（食品科学专业论文）豇豆胰蛋白酶抑制剂基因在毕赤酵母中的高效表达及其蛋白纯化.pdf

中文摘要 本研究从原核表达载体p g e x 4 t c p t i 上亚克隆得到豇豆胰蛋白酶抑制剂( c p t i ) 基因，通 过s n a b ，和n o tj r 双酶切作用，将白盯基因按照载体阅读框转译方向插入到表达质粒p p i c 9 k 的多克隆位点中，构建重组表达质粒p p i c 9 k c p t i 。利用电转化方法将重组质粒转化到表型为 h i s 。的宿主菌k m 7 1 ，利用m i ) 培养基筛选到5 0 0 多个转化子，再经g 4 1 8 抗性的二次筛选，获得 5 株含高拷贝。玎基因的重组毕赤酵母转化子。经过对五株高拷贝重组毕赤酵母转化子的发酵表 达，成功获得一株高效分泌表达的重组菌株，并在发酵上清中可直接检测到c p t i 其大小为1 5 k d ， 比理论值多5 k d ，但是和豇豆中提取的c p t i 蛋白大小一致。推测是由于两种不同来源的蛋白有 相似的糖基化修饰造成的。 对表达条件进行优化，得到重组毕赤酵母表达c p l l 的最佳发酵条件为：以b m m y 和b m g y 为发酵培养基、装液量1 0 、2 8 c 、2 2 5 r p m ，培养基起始p h 值为6 ，甲醇浓度2 ，诱导5 天。 该条件下发酵所得的c p t l 产量约为1 0 0 m g l 左右，活力约为1 8 0 0 t i u m l 。根据c p t i 的等电点， 选用弱阴离子交换柱s e p h r o s ed e a ef f 对重组毕赤酵母分泌表达的蛋白进行纯化，可得到电泳 纯的c p t i ，其得率可达8 1 。 本研究建立了c p t l 的重组毕赤酵母表达体系，建立了大量获得c p t i 蛋白的有效方法，为进 一步开展水稻外源蛋白c p t i 的毒理及致敏研究奠定了基础，同时为其它转基因植物外源蛋白在 真核表达体系中的获得提供了研究经验和基础。 关键词：转基因水稻豇豆胰蛋白酶抑制剂毕赤酵母表达纯化 a b s t r a c t t h e c p t l g e n e w a sc l o n e d f r o m t h e p l a s m i d o f p g e x 4 t - c p t i c l e a v e db y s n a b i a n d n o t l ，i t w a si n s e r t e di nm c so fp p i c 9 ki nr i g h tt r a n s l a t i o n a lf r a m e t h er e c o m b i n a n tp l a s m i do fp p i c 9 k c p t l w a ss u c c e s s f u l l yc o n s t r u c t e da n di ti st r a n s f o r m e di n t op i c h i ap a s t o r i sh o s ts t r a i nk m 7 1 ( h i s ) b y e l e c t r o p o r a t i o n a b o u t5 0 0h i s + t r a n s f o r m a n t sw a so b t m n e db ym d m e d i ap l a t es e l e c t i o n a f t e rt h a t ，5 r e c o m b i n a n t s p i c h i a p a s t o r i s t r a n s f o r m a n t s w i t h m u l t i p l ec o p i e s o f c p 玎g e n e w e r e o b t a i n e ds c r e e n e d b yg 4 1 8g r a d i e n t f o l l o w e db yf e r m e n t a t i o ns t u d yo ft h e5s t r a i n s ，o n eh i g h - l e v e le x p r e s s i n gs t r a i nw a s s e l e c t e do u tf o ro p t i m i z a t i o no ff e r m e n t a t i o nc o n d i t i o n si nw h i c ht h ec p t la c t i v i t yc a nb et e s t e d d i r e c t l yi ns u p e r n a t a n t t h em o l e c u l a rw e i g h to ft h ee x p r e s s e dc p t ii sa b o u t1 5 k dw h i c hi s5 k d h i g h e rt h a ni t st h e o r e t i c a ls i z eb u ti si d e n t i c a lt ot h a to f t h ec p t ip u r i f i e df r o mc o w p e a i ti sd e d u c e d t h a tt h e s et w ok i n d so fc p t ih a v et h es a m eg l y c o s y l a t i o nm o d i f i c a t i o n t h eo p t i m a le x p r e s s i o nc o n d i t i o no fc p t ii sb m g ya sg r o w t hm e d i aa n db m m ya si n d u c t i o n m e d i aw i t hp h6 ，1 0 p e r c e n to fb o t t l ev o l u m ef o rm e d i av o l u m e ，c u l t u r i n gt e m p e r a t u r e2 8 c ，2 o f m e t h a n o li n d u c i n gf o r5d a y s i nt h i so p t i m a le x p r e s s i o nc o n d i t i o n ，t h ee x p r e s s i o nl e v e lo fc p r li s a b o u t1 0 0 m g lw i t ha na c t i v i t yo f1 8 0 0 t i u m l a c c o r d i n gt ot h ei s o e l e c t r i cp o i n to ft h ec p t i ， s e p h r o s e d e a e f f w a s c h o s e n t o p u r i f y i b ep r o t e i n w ec a n o b t a i n8 1 o f t o t a l c p t ie x p r e s s e d i n p i c h i a p a s t o r i si nt h i sm e t h o d t h i ss t u d ye s t a b l i s h e dr e c o m b i n a n tp i c h i ap a s t o r i ss y s t e mf o rc p t le x p r e s s i o na n dd e v e l o p e da n e f f i c i e n tm e t h o dt op r o d u c el a r g eq u a n t i t i e so fc p t lw h i c hm a k eag o o df o u n d a t i o nf o rf u r t h e rs t u d yo f t o x i c i t ya n da l l e r g e n i c i t yo fc p t i ，w h i c ha l s op r o v i d e se x p e r i e n c ef o ro b t a i n i n gf o r e i g np r o t e i n e x p r e s s e d i no t h e r t r a n s g e n i c p l a n t s b yu s i n g p i c h i a p a s t o r i se x p r e s s i o ns y s t e m k e yw o r d s ：t r a n s g e n i cr i c e ，c o w p e at r y p s i ni n h i b i t o r ( c p t i ) ，p i c h i ap a s t o r i o s , e x p r e s s i o n ， p u r i f i c a t i o n i l 插图和附表清单 图1 - 1 质粒p p i c z a 的结构1 4 唧7 图2 - 1 表达质粒p p i c 9 k 的结构1 4 8 1 1 2 表2 1y p d g 4 1 8 平板的制备1 4 图2 ，2p c r 产物的琼脂糖电泳2 2 图2 3 重组表达质粒p p i c 9 k c p t i 的构建2 3 图2 5 线性化质粒的电泳检测。2 4 图2 - 6h i s + 转化子在含3 0 m g m l g 4 1 8 的y p d 平板上的筛选2 5 图2 7h i s + 转化子在含2 0 m g m lg 4 1 8 的y p d 平板上的筛选2 5 图2 8h i s + 转化子在含0 2 5 m g m lg 4 1 8 的y p d 平板上的筛选2 6 表3 1 不同毕赤酵母菌株的诱导表达筛选一3 2 表3 2 诱导过程中1 0 0 甲醇的补加体积3 2 图3 - 1 不同菌株发酵液上清蛋白含量比较一3 5 图3 2 不同菌株发酵液上清抑制剂活性比较3 6 图3 - 3 重组毕赤酵母菌株诱导表达上清的t r i c i n e s d s p a g e 3 7 图3 - 4 装填量对c p t l 表达量的影响3 8 图3 5 诱导起始p h 值对重组菌株表达量的影响3 8 图3 - 6 甲醇浓度对重组菌株表达量的影响3 9 图3 7 发酵液上清离子交换层析阶段梯度洗脱曲线4 0 图3 - 8 豇豆粗蛋白离子交换层析阶段梯度洗脱曲线4 1 图3 - 9 豇豆离子交换洗脱后各管的t r i c i n e s d s p a g e 一4 1 图3 - 1 0 豇豆中c p t i 与酵母表达液上清c p t i 的比较4 2 v 英文缩写( a b b r e v i a t i o n ) 印t ie o w p e at r y p s i ni n h i b i t o r p c r p o l y m e r a s ec h a i nr e a c t i o n i p t g j s o p m p y l - 1 - t h i o 一1 3 - d - g a l a c t o s i d e t a q t h e r m u sa q u a t i e u sd n a ( p o l y m e r a s 曲 r e 州s e d t ab u f f e r ir i s t r i s 伪y d r o x y r o e t h y l ) a r o i n o r o e t h e u e t a et r i s a e c t a t e ( b u f f e r e d ) t b e 嘶s 舳o r d ke l e c t o p h o r e s i sn m 舒目) e d t a e t h y l e n e d i a m i n e t e t r a a c e t i ea c i d p a r s c 抽a u t o n o m o u sr e p l i c a t i o n , a ：u e n c e s h i s 4h i s t i d i n o ld e h y d r o g e n a s e g a p g l y e e r a d e h y d e 一3 - 助o s p h a t ed e h y d r o g e n a c s p g k p h o s p h o g l y c e m t el i n a 5 - u t r5 - u n t r m a s l a t i o nr c g i o n d a sd o w n s t r e a ma c t i v a t i o ns e q u e n c e p e p 4p r o t e a s e - d e f i c i e m m c s r o u l t i p l ec l o n i n gs i t e b s ab o v i n es e n l r oa l b u m i n s d s s o d i u md o d c c y ls u l f a t e p a g e p o l y a c r y l a r n i d eg e le l e c t r o p h o r e s i s b a p n a n b e n n z o y l l - a r g i n i n e - p - n i t r o a n i l i d e d 1 rd i t h i n t h r e i t o l t e m e d n ，n ，n ，n - t e t r a m e t h y l e t h y l e n e d i a m i n e y n b a a a sy e a s tn i t r o g e nb a s ew i t h o u ta m i n oa c i d s o ra m m o n i u ms u l f a t e y p d y e a s t p e p t o n e m e x t t i | o s e ( m e d i u m ) v l 豇豆胰蛋白酶抑制剂 聚合酶链反应 异丙基硫代b d 半乳糖苷 牺热水生菌d n a 聚合酶 t n s e d t a 缓冲液 三( 羟甲基) 氯基甲烷 确s 乙酸电泳缓冲液 t r i 潲酸电泳缓冲液 乙二胺四乙酸 毕赤酵母自主复制序列 组氨醇脱氢酶 磷酸甘油酸脱氢酶 磷酸甘油酸激酶 5 非翻译区 下游激活序列 蛋白水解酶基因缺失突变彤 多克隆位点 牛血清白蛋白 十二烷基磺酸钠 聚丙烯酰胺凝胶电泳 n 苯甲酰一d l - 糖氮酸对硝基苯酰胺盐酸盐 二硫苏糖醇 n ，n ，n ，n 一四甲基乙二胺 无氨基酸及硫酸胺的酵母氯源 酵母提取物，虽白晾，葡萄糖( 培养基) 独创性声明 本人声明所呈交的论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究 成果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人 已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得中国农业大学或其它教育机构的 学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已 在论文中作了明确的说明并表示了谢意。 研究生签名：同可 时间：加年月汐日 关于论文使用授权的说明 本人完全了解中国农业大学有关保留、使用学位论文的规定，即：学校有权保 留送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅，可以采用影印、缩印或扫描 等复制手段保存、汇编学位论文。同意中国农业大学可以用不同方式在不同媒体上 发表、传播学位论文的全部或部分内容。 ( 保密的学位论文在解密后应遵守此协议) 研究生签名酾时间：加年石月r 日 铷戤罗云i 艮帆冰川1 f 1 中国农业大学硕士学位论文 第一章弓i 言 1 1 概述 第一章引言 随着基因重组技术的日益成熟和发展，人们对自然的改造能力越来越强。利用基因重组技术。 有针对性地对生物体进行改造使生物体表现出预期的生物学性状，以满足生产、生活的需要， 就是转基因技术。通过基因重组技术获得的含， 源基因的生物体就是转基因生物( g m o ) ，包括 转基因动物、转基因植物和转基因微生物。目前，在所有的转基因生物中，转基因植物占到了9 5 以上，医此，现阶段所说的转基因生物主要指转基因植物。 1 9 8 3 年，世界上第一例转抗虫基因的烟草在美国培植成功，标志转基因技术的正式诞生【lj 。 在随后的2 0 多年的时间里，转基因技术得到了迅猛发展，转基因植物在全球的种植面积飞速增 长。1 9 9 6 年，全球转基因作物的种植面积仅为1 7 0 万公顷，截至2 0 0 5 年底，世界转基因作物的 种植面积已经达到9 0 0 0 万公顷，种植转基因作物的国家已经增加到2 1 个。其中，转基因作物种 植面积居前5 位的国家分别是美国、阿根廷、巴函、加拿大和中国，占全世界种植面积的9 9 【2 j 。 面对转基因作物如此迅速的发展势头，转基因生物安全性问题受到普遍关注，尤其随着近年 来一些经典事件如p u s z t a i 事件、帝王蝶事件、巴西坚果事件等的陆续发生( 3 - 4 1 。转基因生物的安 全问题逐渐成为各国政府、科学界和社会公众关注的焦点训。 水稻作为世界上最重要的粮食作物之一，为世界近一半的人口提供粮食。人们对水稻遗传转 化和育种利用等方面进行了深入细致的研究，取得了极大的成果。转基因水稻于1 9 8 6 年获得成 功，1 9 8 8 年又有三个实验室分别获得了转基因水稻植株 6 1 。近几年，水稻基因工程更是取得了突 飞猛进的发展，一批抗病、抗虫、抗除草剂、抗盐和品质改良的转基因水稻植株相继获得【7 i 。 其中，转抗虫基因的水稻已经完成了实验室、中间试验阶段，环境释放也已经进入了后期结果总 结和数据整理阶段。作为亚洲人民的主食，转基因水稻在进行商品化生产之前必须进行科学严谨 的安全性评价工作。本文立足于转豇豆胰蛋白酶抑制剂( c b 7 7 ) 基因水稻的安全性展开研究，建 立了获得大量c p t i 的有效方法，为今后进一步进行转基因水稻安全性研究奠定基础。 1 2 转基因水稻的生物安全性问题 随着人口的增长和耕地面积的减少，世界尤其是我国将面临粮食问题的严峻挑战，培育优良 品种是提高稻谷产量的主要途径。传统的育种技术已为培育水稻新品种做出了巨大贡献，并将在 今后继续发挥主导作用，但由于品种资源的贫乏。单靠传统育种已很难有大的突破。基因工程技 术为水稻分子标记辅助育种、水稻转基因育种提供了一条新途径。研究表明，转基因抗虫水稻比 非转基因水稻产量高出6 一9 ，农药施用量减少8 0 ，同时还降低了其对农民健康的不良影响1 1 0 1 。 虽然转基因水稻可以缓解资源紧张的压力，带来巨大的经济效益，但是由于转基因稻米涉及到 中国和全世界晟重要的主粮。冈此，其安全性的争议格外的激烈。 中国农业大学硕士学位论文第一章引言 1 2 1 转基因水稻的食用安全问题 稻米在各年龄层段都是饮食中重要的组成部分，包括刚断奶婴儿吃的米粉和稀粥。因此，转 基因水稻的食用安全性问题是公众关注的主要焦点。转基因水稻除稻米被直接食用和加工食品 外其在食物链中也具有广泛的作用，几乎所有的养殖业都可以将水稻作为饲料，而且稻草不仅 用于喂养牲畜，还被用作生产食用菌，食物链中的任何环都可能涉及转基因水稻及其产品。因 此，转基因水稻的食用安全性更为复杂，更具有隐蔽性。 1 0 1 1 外源基因所编码的蛋白对人体是否有直接或间接毒性及致敏性 抗虫害转基因水稻，均编码对细菌或农作物害虫有害的毒蛋白，这些毒蛋白在发挥杀虫作用 的同时，也可能对人和动物造成伤害。此外，外源基因表达的蛋白质可能有潜在的致敏性。1 9 9 6 年。加拿大转基因大豆导致部分人产生过敏反应，撮后被迫放弃1 4 1 。英国对2 万人的调查结果显 示，对转基因食品过敏的人数占1 4 1 8 ，最敏感的是2 岁以前的婴儿f 1 1 】。因此，转基因水 稻若作为婴儿米粉的主要成分，其潜在的致敏性是值得担忧的。 1 2 1 2 外源基因随机插入宿主染色体是否会引发非期望效应 转基因水稻的插入基因理论上可能导致原已存在的受体基因的失活或表达改变，可能激活其 他在正常情况下处于“沉默”状态( s i l e n c i n g ) 的基因。因此，基因受体在长期进化或驯化过程中逐 渐。沉默”的毒素基因可能会被转基因或基因操作再次激活，进而可能表达具有毒性的非预期成分， 导致食品成分包括营养成分、抗营养因子和天然毒素的变化，会降低食品的营葬价值，使其营养 结构失衡【1 2 j 。 1 2 1 3 外源基因是否会发生水平转移 由于目前有动物实验表明消化的d n a 有转移到肠细胞的可能性【”l 。这就提出抗生素标记基 因转移到肠道细菌的可能性。或重组d n a 转移到人体细胞的可能性。因此考虑载体携带的耐抗 生素标记基因是否会水平转移到肠道微生物中使其具有耐药性，f a o w h o 专家组认为尽管基因 水平的转移可能性很小，但应该对其危险性进行分析，并应禁止抗性基因在基因修饰食品中 的应用。 1 2 2 转基因水稻的生态安全问题 生态安全性包括生存竞争性、与近缘野生种的可交配性、对非靶生物的影响及病毒的重组 和异源包装等内容l l “。人们对转基因水稻生态安全性的担忧主要有一下儿方面： 1 2 2 1 超级杂草的产生 在稻作历史上，栽培稻逃逸到田边地角成为杂草稻已是不争的事实，虽然我国的精耕细作制 度使得杂草稻几乎灭绝，但在尼泊尔、韩国等耕作粗放的国家目前仍然存在大量的杂草稻吼转 基因水稻特别是抗除草剂、抗病虫和抗逆境等综合抗性转基因水稻，由于其人工赋予的强大生命 力，外源基因一旦逃逸至稻田外，就可能变成恶性杂草而需要大量的人力、物力进行根除。 1 2 2 2 转基因水稻的抗药性问题 转基因水稻的应用确实能够降低农药的用量但随着生物适应性的增强，又需开发新型的农 2 中国农业大学硕士学位论文 第一章引言 药和除草剂等，其结果只能是现有投入的更替和总体用量的增加。比如，皿用米防虫已有3 0 多 年的历史，却很少出现害虫的抗药性问题。自从将成基因转入玉米并代替农药使用以来昆虫 对其抗性的发展比对自然界中b t 抗性的发展更快【”】，而且害虫一旦对植物体内i t 基因产物产生 了抗性，人工喷洒的皿就对它无能为力了。 1 2 2 3 非靶生物的危害问题 非靶标生物是指那些受到毒素影响却不是原本要对付的物种，它们可能直接摄入含有毒素的 花粉或植物残体，也可通过间接途径，如捕食吃了毒素的昆虫。这可能会减少重要物种的数量， 或是减少自然中那些帮助控制害虫的益虫的数量，从而危害到整个生态系统【l q 。 根据美国康奈尔大学l o s = y 等人的试验，在苦苣菜叶上撒上转基因犀玉米花粉后，一种称 之为黑脉金斑蝶的幼虫对叶片就吃得少，且长得慢、死得快。4 d 后死亡率达4 4 ，而对照组( 饲 喂不撒b 玉米花粉的叶片1 无一死亡，因而认为廓转基因玉米花粉中含有毒素i l ”。同样，转基 因水稻的花粉、稻谷、稻草或根系的分泌物也可能对其生态系统中的昆虫、鸟类、野生动物、根 系微生物等产生毒害，破坏生态平衡。 1 2 3 转c p t i 基因水稻安全评价研究现状 豇豆胰蛋白酶抑制剂( c o w l at r i p s i ni n h i b i t o r ， c p t i ) 是一种植源性的抗虫蛋白，来源于 豇豆栽培品种加利福尼亚黑眼豆，属丝氨酸蛋白酶抑制剂的一种，而农业害虫主要以丝氨酸蛋白 酶进行蛋白质的消化，若昆虫摄入c p t i 后，其蛋白消化酶的活性将受到抑制；同时，蛋白酶和 蛋白酶抑制剂的复合物还可作为一个反馈信号抑制昆虫的进食。最终昆虫由于缺乏必须的营养而 死亡。抗虫谱表明，c p t l 几乎对所有测试的主要农业害虫都有抑制作用，包括大部分的鳞翅目害 虫和部分鞘翅目害虫，抗虫谱极广l l 。由于它直接作用于昆虫的消化酶，还具有不易产生耐受性 的特点，因此它已成为目前除b t 毒蛋白外使用的最为广泛的抗虫蛋白，c p w i 及其修饰后基因被 转入多种植物获得了大批具有抗虫特性的转基因植物如苹果、棉花、水稻、烟草、番茄、介蓝 等，应用极为广泛。 我国科学家已成功研制转s c k 水稻，s c k 基因是由c p t 基因修饰得到的，修饰后的c p 玎 基因编码的蛋白除具有c p n 序列外，尚含有s k t i 的信号肽序列，但进入内质网后即被切除，形 成的外源蛋白与野生型基本相同，只是改变了在细胞内的定位方式，从而增加了外源蛋白在受体 植物中的积累水平，因此可与c p t i 等同看待【。目前，这种转s c k 水稻品种已经完成了实验室、 中间试验阶段，环境释放也已经进入了后期结果总结和数据整理阶段。作为亚洲人民的主食，转 基因水稻在进行商品化生产之前必须进行科学严谨的安全性评价工作。 目前，国际上进行转基因食品安全性评价时，有三个被普遍认可的原则，即实质等同性原则 “，危险性分析原则【2 l 】和个案分析原则口”。基于这三个原则，我国科学家展开了对转基因水稻安 全性评价的研究，包括营养学评价、毒理学评价“一“并对转基因大米的成分与传统大米的 成分进行了比较和分析1 2 6 1 ， 这些研究的结果都表明，转基因水稻与传统水稻具有实质等同性。 但是，天然食品和相应g m 食品之间，究竟差别到什么程度就不被认为是等同的，并没有任何 明确的界限，也没有合法的准确定义口”。因此，现在还不能从转基因水稻的化学成分以及短期的 3 中国农业大学硕上学位论文第一章引言 动物实验可靠地推测出转基因水稻的生物化学或毒物学作用。 c p t i 在未加工食物中是抗营养物质，它会抑制或降低胰蛋白酶降解蛋白质的能力，对c p t i 的摄食会阻碍年幼动物的生长，只有在烹饪过程中充分变性失活后才不会带来问题口”，如果会产 生c p t i 的转基因稻米或米粉在食用时未经充分加工的话，就会对蛋白质的吸收有影响，而很多 婴儿米粉只经过简单糊化便进行食用，因此，对于转s c k 水稻中外源蛋白c o t i 致敏性的研究显 得尤为重要。 去年1 1 月，澳大利亚转基因豌豆研究紧急刹车，原因是，有研究表明1 2 9 j 被喂饲了澳大利亚 转基因豌豆的小白鼠的肺部产生了炎症，而转c p t i 基因抗虫水稻所转入的c p t i 基因与澳大利亚 转基因豌豆所转入的基因相似，旨在使水稻产生蛋白酶抑制剂从而达到抗虫效果，因此有非政府 组织称其安全性尤其值得担忧。那么，转基因c p t i 基因水稻中外源蛋白c p t i 到底是否具有毒 性和致敏性还有待进一步科学的考证，而要想研究c 川的安全性必须先获得大量的c p t i 蛋白， 本研究即以此为出发点来寻找一种能大量获得c p t i 的有效方法。 4 中国农业大学硕士学位论文 第一章引言 1 3 利用毕赤酵母体系表达异源蛋白的研究进展 长期以来，大肠杆菌( e s c h e r i c h i ac o i l ) 一直被用作表达外源基因的宿主菌，而且已成功表 达了多种外源蛋白。但是这一系统本身存在这若干缺陷：缺少真核生物的蛋白翻译后修饰和加 工，如剪切、糖基化、形成二硫键等；表达的蛋白多以包涵体形式存在，需要经过复杂的复性 才能恢复构象和活性：背景杂蛋白很多，纯化较麻烦；表达量一般不是很高。为了克服大肠 杆菌表达系统的缺陷，1 9 7 9 年人们发展了酵母表达系统。酿酒酵母是首先开发出的酵母表达系统， 但此系统缺乏强有力的启动子、分泌效率差、表达菌株不够稳定、表达质粒易于丢失，鉴于此， 人们又发展了新一代的巴氏毕赤酵母( p i c h i a ；a s t o r i s ) 3 ，随着菌株和载体的改良以及操 作技术上的显著进步，该系统已成为实验室研究及商业生产重组蛋白的新宠。 1 3 1 巴氏毕赤酵母表达系统的优点 毕赤酵母表达异源蛋白的优势主要体现在以下几方面：高表达。利用其强启动子可使表达 的异源蛋白达到其细胞总蛋白的3 0 ，比其它体系高1 0 1 0 0 倍。如破伤风毒素蛋白( t t f ) 的产量可达1 2 9 l t ”1 ，而一般常用的表达系统只在毫克级。高稳定【3 3 】。在进行转化重组时，该 系统的载体能和核基因组发生整合，构建出遗传特性非常稳定的工程菌株，一般不会出现异源基 因随生长而丢失的现象。高分泌。该体系可利用多种信号肽引导异源蛋白进行分泌，如人血清 白蛋白的分泌量可达4 9 t , l ：“1 ，这在已知的分泌表达体系中是罕见的。表达蛋白的后加工。毕 赤酵母采用胞外分泌表达方式是，可对外源蛋白进行翻译后加工，使表达的蛋白更接近于天然蛋 白的构象和活性1 。高密度发酵培养。毕赤酵母在甲醇诱导下连续发酵培养表达水平稳定，易 于放大培养，已又利用毕赤酵母大规模工业化高密度发酵工艺，且发酵罐中细胞干重可达1 2 0 9 l 以上。培养成本低。毕赤酵母营养要求低，培养基重不含蛋白。较廉价，生长快，易于进行操 作和培养，便于工业化生产。产物易纯化。毕赤酵母自身分泌的蛋白非常少，十分有利于纯化。 如表达的重组水蛭素，仅经过两步层析纯化，纯度就高达9 7 以上【3 5 】。目前，国内外利用这种 表达体系已成功表达多种异源蛋白p ”，其中也有人成功表达出k u n i t z 蛋白酶抑制剂【4 2 1 。 1 3 1 巴氏毕赤酵母的生物学特性 过去，人们对巴氏毕赤酵母的生物学特性作了大量研究，可归纳为： 1 、巴氏毕赤酵母可利用甲醇为唯一碳源，并进行快速生长和繁殖。毕赤酵母属是重要的甲 醇酵母之一，不仅能以甲醇为唯一碳源和能源，且能在甲醇培养基中快速生长，进行高密度连续 培养一个发酵循环就可使细胞干重达到1 0 0 2 几【刈。 2 、巴氏毕赤酵母属于二态性酵母，在营养生长期以单细胞为主，但子细胞间可进行同宗交 配。当营养不良时，一方面具有相对交配型的子细胞可进行交配，但交配后只发生质配并不立即 进行核配，因此产生二倍体细胞，并在整个毕赤酵母生活史中持续较长时间。另一方面发生质配 中国农业大学硕士学位论文 第一章引言 的细胞很快进行核配，并最终发育成一个子囊，每个子囊中可以产生吉4 个子囊孢子。当营养条 件改善时，子囊孢子能够重新萌发，产生单倍体的营养细胞完成酵母的生活史。 3 、细胞学研究表明，毕赤酵母细胞内存在一种被称作微体的细胞器，其结构简单并由一层 外膜包围，微体内不含d n a ，其蛋白质由核基因组编码。微体可经诱导产生并能够随同细胞 的生长而分裂。在极端憧况下，微体可充满缨胞体积的8 0 。微体是毕赤酵母细胞内储存蛋白质 的场所，当以甲醇诱导毕赤酵母细胞时，会有大量乙醇氧化酶被合成，并以晶体形式( 非溶解状 态) 存在于微体内，这对异源蛋白的融合表达十分有力，可使其免受胞内蛋白酶的降解，同时也 保证了异源蛋白不会对宿主产生毒害作用。 1 3 2 巴氏毕赤酵母表达系统的构成 毕赤酵母表达系统可以利用其强启动子a o x 进行异源基因的表达。该启动子来自于乙醇氧 仡酶( a l c o h o lo x i d a s e ) d 嵇基鼠。乙酵氧化酶只利用甲酵而不能秘用乙醇它是甲醇代谢途 径中的第一个酶，能催化甲酵氧化成甲酸。a o x 的表达属于严格诱导控制型，当培养基中存在葡 萄糖或甘油等碳源时，a o x 的表达则完全被抑制：而当去除了这些碳源后。甲醇的诱导能够使 a o x 的合成被启动。由于a o x 与氧的亲和力较低，因此毕赤酵母细胞会代偿性地大量合成 a o x ，这种表达有时能达到细胞总蛋白的3 0 i “i 。深入的研究表明，巴氏毕赤酵母中拥有两个 a o x 编码基因，除了a o x l 基因外，还存在a o x 2 基因1 4 ”，这两个基因具有9 2 的序列同源 性和9 7 的蛋白质同源性。其中，a o x l 在甲醇氧化的过程中起主要作用，所以a o x l 的转录 水平远远大于a o x 2 。 乙醇氧化酶的高效表达及对其基因转录过程的严格调控均表明a o x l 启动子是适台于异源 蛋白表达的强效调控启动子，这一点已在a o x l 启动子与l a c z 基因进行融合表达的试验中得到 了验证。对单拷贝a o x l 1 a c z 杂交基因来说，葡萄糖和甘油能严格阻遏它的表达，而甲醇则能 有效地诱导开启a o x l 启动子的表达 4 6 1 ：而带有多拷贝p a r s 的质粒则不受诱导调控，即使有 甘油存在也能进行少量表达，因此，a o x i 启动子能被用来进行各种异源蛋白的生产。 除了a o x l 启动子，人们还在毕赤酵母中分离到其它的启动子，如组成型表达的g a p ( 磷 酸甘油酸脱氢酶) 、p g k ( 磷酸甘油酸激酶) 基因的启动子及来自a o x 2 基因的启动子，但这 些启动予的应用均不如a o x l 启动子普遍。 1 3 2 1 巴氏毕赤酵母表达载体 在巴氏毕赤酵母中不存在内源的能够整合到染色体基因组中的表达质粒。因而在设计质粒载 体时，偏好于整合型表达质粒。因为在毕赤酵母中只有当载体通过与基因组上a o x l 或h i s 4 发生单交叉交换并由表达盒置换了a o x i 基因时，表达质粒才能稳定地存在于酵母细胞中。所以 典型的毕赤酵母表达质粒一般都含有乙醇氧化酶的调控序列，包括5 m o x l 启动子、3 a o x l 终 止序列及3 a o x l 近末端序列。并在5 a o x l 启动子和3 a o x l 终止序列间含有多克隆位点 ( m c s ) ，以供异源基因的插入。选择标记通常为h i s 4 基因，此外，酿酒酵母的a r g 4 基因、 s u c 2 基因及巴氏酵母的t n 9 0 3 ( 3 4 1 8 抗性基因f 4 1 等也可作为选择标记。 作为一个既能在人肠杆菌又能在酵母中蘩殖扩增的穿梭质粒，毕赤酵母表达质粒通常还具有 中国农业丈学硕士学位论文第一章引言 部分p b r 3 2 2 质粒或c o le 1 序列，其中抗生素抗性标记基因a m p 8 或k a n 便于质粒在e c o l i 中的筛选。目前，美国的i n v i t r o g e n e 公司已开发了一系列商用毕赤酵母表达载体，如p h c 3 5 、 p p i c 9 、p h i l - d 2 、p h i l - s 1 、p e i c z a ，b ，c 系列及p p i c z a a ，b ，c ( 图1 - 1 ) 系列等。除了 整合质粒外。毕赤酵母也可以携带多拷贝的附加型质粒。在这种质粒上通常含有巴氏酵母的自主 复制序列a r s l 和p a r s 2 3 6 1 等序列。 为了便于异源蛋白的下游加工，还为毕赤酵母构建了分泌型表达质粒。这是在胞内融合表达 质粒的基础上增加了一段分泌信号序列，通常位于5 4 0 2 ( 1 启动予和m c s 之间。在信号肽的引 导下，异源蛋白在内质网和高尔基体中被修饰加工，并最终转移至胞外。对异源蛋白的分泌虽然 省却了细胞破碎工作，但同时也发现了一个遗憾的现象，即相对于胞内表达来讲，分泌蛋白的表 达量通常较低。 重组质粒构建完成之后，通常需要用一些限制性内切酶如助fi i 、s a ci 和s a li 等将重组质 粒进行线性化处理，这样有利于获得较高的酵母转化率1 。 田1 1 质粒p p i c z a 的结构1 4 “ f i g 1 - 1s t r u c t u r eo f p l a s m l dp p l c z a 1 3 2 2 巴氏毕赤酵母表达系统的宿主菌 巴氏毕赤酵母表达系统的宿主菌多数使通过野生型石油酵母y - 1 1 4 3 0 进行突变改造而来。目 前常用的表达宿主菌有g s l l 5 、k m 7 1 、p m a d l l 、p m a d l 6 等，它们均含有a o x l 基因，均为 甲醇诱导型。在以葡萄糖或甘油为碳源的培养基上生长使，宿主菌a o x l 基因表达受到抑制，生 长比较缓慢；而在以甲醇为唯一碳源时，宿主n a o x l 启动子被强烈诱导。宿主菌就会易野生型 速率生长。 7 中国农业大学颈士学位论文 第一章哼i 言 l 3 3 影响异源蛋白在巴氏毕赤酵母中表达水平的因素 当以a o x 启动子进行诱导时，巴氏毕赤酵母对多数异源蛋白的表达量均能超过g l 水平。 尽管最后表达蛋白的产量主要决定于其遗传特性但充分考虑那些相关因素的影响，如：表达盒 在基因组中整合的位点和方式、表达盒的拷贝数。信号肽的性质。m r b a 上5 和3 的非翻译区 ( u t r ) 、翻译起始密码子( a u g ) 的背景、e d n a 的a + t 元素组成等导致转录或翻译的阻 碍，宿主菌的生理特性，内源蛋白酶的活性、培养基和发酵参数等影响产物稳定性的因素。在 最佳状态下对这些因素进行调节，最终将有利于提高毕赤酵母的表达产率。 1 3 3 1 表达盒的整合位点 研究表明，异源蛋白表达水平与摧合的位点( h i s 4 或a o x l ) 及方式( 单交叉或双交叉) 无关。位点脚舛或a o x l 均已成功地用于整合表达。然而，当在h i s 4 位点发生箍合时，由 于染色体上突变的h i s 4 基因与表达盒上野生型h i s 4 基因的转换，而导致表达盒的丢失因此 选择在a o x l 位点的整合会更稳定。 1 3 3 2 表达盒拷贝数 在毕赤酵母细胞内存在大量a o x 的事实可使人产生一个假设，即以a o x l 启动子进行诱 导表达时单拷贝的表达盒即可产生足够量的异源蛋白。然而实验证明单拷贝表达盒不可能获 得与a o x 等量鸽异源蛋白【，2 。“i 。与酿滔酵母的p g k 基强划不鼠，由于质粒中不存在d a s 因 子，异源基因序列与a o x i 编码区的置换并不影响m r n a 的转录水平刚。 实验证明利用含多个表达盒的质粒【哪或高拷贝数质粒能筛选含多拷贝表达盒的整合子。在 多数情况下，多拷贝表达盒能显著提高异源蛋白的表达产量这已在t n f 、t r f 以及m e g f 的 表达申得到了验证m 一一 ， 与其它表达系统相比利用毕赤酵母的多拷贝表达菌株可以得到相当商的产量。有许多研究 表明这些多拷贝菌株在高密度生长和诱导过程中是稳定的。高拷贝表达盒的整合在m u t 5 转化子 中的发生频率一般在1 1 0 范围内【州。c l a r e p 2 】等通过详细的d n a 分析发现，有7 5 9 5 的 7 r f 转化子在位点a o x t 或h i s 4 进行了整合，并形成了h 1 s 4 基因的转换子。整合前表达盒 首先在酵母体内进行了首尾顺序连接，然后才进行整合。 获得高拷贝整合子的常规方法是通过t n l 0 9 上的g 4 1 8 抗性基因进行筛选。利用携带一个 a o x l 断裂基因的菌株( k m 7 1 ) 能够获得多拷贝的m u t 3 克隆蚓1 。因为含高拷贝表达盒的整合子 可对不断增加的g 4 1 8 浓度产生抗性，所初以在最得到的h i s + 转化子中筛选可到抗高浓度g 4 1 8 ( 2 m g m l ) 的克隆。 1 3 3 3 信号肽 利用巴氏毕赤酵母已高效分泌了牛溶菌酶( 0 5 5 m g l ) i 、h s a ( 3 z 几) 、h e g f ( 0 4 1 l ) ”。m e g f 【o 4 s g l ) 1 4 0 l 和转化酶( 2 5 9 ，l ) 等蛋白。在这些蛋白的分泌过程中，有的利用了 其自身的信号肽，有的则利用了酿酒酵母a 因子的p r e p r o 前导序列，该序列可被巴氏毕赤酵母 的k e x 2 产物进行有效剪切，当用a - 因子p r e p r o 前导序列引导酿酒酵母转化酶在毕赤酵母中进 行分泌时，p r e p r o 前导序列的分泌比转化酶自身的信号肽要快。这表明信号要太也是个决定暴潦 蛋向表达量的重要剂量因子，它不仅会影响异源蛋白的分泌，同时也会影响到终产物的糖荽化形 8 中国农业大学硕士学位论文 第一章引言 ! 曼曼曼曼皇e 曼曼曼曼量置皇! 曼曼皇_ 曼皇! 蔓曼寞曼皇! 曼曼鼍曼! 曼曼曼鼍皇曼曼曼曼皇毫寡曼! 曼曼置蔓曼蔓! 舞i i m 式。 在巴氏毕赤酵母表达的蛋白产物中约有3 5 的n 一连接糖基侧链，含有8 1 4 个甘露糖单 位l “，比酿酒酵母的糖基侧链( 5 0 个) 短，且在这些糖基侧链中不包含末端a 一1 ，3 甘露糖 连接，研究表明末端a 一1 ，3 甘露糖连接是导致酿酒酵母糖蛋白引起免疫反应的主要原因邮l 。 由于较长的外部侧链结构有可能改变蛋白产物的酶学或免疫学特性，因此与酿酒酵母相比毕赤酵 母是生产异源蛋白的最适宿主。 1 3 3 4 异源蛋白c d n a 的a + t 元素 由于有许多a t 富集区可被当作转录终止子而导致翻译的提前终止，因而毕赤酵母菌株对含 有较多a + t 序列的基因的转录效率不高。解决的办法就是利用毕赤酵母偏爱的密码子对异源基 因进行重新设计，使a + t 的含量保持在3 0 5 5 以内 ”l 。 1 3 3 5 宿主菌株表型差异 当利用 o 删的末端同源序列进行整合时，有时会因为异源基因表达盒的置换而导