（植物学专业论文）金丝慈竹atcrn1同源基因becrn1的分离及遗传转化研究.pdf

摘要 为了研究a t c r n l 同源基因b e c r n l 的功能并建立金丝慈竹遗传转化体系， 本实验选用金丝慈竹作为原材料，进行以下各项研究：采用e d n a 末端快速扩增 ( r a c e ) 技术，在金丝慈竹叶片中分离得到b e c r n l ；对b e c r n l 进行生物信息学 分析；植物双元表达载体p c h f 3 b e c r n l 构建与导入；采用组织化学法对金丝 慈竹愈伤组织进行g u s 基因瞬时表达检测金丝慈竹；愈伤组织的抗生素敏感性 测试。结果表明： ( 1 ) 所获得的e d n a 全长为l6 4 6 b p ，带一短p o l y ( a ) 尾巴。该e d n a 包含14 7 3 b p 长的开放阅读框( o r f ) ，编码一个含有4 9 1 个氨基酸残基的多肽，含有长度4 5 b p 的5 u t r 乘i1 2 8 b p3 u t r 。 ( 2 ) n c b ib l a s t 序列分析表明，b e c r n l 与水稻中的相关蛋白( e e c 8 0 5 7 4 1 ) 一致性和相似性最高，分别为4 1 4 4 8 7 ( 8 5 ) 和4 4 6 4 8 7 ( 9 1 ) 。与拟南芥中的c r n l 蛋白( n p1 9 6 8 8 4 1 ) 一致性为5 9 ，相似性为7 5 。 ( 3 ) 构建了植物双元表达载体p c h f 3 b e c r n l ，并采用冻融法导入农杆菌 g v 310 1 工程菌中，为以后验证b e c r n l 基因的功能奠定了基础。 ( 4 ) 采用组织化学法进行g u s 基因瞬时表达检测表明，金丝慈竹愈伤组织可 能有p 葡萄糖苷酸酶的本底活性，所以不适合利用本法进行筛选。 ( 5 ) 金丝慈竹愈伤组织的抗生素敏感性测试表明，卡那霉素、p p t 和潮霉素 都不适用于金丝慈竹抗性愈伤组织筛选。 关键词：金丝慈竹；克隆；b e c r n l ；r a c e ；愈伤组织 t h ei s o l a t i o no fb e c r n lf r o mb a m b u s ae m e i e n s i s v i r i d i f l a v u s a n ds t u d yo ng e n e t i ct r a n s f o r m a t i o n a b s t r a c t i no r d e rt os t u d yt h ef u n c t i o no fb e c r n l t h eh o m o l o g o u sg e n e0 ta t c r n l 、 a n de s t a b l i s ht h eg e n e t i ct r a n s f o r m a t i o ns y s t e mo fb a m b u s ae m e i e n s i s v i r i d i f l a v u s t h i ss p e c i e sw a ss e l e c t e da sr a wm a t e r i a l st od ot h ef o l l o w i n gr e s e a r c h ：b e c r nlw a s i s o l a t e df r o mt h el e a v e so fb a m b u s ae m e i e n s i s v i r i d i f l a v u s b yt h et e c h n o l o g yo f r a p i da m p l i f i c a t i o no fc d n ae n d s ( r a c e ) ；b i o i n f o r m a t i c sa n a l y s i s0 tb e c r n lw a s m a d e ；t h ep l a n te x p r e s s i o nv e c t o rp c h f 3 b e c r n lw a sc o n s t r u c t e da n di n t r o d u c e d ； t h ea n t i b i o t i cs e n s i t i v i t yt e s to fb a m b u s ae m e i e n s i s v i r i d i f l a v u s c a l l u sw a sd o n e ； t r a n s i e n te x p r e s s i o nd e t e c t i o no ft h eg u sg e n ew a sd o n eb yh i s t o c h e m i c a lm e t h o d o nb a m b u s ae m e i e n s i s v i r i d i f l a v u s c a l l u s t h er e s u l t si n d i c a t e dt h a t ： ( 1 ) b e c r n lh a sat o t a ll e n g t ho f a n de n c o d e sap r o t e i no f 4 91a a i th a s w i t ht h el e n g t ho f1 2 8b p 16 4 6 b pw i t ha no p e nr e a d i n gf r a m eo f14 7 3 b p a5 u t rw i t ht h el e n g t ho f 4 5 b pa n da3 u t r ( 2 ) n c b ib l a s ts e a r c hi n d i c a t e dt h a tb e c r n1h a st h eh i g h e s th o m o l o g yw i t ha p r o t e i nf r o mo r y z as a t i v a ( e e c 8 0 5 7 4 1 ) i nt h ea m i n oa c i ds e q u e n c e t h ei d e n t i t y a n ds i m i l a r i t yb e t w e e nt h e ma r e8 5 a n d91 r e s p e c t i v e l y t h e i d e n t i t ya n d s i m i l a r i t yw i t hc r n lf r o ma r a b i d o p s i st h a l i a n a ( n p1 9 6 8 8 4 1 1a r e5 9 a n d7 5 r e s p e c t i v e l y ( 3 ) t h ep l a n te x p r e s s i o nv e c t o rp c h f 3 一b e c r n lw a sc o n s t r u c t e da n ds u b s e q u e n t l yi n t r o d u c e di n t o 彳g r 0 6 口c f e ，f “，”t u m e f a c i e n ss t r a i ng y 3 1 0 1v i at h ef r e e z e t h a wt r a n s f o r m a t i o nm e t h o d ( 4 ) t r a n s i e n te x p r e s s i o no fgu sd e t e c t i o ni n d i c a t e dt h a tt h ec a l l u so fb a m b u s a e m e i e n s i s v i r i d i f l a v u s p r o b a b l yh a sb a c k g r o u n d1 3 - g l u c u r o n i d a s ea c t i v i t y ( 5 ) t h ea n t i b i o t i cs e n s i t i v i t yt e s ts h o w e dt h a tt h ec a l l u so fb a m b u s ae m e i e n s i s v i r i d i f l a v u s w a sn o ts e n s i t i v et ot h ek a n a m y c i n p p ta n d h y g r o m y c i n k e yw o r d s ：b a m b u s ae m e i e n s i s v i r i d i f l a v u s ；c l o n i n g ；b e c r n l ；r a c e ；c a l l u s i i 学位论文原创性声明 本人郑重声明：所呈交的学位论文，是本人在导师的指导下进行的研究工作 所取得的成果。尽我所知，除文中已经特别注明引用的内容和致谢的地方外，本 论文不包含任何其他个人或集体已经发表或撰写过的研究成果。对本文的研究做 出重要贡献的个人和集体，均已在文中以明确方式注明并表示感谢。本人完全意 识到本声明的法律结果由本人承j 旦。 学位论文作者( 本人签名) ：室譬斛多月工乡日 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解南京林业大学有关保留、使用学位论文的规定，同 意学校保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版( 中国科学技术 信息研究所；国家图书馆等) ，允许论文被查阅和借阅。本人授权南京林业大学 可以将本学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以汇编和综合 为学校的科技成果，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存和汇编本学位论 文全部或部分内容。 保密口，在年解密后适用本授权书。本学位论文属于不保密口。 ( 请在以上方框内打“ ”) 学位论文作者( 本人签名) ： 指导教师( 本人签名) ： 压憎1 年6 只) ，弓日 叩6 a ) 3 日 致谢 本研究是在丁雨龙教授和蒯本科教授悉心指导下完成的，从论文的写作修改 都得到了导师的深切关怀和精心指点。导师严谨的工作作风，精益求精的治学态 度，勇于创新的科研精神不断激励我；他们渊博的知识、丰厚的人格魅力给我思 想上带来的影响将使我受益终身。衷心感谢他们为我打开并引导我进入研究生学 习的大门，让我有宝贵的机会去学习植物学方面得知识，训练自己的实验思维， 提高科研能力，开阔我的视野，丰富了我的人生经历。 本论文的工作是在南京林业大学竹类所组培室和复旦大学植物抗衰老基因 研究实验室共同完成的，在这里我感受到了老师同学们真切的情谊。在论文的实 验过程中，承蒙竹类研究所王福升副教授、林树燕老师、张春霞老师支持，是她 们的关怀和指导才使实验能够顺利。感谢复旦大学梁宁菁老师对于我生活和学习 上的关心和照顾，为实验的顺利完成提供各种便利条件。 非常感谢南京林业大学吴涛硕士和李明硕士在实验上无私的帮助；感谢李林 博士、陈云霞博士、代为奇硕士、郝娟娟硕士、冯建元硕士、金奕硕士、寿玉婷 硕士、许孟见硕士、唐明瑁等师弟师妹们的支持与帮助，师门情意难忘! 特别感谢复旦大学博士魏强师兄在整个实验过程中，对我实验技术方面的热 心指导和帮助，传授实验心得和操作中的技巧。得益于他的淳淳教诲，我的实验 才会顺利完成。感谢复旦大学郭玉娟硕士在工作和日常生活中给予我许多的帮助 和支持。非常感谢任国栋师兄在完成实验和论文写作过程中给我的指导和建议。 感谢复旦大学的张艳艳老师和所有同学：任国栋、余进、杨立峰、邱凯、周茜、 高炯、王晓彦、吴守信等，他们在工作和日常生活中给予我许多的帮助和支持。 非常感谢同舍好友李墨爱硕士、焦秀杰硕士，感谢她们真诚的友谊和三年来 在生活上对我的关心和帮助! 感谢我的男友徐宪根，你们是我这三年研究生生活 中倾诉和聆听的伙伴，生活中的点点滴滴都将是我珍贵的回忆! 在此也祝愿你们 及家人平安幸福! 感谢我的父母，他们给了我无私的爱和关怀，在生活和精神上给我支持和鼓 励，使我能够安心的完成学业。是他们在我的求学路上给予我最大的理解和支持! 他们永远是我温馨的港湾! 最后，向辛勤培养我的母校一一南京林业大学全体领导和老师致以崇高的敬 意和真诚的祝福! 1 植物的衰老 第一章引言 植物的衰老是指一个器官或整个植株的生命功能衰退，最终导致自然死亡的 一系列变化的过程。它除了代表器官或组织生命周期的终结之外，在发育生物学 上也有着重要的意义( 姚真等，1 9 9 9 ) 。植物开始衰老的一个普遍现象是生长速率 下降，衰老的进一步表现是器官的颜色变化，如叶片、果实由绿变黄、变红，这 些都是外部的症状。实际上，早在症状出现之前生理生化上已经发生了一系列变 化，主要表现在以下几方面：光合速率的降低，核酸和蛋白质含量的下降，呼吸作 用的变化。体内活性氧、自由基代谢失调累积也是植物衰老的重要因素( 徐爱东， 1 9 9 9 ) 。而叶片是植物利用光能、合成有机化合物的重要场所，在植物生长发育过 程中起重要作用( c h r i s t e n s e nse ta l ，1 9 9 8 ) 。因此，研究叶片衰老就更加有意义。 叶片的衰老是植物的一个重要发育阶段。在这段时期内，植物在成熟叶片内 积累的物质，包括大量的氮、碳有机化合物和矿物质，将被分解并运送至植物其 它生长旺盛的部分，其中大部分被转移到种子内，为下一代的生长做好准备 ( n o o d e nld ，l9 8 8 ) 。在叶片衰老过程中，细胞结构、生理生化代谢以及基因表 达调控等都发生很多变化。在细胞结构上，最主要的变化是叶绿体的降解；在生 理生化变化中，叶绿素和蛋白质、膜脂和r n a 等大分子的分解以及营养物质再 利用等；分子水平上表现为许多衰老相关基因的活跃表达( g a nse ta l ，1 9 9 7 ) 。 1 1 叶片衰老与叶绿素降解 许多研究表明，叶绿素含量和衰老之间存在明显的负相关( m a r t i nce ta l ， 1 9 7 2 ) 。l e s h e m ( 1 9 8 1 ) 研究指出，叶片衰老最明显的表现就是叶绿素逐渐消失， 并伴随着黄化以及叶片的最终脱落。从衰老过程中叶绿体超微结构的变化也可以 看出叶绿体随年龄增长而逐渐解体。因而有人提出叶绿素分解是衰老的原发过程 及衰老的真正标志。 早在1 9 1 3 年w i l l s t a e r 等学者就阐明了叶绿素( c h l o r o p h y l l ) 的基本化学结 构；5 0 年后，有机化学家r o b e r t 成功地合成了c h la ，并因此于1 9 6 5 年荣获诺 贝尔化学奖。随后，人们对叶绿素生物合成代谢进行了广泛、深入的研究，其合成 途径现已明确，而叶绿素降解代谢研究却甚少( 沈成国等，19 9 8 ) 。h e n d r y 等发表 了综述“叶绿素降解一个生化过程”，这标志着叶绿素降解代谢研究的崭新 起点( 甘志军等，2 0 0 2 ) 。在最近几年中，对叶绿素代谢途径中没有颜色的代谢产 物结构的鉴定，逐渐揭示了高等植物衰老叶片中叶绿素降解途径的奥秘( m a t i l ee t a l ，1 9 9 6 ；r o d o n ie ta l ，1 9 9 7 ；t h o m a se ta l ，1 9 9 7 ；k r a u t l e rb ，2 0 0 2 ；o b e r h u b e re ta l ， 2 0 0 3 ；p r u l i n s k ie ta l ，2 0 0 5 ) 。 自从1 9 7 0 年以来，研究者已经提出了很多调控叶绿素代谢的途径。可是直到最近， 人们才得以阐明其内在的分子机制( a y u m it a n a k ae ta l ，2 0 0 6 ) 。叶片衰老过程中，植物细 胞结构最早最明显的变化就是叶绿体的衰退，而叶绿体包含了叶片7 0 以上的蛋白质 ( p y u n go k l i m e ta l ，2 0 0 7 ) 。叶绿素是高等植物进行光合作用的重要物质，同时也 是绿色植物的主要色素，主要有叶绿素a 和叶绿素b 两种。随着叶片的衰老，叶绿 素开始降解，叶片由绿变黄。m a t i l e 等( 1 9 9 6 ) 推测叶绿素b 的降解可能是通过先转 化为叶绿素a ，或叶绿素a 酸酯的形式而进一步降解。现在公认的叶绿素降解途 径被称为p a o 途径( h 6 r t e n s t e i n e rs ，1 9 9 9 ；m a t i l ee ta l ，19 9 6 ；h 6 r t e n s t e i n e rs ，2 0 0 6 ； t a n a k ae ta l ，2 0 0 6 ；e c k h a r d te ta l ，2 0 0 4 ；d a v y dw ，2 0 0 6 ；陈文峻等，2 0 0 1 ) 。 叶绿素降解途径 叶绿瓤匣雪b h 叶臻粕匡翼叶纾素口 叶缚 罔 酸酯t 2 c a o ： 叶绿泰( 酸酯) 口加氧酶 c a r ： 叶绿素( 酸酯) 口还原酶 c b r ： 叶绿奈( 羧醋】6 还原酶 叶 绿 索 循 环 细 胞 质 一弋时 白 妒c c 磷酸戊糖途径 运出质体兰里；0 二! 旦型癣笪萄糖 a d p 幅- ，t $ 2 - h y d r o x y l a t i o n 物种特异性去甲基化 一删液卜耕一 液嚅尹 泡 非酶催化构象变化 i l 二， l 图1 1 叶绿素降解的p a o 途径 f i g u r e l - 1c h lc a t a b o l i s m ：p h e o p h o r b i d eao x y g e n a s e ( e a o ) p a t h w a y 衰老的叶绿体 - + 掣邪- + 嚅 该降解机制包括六步( 图1 1 ) ：( 1 ) 叶绿素b 首先在叶绿素b 还原酶作用下形 成叶绿素a ；( 2 ) 叶绿素a 在叶绿素酶( c h l o r o p h y l l a s e ，c h l a s e ) 的催化下脱植基反 应脱去植醇，降解成为脱植叶绿素a ；( 3 ) 脱植叶绿素a 中间的镁离子在脱镁鳌合 酶( m g d e c h e l a t a s e ，m d c a s e ) 的作用下被脱去形成脱镁叶酸a ( p h a e o p h o r b i d ea ， p h e i d e ) ，它是叶绿素降解中最后的绿色色素；( 4 ) 脱镁叶酸a 的卟啉大环在脱镁 叶绿酸a 加氧酶( p h e o p h o r b i d eao x y g e n a s e ，p a o ) 和红色叶绿素降解还原酶( r e d c h l o r o p h y l lc a t a b o l i t er e d u c t a s e ，r c c r ) 的作用下经过两步反应被氧化开环。中间 产物是红色叶绿素代谢产物( r c c ) ，最终产物是p f c c ，它是有荧光的四吡咯线 性分子( h 6 r t e n s t e i n e rse ta l ，l9 9 8 ；k l w u t h r i c h ，2 0 0 0 ；a p r u z i n s k ae ta l ，2 0 0 3 ；j m m a c h ，2 0 0 1 ) 。由于卟啉环裂解与叶片色素( 绿色) 丧失有关，因此这一步是叶片衰 老时叶色黄化的关键步骤；( 5 ) 然后p f c c 被运出叶绿体，其c ( 8 2 ) 位被羟基化并 运送入液泡( m u h l e c k e rw e ta l ，1 9 9 7 ；r o d o n ise ta l ，1 9 9 7 ) ；( 6 ) 因为液泡里p h 值 偏酸性，修饰过的f c c s 的d 环和次甲基桥上发生非酶催化的异构，最后生成叶 绿素最终代谢产物：非荧光叶绿素代谢产物( n c c s ) ( m a t i l epe ta l ，1 9 9 2 ；k r e u z ke ta l ，19 9 6 ；m t i l l e rte ta l ，2 0 0 6 ；o b e r h u b e rme ta l ，2 0 0 3 ) 。 叶绿素酶和脱镁鳌合酶的活性被证明存在于没有衰老和衰老叶片中，但代谢 途径的第3 个酶，脱镁叶绿酸a 加氧酶( p a o ) 只存在于衰老的叶片中 ( h 6 r t e n s t e i n e rse ta l ，19 9 5 ；m u h k e c k e rw e ta l ，19 9 7 ；g i n s b u r gse ta l ，l9 9 4 ) ，它 的活性与叶绿素丢失的速率成正相关，因此它可能是叶绿素降解的一个关键酶。 1 2 叶绿素降解与滞绿 滞绿是指植物叶片在衰老过程中叶绿素不降解或降解不明显的现象。对绝大 多数植物来说，叶片的黄化反应，即叶绿素降解反应，是叶片衰老最直观的表现。 长期以来，叶绿素的净降解被认为是叶片衰老的必然反应之一。在发现了滞绿突 变体以后，这一传统观念受到了挑战。在衰老过程中保持叶片绿色的突变体叫“滞 绿突变体”。近年来的研究发现，不同的突变体虽然具有相似的滞绿特性，但在对 植物激素处理的响应比、光合作用的能力、相关酶或蛋白质的特征性变化、性状 表达的组织特异性以及遗传机理等方面却存在着诸多差异( 陈文俊等，1 9 9 9 ) 。 不同突变体叶片衰老时光合作用能力下降的情况也不尽相同。t h o m a s 按基 因功能和其表达时间，把叶片中与衰老相关的基因分为五大基本类群( t h o m a s h 1 9 9 3 ) 。 与叶片衰老相关的第一类群基因，主要是控制细胞基础代谢的基因，从叶片幼 年期直至衰老中期都能表达。如编码与呼吸作用有关蛋白的基因、编码基因等。 第二类群，是一些早期合成的，或以酶原形式存在的，甚至以转录本形式积累在 叶肉细胞中，是在叶片发育后期代谢中起作用的蛋白编码基因，在幼年期至成熟 初期表达，如液泡中的水解酶等。第三类群，编码涉及叶片生长和碳同化有关蛋 白的基因，从幼年期至成熟中期表达。如编码卡尔文循环中有关酶的核基因和叶 绿体基因，以及编码类囊体蛋白的基因。第四类群，衰老开始时特异表达的基因。 第五类群，编码类似水解酶和与再分配有关蛋白的基因，于叶片衰老期表达。 t h o m a s ( t h o m a sh ，2 0 0 0 ) 根据突变体叶片发育过程中叶绿素含量和光合速率 的变化，将可能出现的滞绿突变体分成了五个类型：a 型，衰老开始比较晚，而 叶绿素含量和光合速率下降速率与野生型一样；b 型，衰老开始的时间不变，叶 绿素含量和光合速率均下降，但较野生型下降缓慢；c 型，衰老过程不受影响， 但是色素降解过程受到破坏，叶绿素差不多可以永久保留；d 型，是指通过物理 方法，如速冻，煮沸或者风干的方法使植物发生快速组织死亡，造成的滞绿；e 型，叶绿素含量明显增加，但是衰老开始时间和发生速率基本上不变。a 型和b 型称为“功能型”滞绿变异，叶绿素降解和光合功能退化都受到显著延缓。c 型， d 型和e 型称为“非功能型”滞绿变异，衰老过程中叶绿素降解受到显著延缓而光 合功能退化与野生型无异( 陈文峻等，1 9 9 9 ) ( 图1 2 ) 。 图1 - 2 滞绿突变体的5 种滞绿类型 f i g u r e l - 2 f i v ew a y st os t a y g r e e n 滞绿突变体的生理生化研究结果表明，叶绿素的降解与叶片衰老过程中其 他物质的降解途径之间并非偶联的，彼此之间有相对的独立性。相同表型的突变 体存在着不同的遗传基础并因此而造成不同的滞绿机理。研究不同类型滞绿突变 体不仅有助于揭示叶绿素的代谢过程，以及叶绿素含量与光合功能之间的关系， 而且还有助于阐明植物衰老过程的特征，进而探索衰老现象的实质。滞绿突变体 性状相关基因的克隆和利用，可以推动农作物的遗传改良，特别是提高叶菜类蔬 菜的耐储藏性和草坪草的常绿特性。此外，它对提高青饲料的营养品质，禾谷类 作物的产量、抗病性及抗逆性也可能有一定的作用。 1 3 叶绿素降解代谢相关基因 经过长期的研究，一条叶绿素降解的生物化学途径轮廓已经构建出来 4 ( r u d i g e rw ，1 9 9 7 ) ，但是对于衰老进程中叶绿素降解的遗传调控机理一直都还不 清楚。 r e ng 等( 2 0 0 7 ) 在国际上率先从拟南芥中分离鉴定出了一个叶绿素降解代谢 的关键调控基因a t n y e l 。在a t n y e l 突变体中，叶绿素可能与捕光复合体蛋 白紧密结合，未分离。因此，叶绿素不能正常降解，引起滞绿。随后的研究表明 该基因的直系同源基因( o r t h o l o g ) l l p 是调控孟德尔豌豆绿粒性状的基因( s a t oy e t a l ，2 0 0 7 ；a r m s t e a die ta l ，2 0 0 7 ) ，也是调控水稻上滞绿性状的s g r 基因( c h ak w e t a l ，2 0 0 2 ；p a r ks y e ta l ，2 0 0 7 ；j i a n ghe ta l ，2 0 0 7 ) 。s g r 基因已经从不同物种的突 变体中鉴别出来，如：水稻( p a r ks ye ta l ，2 0 0 7 ；j i a n ghe ta l ，2 0 0 7 ；s a t oye ta l ， 2 0 0 7 ) ，豌豆( a u b r yse ta l ，2 0 0 8 ) ，番茄和甜椒( b a r r yc s ，2 0 0 8 ；b o r o v s k yy ，2 0 0 8 ) 。 m a k o t ok u s a b a 等( 2 0 0 7 ) 在水稻中发现了叶绿素降解代谢基因n y c l ( n o n - y e l l o wc o l o r i n 9 1 ) ，并表明它编码叶绿素b 还原酶。y u t a k as a t o 等( 2 0 0 9 ) 指出 伴随捕光复合体和类囊体的降解叶绿体b 还原酶起作用。 a d r i a n ap r u i i n s k i 等( a d r i a n ap r u i i n s k f i ，2 0 0 3 ；a d r i a n ap r u 孟i n s k f i ，2 0 0 5 ) 鉴定和 分离了p a o l 缺失突变体，表明p a 0 1 的积累导致叶片和花中衰老和光依赖细胞的 死亡。在暗中，p a o l 表现出滞绿表型。从而，揭示了p a o ( 脱镁叶绿酸a i j i l 氧酶) 在叶绿素降解中的关键作用。 1 4a t c r n l 研究进展 叶绿素由水溶性的卟啉环结构和脂溶性的植醇链在c 1 7 3 形成酯键。叶绿素 的脱植基反应由叶绿素酶介导，叶绿素酶可以催化叶绿素a 、b 以及脱镁叶绿素 ( h 6 r t e n s t e i n e rs ，19 9 9 ) 。叶绿素酶是叶绿素分解代谢中的限速酶( t a k a m i y ake ta l ， 2 0 0 0 ；h a r p a z s a a dse t a l ，2 0 0 7 ) 。拟南芥有两个叶绿素酶基因彳f c 日j 和a t c l h 2 ， 其中a t c l h 2 有明显的叶绿体信号肽，而a t c l h l 没有明显的信号肽 ( t t s u c h i y a ，19 9 9 ；d j a c o b w i l k ，19 9 9 ) 。利用r n a i 技术同时抑制彳f c h i ，a t c l h 2 没有表现出滞绿的表型；a t c l h l ，a t c l h 2 的缺失双突变也没有任何滞绿表型。 小麦的叶绿素酶在体外能够识别并剪切其他疏水性的酯键，这些结果使得叶绿素 酶在体内的真正作用变得扑朔迷离。a t c l h l ，a t c l h 2 可能不是叶绿素降解中 的重要酶。这些结果不得不使我们重新寻找叶绿素降解过程中的其它途径 ( s c h e n kn e ta l ，l9 9 9 ；d c o r n e l i u sse ta l ，2 0 0 9 ) 。 s i l v i as c h e l b e r t 等( 2 0 0 9 ) 发现了一个新的酶：脱镁叶绿素酶( p h e o p h y t i n a s e ，p h e o p h y t i n p h e o p h o r b i d eh y d r o l a s e ，p p h ) ，它定位在叶绿体中，是诱导衰老的水解酶，广泛存在于藻 类和陆生植物中的。在拟南芥中，p p h 能脱去脱镁叶绿素( p h e o p h y t i n ，p h e i n ) 中的植基， 而不是直接脱去叶绿素a 中的植基。一个p p h 缺失的拟南芥突变体印h j ，叶片衰老时 表现出滞绿表型。p p h 是叶绿素降解途径中的重要组成部分。并认为之前的叶绿素降解途 径应该是相反的：脱镁反应应该先于脱植基反应。叶绿素早期的降解顺序应该是： 叶绿素脱镁叶绿素脱镁叶绿酸。脱植基叶绿素作为叶绿素合成中的重要组分，可 能不是叶绿素降解的中间产物。因此，叶绿素的合成和降解途径是独立的，不关联的。 对叶绿体定位的衰老相关基因进行表达谱分析表明有若干基因的表达模式与n y e l 极为相似，进一步对这些基因的t - d n a 突变体进行鉴定和表型分析，我们获得了一个新 的滞绿突变体c r n l ( c o r e g u l a t e dw i t hn y e l ) ，c r n l 同n y e l 一样，都具有n 末端的叶 绿体定位信号，c r n l 编码一个脂肪酶( e c 3 1 1 ) ，猜测可能具有叶绿素酶的活性( 复旦大 学植物抗衰老基因研究实验室正在研究中) 。并认为，c r n l 和i p p h ，是同一个基因。 2r a c e 技术概述 随着分子生物学的不断发展，对基因的结构与功能及其表达的研究越来越成 为科研的热点。而这些研究都是以分离和克隆目的基因为基础的，因此克隆全长 的某个功能基因是生物技术及分子生物学的起点。 全长c d n a 克隆的策略大致分为3 种( 张庆华等，2 0 0 0 ) ：( 1 ) 传统的方法是标记 探针筛选文库，这须选择合适的文库，考虑合适的组织来源及建库方法，这种方法 费时较长，工作量较大，只适合于少量基因的研究。( 2 ) e s t ( e x p r e s s e ds e q u e n c et a g ) 电子数据库筛选法( e l e c t r o d a t a b a s es c r e e n i n g ) 。e s t 查询法( e l e c t r od a t a b a s e s c r e e n i n g ) 。具体分为两种情况：第一是芯片延伸( s i l i c oe x t e n s i o n ) 或电子步查 ( e l e c t r ow a l k i n g ) ，对一段获得的c d n a 序列，查询数据库得到一些与该片段重叠的 e s t 数据，进行拼接后可以部分延伸，继续进行下一轮的查询，拼接和延伸，就有可 能得到全长的c d n a 序列信息；第二是从头芯片克隆( d e n o v os i l i c oc l o n i n g ) 对某些 与人类或其他动物( 尤其是灵长类和其它哺乳动物) 的某个基因( 或基因家族中的保 守区段) 有高度同源性的基因，可将同源基因或保守的区段进行电子筛库，得到人 类的e s t 信息，进一步进行拼接和延伸，而有可能得到全长的c d n a 序列信息，这 方面已有文献报道。( 3 ) c d n a 末端的快速扩增法，它是一种简单快速5 端和3 端的方法。末端扩增法，是一种应用特异引物和公用引物从低丰度转录模板中快 速扩增已知片段旁侧和末端的简单、快速、有效的方法。 尽管有多种方法可以获得基因的全长序列，但在有些生物中，所要研究的目 的基因的丰度较低，由低丰度的m r n a 来获得全长c d n a 却是个非常困难的问 题。在这种情况下，s a i k i 等在1 9 8 5 年提出了一个简单、快速、有效的基于p c r 扩增而获得基因全长的策略。f r o h m a n ( f r o h m a nm a e t a l ，1 9 8 8 ) 采用这种策略，并把 它命名为“r a p i da m p l i f i c a t i o no fc d n ae n d s ，简称r a c e ”，克隆了大鼠的早期胚 胎中表达的低丰度的i n t - 2 基因。后来有人称它为锚定p c r ( a n c h o r e dp c r ) 和单 侧p c r ( o n e s i d ep c r ) ，在克隆基因全长中开始得到应用。c d n a 末端的快速扩 增( r a p i da m p l i f i c a t i o no fc d n ae n d s ，r a c e ) 它是一种简单快速扩增5 端和3 端的方法，是通过以m r n a 为模板反转录成c d n a 第一链后，采用p c r 方法 实现从基因内部某个特定位点到3 或5 端之间未知序列的克隆，从而得到有 c d n a 全长序列( 郑阳霞，2 0 0 8 ) 。 2 13 r a c e 的原理 3 r a c e 的原理是利用的m r n a 3 末端的尾巴作为一个引物结合位点，以连有 6 寡核苷酸序列通用接头引物的o l i g o ( d t ) 3 0 作为锁定引物反转录合成标准第一链 c d n a 。然后用一个基因特异引物g s p l ( g e n es p e c i f i cp r i m e r ，o s p ) 作为上游引物， 用一个含有部分接头序列的通用引物u p m ( u n i v e r s a lp r i m e r ，u p m ) 作为下游引物， 以e d n a 第一链为模板，进行p c r 循环，把目的基因3 末端的片段扩增出来( 图 1 3 ) 。 2 25 r a c e 的原理 5 r a c e 比3 r a c e 更具有挑战性，其特异性较低，产物可能是单一产物、 多个产物，甚至是不能分辨的连续条带。最终质量取决于扩增所使用锚定引物的 特异性、目的m r n a5 端结构的复杂度和丰度及产物的长度等因素。可利用巢式 引物扩增( 最多进行三轮巢式扩增) ，增加逆转录保温温度和p c r 退火温度，降低 扩增反应中的镁离子浓度等方法增加5 r a c e 的特异性。目前有3 种5 r a c e 方 法：环化法、末端脱氧核糖核酸转移酶法( 迪芬巴赫cw ，1 9 9 8 ) 及s m a r t 反转 录酶法( 刑桂春，2 0 0 1 ) 。 2 2 1 环化法 利用环化法5 r a c e 技术的原理即反转录后先用基因特异性引物p c r 扩增目 的c d n a ，接着在t 4r n a 连接酶催化下使第一条c d n a 链环化，将得到的单链 d n a 做为模板，用基因特异性引物进行p c r 扩增5 端。因为这种方法的引物都是 基因特异性的，所以非特异p c r 产物基本上不会产生。但是在这种方法至关重要 的关键性的环化中，可能由于m r n a 的5 端结构复杂，导致合成的第一条单链 c d n a 的3 端易形成高级结构，从而很容易导致环化反应失败( 邓雪柯，2 0 0 7 ) 。 环化法( s e l f - l i g a t i o n ) ( t a k a r a ) ，其原理如下：( 1 ) 反转录( r t ) 反应：以目的 m r n a 为模板，使用5 末端磷酸标记的r t 引物进行反转录反应，合成c d n a 第 一链。( 2 ) h y b r i dr n a 的分解：使用r n a s e h 降解r n a d n a 杂交分子中的r n a 模板。( 3 ) 单链c d n a 的自身连接：使用t 4r n al i g a s e 使单链c d n a 进行环化 或形成首尾连接物。( 4 ) 最后p c r 反应扩增5 c d n a 未知区域( 图1 4 ) 。 2 2 2 末端脱氧核糖核酸转移酶法 末端脱氧核糖核酸转移酶法5 。r a c e 技术原理即利用序列特异性引物1 反转 录总r n a ，然后分离纯化反转录产物，用脱氧核糖核酸末端转移酶( t d t ) 给反转 录的首链c d n a 加上p o l y a 尾，以o l i g o ( d t ) a d a p t o r 为引物合成第二条c d n a 链。然后用接头引物a d a p t o r 和位于延伸引物序列上游的序列特异性引物2 进行 p c r 扩增。 酬削一燃赫 3 - p , a c e - 鼬a d ye d n a 弘竺竺些竺些些璧些耋搿擀僦各一， 董_ _ 盥篁2 酬酞删屹翮。冒 t 篆尝荔赢蕊赢棚t t t q 芦掣r d o u b l e - g t r a n d e d3 。- r a c ef r a g m e n t s t m d m r d 百髓l - 摹柏雕l 归懒i 孽 _ 一= b ds m a r t i i ah q u e n c e 3 阪e ep c r f 白欲翔l 豳do f p c # g e n e s p e ci f i c 材n l h o s m r 洲胎j n i 髑r o u f l 4 j t l 硝p c k a m p l i f i c a 岳o no f3 f m g m e n t 图i - 33 r a c e 反应具体机制 f i g u r e1 - 3 d e t a i l e dm e c h a n i s mo ft h e3 - r a c er e a c t i o n s 8 u n k n o w nr e g i o n t a r g e tm r n a 厂 孙嗍嘲确 i i i l 竺竺i i 坚! 竺剑i 1imllll i熏5e州钟帅，y删酊阳m， 1j u n k n o w nr e c j 油 ，、一、 图1 - 45 r a c e 反应原理( 环化法) f i g u r e l - 4r e a c t i o np r i n c i p l eo f5 r a c e ( c y c i i n g5 r a c e ) 2 2 3s m a r t 反转录酶法 s m a r t 反转录酶法( b ds m a r t t mr a c ek i t ) 的5 r a c e 技术原理基本上与 末端脱氧核糖核酸转移酶法相似( 图1 5 ) 。利用3 末端序列引物5 c d sp r i m e r 反转录总r n a ，与t d t 法不同的是，s m a r t 反转录酶自身有个特性，即当反 转录到末端的时候，也就是r n a d n a 双链结构末端的时候，它会自动在d n a 链末端加上3 个g 。然后通过与接头引物s m a r ti i o l i g o 结合继续延伸。以 s m a r ti i 接头部分的引物的l o n gu p 扩增第二条c d n a 链，随后再以序列特异 性引物g p s l 和与l o n gu p 接头部分互补的引物s h o r tu p 进行p c r 的扩增阶段 ( 图1 5 ) 。 9 p o l y a + r n a b 0 r n a d n ai 哗b f d f 洲 土 岷品鹚 二当嚼c 罂些篓鬯鬯些塑些，一，n b a m , t 柑- z ， f r a c e 堆。a d i c d n a ；：= ：雅瞠篓娑塞篓篓篓黧尝篓纂羹翼黯粥特 t i r tl 睡m p l a w 善诵咖 5 r a e ep c r l 一_ 暑蠡8 一n m 聃舟 煽 n 嬲办m m n b a , i , 舢 4 咖u p 鼍号皇蕞e c 暨竺翟= 霉譬= 譬翟= = 警”仃t t 耵| r 磐r 。 f i r 翟lr o u n do f p c r l 嘲i n c o r 觚p o e r a 阳t i o d r e no f 州s u p p r 嘲跏 e l e m e n 协：吉 b yl o n gu n i v e r 鞠ip r i m e r 。= - _ 匕= = = 攀鼍函盖2 翟删_ 黼彬 g s p i i t - i q ”t t t t 基繁0 i勰黜积。o ￥f 溉。 l d o u b l e s t r n n d e d - r a c ef r e g m e n t 晒9 1 8 弼目gr 伽罪d 錾p c r 岿佣p i i f i c a 百o no f5 。f r a gme n t 图1 - 55 r a c e 反应具体机制( s m a r t5 r a c e ) f i g u r e1 - 5d e t a i l e dm e c h a n i s mo ft h e5 r a c er e a c t i o n s 2 3r a c e 技术应用现状 自2 0 世纪9 0 年代以来，已有很多利用r a c e 成功获得全长基因的例子。 刘岗等( 2 0 0 8 ) 应用r a c e ( r a p i da m p l i f i c a t i o no fc d n ae n d s ) 技术首次克隆并 鉴定了鸽恒定链基因。田志坚等( 2 0 0 8 ) 通过简并引物r t - p c r 结合r a c e 技术首 次