分子和生物提取物都含有巯基( - - s h ) 和二硫键( q s 1 ，利用金一硫键可直接将连接有巯基的生物分子组装于金表面，也可先获得尾端带有功能基团的含硫化合物在金表面的s a m ，利用尾端的功能基团直接或在活化剂( 或偶联剂) 的作用下连接上生物功能分子，从而实现生物功能分子与基底的稳定结合。近二十年来，这一自组装方式已被应用于葡萄糖氧化酶、核酸传感器等生物功能分子在固体基底表面的固定化，在生物学、药理学及仿生学方面都具有重要意义。l o武汉理工大学硕士学位论文1 4 本课题的提出及其研究意义运用于蛋白分离的方法多种多样，可是到目前为止还没有一套简单并切实可行的方法可以遵循。尤其是对于不稳定的蛋白纯化而言，本身对于纯化的条件就非常苛刻。如从细胞膜上分离出的膜蛋白，一旦脱离膜结构的支撑，无法维持原有的构象，或受到外界环境的影响等等就比较容易失活变性。虽然目前利用特定的亲和标签如h i s t a g 等，通过亲和层析的方法进行蛋白纯化已经运用得较为广泛，可是在试验过程中仍然存在一些问题，如在纯化的过程中，会有其他跟金属离子有结合作用的杂质蛋白对其干扰，导致样品不纯，或者在蛋白样品的吸附和沈脱过程中，容易导致蛋白变性等。本实验旨在探索一种新的蛋白分离纯化的方法，即通过基因操作的手段，在目标蛋白的末端连接上疏水蛋白标记。通过该标记与改性后的疏水材料表面进行相互作用，使之从膜蛋白的复杂体系中分离出来，同时能保持目标蛋白酶的活性。该疏水标记不仅可以使细胞中游离的蛋白酶表达后锚定在细胞膜上，还可通过提取膜蛋白使目标蛋白得以进一步纯化，为某些表达量很低且不易纯化的蛋白提供了一种可能的纯化方法。更重要的是，这种疏水标记可以运用基因的手段进行大小的调控，且可以更换为不同的疏水蛋白标记以适应不同蛋白和不同材料表面的需要。在本实验中融合标签( f u s i o nt a g ) 本身是一种跨膜蛋白，通过膜蛋白的跨膜螺旋结构可以成功实现将目标蛋白锚定在细胞膜上。在此基础上，本研究主要探索在金片表面上通过疏水相互作用对目标蛋白的固定化，从而实现目标蛋白的分离纯化。一方面，通过基因操作的手段，在e c a p 与p h o a 的c 端分别引入跨膜蛋白m r p d 和m r p f 疏水标记后，使得目标蛋白e c a p 与p h o a 最终可定位于细胞膜上，运用差速离心法可初步分离出细胞膜。另一方面，在金片表面进行m p e g s h 和c 1 8 s h 的自组装。此时m p e g s h既可调节c 1 8 - s h 在金片表面的组装密度，同时也可保持目标蛋白的活性。融合蛋白与金片表面相互作用的过程中，去垢剂起着至关重要的作用。去垢剂( 表面活性剂) 是一类既具有亲水基又具有疏水基的物质，可分为阴离子、阳离子和中性去垢剂等多种类型。表面活性剂一般具有乳化、分散、和增溶的武汉理工大学硕七学僚论文作用，其中中性去垢剂在蛋白提取中应用的较多。本实验室保存的主要有去垢剂十二烷基b e t a - d 麦芽糖苷( d d m ) 【4 引、聚乙二醇辛基苯基醚( t r i t o n x 1 0 0 ) t 4 5 】和十二烷基二甲基氧化h 安( l d a o ) 一0 。d d m 是一种非离子型去垢剂，分子量为5 1 0 。6 2 。在它的亲水区有一条糖链，可结合蛋白，用于稳定酶活性和激活酶，以及膜研究等。而t r i t o n x - 1 0 0 是一种常用的非离子性表面活性剂，分子量为6 4 6 8 6 ，棕色油状液体，能溶于冷水，能溶解脂质。l d a o 是一种较为常见的弱阳离子表面活性剂，分子量为2 3 1 。在本实验过程中发现将细胞膜蛋白用d d m 处理后，相对于t r i t o n x 1 0 0 来说更易于保持目标蛋白酶活性，故在后来实验中仅用d d m 来溶解细胞膜。本实验中运用去垢剂d d m 将细胞膜蛋白溶解，使嵌入细胞膜上的蛋白质从细胞膜上解离下来。这时将其与经过改性后的金片混合在一起，在透析的作用下将去垢剂一步一步从体系中移除，而从细胞膜上解离下来的膜蛋白与金片表面通过疏水作用相互结合，从而将目标蛋白锚定在金片上面，最后用相应的缓冲液将未结合的蛋白从金片表面洗去，即可达到分离目标蛋白的目的。如果以上实验结果可以达到的话，由于目标蛋白与疏水标记之间本身可设计酶切位点，在后续工作中只需要通过相应的内切酶将目标蛋白与疏水标记切开，即可获得我们想要的目标蛋白。1 2武汉理工人学硕士学位论文第二章融合蛋白的构建及其诱导表达2 1引言融合蛋白基因是利用基因工程技术将不同来源的基因或基因片段进行拼接，构建重组基因，目的在于使其编码的基因产物或蛋白质同时具有原有异源基因的生理功能和特点【4 7 1 。利用基因融合技术在基因水平上对蛋白进行改造