（遗传学专业论文）斑马鱼心脏发育相关基因δsg和foxp1的克隆、表达和功能研究.pdf

复日大学博士学位论文 斑马鱼心脏发育相关基因巧s g 和凡印，的克隆、表达和功能研究 英文缩略词 3 u t r ：3 u n t r a n s l a t e dr e g i o n ，3 非翻译区 5 - u t r ：5 - u n t r a i l s l a t e dr e g i o n ，5 非翻译区 b l a s t ：b a s i cl o c a la l i g m e n ts e a r c ht o o l ，同源性检索工具 d c m ：d i l a t e dc a r d i o m y o p a t h y ，扩张型心肌病 d g c ：d y s t r o p h i n - a u s s o c i a t e dg l y c o p r o t e i nc o m p l e x ，d y s t r o p h i n 糖蛋白复合物 d p f ：d a y sp o s tf e n i l i z a t i o n ， 受精后天数 d t t ：d i t h i o 缸e i t o l ，二硫苏糖醇 e g f p ：e n h a n c e dg r e e nf l o u r e c e n tp r o t e i n ，增强型绿色荧光蛋白 e s t ：e x p r e s s e ds e q u e n c et a g ，表达序列标签 h p f h o u r sp o s tf e l l i l i z a t i o n ，受精后小时数 l g m d ：l i m b - g i r d l em u s c u l a rd y s t r o p h y ，肢带型肌营养不良 m c s ：m u l t i p l ec l o n i n gs i t e ，多克隆位点 m h b ：m i d b r a i n h i n d b r a i nb o u i l d a r y ，中脑一后脑分界线 m o ：m o 印h o l i n om o d i f i e da n t i s e n s eo l i g o n u c l e o t i d e ，吗啉修饰的反义寡核苷酸 n c b i ：n a t i o n a lc e n t e rf o rb i o m e d i c a li n f o 册a t i o n 美国国立生物医学信息中心 o i 江：o p e nr e a d i n gf r 锄e ，开放阅读框 p c r ：p o l y m e r a s ec h a i nr e a c t i o n ，多聚酶链式反应 r a c e ：r 印i da m p l i 6 c a t i o no fc d n ae n d s ，快速扩增c d n a 末端 i m p c r ：r e v e r s et r a n s c r i p tp o l y m e r a s ec h a i nr e a c t i o n ，反转录p c r s g c ：s a r c o g l y c a j lc o m p l e x ，肌聚糖复合物 s g p ： s a r c o g l y c a n o p a t h y ，肌聚糖病 6 论文独创性声明 本论文足我个人在导师指导r 进行的研究工作及取彳! ：1 的研究成果。论文t 仁除 r 特j 5 | j 加以标注和致谢的地方外，0 i 包含其他人或其它机构已经发表或撰写过的 研究成果其他同志对木研究的肩发和所做的贡献均已在论文中作了明确的声明 并表示了谢意。 作者签名盛垫 论文使用授权声明 日期：c 坯二f 宴 本人完全r 解复旦大学有关保留、使用学位论文的规定，f j ：学校有权保留 送交论文的复印件，允许论文被查阅和借阅：学校可以公布论文的全部或部分内 容，可以采用影印、缩印或其它复制于段保存论文。保密的论文在解密后遵守此 规定3 一。， 踢 竹：者签名：互宝星坠导帅攀名；日期二苎舌i 二立皇9 复旦大学博上学位皓文斑马鱼心脏发育相关基园声s g 和脚，的克降、表达和功能酬宄 摘要 ( 一) d s g 是肌聚糖复合物的成员，它在各种脊椎动物的骨骼肌和心肌中特异表 达。肌聚糖复合物摹因的突变在人类中与肢带型肌营养不良症( l g m d ) 和扩张 型心肌病( d c m ) 相关。在本文中，我们克隆了斑马鱼函s g 基因，井研究了其 在胚胎发育时期的表达谱，并通过吗啉修饰的反义寡核苷酸介导的基因抑制深入 研究了该基因在斑马鱼胚胎发育过程中的功能。 斑马鱼乒s g 基因全长c d 咐a 的长度为1 9 3 8 b p ，其中的开放弼读框编码了一 条含有2 9 0 个氨基酸残基的多肽。该基因表达产物在氨基酸水平上与人、小鼠、 仓鼠、鸡的j s g 基因产物分别有7 2 、7 3 、7 3 和6 9 的相似性。小s g 的基 因组序列分析显示该基因由8 个外显子和7 个内含子组成，覆盖了长将近2 0 0 k b 的基因组区域。原位杂交结果显示j 的表达最初开始丁分节期早期。高水平 的正s g 表达出现在骨骼肌和心肌。其它如眼部和下颚肌肉、胸鳍、鳃弓、和鳔 也有显著的表达。此外受精三天后，存中脑和视网膜也能观测到出舳表达。 我们采用吗啉修饰的反义r n a 进行基因抑制，结果显示绝大多数注射 d 册一m 0 的斑马鱼胚胎都显示出严重的异常表型：发育不全的头部，线性心脏， 微弱的心跳和短小的躯干，并且大多在5 天内死亡。而注射同样剂量的对照m 0 的胚胎发育与正常胚胎没有明显区别。m o g f p 和拯救实验证据也有效的证实使 用的m o 能抑制内源5 粥蛋白的翻泽。原位杂交分析显示在受累胚胎中，近轴 细胞和肌肉前体细胞减少。甜孵基因表达的缺失严重阻碍了心脏早期发育过程， 并影响了心肌细胞的分化。更有趣的足心脏的左右非对称模式发生了改变。同时 免疫印记分析显示s g 复合物相关蛋白的表达量在m o 注射胚胎中明显下捌，甚 至摹本消失。这些结果显示d 郴在早期心脏和肌肉的发育中具有很重要的作用， 我们推测s g 复合物可能作为膜受体参与早期发育的信号传递。 ( 二) f o t k h e a d 转录因子家族一类由许多调控分子组成的大家族，它们共同拥有一 个保守的1 1 0 个氢基酸残基的d n a 结合域一一f o f i ( 1 l e a d 结构域。该家族在包括 脑、心血管系统、肺、肠和肾等组织的发育过程中都发挥重要作用。其功能包括 参与细胞增殖，分化，染色体重塑，有丝分裂过程和转化过程等。本文中我们克 隆了斑马鱼，如p 基因( g e n e b a n k 序列号为d q 3 3 3 3 0 3 ) ，进行了生物信息学分析， 复旦大学博士学位论文斑马鱼心脏发育相关基因凸譬g 和尺u 咿，的克隆、表达和功能研究 并研究了其表达谱。 斑马鱼脚j 全长c d n a 的长度为2 4 4 0 b p ，其中的开放阅读框编码了一条 含有6 5 9 个氨基酸残基的多肽。该基因表达产物在氨基酸水平上与人、小鼠、仓 鼠、鸡、云雀和爪蟾的凡叩j 基因产物分别有7 2 、6 8 、6 8 、7 0 、6 5 和 6 2 的相似性。其中包含一个锌指结构域，一个亮氨酸拉链和一个f o r l ( 1 1 e a dd n a 结合域。通过5 r a c e 和i m p c r 分析发现了4 个脚j 可变剪接体a 型一d 型。整胚原位杂交和i 盯一p c r 结果显示在胚胎发育阶段凡即，的时空表达谱是 非常复杂而动态的，尤其是在神经系统的发育过程中。各可变剪接体的时空表达 谱有很大区别，其中高量的母源表达主要为d 型，b 型也主要在胚胎发育中期 表达，a 型和c 型可能为幼鱼及成体后的主要表达类型。该基因在中枢神经系 统的许多区域都有表达，特别是中后脑分界线，后脑和脊索。同时凡印j 在视网 膜、耳、鳃弓、孵化腺、心脏、原肾管、肠道、原肛、胸鳍和鳔等部位都有广泛 的高表达。 通过对斑马鱼基因功能的研究可以揭示其在斑马鱼发育过程中所起的作用。 在本文中我们采用m o 印h o l i n o 进行凡叩j 基因抑制，结果显示大多数注射 凡叩，m o 的斑马鱼胚胎出现一致的表型，主要集中在脑部发育和心脏发育障 碍，此外还有躯干弯曲，孵化腺细胞异常等。而注射同样剂量的对照m o 的胚 胎发育与正常胚胎没有明显区别。这些结果表明斑马鱼脚j 基因在启动胚胎发 育和其后的组织器官发生如神经系统、心脏和其它多个组织中都有重要的作用。 关键词：斑马鱼、6 一。沁、f 唧、骨骼肌、心脏发育、中枢神经系统、可变剪接、 整胚原位杂交、基因抑制 复口大学博士学位论文斑马鱼心脏发育相关基因d s g 和脚，的克隆、表达和功能研究 a b s t r a c t ( 1 ) 6 5 g ，o n em e m b e ro ft h es a r c o g l y c a l lc o m p l e x ，i sav e 巧c o n s e r v a t i v em u s c l e s p e c i f i cp r o t e i ne x c l u s i v e l ye x p r e s s e di n t h es k e l e t a la n dc a r d i a cm u s c l eo f v e r t e b r a t e s m u t a t i o n si ns a r c o g l y c a n sa r ek n o 、1 t 0b e i n v o l v e di nl i m b g i r d l e m u s c u l a rd y s t r o p h y ( l g m d ) a n dd i l a t e dc a r d i o m y o p a t h y ( d c m ) i nh u m a n s h e r e w er e p o nm o l e c u l a rc l o n i n g ，c h a r a c t e r i z a t i o na n dd e v e l o p i n ge x p r e s s i o no fan o v e l z e b m f i s hj 一s gg e n e a n d 、v ea d o p t et h eg e n e s p e c i f i cm o 印h o l i n om o d i f i e da n t i s e n s e o l i g ot 0c a r r yo u tg e n ek n o c l d o w na s s a ya u l da n a l y s i s i t si n n u e n c et oz e b r a f i s h e m b r y o g e n e s i s t h e 如ul e n g t ho fz e b r a f i s h 正i s gc d n ai s19 38b pa n di te n c o d e sap o l y p e p t i d e o f2 9 0a m i n oa c i d sv ，h i c h s h a u r e s7 2 ，7 3 ，7 3 a n d6 9 o v e r a l li d e n t i t ) rw i t h h u m a i l ，m o u s e ，h a m s t e ra 1 1 dc h i c k e n6 一i s g ，r e s p e c t i v e l y c h a r a c t e r i z a t i o no fz e b r a f i s h 6 - s gg e n o m i cs e q u e n c er e v e a l st h a ti ts p a n sa _ b o u t2 0 0 k ba 1 1 dc o n t a i n se i g h te x o n s a n ds e v e ni n t r o n s t h ee x p r e s s i o np a t t e mo f函5 gi nz e b r a f i s he m b r y o n i c d e v e l o p m e n ti ss t u d i e db yw h o l e m o u n t 伽s 订“h y b r i d i z a t i o n t h eo n s e to fz y g o t i c t r a n s c r i p t i o ni sa te a r l ys e g m e n t a t i o np e r i o d s t r o n ge x p r e s s i o no f6 - 册w a so b s e n r e d i nv 撕o u sm u s c l e si n c l u d i n gt l l o s eo ft h es e g m e n t ，h e a i r t ，e y e ，j a w ，p e c t o r a lf i n ， b r a n c h i a la r c h e sa j l ds w i mb l a d d e ri nz e b r a f i s he m b 叫o e x p r e s s i o nc o u l da l s ob e f - o u n di nm i d b r a i na n dr e t i n aa r e r7 2 h p f f u n h e r m o r e ，w ec a r r yo u tg e n ek n o c k d o w nb ym o 印h o l i n om o d m e da n t i s e n s e 0 1 i g o n u c l e o t i d e t h em o i n j e c t e de m b 巧o ss h o w e ds e v e r ea b n o m a l i t yi nb o t hm e c a r d i a ca n ds k e l e t a lm u s c l e h o w e v e r ，t h ee m b 巧o s e c t e dw i t ht h es 锄ed o s e c o n t r o lm o p h o l i n oo l i g o n u c l e o t i d es h o 、e dn od i f 诧r e n c e 仔o mt h eu n i n je c t e dw i l d t y p e e m b 巧o s t t h ee v i d e n c e sp r o v i d e db ym o - g f pa j l d r e s c u ee x p e r i m e n ta r ev a l i d e n o u 曲t oc o n f i m t h a tm o e f f e c t i v e l yr e p r e s s e st h et r a n s l a t i o no f6 一s gp r o t e i n s o m e s e v e r eo n e sh a ds e r i o u sm o 叩h o l o g i c a la b n o n n a l 埘s u c ha u sh y p o p l a s t i ch e a d ，l i n e a r h e a i t ，v e r yw e a l ( h e a r t b e a t sa 1 1 dm “s ht n m k ，a 1 1d e a dw i t h i n5d p f w h o l e - m o u n t 切 j f f 甜h y b r i d i z a t i o na n a l y s i ss h o w e dt h a ti n6 一5 t gk n o c k d o 、 ，ne m b 巧o sa d a x i a lc e n sa n d m u s c l ep i o n e e r s 、v e r ea f - f e c t e d i na d d i t i o n ，a b s e n c eo f 函s gp r o t e i ns e v e r e l yd e l a y e d t h ec a r d i a cd e v e l o p m e n ta n di n n u e n c e dt h ed i 位r e n t i a t i o no fc a r d i a cm u s c l e ，a n dt h e c a r d i a cl e 盘- r i g h t a u s y m m e t 巧w a sd m m a t i c a l l yc h a n g e di nm o 印h o l i n o t 1 e a t e d e m b w o s i m m u n o b l o ta n a l y s i ss h o w sd o w 【1 r e g u l a t i o no f t h es a r c o g l y c a n s t h e s ed a t a t o g e t h e rs u g g e s tt h a t 正双了p l a y s a ni m p o r t a n tr o l eh l e a r l yh e a na n dm u s c l e 4 复旦大学博士学位论文 斑马鱼心脏发育相关基因乒s g 和凡印，的克隆、表达和功能研究 d e v e l o p m e n t ( 2 ) t h ew i n g e d - h e l i “f o r l ( 1 l e a dt r a j l s c r i p t i o nf a c t o rg e n e 加n i l yi sal a r g eg r o u po f p r o t e i n st h a t s h a u r eac o n s e n ，e d1 10 一锄i n oa c i dd n a - b i n d i n gd o m a i nt e h n e da s w i n g e d - h e l i xo rf o r k h e a dd o m a i n m e m b e r so ft 1 1 i sf a m i l yh a v eb e e ns h o ，i lt op l a y i m p o r t a n tr o l e si nt 1 1 ed e v e l o p m e n to fv 撕o u so r g a i l s ，i n c i u d i n gb r a i n ，c a u r d i o v a s c u l a r s y s t e m ，l u n g ，g u t 锄dk i d n e y ，w i t l lt h e i rd i v e r s em n c t i o n si n c l u d i n gp r o - l i f e r a t i o n ， c e l l u l a r d i f f e r e n t i a t i o n ， c h r o m a t i nr e m o d e l i n g ，m i t o t i cp r o g r a m ，a n dn e o p l a s t i c t m s f o 肋a t i o n i nt h i sr e p o r t ，、v ed e s c r i b e dt 1 1 ei s o l a t i o n ，c h a r a c t e r i z a t i o na n d e x p r e s s i o no f p ji nz e b 僦s h t h e 凡l l l e n 百hz e b r a f i s h 脚jc d n aw a s2 4 4 0 b pe n c o d i n ga6 5 9 - a m i n o - a c i d p r o t e i nw h i c hs h a r e s7 2 ，6 8 ，6 8 ，7 0 ，6 5 ，a i l d6 2 o v e r a ui d e n t i t yw i t h h u m a n ，m o u s e ，r a t ，c h i c k e n ，a v i a n ，a n d 仔o g 脚j ，r e s p e c t i v e l y t h ep r o d u c to f f d 印jg e n ec o n t a i n saz i n c - f i n g e rd o m a i n ，al e u c i n ez i p p e rd o m a i na n daf o f k h e a d d o m a i n 5 r a c e 锄dr t - p c rh a v ec o n 6 m e dt h a tz e b r a f l s h 脚jt r a n s c r i p t s c o n t a i na tl e a s tf o u rd i f f e r e n ts p l i c i n gv 撕觚t sn 锄e d 脚朋一d 1 1 1 er e s u l t so f w h 0 1 e - m o l l j l t 砌s 打“h y b r i d i z a t i o na n di 己t p c rs h o w e d 脚h a v ev e r yc o m p l e x a n dd y n 锄i ce x p r e s s i o np a t t e md 嘶n ge a r l ye m b r y o n i cd e v e l o p m e n t t 1 1 es p a t i a la i l d t e m p o r a le x p r e s s i o np a t t e m so ff i o u rs p l i c ei s o f o n n sa r ed i f f e r e n t r e m a r k a b l es i g n a l s o f 脚jw e r ed e t e c t e di nm a n yd o m a i n so f 廿1 ed e v e l o p i n gc e m r a ln e r v o u ss y s t e m ， e s p e c i a l l yi nm i d 1 1 i n db r a i nb o u n d a r y ，h i n d b m i n ，a n ds p i n a lc o r d s t r o n ga i l db r o a d e x p r e s s i o nw a sa l s oo b s e r v e di nr e t i n a ，e a r ，b r a n c h i a la u r c h e s ，h a t c h i n gg l a n d ，h e a r t ， p r o n e p h r i cd u m ，g u t ，p r o c t o d e u m ，p e c t o r a lf i na r l ds w i m b l 敬i d e r k n o c k - d o w nh a db e e nu s e di i l s t u d y i n g t h eg e n e向n c t i o ni nz e b r a n s h d e v e l o p m e n t a l m o s ta ut h e 脚，一m o i n j e c t e ds h o wh i g h l yc o n s i s t a n tp h y n o t y p e i n c l u d i n gh y p o p l a s t i ch e a d ，s m a ne y e s ，p e r i c a r d i a le d e m aa n d w e a kh e a n b e a t s t h e e m b 巧o si n je c t e dw i t ht h es a m ed o s ec o n t r o lm o p h o l i n oo l i g o n u c l e o t i d es h o w e dn o d i f 艳r e n c ef r o mt h eu n i n je c t e dw i l d t y p ee m b 巧o s t h e s er e s u l t sp r o v i d ee v i d e n c et h a t 脚jm i g h tb ev e d ，i m p o r t a n ti nt h ed e v e l o p m e n to ft h ec e n t r a ln e r v o u ss y s t e m ， h e a r t 锄dm a n yo t l l e ro r g a n s k e yw o r d s ：z e b r a f i s h ，6 i s g ，f o x p l ，s k e l e t a lm u s c l e ，h e a i r td e v e l o p m e n t ，c n s ， a l t e m a t i v es p l i c i n g ，、v h o l em o u n t 砌s 打“h y b r i d i z a t i o n ，m o 叩h o l i n o 5 复日人学博士学位论文 斑马鱼心脏发育相关基测正5 g 和胁p ，的克隆、表达和功能研究 第一部分 斑马鱼心脏发育相关基因6 s g 的克隆、表达和功能研究 刚百 万一s g 基因编码一个3 5 k d 的单穿膜蛋白，是肌聚糖复合物( s a r c 0 9 1 y c a n c o m p l e x ，s g c ) 的成员，在肌肉组织中特异表达( n i g r ov ，1 9 9 6 ；j u n gd ，1 9 9 6 ： y o s h i d am ，1 9 9 7 ) 。在肌细胞膜上，肌聚糖复合物与s a r c o s p a n 蛋白紧密结合， 再与另两个糖蛋白复合物d y s t m g l y c a n 复合体和s y n t r o p h i n 复合体共同结合 d y s t r o p h i n 而形成d y s t r 叩h i n 糖蛋白复合物( d y s t r o p h i n 咀s s o c i a t e d9 1 y c o p r o t e i n c o m p l e x ，d g c ) ( 图1 1 ) 。在肌肉组织中，d c g 在胞内肌动蛋白和胞外基质| e j j 形成重要的连接，保护细胞膜的稳定( e r v a s t ij m ，1 9 9 0 ： y o s h i d am ，1 9 9 0 ) 。 图1 1 人类d g c 分子模型( s t e d h e np c ，2 0 0 3 ) 除了6 阳，肌聚糖复合物还至少含有三个单穿膜蛋白：a 一，一和y $ g ( h a c k a a ，2 0 0 0 ) 。在人和鼠类中，四个肌聚糖复合物亚基和s a r c o s p a n 都在骨骼肌和 心肌中表达。除了四个基础的肌聚糖蛋白，后来的研究还发现了0 。好和一s g ，阳 在条纹肌和平滑肌中都表达( w h e e l e rm t ，2 0 0 2 ) ，而s 舳与其它s g 家族成员不 同，它广泛表达在许多组织中，包括脑( e t t i n g e ra j ，1 9 9 7 ) 。此外，6 ，二 复旦大学博士学位论文 斑马鱼心脏发育相关基因粕g 和凡印的克隆、表达和功能研究 和s 一粥还在平滑肌组织中组成另一种肌聚糖复合物( 、胁e e l e rm t ，2 0 0 4 ) 。最 近的研究表明s g 复合物的特殊装配途径是依赖于伊和6 搦的。卢s g 启动装配过 程，它与占阳的结合是s g 复合物在细胞膜上正确定位所必须的( n o g u c h is ，2 0 0 0 ； s h iw ，2 0 0 4 ) 。此外，s g 复合物除了其固有的在肌肉膜上的支撑作用外，仅一s g 还有细胞外a t p 酶的活性，s g 复合物也可能作为膜受体传递细胞间的信号( c h a n y m ，1 9 9 8 ) 。一些信号分子如i m e g r i n ，f i l 锄i nc ，一氧化氮都被证实与s g 复合 物相关。 6 册基因突变已被证实与肢带型肌营养不良( 1 i m b g i r d l em u s c u l a rd y s t r o p h y ， l g m d ) 相关。l g m d 是常见的常染色体遗传性疾病，也有散发。该症占进行性 肌营养不良性肌病的2 5 4 5 ，是进行性肌营养不良性肌病中除d m d b m d 之 外最常见的类型。伴随分子遗传学的发展，将l g m d 分为1 7 个亚型，s g 蛋白的突 变能导致l g m d 2 c f ( d u r b e e jm ，2 0 0 2 ) 。j 阳主要与2 f 型l g m d 相关( n i g r o v ，1 9 9 6 ；m o r e i r ae s ，1 9 9 8 ；d i n c e rp ，2 0 0 0 ) 。任何一个s g 蛋白的突变都能 引起不同形式的肌肉营养失调症状，现在这些病被通称为肌聚糖病 ( s a r c o g l y c a n o p a t h y ，s g p ) 。这些基因中任何一个的突变而引起的该蛋白完全 或部分的表达缺失都能导致其它s g 蛋白表达的继发性减少。在小鼠中，4 个s g 基因的基因剔除小鼠模型都己建立( d u c l o sf ，1 9 9 8 ；h a c ka a ，1 9 9 8 ；a r a i s h i k ，1 9 9 9 ；c o r a l 一v a z q u e z r ，1 9 9 9 ；d u r b e e jm ，2 0 0 0 ； s a s a o k a t ，2 0 0 3 ) 。 这些模型小鼠在出生两周后骨骼肌纤维都开始退化，在骨骼肌中可观察到细胞渗 透，纤维化，石灰化等症状。 在不同的物种中，6 阳还被证实与扩张型心肌病( d i l a t e dc a r d i o m y o p a t h y ， d c m ) 相关。研究发现将近三分之一的先天性d c m 都是由遗传的基因突变引起 的，6 s g 就是导致家族性和先天性d c m 的致病基因之一( t s u b a t as ，2 0 0 0 ) 。 1 9 9 7 年著名的仓鼠系b 1 01 4 6 被证实其突变位于击阳基因中，大约3 0 k b 的基 因组序列缺损致使巧册的第一外显子缺失，从而导致该仓鼠的一系列s g p 症状 ( n i g r ov ，1 9 9 7 ：s a k 锄o t oa ，1 9 9 7 ；s a k a m o t oa ，1 9 9 9 ) 。 斑马鱼( b ，口c 脚f d ，p ，f d ) 是原产于印度的一种小型鲤科热带鱼，由于其 在遗传和发育生物学研究中具有独特的优势，近年来逐渐成为一种理想的模式生 物。与传统的模式生物相比，它的优势在于：体形较小，长3 c m ，因此养殖不需 要太大的空间，而且节约了费用；容易饲养，繁殖速度也很快，每3 个月就可以 繁殖一代，在短时间内就可以观察到突变个体的发育情况，实验周期相对较短； 产卵量大，雌性个体在1 个星期内可以产下几百个卵，而且行体外受精，这使得 8 复旦大学博士学位论文 斑马鱼心脏发育相关基因函硒和啦p ，的克隆、表达和功能研究 对受精卵的操作非常方便：斑马鱼还有一个非常重要的特点是卵呈透明，并且体 外发育，因此在显微镜下可以观察受精卵发育的整个过程，从细胞分裂一直到形 成身体的不同部分，也可以了解各器官系统是怎样形成的。尤其是斑马鱼可以在 完全缺失循环系统和心脏功能的状况下发育到幼鱼阶段，特别适合对心血管系统 的研究。因此我们希望通过对斑马鱼粕g 基因时空表达谱和功能的研究加深我 们对脊椎动物骨骼肌和心肌的发育，功能和相关疾病产生过程的了解。 本部分报道了斑马鱼6 粥c d n a 的克隆及其相关序列分析，并通过整胚原 位杂交检测了参孵基因在胚胎发育过程中的表达情况。在此基础上我们采用吗 啉修饰的反义i a 抑制胚胎中巧册的表达，研究了6 粥表达下调对于斑马鱼 胚胎发育的影响。 9 复咀大学博士学位论文 斑马鱼心脏发育相关基因凸跖和脚，的克隆、表达和功能研究 材料和方法 主要仪器和设备 1 冷冻台式离心机( 5 8 1 0 r ，5 8 0 4 r ) ，德国e p p e n d o r f 公司产品； 2 台式离心机( c e n t r i f u g e5 4 1 5 d ，m i n i s p i n ) ，德国e p p e n d o r f 公司产品； 3 p c r 扩增仪( 2 2 3 3 1 ) ，德国e p p e n d o r f 公司产品； 4 电泳仪和电泳槽，上海辉煌科学仪器公司； 5 垂直式电泳槽，b i o r a d 公司产品 6 凝胶成像系统，上海复日公司产品； 7 四孔双列恒温水浴锅( h h s b 9 9 ) ，浙江海宁新华医疗器械厂； 8 电子天平( j a l 0 0 3 ) ，上海精科天平厂； 9 电热恒温培养箱( h h b i l 4 2 0 ) ，上海跃进医疗器械厂； 1 0 超低温冰箱( s a n y 0m d f u 5 0 v ) ，日本s a n y 0 公司产品； 1 1 控温可调速摇床( t h z c ) ，江苏太仓实验设备厂； 1 2 显微注射用解剖镜( s m z l 4 3 一n 2 t g ) ，m o t i c 公司产品； 1 3 显微注射仪，包括持针器( h i 一6 1 ) 、进针器( m n 1 5 1 ) 、支架( g j 一1 ) ，日本 n a r i s h i g e 公司产品； 1 4 显微注射用针，由d r u 唧o n d 公司1 0 u l 毛细玻璃管拉制而成； 1 5 拉针仪( h e k ap i p 5 ) ，日本h e k a 公司产品； 1 6 荧光解剖镜( s x z 1 2 ) ，日本o l y m p u s 公司产品； 1 7 数码相机( e 9 9 5 ) ，日本n i k o n 公司产品； 主要试剂、试剂盒、酶、载体和菌株 1 各种限制性内切酶、t 4 一d n a 连接酶、k l e n o w 片段均为n e we n g l a n db i o l a b s 公司产品： 2 p c r 反应试剂，包括：t a q 酶、反应缓冲液、d n t p 等均购自p r o m e g a 公司； 3 原位杂交试剂：s p 6r n a 聚合酶( 含5x 反应缓冲液和1 0 0 f l md t t 溶液) 、t 7r n a 聚合酶( 含5x 反应缓冲液和1 0 0 i i i md t t 溶液) 、t 3r n a 聚合酶( 含5x 反 应缓冲液和1 0 0 f n md t t 溶液) 、r n a 酶抑制剂( r n a s i n ) 、r qr n a s e f r e ed n a s e ( 含反应缓冲液及终止缓冲液) 等均购自p r o m e g a 公司； 地高辛标记的核糖核苷酸混合物( d i g r n a1 a b e l i n gm i x ) 、封闭试剂( b l o c k i n g r e g e a n t ) 、耦连碱性磷酸酶的抗地高辛抗体( a n t i d i g o x i g e n i n a pf a b f r a g m e n t s ) 、显色试剂( b mp u r p l ea ps u b s t r a t e ) 购自r o c h e 公司； 色素抑制剂苯脲胺n p h e n y l t h i o u r e a ( p t u ) 、肝素、酵母t r n a 、蛋白酶k 、 l o 复旦大学博士学位论文斑马鱼心脏发育相关基因6 一s g 和脚，的克隆、表达和功能研究 马来酸、小羊血清、d e p c 、左旋咪唑、多聚甲醛、甲酰胺购自s i g m a 公司； 4 溴化乙锭( e b ) 为f u l k aa g c h 公司产品： 5 酚、氯仿、异戊醇等各类有机和n a c l 等无机试剂均为上海试剂厂产品； 6 大量质粒抽提试剂盒：q i a g e nm a x i p r e pk i t ； 7 r n a 抽提试剂盒为华舜公司产品； 8 反转录试剂盒购自c 1 0 n t e c h 公司； 9 r n a 纯化试剂盒购自q i a g e n 公司； 1 0 p c r 产物及胶回收试剂盒：r o c h e 公司产品； 1 1 p c r 引物使用相关软件p r i m e rp r e m i e r5 0 0 自行设计，由上海赛百盛基因 技术有限公司合成； 1 2 d n a 测序工作送交上海英骏生物技术有限公司完成； 1 3 p g e m te s a yv e c t o r 购自p r o m e g a 公司，用于克隆p c r 片段； 1 4 p e g f p n 2 质粒为c 1 0 n t e c h 公司产品，由本室扩增保存； 1 5 p x t 一7 质粒由孟安明教授惠赠，由本室扩增保存； 1 6 c d n a 全长克隆载体为s t r a t a g e n e 公司的l a m d az a pe x p r e s s i o nv e c t o r ； 1 7 质粒转化受体菌d h 5 仅由本实验室提供。 方法 1 斑马鱼品系及繁育 本实验室所用的斑马鱼( d 口玎f d 彤，叫均为a b 品系，由清华大学生物技术系孟 安明教授惠赠，本实验室繁殖培育。 斑马鱼胚胎、幼鱼及成鱼一般都在2 8 左右养殖水中培养，p h 7 o ，饲养室 设定1 4 小时光照1 0 小时黑暗的模拟日夜循环，每天分早、中、晚三次投喂饵料。 胚胎在9 c m 培养皿中用h o l 仔e t e r 液培养。4 5 天时将从绒毛膜中孵化出的幼鱼转入 稍大的器皿，喂以草履虫( p a r 锄e c i u m ) ，每天两次，平均每次每条鱼喂0 5 1 m 1 。 大约6 天后，加喂丰年虫( b r i n es l l r i m p ) ，当所有幼鱼都开始吃丰年虫时，可停 喂草履虫。三周后幼鱼可转入循环水系统，并继续喂以丰年虫。六周后幼鱼可开 始加喂剪碎的红血虫，并逐步过渡至完全以红血虫为食。 h o l 舶t e r 液的配制：k c l 0 1 9 c a ( c 0 3 ) 2 o 2 3 5 9 n a h c 0 3 0 4 9 n a c l 7 9 溶于8 0 0 m l 去离子水中，浓盐酸调p h 值到6 5 7 0 ，补充去离子水至1 l 。 复旦大学博士学位论文 斑马鱼心脏发育相关基因西s g 和凡叩，的克隆、表达和功能研究 2 舳gc d n a 全长克隆 编码斑马鱼基因的全长6 s gc d n a 克隆来源于成体斑马鱼肾髓c d n a 文库大 规模测序。该文库由哈佛大学休斯研究所附属儿童医院z o nl i 教授实验室构建， 并由上海市第二医科大学血液研究所宋怀东教授课题组进行大规模测序研究 ( s o n gh d ，2 0 0 1 ) 。本文中所采用的全长6 好c d n a 克隆由宋怀东教授提供， 全长c e i n a 序列的n c b i 登录号为a y 3 9 8 4 1 8 。 3 各种生物信息学分析软件 6 阳基因0 i 疆的鉴定和蛋白质翻译由n c b i 的在线分析软件o r ff i n d e r 完成 ( b 垡p ；厶鱼! ! 坠垒y ：坠星坠i ：旦! 幽：卫i b ：g q ! g q 咝g q ! 垫! 幽! ) 。 同源基因的搜索由n c b i 的在线分析软件t b l a s t n 完成 ( b ! ! 卫；盎! 坠型：望曼b i ：旦! 盟：n i h ：g q y 丛曼l 墨卫) 。 多序列比对采用软件c l u s t a lw 1 8 完成，并在g e n e d o c 中制图。同时采用 在线蛋白预测分析站点垦业；丝丛坠i 曼：坠i q 鱼：坌q ! 丛里b i 垦：星鱼丛卫! 鲤i 鱼垃! q 鲤i 旦进行辅助分析。 进化树由软件m e g a 3 1 运行得出。 蛋白结构域分析由n c b i 在线分析软件c ds e a r c h 完成 ( 丛熊坠型型：旦曼堕：旦! 堕：垣b ：g q 量! 型曼! 坠! 曼缱鱼鱼纽业鱼：竺垂) 。并参考在线蛋白预测分 析站点分析结果( h ! 垃：丛迪i 曼：堕q 曼：鱼q ! 坠里b i 垒：四型乜! 煎i 曼! 乜! q 丛坠) 。 函孵基因组序列的获得是通过将c d n a 序列与s a n g e r 测