（生物化学与分子生物学专业论文）肠浒苔碱提水提多糖性质的比较.pdf

摘要 浒苔经水提和碱提得到浒苔水提多糖( w e ) 和碱提多糖( a e ) 。粗多糖采用冻融， 蛋白酶法和s e v a g e 法联合脱蛋白进行纯化得到d w e 和d a e 。同时对w e 和a e 、d w e 和d a e 的物理性状、粗多糖含量( 苯酚硫酸法) 、蛋白质含量( 凯氏定氮法) 和硫酸根含量( 比浊 法) 等性质进行了比较分析。结果显示：水提浒苔粗多糖比碱提浒苔粗多糖的多糖含量 和硫酸根含量都要高，经g c 分析两种方法得到的浒苔水提多糖( w e ) 和碱提多糖( a e ) 的组分及其含量均有差别，w e 组分的单糖组成为鼠李糖、木糖、甘露糖、半乳糖、葡萄 糖，其摩尔比为3 7 2 ：1 ：o 1 2 ：0 1 2 ：1 8 2 ；a e 单糖组成为鼠李糖、木糖、甘露糖、 半乳糖i 葡萄糖、葡萄糖醛酸，其摩尔比为1 2 1 ：1 ：2 4 8 ：2 9 2 ：3 4 l ：o 6 5 。同时 采用比浊法检测两种多糖的硫酸根含量，水提多糖( w e ) 和碱提多糖( a e ) 的硫酸根含 量分别为7 5 和5 7 5 。 通过体外淋巴细胞转化试验结果表明，本实验通过m t t 方法体外检测浒苔多糖对小 鼠淋巴细胞生长状况的影响，结果表明：对于未脱蛋白的水提粗多糖，在单独作用时对 淋巴细胞的增殖没有明显作用。而与c o n a 共同作用时，水提粗多糖在2 0 0 一4 0 0ug m 1 时能明显刺激t 淋巴细胞的增殖，并且随着剂量的增加，其刺激增殖的能力也明显增加， 并且与阳性对照组相比差异显著，与l p s 共同作用时，对b 淋巴细胞的增殖，只是在最 高剂量时作用明显。对于未脱蛋白的碱提粗多糖，在单独作用时对淋巴细胞的增殖没有 明显作用。但是与l p s 共同作用时，均能明显刺激b 淋巴细胞的增殖，但是没有剂量依 赖性，对t 淋巴细胞的增殖作用在1 0 0 和4 0 0 ug m 1 时明显。脱蛋白以后，水提多糖 在单独作用时对淋巴细胞的增殖没有明显作用。而与c o n a 和l p s 共同作用时，水提粗 多糖在三个剂量水平均能明显刺激t 、b 淋巴细胞的增殖，并且呈现良好的剂量依赖。 脱蛋白后的碱提多糖在单独作用时能明显刺激淋巴细胞增殖，并且有良好的剂量依赖关 系。并能诱导c o n a 诱导的t 淋巴细胞的增殖，但是对于l p s 诱导的b 淋巴细胞的增 殖只有当浓度达4 0 0 ug m l 时有明显作用。 关键词：浒苔；多糖；分离纯化；性质研究 a b s t r a c t 。 t h ee n t e r o m o r p h am e n s e sr a i s ew i m l ea l k a l ir a i s e0 b t a i nn l ee n t e r o m o r d h aw a t e rt o m i s e 也ep o l y s a o 出撕d e ( w e ) a n dm ea 1 1 c a l im i s et l l ep 0 1 y s c h a r i d e ( a e ) t h et h j c k p o l y s a c c l 谢d eu s e st 1 1 e 丘e e z i n g 趾dt l l a w i i l g ，n l ep r o t e i l l a s e1 a w a n dt 1 1 es c v a g el a wl l i l i t e s c a r r i e so nn l ep u r i j e i c a t i o nt 00 b t a i nd 、 僵a n dd a e 甜b m n e n o s e 五呜e m e a n w 坷l et 0w ea 1 1 d a e ，d w ea n dt h ed a ep h y s i c a lc n l et 1 1 i c kp o l y s a c c h 撕d ec o m e n t ( p h e n o ls u l f l j r i c i dm e n l o d ) ，t h ep r o t e i nc o n t e n t 体e l v i i lf i x a ：t i o no fi l i 臼0 9 e n ) 锄dm es u l f - a t er a d i c a lc o n t e n t i d i m 嘶cm 如o d ) a n ds oo nn a t u r eh 勰c a r r i e do nm ec o 旺币缸a t i v e 撇l y s i s t h er e s u l t s h o w e dm a tt 1 1 ew 撕r a i s e sm ee n t e f o m o r p h at l l i c kp o l y s a c c h a u r i d et or a i s em ec n t e f o m o i p l l a n l i c kp 0 1 y s a c c h 撕d e 廿l ea l k a l it h ep o l y s a c c h a d d ec o n t e n ta n dn l es u l 觚ca c i dc o n t e n tm l l s t b el l i 曲c rt l l 觚，觚a l y z e se n 诧r o m o 刑i l as h l l it i 、h 0a 舭rg c 俩om c 廿1 0 d so b t a i l l 。( w e ) 锄d t h ea 1k a l ir a i s e st l l ep o l y s a c c h a r i ( i et l l ec 唧o n e n t 孤dm ec o n t e n th 嬲廿l ed i 珏i e r e i l c e ，t h i s w a t e rs o l u b l ep o l y s a c c l 谢d e ( w e ) w 嬲c o m p o s e do fr l 地x y l ，g a l ，g 1 c ，g 1 c u ai nai n o l ar r a t i o 、o f3 7 2 ：1 ：o 1 2 ：o 1 2 ：1 8 2 ；1 ka l l 渤ie 袖渤c t i o np o l y s a c c h 撕d e ( a e ) 、v 勰c o m p o s e do f r h a ，x y l ，m 趾，似，g l c ，g l c u a ：i i lao fm t i oi s1 2 1 ：1 ：2 4 8 ：2 9 2 ：3 4 l ：o 6 5 s 训t 黜o l l s l y u s e st h et i l r b i d i m e t r i cm e t h o dt 0e x a m i i l e 细ok i r l do fp o l y s a c 蜘d e s 廿l es u l f i a t e 础c a l c o n t e n t ，t h ew a t e rr a i s e sm ep 0 1 y s a c c h 撕d e 锄d 也e 椰湖ir a i s e sn l ep o l y s a c c h a r i d e 廿1 es u l f a t e r a d i c a lc o n l 【e 1 1 tr e s p e c t i v e l yi s7 5 a l l d5 7 5 i nv i t r o1 咖h o c y t ep r 0 1 i f e r a t i o ne x p e r i m e n t ，t h ec r u d ep 0 1 y s a c c h a r i d ew ea n da eh a dn oe f f e c to n1 y m p h o c y t ep r 0 1i f e r a t i o na l o n e t h ew a t e rp 0 1 y s a c c h a r i d es t i m u l a t e dc o n a i n d u c e dt1 y m p h o c y t ep r 0 1i f e r a t i o na tt h ed o s e so f2 0 0 一4 0 0l ig m l ，i nad o s e d e p e n d e n tm a n n e r a n di ts t i m u l a t e dl p s i n d u c e db1 y m p h o c y t ep r 0 1 i f e r a t i o na tt h eh i g h e s td o s e t h ea l k a l i e x t r a c tp 0 1 y s a c c h a r i d e( a e ) c o u l ds i g n i f i c a n t l ys t i 肌1 a t ec o n a i n d u c e d1 y 1 口噬) h o c y t ep r 0 1 i f e r a t i o na tt h ed o s e so f1 0 0a n d4 0 0pg m 1 ，a n dc o u l ds t i m u l a t e dl p s i n d u c e d1 y m p h o c y t ep r 0 1 i f e r a t i o na tt h r e ed o s e so ft h ep 0 1 y s a c c h a r i d e k e yw o r d ：e n t e r 伽吣r p h a ：p 0 1 y s a c c h 踟? i d e ：s e p a r a t i o np 1 工r i f i c a t i o n ：n a t u r er e s e a r c h i i 独创性声明 本人郑重声明：所提交的学位论文是本人在导师指导下独立进行研究工作 - 所取得的成果。据我所知，除了特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含 其他人已经发表或撰写过的研究成果。对本人的研究做出重要贡献的个人和集 体，均己在文中作了明确的说明。本声明的法律结果由本人承担。 学位论文作者签名：丞剑嗌 日期： 枷谬多j 哆 学位论文使用授权书 本学位论文作者完全了解东北师范大学有关保留、使用学位论文的规定， 即：东北师范大学有权保留并向国家有关部门或机构送交学位论文的复印件和 电子版，允许论文被查阅和借阅。本人授权东北师范大学可以采用影印、缩印 或其它复制手段保存、汇编本学位论文。同意将本学位论文收录到中国优秀 博硕士学位论文全文数据库( 中国学术期刊( 光盘版) 电子杂志社) 、中国 学位论文全文数据库( 中国科学技术信息研究所) 等数据库中，并以电子出 版物形式出版发行和提供信息服务。 ( 保密的学位论文在解密后适用本授权书) 学位论文作者签名：邋 日 期：塑生f 当 学位论文作者毕业后去向： 指导教师签名： 日。期： 鼍嫩够 ， 电话： 邮编： 0 4 7 0 8 3 4 0 5 6 7 0 2 1 0 0 8 东北师范大学硕士学位论文 第1 章引言 蛋白质、核酸、多糖是最重要的三种生物大分子。蛋白质和核酸在生命现象 中的重要性为世人所知，以基因重组为代表的生物工程已经大大地造福于人类社 会u 1 。而糖类的研究已有近百年的历史，糖类的生命科学几乎与蛋白质的生命科 学同时诞生口1 。但是，糖生物学的崛起只是近2 0 年的事，远远落后于蛋白质和 核酸的飞速发展。之所以如此，有两个重要原因：首先是理论上的简单化。人们 过低地估计了糖类对生命过程的贡献，科学工作者认为糖类只不过是一种能源和 细胞内支撑物；其次是在研究方法上较困难。从自然界分离的粗多糖是非常复杂 的混合物，其中包括各种生物大分子的混合，不同多糖( 中性多糖、酸性多糖、 杂多糖) 的混合以及不同分子大小，不同糖苷键构成的不同多糖的混合，因此必 须采取适合其结构特点的方法进行分离、分级和纯化。多糖结构的复杂性也大大 增加了多糖研究的难度口1 。直到2 0 世纪6 0 年代以后，随着三次革命性的进展， 大大推动了糖类的研究。多糖是天然的生物大分子物质，来自于高等植物、动物 细胞膜、微生物细胞壁，是所有生命有机体的重要组成部分，并与维持生命所必 需的多种生理功能有关。近几十年来，由于相关研究包括膜的化学功能，免疫物 质的研究以及对新药物资源的寻找等，人们发现糖类在生物体中不仅是作为能量 资源或结构材料，更重要的是它参与了生命科学中细胞的各种活动，具有多种多 样的生物学功能。多糖研究得较早且最多的，是从细菌中得到的各种荚膜多糖， 它在医药上主要用于疫苗。1 9 8 4 年，苏联人在荷兰召开的第十二次国际碳水化 合物讨论会上报道了用全合成特定结构的荚膜多糖作疫苗，受到与会者的极大兴 趣。尔后，有关真菌多糖的研究既深又广，如酵母菌多糖、食用菌多糖，特别是 食用菌多糖的研究，报道的频率是相当的高，其中以香菇多糖研究得较清楚。另 外，植物多糖的开发也倍受人们的青睐，由于我国是中药的起源之地，而糖类是 中药材中普遍存在的成分，在对各种中药材的化学成分研究的过程中，人们都少 不了对其中多糖的关注。到目前为止，已有近3 0 0 种的多糖类化合物从天然产物 中被分离提取出来。其中，从植物中尤其是从中药中提取的水溶性多糖最为重要。 这些活性多糖的生理活性，化学结构以及构效关系成为多糖研究的前沿阵地，取 得了很大的进展h 1 。 近几十年来，人们发现从植物中提取的多糖具有非常重要与特殊的生理活 性。些多糖参与了生命科学中细胞的各种活动，具有多种多样的生物学功能，如 参与生物体的免疫调节功能，降血糖、降血脂、抗炎、抗疲劳、抗衰老等，人们 已成功地从近百种植物中提取出了多糖并广泛地用于医药和保健食品的研究和 开发中。植物多糖研究得比较深入的是稻草多糖、麦秸多糖、竹多糖、黄芪多糖、 1 东北师范大学硕士学位论文 刺五加多糖。 1 1 多糖的生物活性 1 1 1 多糖促进免疫功能随6 1 多糖最为突出的功能就是其对机体免疫功能的加强。目前己发现有1 0 0 多种 中药中的多糖类化合物具有免疫促进作用。普遍认为多糖是一种无细胞毒的免疫 促进剂。多糖能在多条途径、多个层面对免疫系统发挥调节作用：( 1 ) 提高巨噬 细胞的吞噬能力；诱导白细胞介素1 ( i l l ) 和肿瘤坏死因子( t n f ) 的生成，具有这种 免疫促进功能的多糖有香菇多糖、黑柄炭角多糖、裂裥菌多糖、细菌脂多糖、牛 膝多糖、商陆多糖、树舌多糖、海藻多糖等：( 2 ) 促进t 细胞增殖，诱导其分泌白 细胞介素2 ( i l 2 ) ，具有这类免疫促进功能的多糖有中华猕猴桃多糖、猪苓多糖、 人参多糖、刺五加多糖、枸杞子多糖、芸芝多糖肽、香菇多糖、灵芝多糖、银耳 多糖、商陆多糖i 、黄芪多糖等：( 3 ) 促进淋巴因子激活的杀伤细胞( l a k ) 活性。 这类多糖有枸杞子多糖、黄芪多糖、刺五加多糖、鼠伤寒菌内毒素多糖等：( 4 ) 提高b 细胞活性，增加多种抗体的分泌，加强机体的体液免疫功能，这类多糖有银 耳多糖、香菇多糖、褐藻多糖、曹蓿多糖等：( 5 ) 通过不同途径激活补体系统，有 些多糖是通过替代通路激活补体的，有些则是通过经典途径，这类多糖有酵母多 糖、裂裥菌多糖、当归多糖、茯苓多糖、酸枣仁多糖、车前子多糖、细菌脂多糖、 香菇多糖等。 1 1 2 多糖的抗肿瘤功能 肿瘤是一类严重威胁人类健康的疾病。研究表明，多种植物成分具有抗肿瘤 作用，其中多糖是被公认的抗肿瘤效果比较突出的大分子。自从5 0 年代发现酵 母多糖具有抗肿瘤效应以来，已分离出了许多具有抗肿瘤活性的多糖，其研究成 果令人振奋。就多糖的抗肿瘤作用而言，可将抗肿瘤多糖分为2 大类口1 ：一类是具 有细胞毒性的多糖直接杀死了肿瘤细胞，这类多糖有牛膝多糖、茯苓多糖、刺五 加多糖、银耳多糖、香菇多糖、芸芝多糖等：第二类抗肿瘤活性多糖是作为生物 免疫反应调节剂通过增强机体的免疫功能而间接抑制或杀死肿瘤细胞的，如能促 进l a k 、自然杀伤细胞( n k ) 活性、诱导巨噬细胞产生肿瘤坏死因子的多糖，具有 抗肿瘤活性的多糖大多是通过这种途径起作用的，也就是常说的宿主介导抗肿瘤 活性。此外，魏小龙等阳1 对地黄多糖抗肿瘤功能进行系统研究时发现，分子质量为 l o o o 2 0 0 0u 的低分子质量的地黄多糖可使l e w i s 肿瘤细胞内的p 5 3 基因表达明 显增强，从而引发l e w i s 肺癌细胞的程序性死亡，这可能是多糖抗肿瘤作用的又 一新途径。 1 1 3 多糖的抗突变、降血脂、抗菌及病毒等功能 突变是肿瘤发生的前提，所谓突变是指在一些遗传因素或非遗传因素的作用 东北师范大学硕士学位论文 下，使人体中调控细胞生长、增殖及分代的正常细胞基因发生突变、激活和过度 表达，从而使正常细胞发生癌变的过程。而某些食物或作物成分就可以减少或减 弱这一过程的发生。人类膳食中就有大量的抗突变成分，如大蒜中的有机硫化物、 v e 、v a 、v c 、类黄酮、多糖等呻1 。目前发现具有抗突变活性的多糖有人参多糖、 波叶大黄多糖、魔芋多糖、枸杞子多糖、紫芸多糖等嘲。高血脂症是指血液中一 种或多种物质成分异常增高的病症，它能直接导致动脉粥样硬化、冠状动脉粥样 硬化等心脏病，而后者的死亡率较高，因此积极防治高脂血症具有十分重要的意 义。现已发现的具有降血脂活性的多糖有海带多糖、褐藻多糖、甘蔗多糖、硫酸 软骨素、灵芝多糖、茶叶多糖、紫菜多糖、魔芋多糖等1 。近年来，硫酸化多糖 作为抗生素类药物，可以治疗艾滋病，所以引起了人们的广泛重视。早在1 9 6 5 年， 研究者陆续发现某些天然多糖硫酸酯如卡拉胶、肝素有抑制疱疹病毒复制的作 用。目前，许多经硫酸酯化的多糖，如香菇多糖、地衣多糖、裂褶菌多糖、木聚糖、 箬叶多糖的硫酸酯有明显的抑制h i v l ( h u 册a ni 咖u n ee f f i c i e n c yv i r u st u p e i ) 活性，其作用机理是干扰眦v 一1 对宿主细胞的粘附作用，抑制逆转录酶的活性 等。抗病毒硫酸酯化多糖的硫酸根取代度在1 5 2 0 为最佳，如果将这些多糖的硫 酸根除去，则上述活性随之消失。 1 1 4 保肝作用 狗肝菜多糖能使肝损伤动物血清a l t 、a s t 活性显著降低。冬虫夏草多糖 治疗慢性乙型肝炎，可在免疫调节、保肝和抗病毒等三方面发挥作用，取得较好 疗效。香菇多糖对慢性肝炎有免疫调节作用，主要是促进t 细胞活性，具有抗病 毒及诱生i f n 保护肝脏的作用。中华猕猴桃多糖具有较强的清除活性氧自由基的 能力，并且还有与机体内源性抗自由基体系相类似的作用能力，刺五加果多糖、 云芝胞内多糖对四氯化碳造成小鼠的肝脏损伤具有一定的防护作用n 3 1 。用猪苓 多糖注射液治疗慢性病毒性肝炎5 3 8 例，对改善自觉症状、s g p t 恢复正常等验 证均有显著性差异，乙肝表面抗原( h b s a g ) 滴度下降及抗原转阴率达3 5 4 3 8 6 ，均优于对照组，具显著性差异。 1 1 5 抗氧化及抗疲劳作用 许多中药多糖都具有提高抗氧化酶活性、清除自由基、抑制脂质过氧化，从 而保护生物膜的作用。y e u n g 报道云芝多糖能增强g s h p x 的活性，促进h 。0 ：的清除 。6 。丙二醛( m d a ) 是反映机体脂质过氧化损伤的重要指标，具有很强的生物 毒性，极易与磷脂蛋白发生反应改变细胞膜的通透性，而造成组织细胞的氧化损 伤。许多资料表明，宁夏枸杞多糖具有清除自由基作用，而阻断脂质过氧化反应， 使m d a 生成减少，同时它也可以提高机体抗氧化酶活性，抑制自由基引发的脂质 过氧化损伤。刘晓莉等人研究发现，枸杞人参、银杏叶、天麻水提液均可降低小 白鼠体内佃a 的含量。人参对脑和心肌中肋a 含量的抑制率最高，分别为2 0 6 3 东北师范大学硕士学位论文 和2 1 3 ：天麻对肝和肾组织中m d a 含量的抑制率最高，分别为1 4 5 和1 3 6 。 魏文树等对云芝多糖生理活性研究证明其对活性氧有清除作用。另有实验结果显 示，以生理盐水为对照，o 3 2 0 9 6 的沙棘多糖溶液就已有明显的抗氧化作用 ( p o 0 1 ) ，随着浓度的升高，抗氧化作用明显上升，但浓度下降至o 0 6 4 ，抗 氧化作用差异无显著性。许多植物多糖具有抗疲劳作用。如枸杞多糖能提高实验 小鼠的肌糖原、肝糖原储备，增加乳糖脱氢酶的总活力，加速血尿素的清除和降 低运动后的血乳酸水平，能明显延长小鼠游泳时间，故其能增强机体体力，迅速 消除运动后的疲劳。崔祝梅等对甘肃多序岩黄芪多糖研究发现其可明显延长老年 小鼠游泳时间。 1 1 6 降血糖功能 近几年许多人对植物多糖降血糖的功能有很多的研究。薛惟建等人研究了昆 布多糖及褐藻淀粉对小鼠实验性高血糖的防治作用，注射后小鼠血糖水平明显降 低。日本k o n n o 等人从朝鲜白参、中国红参和日本白参分离到2 1 种人参多糖， 均有降血糖作用。黄芪多糖对血糖及肝糖原含量影响的研究发现黄芪多糖具有双 向调节血糖的作用。彭红等人研究发现南瓜多糖能提高动物对高糖的耐受力：且 与胰岛素有很好的协同作用：它对正常动物血糖的影响不明显。百合多糖降血糖 能修复b 一胰岛细胞、增强分泌胰岛素功能和降低肾上皮质激素分泌，以及促进 肝脏中血糖转化为糖原的联合作用，从而使血糖降低，对治疗糖尿病有显著的效 果。枸杞多糖对实验性糖尿病兔有明显的降血糖作用，有效率达1 0 0 ，且对正 常小鼠血糖无影响。 1 1 7 其他功能 糊精、人参果胶这两种植物多糖对大鼠实验性胃溃疡( 消炎痛型、应急型、 幽门结扎型及醋酸型) 均有不同程度的抑制作用。红藻类多糖也具有抗溃疡作用。 另据报道褐藻淀粉、海带淀粉有明显的抗凝、解痉、解聚、降压降脂、降低血粘 度及扩张血管和改善微循环的功能，从而达到抗心血管疾病的作用。同时海藻及 海带多糖具有对有毒重金属( 如p b 、s n 、c d 等) 的阻吸功能和抗辐射功能。另 外许多植物多糖具有促进核酸和蛋白质的生物合成作用，如灵芝多糖、黄芪多糖 等 。 总之，植物多糖具有许多生理活性和保健功能。植物来源的多糖类化合物由 于它们的独特功能和很低的毒性，随着植物多糖研究的不断深入，其在临床应用 和保健食品开发上将有很广阔的前景。 1 2 多糖的研究方法 植物多糖的提取有不同的方法，包括溶剂提取法、酸提取法、碱提取法、酶 解法、超滤法、超声波强化法、微波法。采用醇析或其它有机溶剂沉淀所获得的 4 东北师范大学硕士学位论文 多糖，常含有较多的蛋白质，必须予以除去，常用的方法有s e v a g 法、三氟三氯 乙烷法、三氯乙酸法。s e v a g 法是用得最多的方法，该方法条件温和但效率不高， 重复多次才能除去大部分蛋白质。该方法是将多糖的水溶液与氯仿混合，并振摇 成乳化液，此时蛋白质变性成胶状，离心后蛋白层存在于有机相和水相之间。为 了加速蛋白质的变性，最好用p h = 4 5 的缓冲溶液代替水，并加少量正丁醇或正 戊醇，或将氯仿、正丁醇( 4 ：1 ) 加入糖液1 份中振摇离心去蛋白质。另外，也 可以利用蛋白酶与s e v a g 法结合进行脱蛋白。除色素可以用食品级粉末状活性炭 吸附，也可以用h 。0 2 对色素的有色集团产生破坏而除去色素，还可以用大孔吸附 树脂柱层析脱去色素，这个方法还可以使多糖混合组分初步分离。通过上述方法 所得到的是多糖混合物，如果要得到单一的多糖，还必须对该混合物进行纯化。 纯化多糖的方法有很多种，如；部分沉淀法、盐析法、金属配合法、纤维素柱层 析法、制备性高效液相层析、季铵盐沉淀法、凝胶柱层析法、超过滤及亲和层析、 纤维素阴离子交换柱层析法等，针对多糖的特性，可选择不同的分离纯化方法， 如根据多糖分子大小和形状的不同，采用凝胶过滤色谱法、膜分离法，根据多糖 分子的电荷特性可采用离子交换色谱法。多糖的性质往往与它的相对分子质量大 小有关。常用于多糖相对分子质量测定的方法有凝胶色谱法、蒸气压渗透剂法、 端基法、粘度法、光散射法、高效液相色谱法、渗透压法和超滤法等。由于多糖 结构的微观不均一性，使多糖的结构分析难以得出完全准确的结构式。多糖中单 糖的组成检测的纸层析、薄膜色谱法( t l c ) 、高效液相色谱( h p l c ) 、气相色谱 法( g c ) 、毛细管电泳法( c e ) 。多糖结构分析主要方法有甲基化分析法、过碘酸 氧化、s m i t h 降解的方法、乙酰解和甲醇解、红外光谱( i r ) 分析、核磁共振( n m r ) 质谱分析法、m s 、g c m s 、x 一射线纤维衍射分析。 1 3 浒苔的研究情况 海藻是生长于海洋中的低等植物，是海洋中有机物的原始生产者和无机物的 天然富集者，被称为海洋森林，是海洋生物的重要组成之一。海藻中的活性物质 主要有两类，一种是小分子物质( 卤族化合物、萜类化合物、海藻单宁、昆布氨 酸等) ，另一种是海藻多糖。其中，海藻多糖是研究较多的一类，是海藻中的重 要组成部分，具有很大的应用价值，琼脂、卡拉胶、褐藻胶等早就已经能进行工 业化生产了阱1 。近年来的研究表明，海藻多糖除了具有工业价值外，还具有多种 生物活性及作为药物和药物中间体的功能。 浒苔励t 彻咖胁- j 角朋又称苔条，属绿藻门石莼目石莼科浒苔属 植物。浒苔属世界约有4 0 种，中国约有1 1 种，主要有条浒苔、肠浒苔、扁浒苔、 浒苔、小管浒苔等五种，生长在潮间带，在我国野生藻类中资源丰富，尤其在东 南沿海一带分布广泛。多数种类海产，广泛分布在全世界各海洋中，有的种类在 半咸水或江河中也可见到。常生长在潮间带岩石上或石沼中，或泥沙滩的石砾上， 有时也可附生在大型海藻的藻体上。藻体晒干后可供食用，也可作饲料。肠浒苔 气 东北师范大学硕士学位论文 可供药用。 浒苔藻体绿色，高可达1 2 m ，粗约2 c m ，管状或扁压，有明显的主枝，多 细长分枝或育枝，枝长及粗的变化很大，分枝的直径小于主杆2 钔。它自古以来即 为食用和药用藻类，在本草纲目中记载浒苔可“烧末吹鼻止衄血；汤浸捣敷 手背肿痛”；隐身居饮食谱记载：“清胆，消瘰疬瘿瘤，泻胀、化痰，治水土 不服嘶h ；在我国食物营养成分表上记载：浒苔含铁量为我国食物中之最。 药用部位：全藻。性味功能：咸、寒，软坚散结、清热解毒。主治：甲沟炎、颈 淋巴结肿、背痈、疖疮。 浒苔营养成分。浒苔粗蛋白质含量为1 3 2 1 ，粗脂肪为1 0 4 ，灰分为2 1 8 7 ， 是一种高蛋白、低脂肪的绿藻。浒苔含1 7 种氨基酸，其中鲜味氨基酸含量最高， 达总量的2 6 1 9 ，其次是甜味氨基酸，达总量的2 2 1 4 ，可作为很好的食物氨基 酸来源。浒苔含1 3 种脂肪酸，不饱和脂肪酸有1 1 种，占脂肪酸总量的5 8 1 8 ，其 中人体必需脂肪酸亚麻酸含量最高，达1 5 9 8 ；其次为单不饱和脂肪酸油酸达 1 3 0 7 ，对人体有很好的生理功能，是一种良好的功能性油脂的原料。 浒苔作为一种传统药用藻类，在我国古代药典本草纲目和随息居饮食 谱 都记载了它的功效，但是目前国内外对浒苔多糖的研究报道较少。主要活性如下。 降低胆固醇方面的活性：日本的金田在动物实验中，直接用浒苔的藻体粉末 饲喂大白鼠，发现有明显的降低胆固醇作用呦1 ；1 9 9 5 年中国药科大学周慧萍等报 道从福建产的浒苔中分离和纯化得到一种酸性异多糖，并研究证实其有降血脂的 功能及提高s o d 活力、降低l p o 含量的抗衰老作用矧。 抗菌和抗病毒活性：vv l a c h o s 嘲3 等报道了从南非采集的浒苔热水提取多糖 的抗菌活性，发现多糖对细菌的抑制能力好于酵母茵和霉菌；j b h u n d s o n 乜町 等对1 3 种韩国海藻的甲醇提取物进行研究，发现其中浒苔提取物有很好的抗h s v 和s i n 、，病毒活性。 兔疫活性：b e s h a n 等对8 种海藻中提取的水溶性多糖用人体淋巴细胞 进行免疫活性研究，结果表明绿藻多糖明显促进人体淋巴细胞的增殖，主要表现 在t 、c t l 、i g 和t n f 上，显示了它们在临床疾病治疗如抗肿瘤方面将有很好的 应用。 r o s a r i oc a s t r o q 等研究了藻类水溶性多糖对大菱稣嗜菌细胞的呼吸活 性调节的研究，结果表明绿藻类的浒苔、石莼可以很好的提高大菱鲆的呼吸活性， 从而提高嗜菌细胞中的中性粒细胞和巨嗜细胞杀死细菌病原体的能力，显示了其 对哺乳动物在提高免疫方面的良好作用。 消炎活性：n o d ah ，k i v o k ah i o a c h io k a j 池3 和y a s u j i0 k a i 啪1 等报道 浒苔提取物有消炎作用，对e h r l i c h 癌和皮肤癌抑制作用等生理功能。 近年来，国内外对浒苔等海藻多糖的研究逐渐增多，表明浒苔等海藻多糖具 有很高的研究价值。本文通过对碱提和水提浒苔多糖的结构与部分活性的比较研 究，为浒苔的开发与利用提供了一定的科学依据。 6 东北师范大学硕士学位论文 关于碱提和水提浒苔细胞壁多糖的性质比较的研究尚未见报道 注：本文所用缩写符号 一 r h a - 鼠李糖x y 卜木糖 g l c 一葡萄糖g a 卜半乳糖 a r a 一阿拉伯糖 m a n 一甘露糖g 1 u a 一葡萄糖醛酸 东北师范大学硕士学位论文 第2 章结果与讨论 2 。1 材料与仪器 ( 1 ) 实验材料 浒苔购于浙江宁波；s e v a g e 试剂、三氟乙酸等化学试剂均使用分析纯。 ( 2 ) 仪器 d k s 2 6 型电热恒温水浴锅；r e 一5 2 c 旋转蒸发仪；s h z 3 循环水多用真空泵； l d s z a 型离心机；冷冻干燥机a i p h a l 2 ( 德国c h r i s t 公司) ；6 0 1 0 型紫外分光光 度计，7 5 4 可见光分光光度计；s e r h a r o s ec l 一6 b ( 1 5 9 0 c m ) 柱；v a v i a n3 4 0 0 气相色谱仪。 2 2 浒苔多糖提取及其粗多糖的研究 2 2 1 浒苔多糖的提取 浒苔样品用自来水冲洗，自然风干后取1 0 0g ，切碎，用9 5 乙醇，8 0 回 流提取2h ，过滤，重复三次，除去色素及小分子物质。滤渣用水冲洗若干遍， 直到滤液与苯酚一硫酸反应基本为无色；以浒苔滤渣与水的质量比为1 ：1 5 加入 蒸馏水，9 0 提取2h ，过滤，滤渣重复提取三次。合并滤液，浓缩至液体微黏， 加入3 倍体积的9 5 乙醇，4 静置过夜，离心( 3o o or m i n ) 。沉淀依次用8 5 乙醇、9 5 乙醇、无水乙醇及乙醚脱水，p 。0 。真空干燥过夜，得粗多糖w e1 5g ， 为乳白色粉末。 将洗净的浒苔残渣( 经过乙醇和热水分别提取小分子和多糖) ，用 0 5 m o l 几n a 0 h 浸提三次，合并滤液，离心，上清液浓缩后加入3 倍体积9 5 工业酒 精醇沉，4 静置过夜，离心，再经过常规干燥得到粉末状粗多糖a e 。浒苔水提 粗多糖a e 为色粉末，而且易溶于水。 2 2 2 分级纯化 ( 1 ) 冻融分级 将浒苔水提和碱提粗多糖配成5 的水溶液，放于一2 0 过夜，次日将其置于 室温，待其为冰水混合物时离心( 7 0 0 0 r p m m i n ) ，上述操作重复3 4 次，直到离 心后无沉淀。 ( 2 ) 脱蛋白 将冻融后得到的多糖配成2 的糖液，用英国进口的链酶蛋白酶，按蛋白质 与酶量比为l ：2 0 0 取蛋白酶加入至糖液中，边加边搅拌。混合液装入透析袋， 加入少量二甲苯防腐，l n a c l 做激活剂，3 7 保温2 4h ，9 0 灭活后按糖液总 体积的1 4 加入s e v a g e 试剂( v i e t g ：氯仿= 1 ：4 ) ，摇床充分震荡2h ，静置，离 心。取上清重复操作，直至无游离蛋白。透析，浓缩，冻干，得d w e 和d a e 。 r 东北师范大学硕士学位论文 2 2 3 水提及碱提粗多糖的性质研究 ( 1 ) 糖含量测定：采用苯酚一硫酸法。 ( 2 ) 蛋白含量检测：采用凯氏定氮法。 ( 3 ) 硫酸根的定性与定量检测： b a c l 2 定性检测结果表明：该级分有白色沉淀产生，且沉淀不溶于矾0 3 ，说 明该级分含有硫酸根。并采用比浊法测定其硫酸根含量。 结果如表1 所示。 表1w e 和a e 性质比较 样品收率( )糖含量( ) 蛋白含量( ) 硫酸根含量( ) 2 2 5 蛋白分布检测 将脱蛋白后的样品( d w e ，d a e ) 溶于蒸馏水，以紫外分光光度计检测其在2 0 0 4 0 0 姗区域的吸收情况。结果显示在2 6 0 硼和2 8 0 姗处无吸收峰，这说明其不含 核酸和蛋白质。 2 2 6 粗多糖的级份分布 脱蛋白后的水提多糖和碱提多糖经s e r h a r o s ec l 一6 b ( 1 5 9 0 c m ) 柱层析， 2 2 m 1 1 2 m i n ，每管2 2 m 1 ，生理盐水洗脱，苯酚一硫酸法测糖分布，粗多糖分子 量分布如图所示( f i g1 ) 。 9 东北师范大学硕士学位论文 f i g1 d w e 与d a e 的凝胶层析分析图 2 2 2 7 单糖组成分析( 气相色谱法g c ) 利用g c 分析单糖组成及摩尔比例。样品的酸水解、乙酰化：取3 、5 m g 样品， 放入1 0 i i l l 试管中，加入2 m 0 1 三氟醋酸( t f a ) 2 i i l l ，充n 。后封管，1 1 0 下水解3 h 。 水解液减压蒸干( 4 0 ) ，除尽t f a 。完全酸水解产物n a b h 4 还原，加入数滴醋酸 分解过剩的n a b h 。，减压浓缩还原液至小体积，加入0 3 m l 甲基咪唑和2 m l 醋酐， 进行乙酰化。反应半小时后，加入5 i i l l 水终止反应。加入2 m l c h c l 。萃取，萃取液 减压浓缩进行g c 分析。 测定条件：载气及流量：h e ，l m l m i n 。进样口温度：2 8 0 。气化室温度：2 8 0 。离子源温度：2 0 0 。柱温采用程序升温：5 0 ( 3 0 。c m i n ) 1 7 0 。c 、 ( 3 。c m i n ) 2 2 0 。c ( 1 0 。c m i n ) 2 8 0 ( 保持5 分钟) 。进样体积：o 1 乩， 分流比= 1 0 0 ：1 。根据气相色谱结果分析如下( 摩尔比) ： w e ：鼠李糖：木糖：甘露糖：半乳糖：葡萄糖= 3 7 2 ：1 ：0 1 2 ：0 1 2 ：1 8 2 a e ：鼠李糖：木糖：甘露糖：半乳糖：葡萄糖：葡萄糖醛酸= 1 2 1 ：1 ；2 4 8 ： 2 9 2 ：3 4 】：0 6 5 f 蟾2 水提粗多糖w e 的气相色谱 1 0 东北师范大学硕士学位论文 f i g3 碱提粗多糖a e 的气相色谱 2 3 小鼠体外淋巴细胞转化活性研究 本实验通过m t t 方法体外检测浒苔多糖对小鼠淋巴细胞生长状况的影响，结 果表明： 1 对于未脱蛋白的水提粗多糖，在单独作用时对淋巴细胞的增殖没有明显作用。 而与c o n a 共同作用时，水提粗多糖在2 0 0 一4 0 0ug m 1 时能明显刺激t 淋巴 细胞的增殖，并且随着剂量的增加，其刺激增殖的能力也明显增加，并且与 阳性对照组相比差异显著，与l p s 共同作用时，对b 淋巴细胞的增殖，只是 在最高剂量时作用明显( 表3 ) 。 2 对于未脱蛋白的碱提粗多糖，在单独作用时对淋巴细胞的增殖没有明显作用。 但是与l p s 共同作用时，均能明显刺激b 淋巴细胞的增殖，但是没有剂量依 赖性，对t 淋巴细胞的增殖作用在1 0 0 和4 0 0ug m l 时明显( 表3 ) 。 3 脱蛋白以后，水提多糖在单独作用时对淋巴细胞的增殖没有明显作用。而与 c o n a 和l p s 共同作用时，水提粗多糖在三个剂量水平均能明显刺激t 、b 淋 巴细胞的增殖，并且呈现良好的剂量依赖( 表4 ) 。 4 脱蛋白后的碱提多糖在单独作用时能明显刺激淋巴细胞增殖，并且有良好的 剂量依赖关系。并能诱导c o n a 诱导的t 淋巴细胞的增殖，但是对于l p s 诱 导的b 淋巴细胞的增殖只有当浓度达4 0 0ug m l 时有明显作用( 表4 ) 。 东北师范大学硕士学位论文 表3 水提与碱提粗多糖淋巴细胞转化实验结果 注：木表示尸 0 0 5 ；料表示k 0 0 1 ；以上数据均与阴性对照相比。 表4 水提与碱提脱蛋白多糖淋巴细胞转化实验结果 注：木表示k 0 0 5 ；水：l c 表示k 0 0 1 ；以上数据均与阴性对照相比。 1 2 东北师范大学硕士学位论文 第3 章实验方法 3 1 粗多糖的分级纯化方法 3 1 1 、材料 本实验所用材料购于浙江省宁波市， p r 0 1 i f e r 心o 3 1 2 、脱蛋白呻侧 5 糖溶液，用英国进口链酶蛋白酶，按酶：蛋白= l ：2 0 0 取蛋白酶，加入糖 溶液中，加少量二甲苯防腐，1 n a c l 作激活剂，3 7 ，保温4 8 小时，按糖液 总体积1 4 加入s e v a g e 试剂( 氯仿：正丁醇= 4 ：1 ) ，充分振荡1 2 小时，静止， 离心，取上清重复，至无游离蛋白为止。 3 2 一般方法 3 2 1 、常规干燥法 醇沉后的样品依次用8 5 ，9 5 乙醇、无水乙醇脱水，再用乙醚脱去乙醇后， 置于盛有p 。o 。及n a 0 h 的真空干燥器内真空干燥，过夜。 3 2 2 、冰冻干燥法 将盛有糖液的圆底烧瓶放入冻乙醇中( 一4 0 ) 摇动，使糖液均匀的挂在内 壁上，置于一8 0 的超低温冰箱内预冻4 小时以上，然后打开冰冻干燥机挂瓶， 至样品冻干。 3 2 3 、乙酰化5 2 堋1 2 0 m g 糖样加入到1 m 1 的2 m o l l 三氟乙酸1 2 0 条件下处理3 小时，然后放 入6 0 一8 0 水浴条件下滴加乙醇以除去剩余的三氟乙酸，用p h 试纸检测至中性； 加0 1 m 0 1 l 碳酸钠l m l ，加l m g 肌醇3 0 处理5 0 分钟；加5 0 毫克k b h 4 室温下 处理1 5 小时；滴加2 5 乙酸中和至不产生气泡( p h = 6 ) ；加入阳离子交换树脂 ( 大约使其至液面) 除盐处理2 小时，用蒸馏水5 6 m l 冲洗过滤( 使用定量滤纸) ， 滴加甲醇除酸至中性；8 5 条件下真空去除水分( 大约2 小时) ；加1 m 1 正丙胺 与1 m 1 无水吡啶5 5 条件下处理3 0 分钟；抽干后加入0 5 m l 无水吡啶与0 5 m l 乙酸酐，9 0 条件下处理1 小时；抽干后加入1 m l 无水二氯甲烷，离心后取上清 检测。 3 3 糖的有关性质测定及纯度鉴定方法 3 3 1 、总糖含量测定( 酚硫酸法) n 3 苯酚一硫酸法原理为：多糖在浓硫酸水合产生的高温下迅速水解，产生单糖， 1 3 东北师范大学硕士学位论文 单糖在强酸条件下与苯酚反应生成橙色衍生物。在波长4 9 0 n i i i 左右处和一定浓度 范围内，该衍生物的吸收值与单糖浓度呈线性关系，从而可用比色法测定其含量， 所用的单糖对照品尽量采用与其多糖组成一致或为含量较高的单糖，这样测得的 值较准确。 将1 0 m g l o o m l 糖溶液，6 的酚溶液，浓h 。s 0 4 依次按l ：0 5 ：2 5 的比例加入， 振荡，静止，冷却，然后在4 9 0 姗波长下比色，所得数值查标准曲线可得总糖含 量。 3 3 。2 蛋白质含量测定( 凯氏定氮法) 准确称取糖样1 0 0 m g ，加入5 m 1 浓硫酸，加入半勺催化剂( k 。s 0 4 ：c a s 0 46 h 。o = 3 ： 1 ) 。明火垫石棉网加热，变黑后加入少许高氯酸( h c l 0 4 ) 继续加热至溶液变浅 透明( 淡绿色) 。冷却定容至5 0 0 m l 。蒸馏，与硼酸反应，用o 0 0 9 8 4 5 nh c i 滴 定，通过计算得总蛋白含量。 3 3 3 、硫酸根的定性测定与定量测定测定( 比浊法) 取样品( w e ，a e ，d w e ，d a e ) 各0 1g 置于带盖的试管中，加lm o l lh c i 1 0 札，密封后l o o 水解6 h ，4 0 蒸干，以2 l l 去离子水溶解，滴加2m o l l 的b a c l ：，观察其是否有白色沉淀产生。以去离子水为空白对照，确定是否有硫 酸根存在 称取样品卜3m g 加入1 札1m 0 1 几h c l ，密封，于1 0 0 水解6h 。冷却 、后，内容物4 0 减压蒸干，残渣用1l n l 水溶解。取水解液0 1i i l l ，加入蒸馏 水到0 4m l ，再加入8 ( w w ) 三氯乙酸溶液o 3 5i i l l 和氯化钡明胶溶液o 2 51 1 1 l ， 混合，混合物静置1 5 2 0m i n 3 6 0 m 波长测定浊度。以1 0 0ug i n lk 。s o 。水溶液， 和水空白做对照 3 3 4 、高效液相色谱( h p l c ) 测定纯度及分子量汹3 3 m g 糖样溶予1 m l 纯水中，超声波处理5 m i n ，进行h p l c 分析，生理盐水洗 脱，与标准曲线对照得分子量。 3 3 5 、糖分子量分布分析( s e p h a r o s ec l - 6 b 柱层析) 3 3 5 1 s e p h a r o s ec l 一6 b 乙醇浸泡，溶胀后用倾泌法将不易沉下的较细颗粒