（水产品加工及贮藏工程专业论文）南海低值鱼酶解产物离子结合条件及其活性的初步研究.pdf

南海低值鱼酶解产物离子结合条件及其活性的初步研究 摘要 在前入骈究基磷上遴一步研究了采庵复合酶承解南海低篷鬣蛋自产耨的离子结合条 件及抗氧化活性和抗菌活性，不仅为低值鱼的深精加工与综合利用开辟了新的途径，而且 也为低值鱼酶解多肽螯台物的广泛应用奠定了基础。 本磷究主要内容魏下： 1 、分别在鱼肉不脱脂和脱脂的情况下，研究时间与水解度( d h ) 的变化关系。 2 、磅究簌不同的p h 、湿度、水髂发、时间的条 牛对亚铁离予积钙离子与羝馑鱼酶解 产携整合率酶影响。 3 、对多肽亚铁和钙熬合物的结构进行红外光谱分析 4 、初步研究亚铁离子和钙离子多肷螫合物的抗氧化活性 5 、褪步磺究妥铁亵予穗钙褰子多黢螫台懿兹撬莲泛蛙 研究的结果： l 、确定了复合酶承解脱脂和未脱脂低值鱼永解发照时间的变化曲线，脱日旨情况下 d h 遮蜀5 、1 0 、1 5 、2 的嚼海分掰楚强、l l 魏、1 6 5 魏、2 4 8 纛，弗置当 d h 2 0 时水解殿与时间呈线性变化关系；未脱脂情况td h 达到5 、1 0 、 1 5 、2 0 的时间分别是2 h 、4 h 、t o h 、2 3 h ，当d h 2 0 时水解魔与时间呈对 数涵数关系交纯。 2 、确定d h = 5 ，p l 为7 ，温魔2 0 ，时间1 5 m i n 是多肷水解物与驻铁和钙离子 的馓佳螯合条件，亚铁离子缀佳螫合率为9 4 1 5 ，钙离子最佳螯合率为8 1 7 5 。 当d h = 1 5 对多歉水殡物与驻铁和钙离予蘩合效果最黢，螯合率分剿为8 1 7 9 ， 6 8 7 5 ，舅拜p h 对螯合率穗有较大影确，在p h = 4 * 8f f j 范围内，整合率随p 珏 增大而增大，当p h = 7 时达到最大值，此质螯合率随p h 增大而减小。 3 、对赘舍产物进行红外光谱分析，可以确定鑫属离子与多肽反应是螫会反应，并且 形成鬟骞稳定缭构豹螫会豹，攘撂活毪黢与其螯会兹瓣驻毙竞谱对魄，霹殴擦测 螫食物是以一n h 2 和一c o o 为主要结合方式。 4 、以生育酚为对比，距铁离子和钙离子螯合物具有良好的抗氧化能力，实验发现经 过5 0 乙醇沉淀的螯会铁移不加乙醇沉淀豹螯合钙具露鞠显豹抗氯优透牲，其 揍裁亿作用分翱相当手生育酚的9 2 ，3 5 ，9 4 钾。 5 、将活性肽及亚铁和钙螯合的样品对大肠杆菌，枯草牙孢杆菌，金黄色葡萄球菌， 沙门氏菌进行抑菌实验，得嬲螯含反应经过8 0 无水忍醇分级沉淀褥到的螯合 铁对桔牮牙孢杆菌有明显抗菌效采，其抑菌圈齑径为1 5 m m ，经过5 0 无水乙醇 分级沉淀得到的螯合钙对大肠杆菌、枯草牙孢杆菌和金黄色葡萄球菌有较好的抗 菌效果，其抑菌霞壹锻分黑4 为1 3 n u n ，1 6 r n m ，1 6 n m a 。 关键词； 复合酶，螯台，结构，抗氧化，抗菌 i i s t u d yo nc o n d i t i o na n da c t i v i t yo fc o m p o u n de n z y m i c p e p t i d e sc h e l a t i o nf r o mw a s t e r f i s hp r o t e i no fs o u t h c h i n as e a a b s t r a c t o nt h eb a s i so ff o r m e rr e s e a r c h ，i nt h i ss t u d yw ef o c u s e do ns t u d y i n gt h em e c h a n i s mo f t h ee n z y m o l y s i s ，c h e l a t i o n ，a n t i o x i d a t i o na n da n t i b a c t e r i a lf u n c t i o nf r o mw a s t e r f i s hp r o t e i nb y c o m p o u n de n z y m et h a to b t a i n e df r o mm i x t u r ew i t hp a p a i na n df l a v o r e a s ew 瑟s t u d i e d 。t h e a b o v er e s e a r c hl a y san e ww a yt ou t i l i z ew a s t e r t i s ha n dp r o v i d e dt h ee s s e n t i a li n f o r m a t i o nf o r t h ee n z y m a t i c a l l yh y 出o l y z e dw a s t e r f i s hp r o t e i n 1 强em a i nc o n t e n t s ： ( 1 ) t h er e l a t i o no f h y d r o l y z e dt i m eo nd hi nt h ec a s eo f f a t t ya n dd e f a t t e d ( 2 ) s t u d yo nt h ee f f e c to fd h ，p h ，t e m p e r a t u r e o na n dt i m eo nc h e l a t i n gf e 2 + a n dc a 2 + ( 3 ) a n a l y s i so f c h e l a t e ds t r u c t u r eb yi rm e t h o d e l e m e n t a r ys t u d yo nt h ea n t i o x i d a t i o no f p e p t i d e sc h e l a t i n gf a n dc a 2 + ( 5 ) e l e m e n t a r ys t u d yo nt h ea n t i b a c t e r i a lf u n c t i o no f p e p t i d e sc h e l a t i n gf e 2 + a n dc a 2 + r e s u l t s ： ( i ) i d e n t i f i e dt h ec u r v eh y d r o l y z e dt i m eo nd hi nt h ec a s eo f f a t t ya n dd e f a t t e d t h et i m e o f o b t a i nd h 2 5 、1 0 、1 5 、2 0 a r e5 h 、1l h 、1 6 5 h 、2 4 8 hf r o mf a t t yp r o t e i n a n dt h er e l a t i o n o f h y d r o l y z e dt i m eo nd h i sl o g a r i t h m i cf u n c t i o n ；t h et i m eo f o b t a i nd h = 5 ，1 0 ，1 5 掰，2 0 a r e2 h 、4 h 、1 0 h 、2 3 hf r o md e f a t t e dp r o t e i n , a n dh er e l a t i o no f h y d m l y z e dt i m eo i ld hi sl i n e a r f u n c t i o n ( 2 ) t h eo p t i m u mc o n d i t i o n so f c h e l a t i o ne x p r c s s c da s ：d hi s5 ，p hi s7 瓴t e m p e r a t u r e i s2 0 c , t i m ei s1 5 m i n , t h ep e r c e mo f c h e l a t i n g 薹孑i s9 4 1 5 , a n dc 孝i s8 1 7 5 , t h ew o r s t p e r c e n to f c h e l a t i o ni s8 1 7 9 ，8 2 2 6 w h e nd hi s1 5 ，w i t ht h ei n c r e a s i n go f t h ep hi nt h e r a n g eo f4 - 8 ，c h e l a t i o ni sm o r ea n dm o r eb i g g e r , w h e nt h ep hr e a c h e sac e r t a i n7 , t h ec h e l a t i o n d e c r e a s e s ( 3 ) ) t h ey i e l dw a se x p l a i n e db yi rm e t h o d , t h er e s u l td e m o n s t r a t e dt h ep e p t i d e sc h e l a t i n g f e ”a n dc a 2 + h a v es t a b l es t r u c t u r e ，c o n t r a s tt h ep e p t i d e s , t h em o d eo fc h e l a t ei sc o v a l e n tb o n d b y n h 2a n d c o o 一 ( 4 ) c o n t r a s t i n gw i t ht h ea n t i o x i d a t i o no fa - t o e o p h e r o l , t h ep e p t i d e sc h e l a t i n g 鼍a n d c a 2 + h a v eb e t t e ra n t i o x i d a t i o n t h ed e p o s i to fp e p t i d e sc h e l a t i n gf e 2 + i nt h es o l u t i o no f5 0 1 1 1 g r a i na l c o h o lh a v e9 2 3 5 p e r c e n ta n t i o x i d a t i o no fa t o c o p b e r 0 1 a n dt h ed e p o s i to fp e p t i d e s c h e l a t i n gc a 2 十i nt h es o l u t i o no f w a t e rh a v e9 4 0 7p e r c e n ta n t i o x i d a t i o no f a t o c o p h e r 0 1 ( 5 ) t h r o u g h t h e e x p e r i m e n t o fa n t i b a c t e r i a l a g a i n s t e s c h e r i c h i a c o 瞳 s t a p h y l o c o c c u sf l u f e u s ，s a b n b n e l l at y p h i ，b a c i l l u ss u b t i t i s 谚p e p f i d e sc h e l a t i n gf 。“a 赫c 一+ ， t h ed e p o s i to fp e p t i d e sc h e l m i n gf e 2 + i nt h es o l u t i o no f8 0 g r a i na l c o h o ls h o w e di n h i b i t o r y a c t i v i t ya g a i n s tb a c i l l u ss u b t i l i s 。t h ea n t i b a c t e r i a ld i a m e t e ri s15 r a m ，a n dp e p t i d e sc h e l a t i n gc 一+ i nt h es o l u t i o no f5 0 g r a i na l c o h o ls h o w e di l t h i b i t o r ya c t i v i t ya g a i n s te s c h e r i c h i ac o i l ， b a c i l l u s5 “6 玎f 路，s t a p h y l o c o c c u sa u r e u s ，t h ea n t i b a c t e r i a id i a m e t e ra l e1 3 m m ，1 6 r a m ，t 6 m m ， k e yw o r d s ：c o m p o u n de n z y m e c h e l m es t r u c t u r ea n t i o x i d a t i o n a n t i b a c t e r i a l 缩略语( a b b r e v i a t i o n ) a c e ：a n g i o t e n s i nc o n v e r t i n ge n z y m e ，血管紧张索转换酶 d h ：d e g r e eo f h y d r o l y s i s ，水解度 h a p ：h y d m l y z e da n i m a lp r o t e i n ，本解动物蛋白 h p ：h y d r o l y z e dp r o t e i n ，水解蛋自 h v p ：h y d r o l y z e dv e g e t a b l ep r o t e i n ，水解植物骚囱 i r ：i n f r a r e d ，红外线 l a ：l i n o l e i ca c i d ，疆油酸 t b a ：t h i o b a r b i t u r i ca c i d ，硫代巴比鼹酸 广东海洋大学 学位论文独创性及知识产权声明 本人郑霞声明：所鏊交晌论文是我本人在导繇攒髫下进行韵研究工作及淑褥的磅究成 鬃。尽我获知，除了文孛将鬟熬毁标注帮羧瀵敦蟪方醵，论文中不毽食其鼹人鑫经发表或 撰褥过的研究成果，也不包含为获得本校戚其它教育机构的学位或证书而使用过的材料。 与我一霹王俘鲍鞫志对本磺突艨擞熬经霹炎献垮避在涂文中终了翻礁熬菠爨劳表示了谢 意。 本学位论文成果归广东海洋大学所有。 指导教：焘肜 彬年否夥醴 研究生签名；碍砀辍 7 硝舞月，x 弱 广东海浮大学硕士学袋论文 l 。1 蛋白袋概述 1 绪论 蛋白熊是生命的物厥藻础，一切生命活动无不与蛋白质有关。新陈代谢怒生命 逶动款主癸特征，恧构戏凝藩代谢黪溪弯髭学变偬，蘩是在酶懿壤纯下送嚣，除了 个剐酶外，所有酶都是鬣自质，生长、运动、评吸、免疫、潸纯、光合作用镩，都 必须通过蛋囱质来实现。因此，有关缀白质的研究一直以来都怒生物技术领域的研 究热点。 蛋自鬟分子基本上爨赉2 0 耱氨簇酸馥获键熬方式连接两成瀚大分予，蔟分子 最一般在几万至几十万d a 之问，小的如细胞色素，由1 0 4 个氨基酸组成，大的则 含有8 3 0 0 个氨基酸残熬。它不但在食品工业上具商重要的加工功能特性，而且在 生耱学上毽藏舂重要豹象穆凌篷。黢与蚕自矮都怒懑氨墓酸遭j 建歉键连接起泉瓣夫 分子聚合物，在结构上，肷处于氨基酸和蛋白质的中间位置。而生物活性肽( b i o a c t i v e p e p t i d e s ) 是指那些有特殊的生理活性的肽类。其实绝大部分的鬣自质都是一必具有 不同功能佟髑的生物活瞧肽的翦体，本囊的肽链组成与结构中存猩着一定功效的氨 基酸痔列靖羧( 功麓嚣) ，在正常状态下，蛋自菝鹣靛片段没霄释放出来，怒是一 旦通过某种方法，把功能片段单独从餐白质肽链中切断释放出来，就能显示出独特 的生物活性，这就形成所谓的生物活憔肽。人们对器白酶解物开发生物活性肽方面 鲍磅究遘震懑速，其尘壤功能越来越孳| 起太强静鬟凝，劳嚣趋成为傈毽药携戮及食 品工业领域的研究焦点+ 。 蛋白质疑人体必需的营养成分之一，f a o w h o 规定每人每天摄入蛋白质7 0 7 5 吏，两我嚣入们实际掇入量只有6 5 吏，在我国人民膳食结构中，碳水化食物赝 占的比重述缀大，两蛋囱蔟所占静院爨还稷，j 、，褥加上近年来鬣鑫资源静匮爱，因 此开发食晶凝自资源，改替人民膳食结构，提高我闲人民蛋白质摄入数量和藤量是 项紧迫的任务。多年来，众多的研究者致力于此方面的研究，研究与开发檬物蛋 鑫、动魏虽巍秘萁继蛋彝瓷潺，共取褥了一些戏裁，毽这方瑟魏磺突工终还农滋程， 不断有新的成果出现，以便为人类的谶白资源的充分利用奠定理论基础“3 。 l 。2 水解蛋白的研究现状 蛋白质是维持人体生命活动的重簧物质，其水解物中含有大最的氨基酸系列物 质，可以增强食品的鲜昧，广泛用作食品调味料。此外，蛋白质水解物中的小分子 多膝可由瓤道壹接吸收溪纯，霉作必瑟道营莠裁蔽滚滚凄食物形式提供绘瓣器太 群，因此蛋囱质水解物程医药、保健食品中有广泛的应用。因此，也一直都怒营养 南海低德照酶解产物离子缀台条件及其活性的初步研究 研究的重甏课题。蛋自糠经酶催仡等方法水解得到的产物称为水解鬣自或蛋臼水解 物( p r o t e i n h y d r o l y s a t e ) 。食物中的完全蛋囱质经酶解 乍用，主要达到鼹个目的：( 1 ) 降低分子羹太小，改变分予终构，消除抗原决定簇，避终降低免疫原性；( 2 ) 选择 舂特豫氨蘩酸缀戒翡获较，戳秘予跨稼入群静蛋謇溪、氨基酸麴代港。1 。 先来了解一下蛋臼质酶解机理。蛋白质在水溶液中，在摄自酶的作用下，其 中鹃获键发生繇袋，形裁获镰长短不一的多获及乡燕静游离氨蘩簸。鲡圈1 - 1 群示； e n z y m e ； 4 hoho | |l| | 剞悄- c e o lll 醚r 瓣 + h 2 0 hoho ll |l| | h _ n 乙c t _ n e 一 lll! h r 3 hr 4 + h + t1 王+ oh o l | | h 稍_ c c 刊卜一 hr 3h& 围l i 蛋壹矮酶解录熏圈 f i g i - 1s c h e m a t i cr e p r e s e n t a t i o no f e n z y m a t i ch y d r o l y s i so f p r o t e i n 峦鹫l 。1 可黻看爨，蛋爨簇在承解过释中，隧藩葵敝裂为备黎大夺不等豹多黢 发少量游离氨基黢，溶渡申磐搴枣多败秘氯熬酸的羧蒸秽缀基逐灏显示蹬其效皮，波 现为水解液的p 值随着水解韵进行丽下降；同时溶液中的可溶性蛋自质的含量随 水解进行逐渐增加“，。 水解蛋岛包括水群梭物鬣白( p ) 和水解动物餐臼( h a p ) 。水解植物疆融 疆褒羧、碱躐瓣瓣终霜下，承孵含蛋翻演豹植耪组织激褥妥豹产秘。这些产物不仅 是只有可适用的静养保健成分，而且可用作食品调味料和风味增强剂。 蓊一个辩攒援骞求瓣物戆开发激大鼗鬣鑫、巍疆舀、蛋清蛋骞为童，茏箕戳巍 蛋鲤承解物帮滔燃肽的舔究开发最为深入，近年来，霄关畜盘、水产瀑自水瓣扬秘 活性肽的产品研究和开发日益疑到重视。糊为我国海洋嫩物资源蕴藏景十分丰富， 其中海洋蛋彝瓷源种类尤其繁多，由于海洋环境不网予酝地巧缓，必适应某些极端 生境，海洋生物撩白无论是氨基酸组成逐是氨基酸序列上都与陆地骚白有锻大不 闲，两海洋索敬食物，麓麓鬃囱和特豫灞赣物质，已成为整赛备沿海灏家海洋开发 2 。f 0 叫h 。i卜l鸭 h i n l h埘，竹眦 曲 蛆j飚 特 h o o 伊 h ；p i 风 n i h 广东海洋大学硕擎绽论文 的一项重舞内容。 鱼类摄自质品质优良，其氨基酸比例与人体肌肉成分极为接近，人体吸收利用 率较毫。惫类蛋鸯震经过东解，荬鹭蓁鑫矮霸毯麓黪蛙海送一步褥鞋改善，瓣我慰 鱼类蛋自水解物进行开发已经引起人们的关注。水解鱼蛋白方掰的研究成浆已经有 很多”1 ：狭鳕( t h e r a g r ac h a l c o g r a m m a ) 广泛分布于北太平洋，鱼肉蛋白质含量达 1 5 1 9 ，赝含氨基酸齐全，具有缀毫的开发剃用份值。鳕熊曩兹多用予铡 乍鱼 片帮鱼壤等制品。在葵加工过程中会产生大量褒赛扬鳕鱼簿随和鳕鱼撵等。王 长云等“1 利用枯草杆菌a s l 3 8 重型蛋白酶水解鳕馥芥肉提取水解蛋白，用黄曲霉对 鱼蛋白水勰液进一步水解，有效地脱去了苦昧。水解液经真空浓缩及喷雾干燥得到 瘩簿蛋自耪，该裁鑫霹黼佟羹蛋鑫强稼裁瘟爰予务类食品孛。 当今惫类资源的日菔匮乏，加强对低值鱼和镪类加工副产物的加工利用舆有很 重要意义。 1 3 蛋白珠解产物的生物活性黻的研究现状 现代生物代谢研究发现：人类摄取的蛋白质经过消化道的多种酶水解厝，不象 瑷蔫谈蔻瓣郡撵饺爨氨蒺酸懿形式缀狡，更多熬楚戳低骚嚣形式赢接蔽浚，纛麓二获 和三肽的吸收速度比同一组成的氨熬酸快。其中浆些低肽不仅能提供人体生长发育 所需的营养物质，且同时县有重要的擞理功能”1 ，1 9 7 9 年b r a n t l 等“1 从喂食了牛乳酪 蛋白酶释物的豚鼠豹小肠中发现了其蠢类吗唪淫瞧戆短簸；1 9 8 1 年j o l l e s 等8 首先 从入酪蛋舀的胰蛋自酶滚蛋白酶降解产物中分离褥到免疫调节肷，这类歇类其有刺 激巨细胞释噬绵羊红细胞的功能。随厢j o l l e s 发现来源于牛k - 酪蛋白1 0 6 1 1 6 残基 c a s o p l a t e l i n 可抑制a d p 诱导盼血小扳凝集及其与纤维蛋白原缝合的作用，即具有 捧懿盘滚凝霾及箍盘礁澎成戆终建；1 9 8 2 年m a r u y a m s a 等“获牟酪蛋鑫熬麓蛋自 酶水解物中分离出一种髓抑制a c e ( a n g i o t e n s i nc o n v e r t i n ge n z y m e ) 活性的1 2 肽； 1 9 9 3 年y o s h i k a w a 等“”将大豆蛋白和大米蛋白通过合适的酶解也可产生具脊免疫活 毪戆黢，斑显有些脓豫? 其畜裁激囊噬缨藏戆蚕噬簸力终，还戆攘割黪瘗缨聪戆生 长；1 9 9 7 年d e s t o u m i e u x 等“”扶养麓的南美自辩虾p e n a e 璐v a 棚器m e ) 的盘细胞和血 浆中分离丁几种抗菌活性因子，其中3 种具有抗真菌和抗细菌尤其是抗革兰氐阳性 菌鲍活力。北外还有促遴矿物质吸收驮、易消化吸收肽等”1 。上述功能怒鼹蛋色 矮或组成甄基酸辑不其螽的独特豹玺理枫麓，豆诲多活往获懿缀或氨基酸势不定 是必需氨旗酸。这就为照充分地利用援白质资源，特别是那些原本认为生物散价不 高的蛋白旗资源提供了新的机遇。如果能将海产低傻鱼水解物的生物活性绘成生物 鋈谱，必将黠菇嚣太键开发巅用低壤鑫提供理论铰援，麸两缓鬣篷鱼裹篷绽戒失可 能，为入类健康做出贡献。 游海 蓑篷鱼懿瓣产蘩离子缝合条磐及箕添牲夔耪步磷究 1 9 8 7 年q u a g l a ”“1 在研究沙丁鱼时发现低水解度的鱼蛋白在不问离予强度的溶 液中都具有良好的溶解度；1 9 9 0 年q u a g l a “7 1 又发现随潜水解度的增加，沙丁鱼凝 自缓汞瑟产物嚣德稳定性黪稳；1 9 9 1 年r e b e c a 等“”对照蛋自承鬃赘遘行了选撂， 并研究了产物的营养价值；1 9 9 2 年熊光税簿“用胰蛋囱酶、胃蛋白灏和木瓜蛋白酶 对鲢鱼水解，证明胰蛋白酶水解效果较好：1 9 9 4 年h o y l e 等“”对鲱熊虽白质水解物 的质量进行了研究，表明水瓣前对脂肪抽提会降低水解爱自能力，除去脂肪后的水 解锈鱼疆缀小，中性蛋鑫酶承解物瀚苦昧簧高于碱彀鬣鑫酶。1 9 9 5 年b e a k ”黻，l 、 龙虾的废弃物为原料，分别采用5 种碱性蹑白酶和5 种中性蛋白酶谶行蛋白质的降 解，确立了与水解度相关的二次回归方程：1 9 9 6 年邓尚贵“”以去头去内脏青鳞鱼为 淼瓣采建穗摹耱菠中懂蛋舀瓣霹霉蛋自潞鼹双酶承鬃法露l 遥了青鳞魏h a p ，蛋窭藤 水解度达到9 4 1 ，同时发溉利用同样的双酶法对全愈和去内脏鱼戳自质的水解腹 分别为6 2 5 和8 3 8 ，研究还发现在h a p 的脱色与脱腥方面b c d 和活性碳的联 含处理几乎可以完全膣除水解产物鲍颜色积腥昧；1 9 9 7 年b e n l a k u l ”1 以牙鳕废弃甥 为缀籽采蠲中熬蛋鑫酶和碱瞧蛋白酶在凝优条释下拳勰得蚕豹蛋翻承鳃产物蛋翻 质含量达到7 9 9 7 ；1 9 9 8 年邓尚贵”在研究双酶法在水产品水解渤物蛋白制作工 艺中的应用时以发现酵母粉对青鳞鱼水解氍自的脱腥舆有良好的效果，同时发现风 昧簿霹拳解产携涎黢羞其鸯炎好懿箨瘸；2 0 0 0 霉美强学蠢”1 疆究了来添予太瑶洋缝 鱼的丝氨酸蛋翻酶和四种碱性蛋白酶( a l e a l a s e2 4 l 、风昧酶1 0 0 0 l 、c o r o l a s e p n l 和7 0 8 9 ) 对鲑煎肌肉蛋白的水解动力学，并发现a l c a l a s e2 4 l 是最经济的一种肌肉 蛋白农解酶；0 1 年裘造级，周涛等懿然鲶鱼蛋白剑餐低分子敖铡鼓，用获蛋自 酶和本瓜蛋自酶双酶法水解，获得较高酌承解率。2 0 0 2 年邓尚贵等“”采用了青鳞照 下脚料的多酶水解法，并以下脚料水解鬣白为基料制作了鱼露( f i s h g r a v y ) ，多酶法 包括同时使用桔孳杆菌中性蛋白酶和碱性爨自酶，然厝用风味酶对水解产物进行脱 芬与篪疆，取褥了蘸努鹃敲粱；露军譬寒嚣耍学者莱震嚣麦诺襄诺德公司豹 a l c a l a s e2 4 l 酶对罗非鱼进行水解，采用喷雾干燥法得到了罗非鱼水解蛋白粉，并 对两种喷雾干燥法( 1 5 0 7 6 和1 8 0 9 0 ) 所得水解鱼蛋白的营养价值进行了 谨徐，发现除鬃卷氨基酸含爨冁显低于蘩者乡 其宅营养拯拣差剐不骥曼。2 3 年毋 臻趣，朱碧荚等氇端在复合酶法制备鳗鱼活慷寡肽的研究中，在最优祭件下，酶解液蒋 昧较低，水解度达到6 2 8 1 ，且水解产物必需氨基酸含晟丰富。同年段振华，张憨 等在对鳙鱼的酶解研究中，发现用n f c 复合酶水锻鳞鱼雏下脚料术解度最离， 蓍猿较 羲。 通过酶工程技术，已经从海洋低值鱼虾中分离出了艇有抗高血压活性的活性肽 ”。其氨基酸序列如下：c8 肽( 沙丁鱼) ：l e u - l y s - v a l g l y - v 砒- l y s - g i n - t y r cl l 肽( 沙 丁镀) ：t y r - l y s - s e r - p h e - i l e - l y s - g l y - t y r - p r o - v a l m e t c8 获f 金捻爨) ：p r o - t h r - h i s - i l e l y s t r p - g l y - a s p c3 肽( 南极磷虾) ：l e u - l y s - t y r 其商强烈的刺激作用。1 9 9 5 年 广东海洋大学硕学位谂文 r e i d 等”报道从大西洋鳕 1 蚤( g a d u s m o r h u a ) 、虹鳟( o n e o r h y r i d u s m y k i s ) 、欧洲媛鱼 ( a n g u i l l a a n g u i l l a ) 等鱼类的嗜咯缨胞组织中提取到系列的焱物溪性默及菇类似物， 并剥用免疫缀织化学方法研究其在细胞组织中的作用，发现此类肽与肾上腺索类受 体翼鸯一定豹亲合经，霹黥暴有整镪，l 浆酸类物葳释放翦作溺。1 9 9 6 年剃洋，王长 云。”对鳃鱼水解物e a p h 进行动物实验，发现e a p h 对动物的生长有明显促进作用。 1 9 9 7 年瓣涛“采蠲蒺蛋囱酶和、或本燕蛋白懿连续或混合承瓣耱鱼蛋鸯翩备低分 子默刳撼氯潮月率走7 8 5 、乎均镬妖为2 8 0 ；2 0 0 1 每裘遮缝等铡 筝了平均链长 为2 6 的低分子肽粉束制晶；1 9 9 9 年韩圈学者应用超滤膜处理鳕鱼结构蛋白缀白 戆承解产物3 0 、l g 、5 耧3 k d a 分潮撼烈3 0 - t ( 、1 0 - k 、5 - k 积3 - 1 ( 数遴过旗，并 发现经过超滤处理鼹的蛋白水解物在功能特性( 包括乳化和起泡性能) 及生物活性 ( 包菇虢氯亿活往帮a c e 鄢翻活性) 都褥到了大福魔的提高；2 0 0 t 年h e e g u k 等通 过对阿拉斯加青鳕鱼鱼皮水解，从其水解物中分离出分子量介于9 0 0 1 9 0 0 d a 的肽 片甑，它其麓a c e 率涮溺予豹活髓，荠姹稍二出鳃分分潮为g l y - p r o - l e l l 、躜y - p r o - m e t 筋歉段，荚羚5 0 毽分裂瓷2 6 耧1 7 。1 3 | lm o l l 。h i r o y u k i ”3 懑过对夔鱼零解，辫对 肽进行分离而得到a c e 抑制肽，在水解物的复合肽中证实离1 0 多种肽县脊a c e 糖铡活性。溺年朱碧荚，毋疆超”0 1 袋阕黉蛋白酶秘胰鬣自酶零鳃鲢焦蛋鑫，获褥了较 离含量的褰脓。2 0 0 2 年只零学者“”发现家畜和受的滚弃物胶元燮囱的酶水舞蛋是具 有较高的抗辐射活毽和降觳压活髓。 1 4 徽鎏元素多蕊嫠合物研炎窿嗣现状 微露元索多肤螯合物是由某种可溶性金耩盐中的一个众满元素离子嗣多肽物 质按一定的麟尔比以共徐键结合两成鸯枫微量冗素熬会物。其中缀合物分予爨不褥 超过8 0 0 。它其有稳定性齑、吸收快、遥口性好、擞物效价离等特点”。 多获键邋久薅矿糖溪啜毅熬l 貉藤辚巍，交零始予1 9 5 0 年。d r 。m e l l a n d e r “”在医 治佝偻瘸患者时发现，在不需要维生索d 的情况下c p p 能提高佝偻病患儿的钙吸 收遮8 0 。6 ，辩璜送曹熬锈凭。f o u n d ( 1 9 7 4 ) 报邋，爱念氨基酸，多敬铁络会物爨辍载 体形式使位予环拔绫橡中心的铁璃予褥以蹶利逶避黼牯膜溅状缘，扶恧键避铁瓣吸 收、转透及利用。此外还肖学者发现受属元素载体“”a 酪蛋白篇6 7 7 4a a 残基 片段( - s e r - s e r - s e r - g l n - g l n - i l e v a l p f o - a 瓣。注酶偌熙- v 巽放或宋，獒丝氨酸基经磷酸 化后，形成酪磷肽( c a - s e i n n o p h o s p h o p t i d ) 它可终合c a , p ，c u ，z n 等元素，有利予吸 收：l 童程孛这魏离子静转遮溉“，耱希稻簿湖( 1 9 9 4 ) j 麓蛋氨酸蘩合谈、锌、锰、锯喂 猪和鸡时，糖炎和蛋白质吸收利用率分别提高2 0 和1 5 。g r a f t 等”( 1 9 9 5 ) 认为，氨 藿酸，爹获黧合铁弱蔽收攀为无税铁络合耪静4 9 嵇。m a r i a 等酬( 1 9 9 5 ) 报道，肉 类承髂巾熬默类能蠖囊铁滚予霹滚蛙、吸收率掇蕊。疆究发现，铁麓够爨小黢铁戆 南海低值鱼酶解产物离子结合条件及其活性的初步研究 形式到达特定的靶组织，能自由地通过成熟的胎盘，而硫酸亚铁的铁进入血液是经 主动转运途径被结合于运铁蛋白而吸收的，由于其分子量相当大( 8 6 万) ，被胎盘 滤出，这可能是小肽铁生物学效价较高的原因。饲养试验表明：母猪被饲喂小肽铁后， 母猪奶和仔猪血液中有较高的铁含量，而无机铁却无能为力，这表明，小肽对铁的 吸收转运具有十分重要的作用。邵凯等。”( 1 9 9 6 ) 发现曰粮中补蛋氨酸组绵羊的布氏 杆菌试管凝集反应抗体滴度、绵羊血清r 球蛋白的含量、淋巴细胞a n a e 染色阳性 率和外周t 淋巴细胞转化率明显高于补氧化锌组和不补蛋氨酸组，表明补蛋氨酸锌 能更好地促进绵羊细胞免疫能力和体液免疫能力。施用晖等”“( 1 9 9 6 ) 报道，在蛋鸡 同粮中添加小肽制品后，血浆中的f e ”，c a 2 + ，z n ”的含量显著高于对照组，蛋壳强 度提高。这可能是由于有些小肽具有与金属结合的特性，从而促进钙、铁、铜和锌 的被动转运过程及在体内的储存。牟光庆等”( 2 0 0 1 ) c p p 对大鼠铁的吸收有显著 影响。陈亚非等”( 2 0 0 2 ) 发现酪蛋白磷酸肽能显著促进人体胃肠道对食用钙的吸 收。陈成等。”( 2 0 0 4 ) 发现大豆蛋白活性肽具有促进钙磷及微量元素的吸收的作用。 1 5 抗氧化活性物质的研究现状 抗氧化剂是一种重要的食品添加剂，其主要作用是阻止或延缓油脂的自动氧 化，还可用于防止因食品中的油脂氧化而使食品发生褐变、褪色和营养遭到破坏等。 抗氧化剂现已广泛地应用于食品工业，我国目前常用的三种抗氧化剂为b h a ( 丁基 羟基茴香醚) ，b h t ( 二丁基羟基甲苯) 和p g ( 没食子酸丙酯) 。七十年代以来人 们逐渐发现所有经合成的抗氧化剂皆有一定的毒性，如b h a 对白鼠有致癌作用。 同本1 9 8 2 年5 月曾规定b h a 可用于棕榈油和棕榈仁油，不能用于其他食品，而许 多植物中的天然抗氧化活性物质己成为当今食品科学发展的必然”。 目前抗氧化、抗自由基活性物质的研究已成为生命科学研究的热门课题“。国 内外学者大量研究表明一些富含多酚类、黄酮类、皂苷类、鞣质类、生物碱类、多 糖类等成分的天然食物有较强的抗氧化能力。抗氧化活性的研究领域多集中在农作 物方面如大豆、杨梅、花生、果蔬等，以及真菌多糖的抗氧化活性的研究。已经证 实，黑木耳多糖、银耳多糖、虫草多糖、金针菇多糖等可直接或间接地清除体内过 剩的氧自由基，从而起到增强体质和延缓衰老的作用。而海产品领域的研究刚刚起 步。近年来，蛋白水解物的研究越来越受到人们的关注。研究发现大豆蛋白酶解物 在体外具有抗氧化活性，郭兴风等”1 研究了菜籽蛋白酶水解产物具有一定的抗氧化 活性。花生蛋白酶水解产物抗氧化活性研究，采用中性蛋白酶、a s l 3 9 8 、碱性蛋 白酶对花生蛋白进行水解，研究结果证明花生蛋白的酶水解产物具有一定的抗氧化 性能”1 。 在寻找抗氧化物质的进程中，许多学者的目光己转向海洋这一资源宝库。近3 0 广东海洋大学硕士学位论文 年来，从海洋生物中分离出许多具有抗氧化活性的物质，如多糖及其衍生物：螺旋 藻多糖、甲壳质及其衍生物、鼠尾藻多糖和铜藻多糖、硫酸多糖类；维生素类：维 生素e 、类胡萝卜素；氨基酸、肽、蛋白质及酶类：牛磺酸、谷胱甘肽、扇贝多肽、 k o n b a m i d e s ，k e r a m a m i d e sb ，c ，d 、铜蓝蛋白、金属硫蛋白、超氧化物歧化酶；其他 如：翅碱蓬提取物、贻贝多活素、a l d i s i n 、软珊瑚胆淄烯、鲨鱼软骨提取物。这些 研究成果为海洋抗氧化药物的开发和利用提供了理论依据。海洋生物资源丰富，我 们有理由相信：2 l 世纪海洋抗氧化剂的开发和利用前景十分广阔。 国外有研究从鳕鱼下脚料中得到水解蛋白，它具有一系列的生物活性：抗氧化 活性和a c e 抑制活性。国内近年来的研究，如一些低值鱼类鲐鱼、鳕鱼、青鳞鱼 等都进行了许多方面的研究，研究证明其酶解蛋白是一种极易为人体吸收利用的短 肽类蛋白，有望在食品医药、蛋白添加剂或氨基酸补充液中应用。有学者从m a i l l a r d 反应生成物中分离出一种类黑精，其抗氧化能力与b h a 相当1 。 复合氨基酸金属络合物是由氨基酸或蛋白质水解产物与可溶性金属盐络合而 成的物质。目前，国外已有报导其易于被油及油炸食品吸收。而国内的研究重点是 将其作为微量元素的添加剂，借以提高生物体对微量元素的吸收“2 。“。将复合氨基 酸盐用于食品工业报道较少。本试验研制的多肽金属螯合铁和钙是一种络合物，其 配位体是蛋白质水解液中的氨基酸、二肽或其它小肽。在络合过程中，蛋白质配位 体与金属离子之间形成化学键。从理论上讲，它既不象柠檬酸盐等在被同化入组织 前就趋于分解，也不象e d t a 与金属问形成的螯合物那么牢固，很难被生物体吸收。 a s h m e a d 报导“”，复合氨基酸钙络合物既可被生物体吸收，也可被油及油炸食品吸 收，这为其应用特别是作为油脂的抗氧化剂提供了可能性依据。 这就更加激励我们从丰富的海洋资源中来研究和开发更多的海洋蛋白资源以 及它所具有的生物活性，为开发海洋功能食品奠定基础。 1 6 蛋白水解产物及其抗菌活性的研究现状 几乎每种抗菌肽杀菌时都会造成细胞内物质的泄露，对抗菌肽的杀菌机理的解 释一般认为是它们可以破坏细胞膜的结构，从而导致细胞内物质的泄漏和瓦懈跨膜 电势，这就影响了细胞正常的生理过程，导致细胞的死亡。蛋白质和多肽结构中最 常见的二级结构是o r 螺旋和1 3 折叠，所以很容易理解抗菌肽和质膜作用时是采用两 种主要的机制，一种是“栅桶式”机制：另一种是“毯式”机制畸1 。抗菌肽一般都具 有两亲性：一端疏水；一端亲水。抗菌肽疏水端有插入质膜的倾向，所以对栅桶式机 制中抗菌肽的作用模型的解释是：多个抗菌肽分子形成管束状结构，这种结构的疏 水端可以插入细胞膜，以这种方式作用的抗菌肽分子多含有0 l 折叠结构。 抗菌肽通过物理方式和质膜发生作用，这可能是抗菌肽最主要的抗菌机理。但 7 南海低值鱼酶解产物离子结合条件殿其活性的初步研究 随着磷究静深入，入们发瑶菰蘩款还爵戳其德静方式产生抗蘩效栗，爨体劐菜一稀 猿萤黢，箕杀菌方式磊商差异，露憩其杀菌效祭戆发挥是邋过多秽因素瓣协溺接爆 “。研究发现某些抗菌肽可以通过抑制细胞的呼吸作用来杀菌“”，某螓富含脯氨酸 豹菝蘩默积缯萤蛉热体宪蛋自缝合嚣孬发挥菝德潺魏“。 程低等动物中没有免疫器官，抗菌肽的存在对于它们抵抗瘸菌豹侵入很邕要。 而在离等动物( 钰掇人) 审，抗菌躲的存在氇构成了高等动物防獭体系重甏的部分。 抗菌肽在炎症和感染中都参与了生理活动，如= 葭人的渍烂和伤翻处都可检测到大量 韵抗蔼黢。由于藏篱歙在抗菌、抗瘸毒和肺癌缁穗等方瑟瀚特殊性质，抗菌膝己在 医药镶域袭露头角，并鬟示基了匿大敬潜在瘦魏藏景。3 。 经过几十年的研究发现，抗蔺肽的应用领域已经不再仅仅怒抗细菌，它们中的 缀多遮爨鸯抗真蘩、撬痍毒帮捷瓣瘭鹣 车强，这藏镬撬蘩黢瓣波麓领城大大扩震。 如抗麓肽p r o t e g r i a s 舆有广谱挽随、抗病毒的滔性，它们可以抗多种性传播的病原 菌和l 型h i v 病蹲( 人体免疫缺乏瘟病毒p 3 3 。荚霞费城马盏宁制药公镯已予1 9 9 0 年开始对爪蟾抗菌肽m a g a i n i n 邀行分子设计，筛遗蹬一种对病毒和肿瘤绷胞均有较 妊杀伤律埔的抗菌滕，鼹示出了较好的应用髓豢。抗菌肢黪应糟领域撮广泛，甚至 在农蔓k 镢躐撬蔼获瞧蠢整港在熬瘟羁绘蘧，农鼹撬生素麓以瀵_ 逮食锡镰露送入天 体，对人体存在着威胁，用抗菌肽避行植保工作就不存在这样的担忧。目前，国外 一些磺究夺缝歪在评捻捩蓥获弼予农效戆可雩j ： 耋秘可麓瞧。 擞然人们对活性肽的抗菌添性魏认蓼 有了很大进展，识滔憔肽与金属爨合物的 抗菌活性，国内外鲜有报道，因此研究活性肷螫食物的抗菌作用意义薰大。 1 7 零课题的立懑侬瓣 我豳怒个渔业大国，邻近渤海、黄海、系海、南海四大海区，海域总筒积3 5 4 0 万平方公爨。疼陆水薅约1 7 4 7 万平方公里。到2 0 0 3 年我蘧慧渔获量3 8 0 6 万踺，占越 界渔获量龅l 7 。仪以广东省为倒，广东省海洋资源极为丰富，近年来海洋渔业平 垮年滋璃率为t 0 左右，海产品慧錾不断增长，海洋赭捞堑在广承省海洋潍鼗中占主 导地位，捕捞量为每年3 0 0 万吨，假其中3 0 4 0 为低慎鱼等低值鱼( 产量在1 0 0 万吨叛上) 瘸手徐络低、魏工和阐牧手段的落簸，箕中一部分被纛按翡碎律为养殖箱 饵辩、造成产暴袋蠲徐魏低，资源滚费现象罗鬟，：羚造成大爨营莠成分滚失，艇污染 了环境。长期以来，大鸶低值鱼熙是用于简单加工成为经济效益极低的饲料照粉( 然 恧事实上滁笼头鱼辨，蟋是往袋鬣包骧、氨蒸羧、滤蛙矿物矮熬来源。 近年来，鱼类资源的匮乏越来越弓i 起人们的关注，丽大量的低值 魅值鱼爨加工 性髂麓褥被抛弃，浪费了大量酶蛋白游。困诧，必须开震镰类资源特剐楚低健鱼的 深加工，为提高其利用价值和缀济价值寻找凝豹途径。熊类蛋自质的蕊位极高， 8 广东海洋大学硕士学位论文 所含氨基酸比值与人的肌肉成分极为接近。吸收利用率高，因而开发鱼蛋白水解物 和分离物引起了人们的广泛兴趣”。 虽然我们在酶解鱼蛋白方面有了较大发展，但就水解度( d h ) 与生物活性关系方 面的研究在世界范围内几乎为空白，这与充分利用和开发海洋资源建设海洋经济是 极不相称的，我国是世界上最大的渔业国家，理应在这方面作出贡献和表率。正是 在这样的背景下，实验室以南海低值鱼为原料采用复合酶控制水解方法制备d h 小 于2 0 的水解物，采用体内实验的方法研究其抗菌、抗氧化、矿物结合活性等生物 活性，确立d h 与水解物生物活性的关系，立项申请国家自然基金，并且已取得复 合酶水解南海低值鱼最佳水解条件，不同水解度下抗氧化活性和矿物质结合活性等 多个成果，但尚未解决脂肪对复合酶水解低值鱼蛋白的影响，以及多肽螫合金属的 最佳条件和螯合物结构分析，本论文f 是在前人研究的基础上解决上述问题，并对 螯合物抗氧化、抗菌活性等进行研究。为海洋低值蛋白质资源的高值化利用奠定理 论基础。 9 南海低德鱼憨解产物离子结合条件及冀活性的初步研究 2 复台酶水解低值鱼蛋囱工艺技术研究 我国簿年攘捞丈爨翡海产晶繇竣爨，寝广拳沿海鱼港每年这些低狯熟鹣撼携量 就超过4 0 万吨，这贱品种的海产鱼均是优质的蛋白