（分析化学专业论文）共振瑞利散射测定核酸和蛋白质的新方法研究.pdf

共振瑞利散射测定核酸和蛋白质的新方法研究 共振瑞利散射测定棱酸和蛋白质的新方法研究 摘要 苤握趟型墼射 删瑚c e r a y l e i g hs c a t t e r i n g ，缩写为r r s ) 作为一种新兴的定 量分析技术起步于9 0 年代，由于r r s 具有操作简便、灵敏度高、选择性好等 特点，因此，它的出现受到人们的广泛关注。已将其用于生物太盆子( 如核酸、 蛋白质1 的测定，由于核酸和蛋白质在一定条件下以大阴离子或大阳离子形式存 在，能与某些带相反电荷的阳离子或阴离子缔合，从而导致共振瑞利散射强度 急剧增强，并产生新的r r s 光谱。方法显示了极高的灵敏度。本文明以下五种 体系为例，y 研究了某些益酸- 碱性染料反应体系、核酸- 金属离子反应体系以及 某些蛋白质杂多酸反应体系、蛋白质金属离子反应体系的r r s 光谱特征、影 响因素、分析化学特性及其分析应用。 f 1 核酸碱性三苯甲烷染料体系 、 研究了几种核酸如鲱鱼精d n a ( h e r r m gs p e r md n a ，h s d n a ) 、鲑鱼精 d n a ( s a l m o nd n a ，s d n a ) 、小牛胸腺d n a ( c a l ft h y m u sd n a ，e t d n a ) 和酵 母r n a ( y e a s tr n a ，r n a ) 与碱性三苯甲烷染料的结合反应。在中性或弱碱性的 t r i s 缓冲溶液中，核酸能与乙基紫( e t h y lv i o l e t ，e v ) 、结晶紫( c r y s t a lv i o l e t ， c 、甲基紫( m e t h y lv i o l e t , m y ) 反应生成新的反应产物，导致溶液的共振瑞利 散射强度急剧增强，并产生新的r r s 光谱，最大r r s 峰分别位于5 0 5 r i m 伍v 体系) 、4 9 5 n m ( c v 体系) 和5 2 0 n m ( m v 体系) 处。以h s d n a 为例研究了各体系 反应的适宜条件，最佳p h 范围分别是6 3 8 4 ( e v - h s d n a 体系) ，6 7 8 o ( c v h s d n a 体系和m v h s d n a 体系) ，各体系均在h s d n a 浓度为肛2 o g g m l 时与 散射强度呈直线关系，方法具有较高的灵敏度，其检出限分别为4 7 n g m l ( e v h s d n a 体系) ，1 3 0 n g m l ( c v - h s d n a 体系) 和1 2 2 n g m l - h s d n a 体系) 。考 中文摘要 察了某些共存物质的影响，并用于合成样品中核酸的测定，获得了满意的结果。 2 核酸碱性吖啶染料体系 在弱碱性的 i r i s 缓冲溶液中，当某些核酸与碱性吖啶染料如吖啶橙( a c r i d i n e o r a n g e ，a o ) 和吖啶黄( a c r i d i n ey e l l o w , a y ) 结合形成新的反应产物时，能导致溶 液的共振瑞利散射强度显著增强，并产生新的r r s 光谱。根据染料的不同， 其最大共振瑞利散射峰分别位于5 3 0 n m ( a o 体系) 和4 7 0 n m ( a y 体系) 。以h s d n a 为例，研究了两种体系的适宜反应条件，其最佳p h 值范围分别为7 2 8 i ( a o - h s d n a 体系) ，7 5 8 i ( a y h s d n a 体系) ，并在核酸的浓度分别为0 3 0 l l # m l ( a o - h s d n a 体系) ，o 之5 扯g m l ( a y - h s d n a 体系) 时与散射强度呈直线关系， 方法具有较高的灵敏度，对h s d n a 的检出限分别1 2 n g m l ( a o - h s d n a 体系) ， 3 l n g m l ( a y b s d n a 体系) 。考察了某些干扰物质的影响，并用于合成样品中核 酸含量的测定，获得了满意的结果。 3 f e ( i i ) - 核酸体系 在p h 值为7 5 7 7 的碱性t n s 缓冲溶液中，某些核酸如h s d n a 、c t d n a 、 s d n a 和y r n a 等与亚铁离子反应时，能导致共振瑞利散射强度急剧增强，最 大r r s 峰位于4 7 0 n m 处，并在4 1 5 n m 和4 5 0 r i m 处有较强的r r s 峰。核酸浓 度分别在肛3 0 i t g m l 0 m d n a ) 、o 2 - 2 0 腿j m l ( c t d n a ) 、0 - - 2 0 “g m lf s d n a ) 和 o 7 - 3 5 1 t g m l ( y r n a ) 时与r r s 强度成正比关系。方法具有高的灵敏度，对不 同核酸的检出限分别为1 2 n g m l ( h s d n a ) 、1 8 n g m l ( c t d n a ) 、1 4 n g m l ( s d n a ) 、 1 1 n g m l ( y r n a ) 。考察了共存物质的影响，并用于核酸合成样品的分析，获得 了满意的结果。 4 杂多酸蛋白质体系 研究了几种杂多酸如：磷锑钼酸、磷锑钼蓝、磷钼酸、磷钼蓝、磷铋钼蓝 和磷钼钒酸等与蛋白质的结合反应。在h 2 s o 介质中，当某些蛋白质如牛血清 白蛋白( b o v i n es e r u ma l b u m i n ，b s a ) 、人血清白蛋白( h u m a ns e r u ma l b u m i n h s a ) 和0 【- 糜蛋白酶等与杂多蓝或杂多酸相结合时，能导致共振瑞利散射强度 大大增强，其最大共振散射峰位于4 7 0 r i m 处，该方法有较高的灵敏度，其中以 2 麸振瑞利散射测定核酸和蛋白质的新方法研究 磷锑钼蓝b s a 体系的灵敏度最高，其检出限为8 n g m l 。以磷锑铝蓝- b s a 为例， 研究了其适宜的反应条件和影响因素，以及蛋白质浓度与散射强度的关系，结 果表明当蛋白质浓度在o 1 5 0 9 9 m l 时与散射强度呈直线关系。方法有着较高 的选择性，用于合成样中蛋白质含量的分析，获得了满意的结果。 5 f e ( ) 蛋白质体系 在p h 值为7 3 7 7 的t r i s 缓冲溶液内，当亚铁离子与某些蛋白质如b s a 、 h s a 、纤维素酶等反应时，能在4 0 0 n m 、4 7 0 r i m 处导致共振瑞利散射强度急 剧增强。以f e ( i i ) - b s a 体系为例，研究了其光谱特征、适宜的反应条件、蛋白 质浓度与散射强度的关系，以及方法的灵敏度，发现蛋白质浓度在0 - 6 0 i t g m l 时与r r s 强度呈直线关系，对b s a 的检出限为1 7 n g m l 。考察了某些干扰物 质的影响，并用于蛋白质合成样品的分析，结果满意。 、 菱苎塑至 a s t u d y o nt h en e wm e t h o d sf o rd e t e r m n a t i o no fn u c l e i c a c i d sa n dp r o t e i n sb yr e s o n a n c e r a y l e i g hs c a t t e r i n g a b s t r a e t r e s o n a n c er a y l e i g hs c a t t e r i n g ( r r s ) r i s e sf r o m 19 9 0 sa san e w a n a l y t i c a lt e c h n i q u e ，s i n c e t h em e t h o dh a s s i m p l eo p e r a t i o n ，h i g h s e n s i t i v i t y a n dh i g hs e l e c t i v i t y ，i tr e c e i v e sw i d e s p r e a da t t e n t i o na n d i n t e r e s t u s i n g r r st od e t e r m i n eb i o m a c r o m o l e c u l es u c ha sn u c l e i c a c i da n d p r o t e i nw h i c hb e i n gb i ga n i o no rc a t i o ni nc e r t a i nc o n d i t i o n ，i t r e a c t sw i t hs o n l ei o nw i t hc o u n t e rc h a r g et of o r mn e wp r o d u c t ，a n d r e s u l t si nt h es i g n i f i c a n te n h a n c e m e n to fr r sa n dt h ea p p e a r a n c eo fa n e ws p e c t r u mo fr r s ，s ot h em e t h o ds h o w sf a i r l y h i g hs e n s i t i v i t y t a k i n gt h ef o l l o w i n g f i v es y s t e m si n c l u d i n gt w on u c l e i ca c i d b a s i cd y e s s y s t e m s ，o n e n u c l e i ca c i d m e t a li o n s y s t e m ，o n ep r o t e i n h e t e r o p o l y a c i d ss y s t e ma n do n ep r o t e i n - m e t a li o ns y s t e mf o re x a m p l e s ，t h i sp a p e r h a sb e e ns t u d i e dt h er r s s p e c t r a lc h a r a c t e r i s t i c s ，t h ea f f e c t i n gf a c t o r s ， t h ep r o p e r t i e so f a n a l y t i c a lc h e m i s t r ya n dt h e i ra n a l y t i c a la p p l i c a t i o n 1 n u c l e i ca c i d - b a s i ct r i p h e n y l m e t h a n ed y es y s t e m s t h er e a c t i o n sb e t w e e ns o m en u c l e i ca c i d ss u c ha s h e r r i n gs p e r m d n a ( h s d n a ) ，s a l m o nd n a ( s d n a ) ，c a l ft h y m u sd n a ( c t d n a ) a n d y e a s t r n a ( r n a ) e t a 1 a n db a s i ct r i p h e n y l m e t h a n ed y e sh a v eb e e ns t u d i e db y r r sm e t h o d i nn e u t r a la n dw e a kb a s i ct r i sb u f f e r s o l u t i o n ，n u c l e i c a c i d sc a nb i n ds o m eb a s i c t r i p h e n y l m e t h a n ed y e s i n c l u d i n ge t h y l v i o l e t ( e v ) ，c r y s t a lv i o l e t ( c v ) a n dm e t h y lv i o l e t ( m v ) t of o r mn e w 4 共振瑞利散射测定核酸和蛋白质的新方法研究 p r o d u c t s ，i t c a nr e s u l ti nt h eg r e a te n h a n c e m e n to fr r si n t e n s i t ya n d t h ea p p e a r a n c eo fn e wr r ss p e c t r a t a k i n gh s d n af o ra ne x a m p l e ，t h i s d i s s e r t a t i o n i n v e s t i g a t e d t h e a f f e c t i n g f a c t e r sa n ds u i t a b l er e a c t i o n c o n d i t i o n s 、a n dt h eo p t i m u mp hr a n g ei s6 3 8 4f o re v h s d n as y s t e m ， 6 7 - 8 0f o rc v h s d n as y s t e ma n dm v - h s d n as y s t e m ，r e s p e c t i v e l y t h ei n t e n s i t yo fr r si s d i r e c t l yp r o p o r t i o n a lt o t h ec o n c e n t r a t i o no f h s d n ai nt h er a n g eo f0 - 2 o 1 9 m lf o ra l l s y s t e m t h em e t h o dh a s f a i r l yh i g hs e n s i t i v i t ya n dt h ed e t e c t i n gl i m i t so fh s d n a a r e4 7 n g m l f o re v - h s d n a s y s t e m ，1 3 n g m lf o rc v - h s d n as y s t e ma n d1 2 2 n g m l f o rm v h s d n as y s t e m ，s e p a r a t e l y t h ei n f l u e n c eo fs o m ec o e x i s i t i n g s u b s t a n c ew a s i n v e s t i g a t e d a n dt h em e t h o dw a s a p p l i e d t ot h e d e t e r m i n a t i o no ft r a c ea m o u n t so fn u c l e i ca c i di ns y n t h e t i cs a m p l ew i t h s a t i s f a c t o r yr e s u l t s 2 n u c l e i ca c i d - b a s i ca c r i d i n ed y e ss y s t e m s i nw e a kb a s i ct r i sb u f f e rm e d i u m ，s o m en u c l e i ca c i d sc a nr e a c tw i t h b a s i ca c r i d i n e d y e s s u c ha sa c r i d i n e o r a n g e ( a o ) a n d a c r i d i n e y e l l o w ( a y ) t of o r mn e wp r o d u c t s ，t h ef o r m a t i o no fn e wp r o d u c t sc a n l e a dt oa l a r g ee n h a n c e m e n to fr r sa n dt h ea p p e a r a n c eo fn e wr r s s p e c t r ai nw h i c ht h em a x i m u mr r sp e a ki ss e p a r a t e l yl o c a t e da t4 7 0 n ma n d5 3 0 n m d e p e n d i n g o nd i f f e r e n td y e s t a k i n gh s d n af o re x a m p l e ， t h e p a p e ri n v e s t i g a t e d t h es u i t a b l er e a c t i o n c o n d i t i o n s ，i nw h i c ht h e o p t i m u mp hr a n g ei s 7 2 - 8 1f o ra o h s d n as y s t e m 7 5 - 8 1f o ra y - h s d n a s y s t e m ，s e p a r a t e l y t h ei n t e n s i t y o fr r si s d i r e c t l y p r o p o r t i o n a lt ot h ec o n c e n t r a t i o no f h s d n ai nt h er a n g eo f 0 - 3 0 i _ t g m l f o ra o - h s d n as y s t e ma n d 0 - 2 5 1 t g m l f o ra y - h s d n as y s t e m t h e m e t h o dh a s h i g hs e n s i t i v i t ya n dt h ed e t e c t i n g l i m i t so fh s d n aa r e 12 n g m lf o ra o h s d n a s y s t e m ，3 1n g m lf o ra y h s d n a s y s t e m ， 菱奎塑茎 r e s p e c t i v e l y t h e i n f l u e n c eo fs o m e c o e x i s i t i n g s u b s t a n c ew a s i n v e s t i g a t e da n dt h em e t h o dw a sa p p l i e dt o t h ed e t e r m i n a t i o no ft r a c e a m o u n to fn u c l e i ca c i di ns y n t h e t i cs a m p l ew i t hp l e a s e do u t c o m e 3 f e ( 1 i ) 一n u c l e i ca c i ds y s t e m s w h e nf e ( 1 i ) c o e x i s t sw i t hs o m en u c l e i c a c i d ss u c ha s h s d n a ， c t d n a s d n aa n dy r n ae t a 1 i n b a s i ct r i sb u f f e rs o l u t i o no f p h = 7 5 7 7 ，i t c a nr e s u l ti na g r e a ti n c r e a s e o fr r si n t e n s i t y t h e m a x i m u mr r sp e a ki sl o c a t e da t4 7 0 n m t h ei n t e n s i t y o fr r si s d i r e c t l yp r o p o r t i o n a lt ot h ec o n c e n t r a t i o no f n u c l e i ca c i d si nt h er a n g e o f0 - 3 o l t g m lf o rh s d n a o 2 - 2 o l x g m lf o re t d n a ，0 - 2 o b g m lf o r s d n a ，a n do 7 - 3 5 1 t g m lf o ry r n a t h em e t h o dh a sh i g hs e n s i t i v i t y a n dt h e d e t e c t i n g l i m i t so fn u c l e i ca c i d a r e12 n g m lf o r h s d n a ， 1 8 n g m l f o r c t d n a ，1 4 n g m l f o r s d n a ，1 1 n g m l f o r y r n a ， r e s p e c t i v e l y t h e i n f l u e n c eo fs o m e c o e x i s i t i n g s u b s t a n c ew a s i n v e s t i g a t e da n dt h em e t h o dw a sa p p l i e dt ot h ed e t e r m i n a t i o no f t r a c e a m o u n to fn u c l e i ca c i di ns y n t h e t i cs a m p l ew i t hp l e a s e dr e s u l t s 4 h e t e r o p o l ya c i d s - p r o t e i ns y s t e m s t h er e a c t i o nb e t w e e np r o t e i n sa n ds o m eh e t e r o p o l ya c i d sh a sb e e n s t u d i e db yr r sm e t h o d i nh 2 s 0 4m e d i a ，s o m ep r o t e i n ss u c ha sb o v i n e s e r u ma l b u m i n ( b s a ) ，h u m a ns e r u ma l b u m i n ( h s a ) a n da c h y m o t r y p s i n c a nb i n dt h e h e t e r o p o l yb l u eo rh e t e r o p o l yy e l l o wt og i v er i s et o t h e e n o r m o u se n h a c e m e n tr r s t h em a x i m u mr r sp e a ki sl o c a t e da t 4 7 0 n m t h em e t h o dh a s h i g hs e n s i t i v i t y a n dt h ep s b m ob l u e - b s a s y s t e mi s t h em o s ts e n s i t i v e ，t h ed e t e c t i n gl i m i to fw h i c hi s 8 n g m l t a k i n gt h ep s b m ob l u e b s as y s t e mf o ra ne x a m p l e ，t h i sd i s s e r t a t i o n i n v e s t g a t e dt h es u i t a b l er e a c t i o nc o n d i t i o n sa n dt h ea f f e c t i n gf a c t o r sa s w e l la st h er e l a t i o nb e t w e e n p r o t e i n c o n c e n t r a t i o na n ds c a t t e r e d 6 茎堡型型墼塾型壅堡堕塑堡垒垦盟堑垄鲨竺茎 i n t e n s i t y t h er e s u l ts h o w st h a tt h es y s t e mg a v eg o o dl i n e a r i t y i nt h e r e g i o no f0 1 5 0t x g m l t h em e t h o dh a sf a i r l yg o o ds e l e c t i v i t ya n d i s a p p l i e d t ot h ed e t e r m i n a t i o no fp r o t e i ni n s y n t h e t i cs a m p l e s w i t h s a t i s f a c t o r yr e s u l t s 5 f e ( i i ) 一p r o t e i ns y s t e m s i np h = 7 5 - 7 7b a s i ct r i sb u f f e rs o l u t i o n ，w h e nf e ( i i ) c o e x i s t sw i t h s o m ep r o t e i n ss u c ha sb s a ，h s aa n dl y s o z y m e ，i tc a nl e a dt oal a r g e e n h a n c e m e n to fr r sa t4 0 0 n ma n d4 7 0 n m t a k i n gf e ( i i ) - b s as y s t e m f o r e x a m p l e ，t h i sp a p e r d e a l e dw i t ht h ec h a r a c t e r i s t i co fs p e c t r u m ， o p t i m u mc o n d i t i o n s ，t h er e l a t i o nb e t w e e n t h ec o n c e n t r a t i o no fp r o t e i n s a n dt h es c a t t e r i n gi n t e n s i t i e s ，a n dt h es e n s i t i v i t yo ft h em e t h o d t h e i n t e n s i t yo f r r si sd i r e c t l yp r o p o r t i o n a lt ot h ec o n c e n t r a t i o no fb s ai n r a n g e o f0 - 6 o g g m l ，a n dt h ed e t e c tl i m i to fb s ai s 17 n g m l t h e i n f l u e n c eo fs o m e e o e x i s i t i n g s u b s t a n c ew a si n v e s t i g a t e da n dt h e m e t h o dw a sa p p l i e dt ot h ed e t e r m i n a t i o no ft r a c ea m o u n to fp r o t e i ni n s y n t h e t i cs a m p l ew i t hs a t i s f a c t o r yo u t c o m e 7 一 一。 共振瑞利散射测定棱酸和蛋白质的新方法研究 前言 一核酸 核酸分为脱氧核糖核酸( d e o x y r i b o n u c l e i ca c i d ，d n a ) 和核糖核酸( r i b o n u c l e i c a c i d ，g n a ) 两大类，它的基本结构单位是核苷酸( n u e l e o t i d e ) 。作为一类重要的生 物大分子，核酸的定量测定对于疾病的治疗，对于诠释其结构与生物的关系和 疾病的诊断和治疗均有着重要的意义。 核酸含量的测定方法很多，如色谱法、探针技术、显微光度法、免疫分析 法、分光光度法、以及荧光法光度法等。目前以分光光度法和荧光光度法研究 较多，应用较广且操作较为简便。进年来，共振瑞利散射法作为一种新兴的分 析方法，用于测定核酸，由于其灵敏度高，选择性好，且方法简便，从而引起 人们的广泛关注。 1 分光光度法 核酸的分光光度法具有简单、准确与快速等特点。通常的方法有紫外光度 法、定磷法、测糖法以及染料法。 1 1 紫外光度法 由于核酸中的嘌呤碱与嘧啶碱具有共轭双键，使碱基、核苷、核苷酸和核 酸在2 4 0 2 9 0 h m 的紫外波段有一强烈的吸收峰，最大吸收值在2 6 0 h m 附近， 不同的核苷酸有不同的吸收特性。根据此性质可用紫外分光光度计对核酸进行 定性和定量测定。1 方法简便、快速，然而由于核酸和蛋白质( 九。= 2 8 0 r i m ) 的吸 收峰相距甚近，互相干扰，常造成相当大的误差。2 1 2 测糖法 在酸溶液中，r n a 与d n a 的嘌呤核苷键易于水解断裂而产生有戊糖醛基 共振瑞利散射测定核酸和蛋白质的新方法研究 的水解产物，称为去嘌岭酸，嘌呤酸在酸中进一步变成糖醛衍生物，后者可与 特异试剂呈现颜色反应，由此可对核酸进行定量测定。测糖法能对d n a 和r n a 分别加以测定，根据所用的试剂可分为以下几种方法： 1 2 1 二苯胺法：二苯胺法是测核酸方法中较为古老且应用较广的一种方法，1 9 3 0 年被d i s c h e 首次提出用以测定d n a 。在强酸性条件下，水解后的d n a 能与二 苯胺反应，并有蓝色产物生成，其最大吸收波长位于6 0 0 n m 处，根据此性质可 以测得样品中核酸的含量，测定d n a 的范围为2 5 - 2 5 0 恤g m l3 ，与u v 法相 比，该方法更准确，灵敏度更高，对d n a 测定具有特异性，并且可以测定混 和物中的d n a 。然而方法冗长( 需1 6 - 2 0 h ) ，反应条件苛刻，且在测定过程中 容易造成样品的损失。b u r t o n 等对方法加以改进，从而提高了其灵敏度，并将 其用于组织d n a 的测定”，文献7 4 缩短了实验时间。 1 2 2 硫代巴比士酸：在硫酸溶液中水解后的d n a ，再加入高碘酸，硫代巴比 士酸( 又称丙二酰硫脲) 。有粉红色反应物生成，其最大吸收波长位于5 3 2 n m 处，用于d n a 的测定，线性范围为o 5 5 0 0 9 9 ，r n a 和蛋白质不干扰测定。9 与二苯胺法相比，该方法灵敏度更高，而且时间较短。 1 2 3 二氨基苯甲酸法：将d n a 和二氨基苯甲酸二盐酸( d a n a ) 混和液加热至 6 0 。c ，3 0 m i n 之后，在4 2 0 n m 处有最大吸收峰，用于测定d n a ，其线性范围 为2 5 - 1 0 0 0 9 9 。” 1 2 4 地衣酚法：r n a 经过热酸水解和转化之后，可与3 ，5 二羟甲苯( 又名地 衣酚) 在浓h c i 和c u ( i i ) “或f e c l 3 存在下反应，使溶液呈绿色，并在6 7 0 n m 处有吸收峰。在一定范围内，吸收强度与r n a 的浓度成正比，用以测定r n a 及其衍生物，灵敏度为o 0 1 5 舯n o l l 。”将此方法用于测定湖水和海水中r n a 的含量，氨基酸、糖类等低于1 0 m g m l 时，将不产生干扰n 。 1 - 3 定磷法： 定磷法也是核酸测定的一种常用方法，用于测定核酸和核苷酸所含磷成 分。其过程是先将核酸和核苷酸用强酸消化，使有机磷变成无机磷，再用一般 测定无机磷的试剂显色，根据无机磷的含量即可推算出核酸和核苷酸的含量。 9 前言 如在还原剂抗坏血酸存在下，用钼酸盐与无机磷反应生成磷钼蓝”，其最大吸 收波长为6 6 0n m ，由于吸收度( a ) 与浓度有线性关系，含磷量可通过用魁妒0 4 做标准曲线来确定。该方法反应灵敏，用于胎盘组织液核酸含量的测定，变异 系数( c v ) = o 4 3 9 ，回收率为9 9 9 。”但由于d n a 和r n a 都含有磷，所 以在测定时必须把两者分开，再分别测定。 1 4 染料结合法 在光度分析中，除了以上几种测定核酸的方法之外，染料与核酸的结合测 定核酸也是分光光度分析中较为重要的一类方法。该方法主要是基于多核苷酸 中两个单核苷酸残基之间的电离具有较低的p k 值( p k = 1 5 ) ，当溶液的p h 值 高于4 时，全部解离，呈多阴离子状态“，具有与部分阳离子染料结合的能力。 染料结合法测定核酸具有简便、快速、经济、准确的特点，但蛋白质对体系的 测定干扰严重，如有蛋白质存在，需采取适当的方法，预先除去1 - 1 8 。目前， 作为标记物测定核酸的染料有以下几种： i 4 1 甲基绿 单独的甲基绿溶液极易褪色，一定条件下，核酸的加入能使甲基绿保持不 褪色。根据此性质可用于核酸的定量测定。文献”在p h _ 7 9 的t d s - h c | 缓冲 溶液中，将甲基绿与核酸的混和液加热至4 5 。c ，3 h 之后，在最大吸收峰6 3 0 r i m 处测溶液的吸光度，吸光度的强度与一定的范围内的核酸成正比，将该方法用 以测定d n a ，其测定范围为0 - 3 0 0 9 9 ，检测限为2 9 9 。 1 4 2 甲苯胺蓝2 0 甲苯胺蓝的水溶液在6 2 8 n m 处有一最大吸收峰，当有痕量d n a 存在时， 会导致最大吸收峰降低，吸收峰的降低强度与一定范围内d n a 浓度成正比。 据此，可用苯胺蓝测定亚微克级的d n a ，测得的线性范围为0 - 4 0 9 9 m l ，检 测限为o 0 4 8 9 9 m l 。与甲基绿法相比，该方法的灵敏度更高、反应更迅速( 混 和后即可测定) ，且操作简便，反应只须在室温下便可进行。因此，甲苯胺蓝 法是目前测定痕量d n a 的较好的方法。 1 4 3 乙基紫2 1 茎塑堕型墼壁型壅垫璧塑曼自堕塑堑查堕堑窒一 在d h = 6 4 7 4 的条件下，乙基紫在5 9 5n l n 处有一特征吸收峰，当加入d n a 后，乙基紫的吸收峰显著下降，而在5 0 7n m 处出现新的吸收峰。以乙基紫为 标记物，根据其5 9 5 n m 吸收峰下降的程度，可用于对d n a 的定量测定。d n a 的线性响应范围为0 一1 0 8 x l o - s m o l l ，表观摩尔吸光系数”。7 2 4 1 0 4 l t o o l c m 一。方法操作简便，灵敏度高，选择性较好，且反应迅速( 2 m i n 后即可测 定) ，然蛋白质干扰严重。 1 4 4 甲基紫” 在中性条件下，甲基紫在5 7 9 n m 处有最大吸收峰，随着核酸的加入，发生 明显的减色效应，减色强度随着核酸浓度的加大而增强，据此建立测定核酸的 方法。方法线性范围分别为o 5 0 m g l ( c t d n a ) 和0 - 1 0 o m g l ( y r n a ) 。 1 5 其它 在文献。中，首次报道了在碱性条件下。用黄色的二元金属络合物c o ( t o - 测定最大吸收波长线性范围 文献 试剂p h 值 对象 ( r i m ) ( b g m l ) 二苯胺d n a酸性6 0 0 2 5 - 2 5 03 硫代巴比士酸d n a酸性5 3 2 9 f e ( 1 1 1 ) 一苔黑酚 r n a酸性6 7 0 1 1 铝酸铵核酸酸性6 6 01 5 甲基绿核酸7 96 3 0 o - 3 0 0 雎g 1 9 甲苯胺蓝d n a6 2 8o ，_ 4 02 0 乙基紫c t d n a 6 4 7 4 5 9 5o 一3 62 l 甲基紫c t d n a7 45 7 90 - 5 02 2 c o ( 1 0 ( 5 - c 1 c t d n a碱性5 4 5o 4 02 3 p h d h b ) 前言 5 c i p a d a b 与核酸反应后，有紫红色三元络合物生成，其最大吸收峰位于5 4 5 m 处，由此建立了痕量核酸的测定方法。测得核酸的线性范围为0 4 0 9 9 m l ， 检测限位于4 0 4 9 n g m l 之间。方法具有较好的重复性和高的灵敏度，且提高 了测定核酸的选择性。 某些常见的测定核酸的分光光度法见表l 。 2 荧光法 荧光法是定量测定核酸的另一种常用方法，它是基于荧光试剂的加入，导 致溶液中荧光强度增强或猝灭的原理来测定核酸，通常较光度法有更高的灵敏 度。目前，用于核酸研究和测定的荧光试剂有金属离子、金属络合物、有机荧 光小分子试剂及染料。 2 1 金属离子及金属络合物 近年来，以金属离子或金属配合物作为荧光探针标记和测定核酸得到了很 大的发展，尤其是以三价镧系元素，由于它们的共振能带正好与核酸受紫外光 激发时的三线态相重叠，因而能有效的发生从有机配体到中心离子之间的能量 转移，使得具有弱内源荧光的中心离子荧光得到加强，从而成为荧光量子产率 高的荧光探针。 常用作核酸探针的金属离子有t b ( i i i ) 、e u ( i i i ) 2 4 “，这些金属离子与核酸作 用后能使荧光强度得到增强，并在一定的范围内与核酸浓度成正比，据此可用 于核酸含量的测定。此外，c e 0 i ) 2 。2 9 也是一种较好的金属离子探针，由于c “i i d 具有其独特的荧光性质，在弱酸性( p h = 4 3 6 8 ) 的n a c l 介质中，c e ( i i i ) 的荧光 ( k = 2 5 4 0 r a n 和k 。= 3 5 0 0 r i m ) 为多种核酸所猝灭。应用核酸对c e ( i ) 的这种 荧光猝灭特性可以灵敏的测定各种核酸。 用于测定核酸的金属络合物根据配体种类的不同可分为： 2 1 1 8 一羟基喹啉的金属络合物 8 一羟基喹啉( 8 一h q l ) 能与金属离子如：l a ( i i i ) 、y ( i i i ) 、s e ( i i i ) 、a l ( i i i ) ”3 3 形成一种金属发光络合物，此二元络合物在2 7 0 r i m 和3 6 5 n m 附近激发都能产 生5 0 0 r i m 左右的荧光。加入核酸后形成的三元体系的荧光大幅度增强，荧光强 2 共振瑞利散射测定核酸和蛋白质的新方法研究 度以2 7 0 n m 附近较3 6 5 n m 附近激发更显著，与二元体系相比，三元体系荧光 寿命增长且最大发射波长有部分蓝移现象。根据不同的金属络合物以及不同种 类的核酸，其蓝移范围也略有不同。根据荧光强度与一定浓度范围的核酸成线 性关系，可建立高灵敏测定核酸的荧光分析法。 2 1 2 t b ( m ) 邻菲咯啉螯合物 在p h _ 6 8 7 2 t r i s - h c l 缓冲溶液中，稀土金属离子t b ( i i i ) 能与邻菲咯啉 和核酸、变性核酸、核苷酸、聚核苷酸等”“形成三元络合物，其荧光强度 ( k = 2 9 8 啪和n , = 5 4 3 5 n m ) 远远强于二元络合物t b o i ) - 邻菲咯啉，t b 0 i i ) 一核 酸。用于测定核酸，其线性范围为0 4 1 5 0 或2 0 0 i - t e d m l 之间，检测限位于 0 1 - 0 2 a g m l 之间。 2 1 3 e u ( i i i ) 四环素络合物 在p h = 6 8 7 2 t r i s - h c l 缓冲溶液中，e u ( i i i ) - 四环素络合物能与单链或双链 d n a 结合，导致荧光强度大大增强，激发峰位于3 9 8 n m ，发射峰位于6 1 5 r i m 。 加入r n a 于络合物中，却几乎不发生荧光强度的改变，至此，可建立测定核 酸中d n a 含量的灵敏方法，方法测d n a 具有特异性，其线性范围为 o 0 2 1 0 r t # m l ，检测限为o ，o l i t g m l ，使用时间分辨技术可以提高测定下限 ( 0 0 0 5 1 t g m l ) 和检测限( o 0 0 3 1 t g m l ) ，当有r n a 存在时，不干扰d n a 的 测定。” 2 1 4 t b ( i i i ) 钛铁试剂( h u 络合物 金属络合物对于核酸的测定多是基于荧光增强效应，而在p h = 6 9 的六次 甲基四胺h c i 缓冲溶液中，核