（药理学专业论文）克拉维酸高产菌株的筛选及发酵条件的优化.pdf

克拉维酸高产菌株的筛选厦发酵条件的优化 克拉维酸高产菌株的筛选及发酵条件的优化 摘要 克拉维酸( c l a v u l a n i ca c 试) ，也称棒酸，是由棒状链霉菌( 函嬲y 5 c 肠v z 堙盯“s ) 产生的一种一内酰胺酶抑制剂，其结构主要由b 一内酰胺环( c 3 结构) 和唑烷环( g 结构) 构成。它可与8 一内酰胺酶的丝氨酸活性位点不可 逆结合，从而保护b 一内酰胺类抗生素的活性。在医药生产中，棒酸和青霉素、 头孢等b 一内酰胺类抗生素复配使用，可解除这些抗生素的抗药性。我国所使用 的棒酸主要依靠进口。国内的生产菌种产量较低，发酵及其分离纯化工艺较落后 而造成生产成本较高，无法与国外产品相竞争。本研究首先利用途径工程原理对 棒状链霉菌的基因组进行改造，选育出高产的棒酸生产菌，然后探讨了环境因子 对改造后菌株生长特性的影响，得到了适合菌株生长的培养基条件。 本实验以棒状链霉菌为出发菌株，利用途径工程原理对其基因组进行定向改 造。本研究选取头霉素c 的早期合成基因缸f 为目标基因，构建了基因置换载体 d x a i ，1 ，对棒状链霉菌进行胁的定域基因置换，通过检测赖氨酸转氨酶活性和 s o u t h e m 杂交结果分析，得知觚基因被中断，筛选得到一株双交换菌株，命名为 x a i 8 6 3 。发酵结果表明，其产克拉维酸的能力约为原始菌株的2 倍。且菌株具有 遗传稳定性。 接下来，本实验探讨了基因改造菌株适合的生长条件，对c 源，n 源，复 合c 源及c 源和n 源的最佳比值进行了优化实验，选择了甘油和糊精为复合c 源，其摩尔比为1 ：1 ；选择大豆饼粉为n 源，n 源和c 源的最佳比值为摩尔比 4 ：1 。本实验还探讨了消泡剂和磷对克拉维酸产量的影响，得到了在用3 0 l 大 豆粉作为碳源的培养基中，加入0 2 9 l 的c a c l 2 更有利于克拉维酸积累的结论。 在进行一系列培养基优化实验后，确定较为理想的培养基成分为大豆粉、甘油、 糊精、c a c l 2 和m g s 0 4 7 h 2 0 含量分别为3 纠l 、7 4 鲫、6 6 鲫、o 2 刚和0 2 5 l 。 最后，本实验还构建了c 啪1 基因中断载体及调控因子c c n r 、c k r 和限速 酶c d s 2 的表达载体，并对c 啪l 基因中断菌株做了初步的筛选。为进一步对菌株 中山大学硕士学位论文荆琛峰 进行基因工程的改造奠定了良好的基础。 关键词：棒状链霉菌，克拉维酸，k f 基因，基因中断，c 册1 基因，c c 口r 基因 发酵条件优化 克拉维酸高产茵株的筛选及发酵奈件的优化 h i g hp r o d u c t i v es t r a i no fc l a v u l a n i ca c i ds c r e e n a b s t r a c t a n dt h ef b m e n tc o n d i t i o no p t i i i l i z a t i o n m a j o r ：p h a 珊a c o l o g y 胁gc h e n f b n g s u p e i s o r ：p r o f e s s o fa n i o n gx u ，p h d c l a v l l l a n i ca d d ，p r o d u c c dn a t u r a l l yb y 脚细慢y c 酷c 肠y 甜姆p 埘s ，i sap o l e n t i i l l l i b i t o ro f b 1 a d a m a s c i t s 脚l e c u l a rs t n i d u r ec 0 璐i s t so fab - h c t a mr i n g ( c 3 s t 兀l d u r e ) a n da no x a z o l i d i l l ef i n g ( c 5s t m c t l l r e ) np i o t e d sb - l a c t a ma n t i b i o t i c s 五m m b c i n gh y d r o l y z e db yb i i i d i n gj r r e v e r s i b l y t ot h ea c t i v ec e n t e ro f6 一l a c t a 嗽s e a u g m e n t i l l t m t 1 l ec o m b i i l a t i o no fc l a v u l a n i c a c i da n da m o x y c i l l i ni s g o o d 如r r r m i i i t a i n i i l gt h ea n t i b a c t c r i a la c t i v i t yo fa 啪x i l l i i ld u ct oi i i i b i t i o no f6 - l a c t a n m s e b yc l a v l l l a n i ca c i d c l a v u h n i ca c i di sm a m l yp u f c h a s e d1 0 wp m “d i v i t yo ft h e j i i t e m a ll o c a ls t r a i n 柚du n d e r d e v e l o p e df c r m e m a t i o na n dp u r i f i c a t i o np r o o e s si m p c d e c o m r n e r c i a lp m d u c t i o ni no u r u n t r y i nt h i ss t u d y t h es l 豫i nw 弱s c r e e n e db ya g e n o m em o d 确c a 缅nw i t hak n o c k o u lt e c h n i q u e 1 k n ，t h ce 虢c to fc u 】t u r e 缸t o r s o nt h e 乎。州ho ft h es t r a i nc e uw i l hn 1 0 d m e dg e m ew e r ei l l v e s t i g a t e d 柚das u i t a b l e c u l t u r ec o n l p o s i t i o nw a se v a l u a t e d t h ea j l l lo ft h ee x p e r i l n e mi st od i s 埘p tk fg e n ei nt h ec h r o m o s o t l l ei l lo r d e rt o c u to 任c c p b a m y c i i lc p a t h w a y ，t oe i l i l a 硪：ct h ep m d u d i o n o fc l a v t l l a n j c i d al 8 k b 丘a g m e mo f 肠fw 弱o b t a i n e du s i l l gp c ra n dr c p l a c e m e mp l a s m i do fp x a l la n d p x a 】l 2w e r c n s l r u d e d p x a l la l i dp x 气l 2w e r eu s e dt od 远n l p tt h e 缸fg e n eb y b i - p a r e n t a lc o n j u g a t j o n 丘d me c d 矗t o 脚f d 叼7 c 酷c 缸v “矗g e r 船at r a 璐f o r m a n tw a s s c r e e n e d ，卸dn a m e da sx a l 8 6 3 n cg e m co f 脚印f d 幔y c 即幽似啦埘s 柚d 中山大学硕士学位论文荆琛峰 x a l 8 6 3w 蠲柚a l y z e db ys o u t h e mb 1 0 t t i n gt c c h n i q u e ，a n dt h ea c t i v i t yo fl y s j n e e - a m i n o t r a n s f e r a s ei nt h et w os t r a i l l sw a sa l s ot e s t e d b o t hr e s u h sp m v e dt h a tt h e 胁f w a sd i s r i l p t e di i lt h ex a l 8 6 3 j s 帅f d ，砂c 已sc k w “昌例sa n dx a l 8 6 3w e r ec u n u r e d i nt h es h a k e nn a s kr e s p e c t i v e l y a n dt h ep m d u d i o no fc l a v l l l a n i ca c i dw a sa n a l y z e d b yh p l cw j t ht h ed i 归e c r e n tc u n u r et i m ei n t e r v a l ，a i l dt h ey i e l dw a sa p p r o x i m a t e l y2 t i m e sh i g h e fi i it h ex a l 8 6 3a tt h e 缸h i g h e s tp m d u c t i o np o i i l t 1 nt h e 向l l o w i i l ge x p e r 主1 1 舱n t ，t h e c o m p a t i b l e 铲o 、t h c o n d i t i o no fg e i l o 腓 m o d i f i e ds t r a i nw a si n v e s t 逗a t e di nt h es h a k e nn a s ke x p e r i m e n t i tw a sp e r f o 珊e db y v a r y j i l go n e - 蠡c t o r a t a t i m e ，s u c ha sc a r b o ns o u r c e ，n i t r o g c ns o u r c e ，c o m p l e xc a r b o s o u r c ea i i dt h eo p t i m a lp r o p o n i o nb e t w e e nc a r b o ns o u r c ea n dn “m g e ns o u r c e g l y c c m l 卸dd e x t r i l l ew e r ec h o s e nt ob et h ec o m p l e xc a r b o ns o u r c e ，a n dt h en l o l p m p o n i o nw 勰1 ：1 - s o y b c a np o w d e ri sc h o s e nt ob ct h cn n m g c n u r c e a m dt h ei l p m p o r t i o no fn i t r o g e ns o u r c e 柚dc a r b o ns o u r c cw a s1 ：4 t h ei n n u e n c eo fp h o s p h a t e a n da n t i f b r mw e r ea l s od i s c u s s e d ac o n c l u s j o nc a nb ed r a w nt h a tt h ea d d “i o no f o 2 酽c a c l 2 t ot h cm e d i u mw i t h3 0 ls o y b c a np o w d e ra st h cn i t r o g c ns o u r c cw m f a c i l m l t et h ea c c u 舢l a t i o no fc l a v l l h n i ca c i d a f 【e ras e r i e so fo p t i m i z a t i o n ，t h e c 0 i n p o s i t i o no fw a sf i n a l i z e d ，c o n t a i n i n gs o y b e a np o w d e r ，o l y c e r o l ，d e x t r i n e ，c a c l 2 a n dm g s 0 4 7 h 2 0w i t ht h ec o n c e m r a t i o no f3 2 酣，7 4 l6 6 l0 2 la n d0 2 5 l r e s p e c t i v e l y a th s t ，t h ev e c t o rf o rc 册lg e n ek n o c k o u ta n d e x p r e s s i o nv e d o r so f c ( rg e c ， c k r g e n ea n dc n s 2g e n ew e r ec o n s t n l c t e d t h ep r e l i m i i l a r ys c r c e n i i l gf o rc 堋1g e n e l 【i l o c k - o ms t r a j i lw a si i l v e s t i g a t e d i ns h o r t ，t h i si sa ni m p o n a n tf i i n d a m e m a lw o r k 旬r t h ef u n h e rg e n e t j ce n g i n e e r i i i gt e c h n i q u eo nt h es t r 缅 k e yw o r d s ：勋翠幻，缈俚5c 肠，喀已旭s ，c h v u l a n i ca c i d ，缸fg c n e ，g e n ed i s f u p t ，c w 珂1 g e n e ，( t c 口rg e n e ，o p t i m i z 妯go ft h ef e m e n tf a c t o r s 克拉雏酸高产茵株的筛选厦发酵条件的优化 s c n n c 3 ) i y 翻 b p a m 挪 品盯p 6 缸 b s a b p c 口f d d h 2 0 e c d 矗 e d l a 勋 p b s g + c h h p l c h y g f n f i p t g k m m m 0 d o r f d o r p c r 缩略语 r e p t o m y c e sc l 讥7 u l i g e r w s a p r a m y c i i ir e s i s t a n c eg e n e c h v u l a n i ca c i d b a s c p a j r 印r a m y c j i l a m 曲i l l i l l a t t a c h i l 他n ts i t eo f p h a g c b l a d a m a s eg e n e b o v 沁s e r u ma i b u i i l i n b a s cp a 打 g e n e c n 。0 d 如gc h l o r a j 呷h c n i c o l a c c t y l t f a n s f e r a s e d o u b l ed i s t 埘e dw a t e f z 沁c e 一曲缸玎 t 1 l y k cd i a i t l j i l e t e t r a a c e t j ca c i d k 酗b a s e p h o s p h a t eb u 脆f e ds a l i i l e p e r c c n t a g eo fg + c c o n t e n t h o u r h 培hp e r 向r 瑚n c e l i q u i d c h r o m a t o g r a p h y h y g m m y c i l ir e s i s t a c eg e n e g e n ee n c o d i l l g 如r 抽t e g r a o fp h a g e i s o p r o p y l - t l l i o g a l a t o p y r a i l o s i d e k 柚a i n y c m m i l l u t e o p t i c a ld e n s i t y o p e nr e a 幽 唱丘卸【l c o r 适抽o fr e p l i c a t i o n o 吨i i lo f t r a l l s f e f p o 】y m e r a s ec h a 证r c a c t i o n v 棒状链霉菌 阿泊拉霉素抗性基因 克拉维酸 碱基对 阿泊拉霉素 氨苄青霉素 噬菌体d n a 上的附着位点 b 内酰胺酶基因，编码氨苄青霉 素抗性 牛血清白蛋白 碱基对 氯霉素酰基转移酶基因，编码氯霉 素抗性 双蒸水 大肠杆菌 乙二胺四乙酸 千碱基对 磷酸盐缓冲液 g + c 百分含量 小时 高压液相色谱 潮霉素抗性基因 噬菌体整合酶基因 异丙基硫代半乳糖苷 卡那霉素 分钟 光密度值 开放阅读框架 复制起始位点 转移起始位点 聚合酶链式反应 中山大学硕士学位论文荆琛峰 p o l y e t h y l e n eg l y c o l g c n ee n d 访gf o e c o m l 痂a s e r e p l i c o n s e n s i t i v h y s o d i u md o d e c y ls u l f a t e s e c o n d s t r e p t o m y c i l lr e s i s t a n c eg e n e 1 y i s a c e t a t e - e d t ab u 位r 1 y i s e d t ab u 旋r n - t r i s ( h y d r o s y m e t h y l ) m e t h y l 2 一 a i i l 协o e t h a n e s u l p h o n i ca c i d t 1 1 i o s t r e p t o n 聚乙二醇 重组酶基因 复制子 敏感性 十二烷基磺酸钠 秒 链霉素抗性基因 t r i s 乙酸e d l a 缓冲液 t r i s e d l a 缓冲液 n 一三( 羟甲基) 甲基一2 一氨基乙烷 磺酸 硫链丝菌素 & 盯h 鲁 挈叩。螂；|卅眦珊|9 ；l 克拉维酸高产苗株的筛选厦发酵条件的优化 第l 章绪论 自二十世纪4 0 年代使用第一个b 内酰胺类抗生素青霉素以来，由于其广泛 性和安全性，已被广泛地应用于临床，治疗各种感染。随后问世的大环内酯类， 氨基甙类抗生素又使肺炎、肺结核的死亡率降低了8 0 ，当时曾有人断言：人 类战胜细菌的时代已经到来。但是，事实并不像人们想象的那样美好，许多抗生 素在应用多年后出现了不同程度的药效减低。由于青霉素的广泛使用，某些细菌 尤其是金黄色葡萄球菌对青霉素产生了耐药性 a j l a r o w a z d e m a i n 1 9 7 8 ： n e u ，1 9 9 2 ) 。目前公认的细菌耐药机制主要有4 种：产生b 内酰胺酶，酶解破 坏8 内酰胺类抗生素；改变细菌外膜通透性，使抗生素无法进入菌体而发挥 抗菌作用；改变靶位蛋白，使抗生素无法与之结合或降低抗生素对靶位蛋白的 亲和力，从而降低抗菌作用：流出泵机制( e f f l u xp u m pm c c h a n i n s m ) ，细菌内 膜降低对抗生素的通透性或抗生素从体内泵出的机制，使菌体内抗生素量减少 ( 官兰，1 9 9 8 ) 。其中产生b 内酰胺酶是最主要的耐药机制。 有两条途径来克服b 内酰胺酶的破坏作用。首先改变b 内酰胺酶的水解不 敏感，保持抗生素的效力。这是寻找和设计0 一内酰胺抗生素的主要着眼点。第 二是使用近似莉，在与抗生素协同作用中，使b 一内酰胺酶失去活力。第一类是 青霉素和头孢霉素类( 如甲氧西林) ，他们先和酶结合，这种结合至少有一定程 度的可逆性，随后通过正常的水解作用，依次转变为青霉素酸或头孢菌素酸及进 一步的降解产物。这些均属于可逆性竞争性抑制剂。第二类是近1 0 余年来发现 的不可逆竞争性抑制剂，即所谓“自杀性”的6 内酰胺类化合物，它们在正常 的水解反应过程中，不同程度地出现一些次级反应以稳定酶一底物中间体，导致 b 内酰胺酶不可逆地抑制。自7 0 年代以来，已报道的不可逆竞争性抑制剂有天 然来源的克拉维酸( 棒酸) 和碳青霉烯以及( 半) 合成的青霉烷酸亚矾和卤代青 霉烷酸。这些化合物本身是弱的抗生素，但在与对b 内酰胺酶敏感的b 内酰胺 类抗生素合用时有增效作用。在已报道的各种新型抑制剂中，对克拉维酸和青霉 烷砜研究的最为彻底。 克拉维酸( c l a v u l a n i ca c i d ，c a ) 是油状液体，常温下很不稳定，其钠盐是 针状晶体，旋光度【a 】。2 4 约为+ 5 4 ，在分子结构上由b 内酰胺环与恶唑环构成 的双环体系。为一个稠合双环8 内酰胺结构洇1 一1 ) 。它以氧原子取代了青霉素 中山大学硕士学位论文荆珲峰 及头孢霉素噻唑环中的硫原子，具有作为b 内酰胺酶抑制剂所必需的3 r ，5 r 立 体化学结构( b f o w ne f 口f ，1 9 7 6 ) 。克拉维酸的结构与其它天然b 一内酰胺类抗生素 不同之处还在于它c 2 位上有一个b 一羟基乙叉取代基，雨在c 6 位上没有酰胺基。 “ 应广心 图1 1 克拉维酸的分子结构式 f i g1 1s t 珈c t 町e0 f d a l a i ca d d 克拉维酸抗菌活性很弱( 最小抑菌浓度为2 5 1 2 5u g m 1 ) ，但它是强力、广 谱且不可逆的b 内酰胺酶抑制剂。不论在体外还是体内都能同革兰氏阳性菌和 革兰氏阴性菌，特别是金黄色葡萄球菌、肺炎克雷伯氏和奇异变形菌产生的b 内酰胺酶生成牢固不可逆的结合物，从而抑制耐药性细菌对b 内酰胺类抗生素 的分解作用，恢复青霉素类及头孢素类抗生素对许多产生b 内酰胺酶的耐药菌 的抗菌活性。 克拉维酸对金葡菌产生的b 一内酰胺酶和广泛存在于肠杆菌属细菌、流感杆 菌、淋球菌和卡他布汉菌的质粒介导的b 内酰胺酶有强大的抑制作用；对肺炎 杆菌、奇异变形菌和脆弱类杆菌所产生的染色体介导的b 内酰胺酶也有快速抑 制效果；对摩根杆菌、沙雷菌、绿脓杆菌等介导的b 内酰胺酶的抑制作用则差 些。通过克拉维酸对b 内酰胺酶的抑制作用，使氨苄西林、阿莫西林、头孢哌 酮等不耐酶抗生素的抗菌谱增大，抗菌作用显著加强。 1 1 克拉维酸产生菌 1 1 1 克拉维酸产生菌的发现 1 9 7 1 年l j l l y 研究所的h j g g e n s 和勋s t c n e r b 从南美土壤中分离到一株头孢霉 素c 产生菌带棒链霉菌( 跏印幻，c e sc 肠距萨r 淞) ，在其代谢产物中还发现有其 它b 内酰胺类抗生素如异青霉素n ( i s o p e n i c i l l i l ln ) 和去乙酰头孢菌素 c ( d e a c e t y l c e p h a l o s p o r i nc ) 。s c 缸v h f f g p 5 的不同菌株还能产生非b - 内酰胺类抗 生素如全霉素( h o l o m y c i l l ) ，衣霉素( t u n i c a m y c i n ) 等。1 9 7 6 年英国b e e h a m 公司 b r o 枷等首次从带棒链霉菌( s c 肠f 堙蟹，“sa t c c 2 7 0 6 4 ) 的发酵液中发现了天然 的b 一内酰胺酶抑制剂c 钺b r o w n b u t t e n o n h ，1 9 7 6 ；b a g 萨l e y “口f ，1 9 9 7 ) ，它本身的 2 克拉维酸高产菌株的筛选及发酵条件的优化 抗菌活性不高，但对多种b 内酰胺酶有特异抑制作用，能增强青霉素类及头孢 菌素类抗生素对许多b 内酰胺酶微生物的抗菌活性。 除棒状链霉菌作为克拉维酸产生菌外，在b e e c h a m 的专利中( 英国专利 1 ，5 6 3 ，1 0 3 ) s j u i n o n j i n e n s i s 也被用作克拉维酸的产生菌，此菌株保存在日本 发酵研究所，编号f e r m 1 5 4 5 ，同被保存在日本发酵研究所菌种保藏馆的 s k a t s u r a h a m 卸u s ，编号：f e r m 3 9 4 4 也被用作克拉维酸的产生菌。此外，还 有报道国内科研人员在重庆地区筛选到一株克拉维酸产生菌棒状链霉菌的一个 亚种( s c a i i e r u ss u b s p 3 ，0 4 8 ) ( c k n 盯口l ，1 9 9 8 ) 。 1 1 2 克拉维酸产生菌的特征 该克拉维酸的产生菌的气生菌丝体为网状，末端分裂成许多孢子，每个短棒 状侧链通常生长l 一4 个孢子。孢子形状为长椭圆柱形，平均长度是0 6 4 到1 5 3 pm 。用电子显微镜可以观察到光滑孢子表面，基内菌丝不分裂也不生长孢子。 在大量孢子生成的培养基中气生菌丝颜色由暗扶绿到中等灰色，在其它培养 基中菌丝颜色由白到扶，基内菌丝由浅黄到灰黄，都不产生可溶性色素。 棒状链霉菌生长的p h 范围是5 o 8 5 ，在p h4 以下或9 以上时不生长。产 生孢子的p h 值范围是5 0 6 5 ，其中p h6 时产生最多。 1 2 克拉维酸的作用机理 1 2 1b - 内酰胺酶 1 9 4 0 年牛滓的a b r a h 枷和c h a i n 在大肠杆菌提取物中发现了令青霉素失活 的物质，这是首次有关b 内酰胺酶的报道。1 9 4 4 年i ( i 曲y 报道金葡菌对青霉素 耐药性是因为其产生了b 一内酰胺酶。随着0 内酰类抗生素临床应用的增多，新 的b 内酰胺酶也不断产生，如光谱半合成青霉素氨苄西林、羧苄西林以及6 0 年 代第一个使用的头孢霉素，甚至7 0 年代使用的头孢菌素，肠杆菌属头孢菌素和 头霉素类、单酰胺类和碳青霉烯类等广泛应用于l 晦床，均诱发引起了更多革兰氏 阴性菌染色体介导的b 一内酰胺酶的产生。1 9 8 9 年b u s h 根据底物及酶抑制剂的 作用类型，将已知的b 一内酰胺酶划分为四种类型( b u s h ，1 9 8 9 ) ，其中a 、c 、d 型酶的活性中心是丝氨酸。a 型酶主要是t e m 和s h v 酶，分子量约为姗， 优先水解青霉素类抗生素；c 型酶主要是由阴沟杆菌、柠檬酸杆菌、铜绿假单孢 菌及克雷伯氏菌等所产生的。分子量约为3 9 0 0 0 ，优先水解头孢霉素类抗生素； 中山大学硕士学位论文荆珲峰 d 型酶包括o x a 及p s e 2 ，对反应底物的特异性还未被充分认识：b 型酶的活性 中心至少含有一个金属离子，称为金属b 一内酰胺酶，不仅对青霉素和头孢霉素 类敏感，而且能分解包括碳青霉烯在内迄今所有类型的p 内酰胺。据报告，现己 鉴定的b 内酰胺酶近2 0 0 种，包括随着第三代头孢霉素广泛应用而出现的超广 谱b 内酰胺酶。1 9 9 5 年b u s h ，j a c o l y 与m e d e 的s 进一步完善了分类。 1 2 2 克拉维酸作用机理 克拉维酸同0 内酰胺酶的活性位点有很高的亲和力，能与b 内酰胺酶的催 化中心结合，以竞争性抑制方式发挥作用。它通过其b 一内酰胺羰基与酶分子中 的丝氨酸羟基发生反应打开b 内酰胺环而使酶酰化。该反应类似于b 一内酰胺酶 同敏感底物如青霉素之间的反应。对于b 一内酰胺酶类抗生素底物，酰基一酶复 合物迅速水解，释放出酶和无抗菌活性的产物；而由克拉维酸与酶形成的酰基一 酶复合物责相对比较稳定，水解很慢，或者因为一内酰胺环的水解及随后的恶 唑烷坏的打开使暴露出的反应基团同酶发生进一步反应而使复合物更加稳定，。 产生这种类型抑制作用的化合物被称为自杀性抑制剂或依赖失活作用机理的灭 活剂。由于这些反应具有时间依赖性，因此克拉维酸可称是一个进行性抑制剂( 陈 代杰，1 9 9 9 ) 。 酰基一酶 b 一内酰胺酶 图卜2 克拉维酸和b 内酰胺酶之间的反应 r g1 - 21 1 ”i n t 盯a c t i o nb c t w e e nc a a n db l a c t a m a s e 4 克拉维酸高产茵株的筛选及发酵条件的优化 1 3 克拉维酸的生物合成 1 3 1 克拉维酸合成前体物质 e l s o n 用c 1 3 标记物研究c a 的合成途径，酯酸盐可形成c a 分子的一部分 五碳骨架( 碳2 ，3 及8 ，9 ，1 0 ) ，甘油可提供b 一内酰胺环( 碳5 ，6 ，7 ) 的碳骨架( g o u v e i r d 口f ，2 0 0 1 ) 。鸟氨酸与精氨酸均可有效掺入c a ( 碳2 ，3 ，8 ，9 ，1 0 ) 。但因鸟氨酸 为精氨酸合成代谢中的一个中间产物，故精氨酸的掺入并不能排除鸟氨酸作为 c a 合成的直接前体( g o u v c i r “口，2 0 0 3 ) 。v a l c n t i l l 等利用不能将精氨酸转变为鸟 氨酸的她f 、a 唱g 突变株为研究菌株，发现精氨酸为c a 的直接前体。标记的 甘油、甘油酸、丙酸赫和b 一羟基丙酸盐均可掺入到c a ( 碳5 ，6 ，7 ) ，但乳酸或 甘油酸二位碳上的氢却不能掺入，说明这两种物质在掺入前均需被转变成丙酮酸 盐。随着c e a 合成酶( 催化精氨酸和三碳单元的连接) 被分离纯化，研究者发 现此酶以d 一3 一磷酸甘油醛为底物。因此，尽管其它三碳物质可能最终有不同 的利用效率，但显然d 一3 一磷酸甘油醛是c a 分子中三碳单元的直接前体。 综上所述，克拉维酸生物合成前体，c 3 单位来源于甘油或它的代谢产物， 或其它途径来源的磷酸烯醇型丙酮酸，但d 一3 一磷酸甘油醛应该是克拉维酸分 子中三碳单元最直接前体物( k r o l 甜口，1 9 8 9 ) 。c 5 单位来源于t c a 循环的中间 物n 一酮基戊二酸的转化产物；谷氨酸、鸟氨酸和精氨酸，其最适合的前体物似 以精氨酸更为直接( p i t l i k & t o w n s e n d ，1 9 9 7 ) 。必须明确，不论是c 3 单位或c 5 单位的最佳前体都直接或间接经过t c a 循环、糖衍生阶段，所以皆或多或少地 参与克拉维酸所有碳骨架合成。 1 3 2 克拉维酸生物合成途径 通过同位素标记、中问代谢产物的分离、酶的纯化及其特性和基因的研究， 克拉维酸生物合成途径如今已部分阐明( p i t l i k t o w n s c n d ，1 9 9 7 ：l 证a s i b d 吐g i l e z g a r c 趣2 0 0 0 y ( 图1 3 ，1 4 ) 研究中首次分离得到的代谢中间产物 是克拉维酸( c h v u h n i ca c i d ) 和前克拉维酸( p r o c l a v i t l a n i ca c i d ) ，后来又分离得 到两种胍基化合物n 2 2 一羧乙基一精氨酸( n 2 2 一m b o x y e t h y l a 曙i n i n e ， c i 认) 和脱氧胍基前克拉维胺酸( d e o x y g u a l l i d n 叩m c h v 枷j 1 1 i ca c i d ，d g p c ) 。 c e a 合成酶( c e as y t j l c t a s c ) 由位于克拉维酸基因簇中的p y c ( p y r u v a t e - c o n v e r t i n g ) 基因编码，含5 8 2 个氨基酸，具有识别丙酮酸盐及硫氨素 5 中山大学硕士学位论文荆琛峰 焦磷酸( t p p ) 的结构域( s a l o w e 甜口f ，1 9 9 1 ) 。在 t p 、m 9 2 + 存在下，c e a 合 成酶以类似于肽键合成酶的方式催化d 一3 一磷酸甘油醛同精氨酸以c n 键形 成c e a ，但其辅因子t p p 的功能却不同于常用于辅助催化形成c c 键的t p p 的功能。因为丙酮酸盐并不是旺a 合成酶的真正底物，故p y c 基因应当重新命 名为c e a s ( w u 酣口z ，1 9 9 5 ) 。 b 内酰胺合成酶( 6 一l a c t a ms y n t h e t a s e ，6 b ) 催化血转变为d g p c ，在 衄p 、m 9 2 + 存在下，它催化c e a 在分子内形成酰胺键，产生d g p c 。c a 基i 司簇 中，6 厶的破坏将导致菌突变株积累大量的c e a ，且c a 不能被合成。在培养基 中添加d g p c ，可使突变株恢复c a 生产能力( p e r e z r e d o n d o 甜吐，1 9 9 9 ) 。 c a s 具有两个异构酶，即c a s l 和c a s 2 ，分别被基因c 口订和蛇编码。 c n s j 和叩妇在基因组上相距约2 0 k b 。它们均为非血红素铁双加氧酶，以d g p c 和n 酮戊二酸作为底物，将氧分子中的一个氧原子以羟基的形式引入d g p c ， 形成胍基前克拉维胺酸。而后通过两步氧化即环化和去饱和( 脱氢) 使前克拉维 胺酸转变为克拉维胺酸。 克拉维酸高产茸株的筛选及发酵条件的优化 c i 州a m i n 4 协 p 妇拍j t l 羽睁 c a s 和h s 2 - - c a s 圮 s 2 h 嚆c 鹳伽2 斗 c s 1 腻s 2 一删辜驴洲6 h 弋矿 一 、 o 廿悖rc i a v a n 僵 图1 3 克拉维酸合成代谢途径 c l a v u i a l l i c 备c i d f i g1 3b i y n t h e t i cp a m w a yl e a d i n gt oc a ( u f a s r o d r 暗l e z - g a r c ，a ，2 0 0 0 ) 1 kg e 他sa n d e n z y m i c a c i i v i t i e sc l l a r a c t e r i z c da 陀t h e f o l l o w i n g ：c e 酊( a l s 0m h 帕d c )e n c o d i n g 2 - c a r b o x y e l h y l a r g i n i 耻s y n i h a ( c e a s ) ( k h l e e l id 以，1 9 9 9 ；p r e z r e d o n d 0 甜以，1 9 9 9 ) ，6 b c o d i n gb - l a c t a ms ”t h 咖( b l s ) ( b a c h m ne f 以，1 9 9 8 ；b a c h 脚慨n d ，2 0 0 0 ) ，5 2 e n c o d i n gd a v a i n i n a t es y i i t h a ( o 哟( e l s 彻“口f - ，1 9 8 7 ；h o d 萨甜口f ，1 9 9 5 ) ，耐e i i c o d i n g p r o c l a v a i l l i 砷t ea 删d i n o h y 出o l a ( p a h ) ( w u 甜口f - ，1 9 9 5 ) 知d r ( a l 越n 虻dc 口由e 舵o d i n g c l a l a n a t e - 9 一a l d e h y d er e d 嘣a ( o 咀) 科i c h d l s 咖“以，1 9 9 4 ；k r e z r e d d o 甜以，1 9 9 8 ) 7 中山大学硕士学位论文荆琛峰 il | 囊i噩墨i 墨i 罾蠹i p c b r c e n sb t s p n h c a s 2 o r 覃6qr _ 研d n r c a r 图1 4 克拉维酸的生物合成途径和基因簇 f 噜l - 4 t h ep a t h w a ya n dg e n ec l u s t e r0 f c a b i o 驴圮s i s p a h 酶催化胍基前克拉维胺酸脱去胍基。此蛋白与脒基转移酶非常相似， 催化反应需要m n 2 + 的存在。它由硼 基因编码( p e m u m m “a f ，1 9 9 8 ) 。麦芽糖结 合蛋白与p a h 蛋白融合表达，在除去分子伴侣( 麦芽糖结合蛋白) 后得到的多 肽具有p ：a h 活性，催化胍基前克拉维胺酸转变为前克拉维胺酸。此反应的k m 值为c a s 2 的5 0 1 0 0 倍，推测它很可能是c a 合成的限制性步骤。 c a 碳9 位上的氧来自于标记的0 2 。克拉维胺酸碳9 位上的氨基被氧化脱氨 后形成c a 碳9 位上的醛基( 即克拉维醛) 。这种化合物已在s c 缸v “啦萨m sd c l 2 8 ( c a 合成缺陷型) 突变株中被检测到。克拉维醛因具有相应的3 r ，5 r 立体化 学结构而有b 一内酰胺酶抑制活性，但与c a 相比不够稳定。目前催化形成克拉 维醛的酶尚未得到分离，c a 基因簇中亦未发现具有编码氨基转移酶的基因。 催化克拉维醛转变为c a 的酶是依赖n a d p 的克拉维醛还原酶( c h v a l d e h y d e r c d u c t a s e ，c a r ) ，此酶分子量为2 7 1 8 h 。它由位于叩心基因下游4 k b 处的c 口， 基因编码。在c n r 基因下游，还有一些与c a 合成相关的基因，如编码类细胞色 素p 4 5 0 蛋白位于翻r 基因下游，是c a 合成所不可缺少的编码酶基因。 经推测，o r f 6 编码蛋白具有精氨酸氨酰基转移酶活性；o r f 7 编码一种与 多肽转移有关的酶。c a 合成相关的部分基因序列已经被阐释，而其全部基因序 列仍待进一步被揭示。 必须强调指出，上述研究结果均在合成培养基上进行，在丰富培养基中进行 发酵究竟影响多大，还未见报道，因而，它的参考价值还须经过复杂的代谢调控 加以验证。更为重要的野生菌株同生产上应用的高产菌株相比在代谢上有很大差 别，如葡萄糖对产黄青霉素合成青霉素有阻遏作用，但经过诱变后的高产菌株可 8 克拉维酸高产茼株的筛选及发酵条件的优化 以用葡萄糖发酵，所以利用原菌株进行生物合成途径来指导发酵必须全面考虑， 不能全盘套用。 1 4 克拉维酸合成代谢调控 在链霉菌中，抗生素合成和孢子形成是由基因的级联调控所控制。丁酰内酯 家族内的小的扩散因子( 如因子a ) 就位于级联调控的最顶端，而代谢途径专一 性的转录调控因子位于记联调控的最底端。 c c r 基因，位于头霉素c 基因簇中肠f 上游4 k b 处，其编码酶由2 5 6 个氨 基酸组成，功能类似于a c t i l 一0 r f 4 调控蛋白，同通用的调控蛋白a 盘r 和抗生 素专一性调控蛋白d i 、r c d d 、a c t i i 0 r f 4 具有2 6 2 9 的同源序列。c c 趣 属于s a r p 类蛋白( s l r e p t o m y c c sa m i b i o t i cr c g u h t o r yp r o t e i l i ) ，象o m p r 家族类 调控蛋白d n a 结合域的三维结构一样，s 蛆冲蛋白在d n a 结合域的螺旋结构 上也包含大量保守氨基酸。最新研究表明其作用是结合于c c f d - c n 硷i 基因之间的 双向启动子上，对于头孢霉素和克拉维酸生成途径的中、下游所需要酶的转录过 程起到调节作用。而且它还结合在自身的启动子上，是一个正调节因子( i f e n e “ f ，2 0 0 2 ) 。c c 口r 的突变将导致头霉素c 、c a 或其它棒烷类合成的停止；当回补 c c 积基因后，头霉素c 和c a 的合成得以恢复；尽管头霉素c 和c a 这两个b 内酰胺类物质的合成途径截然不同，当增加c c 棵拷贝数后，头霉素c 、c a 的 产量都成倍增加。 c f 积是与克拉维酸合成相关的另一调控基因，其位于c a 基因簇下游的3 k b 处，方向与c 口蛇相反。它编码一个分子量为4 7 k d 的多肽，同许多l y s r 家族的 转录调控因子具有同源性。此多肽在n 端和c 端存在有特征性的螺旋转角螺旋 基序，这与转录调控因子的结构相一致。c 肠r 基因拷贝数的增加导致c a 和丙 酰克拉维胺产量的提高，同时伴随着头霉素c 的产量的降低。 纰r 基因转录为1 7 k b 的单顺反子，它并不受自身蛋白的调控。在c c a r 突 变菌株中，如r 和彻只基因转录子不能被检测到；在c f 口r 突变菌株中，c ( 非 基因及其下游的相关基因都不表达，菌株合成c a 的能力丧失，而克拉维胺酸大 量积累，头霉素c 的产量也大量提高。这表明c l 承调节c a 合成中后几步基因 的表达，c c a r 和c l a r 级联调控头孢霉素c 和c a 的合成。 c c a r 和c l a r 调控模式如图所示： 9 中山大学硕士学位论文荆琛峰 图