（生理学专业论文）人源性神经营养素6的基因克隆表达和功能鉴定.pdf

人源性神经营养素6 的基因克隆表达和功能鉴塞二二! 茎塑萋人源性神经营养素6 的基因克隆表达和功能鉴定博士生张承武导师郑煜教授中文摘要神经营养素( n e u r o t r o p h i n ，n t ) 是一类由神经组织或其靶组织产生的小分子蛋白质。自从2 0 世纪5 0 年代初发现神经生长因子以来，人们已经先后发现了神经生长因子( n e r v eg r o w t hf a c t o r , n g f ) 、脑源性神经营养因子( b r a i n d e r i v e dn e u r o t r o p h i cf a c t o r ，b d n f ) 、神经营养素3 ( n e u r o t r o p h i n 3 ，n t 。3 ) 、神经营养素4 5( n e u r o t r o p h i n 一4 5 ，n t 4 5 ) 、神经营养素- 6 ( n e u r o t r o p h i n 一6 ，n t 一6 )和神经营养素7 ( n e u r o t r o p h i n 7 ，n t 一7 ) 共六种n t 家族成员。由于它们在促进神经元的发生、分化、存活、对抗神经元的凋亡、保护并修复发生病变或受损伤的神经元等诸多方面均具有重要作用，所以，有关n t 的研究一直受到神经科学界的高度重视，是神经生物学领域的热点研究课题。目前，国内外关于n t 的研究主要集中在n g f 、b d n f 、n t 3 和n t 4 5 ，而有关n t 6 的研究报道较少；而且，迄今为止尚未见任何有关人源性n t 6 的报道。因此，我们拟克隆人源性n t 一6 的基因，并对n t 6 结构和功能加以探讨。本研究由流产胎儿脑组织获取总r n a ，采用逆转录聚合酶链反应( r e v e r s et r a n s c r i p t - p o l y m e r a s ec h a i nr e a c t i o n ，r t - p c r ) 的方法扩增获取人的n t - - 6 基因；并将其重组到载体质粒p b k c m v 中，构建n t - -6 基因表达载体，在原核细胞进行了表达。在此基础上，我们将n t - -人源性神经营养素6 的基因克隆表达和功能鉴定中文摘要6 成熟肽编码区的基因进行亚克隆，构建了含有该基因的融合表达载体p g e x - n t 6 ，诱导表达后获得纯化的n t - - 6 成熟肽片段。利用离体培养的乳鼠海马神经元和大鼠面运动神经元逆行溃变的动物模型，对n t 一6 成熟肽片段的功能在细胞水平及整体动物水平进行了研究。实验结果表明，我们成功地克隆了人源性n t 一6 基因；氨基酸序列比较和三维结构分析显示，人源性n t 6 具有该家族蛋白结构的固有特性。含有n t 6 成熟肽片段基因的融合表达载体，在异丙基一b d 硫代半乳糖苷( i s o p r o p y lb - d t h i o g a l a c t o s i d e ，i p t g ) 诱导的条件下，表达了n t 一6 成熟肽片段。经分离纯化的n t 一6 成熟肽，可以促进离体培养海马细胞的存活，对抗由于面神经损伤引起的面运动神经元的逆行溃变a 该项研究不仅有助于拓展人们对n t 这一类重要小分子蛋白质的神经生物学特性的认识，同时也为探讨临床上退行性神经疾病及神经损伤的防治措施提供了重要的理论依据。关键词：神经营养素6 克隆原核表达神经元面神经核溃变d o c t o r a lc a n d i d a t ez h a n gc h e n g w us u p e r v i s o rp r o f z h e n gy ua b s t r a c tn e u r o t r o p h i n ( n t ) i sak i n do fp r o t e i n sw i t hs m a l lm o l e c u l a rw e i g h td e r i v e df r o mn e u r a lt i s s u e so ri t st a r g e tt i s s u e s 。s i n c et h en e r v eg r o w t hf a c t o r ( n g f ) ，t h ef i r s tm e m b e ro ft h en tf a m i l y , w a si d e n t i f i e di nt h e5 0 t ho f2 0 “c e n t u r y ,i n c l u d i n gb r a i n - d e r i v e dn e u r o t r o p h i cf a c t o r( b d n f ) ，n e u r o t r o p h i n - 3( n t 一3 ) ，n e u r o t r o p h i n 一4 5( n t 一4 1 5 ) ，n e u r o t r o p h i n 一6 ( n t 一6 ) a n dn e u r o t r o p h i n 一7 ( n t 一7 ) ，t o t a l l ys i xm e m b e r so fn t sh a v eb e e nr e p o r t e d b e c a u s eo fi t si m p o r t a n tr o l ei ne n h a n c i n gt h en e u r o n so c c u r r e n c e ，d i f f e r e n t i a t i o n ，s u r v i v a n c e ，a n t a g o n i z i n gt h en e u r o n sa p o p t o s i sa n dp r o t e c t i n ga n dr e n o v a t i n gt h ei n j u r e dn e u r o n s ，r e s e a r c h e so nn t sh a v ea l w a y sb e e nt h eh i g h l i g h to ft h en e u r o b i o l o g y a tp r e s e n t ，m o s ts t u d i e sa r ef o c u s e do nt h en g f ，b d n f ，n t 一3a n dn t 一4 t h e r ea r ef e wa b o u tn t - 6 ，a n de v e nf e w e ra b o u tn t - 6d e r i v e df r o mh u m a nb e i n g h e r e b y ，t h ep r e s e n tp r o j e c tw a sc a r r i e do u tt os t u d yt h es t r u c t u r ea n df u n c t i o no fh u m a n d e r i v e dn t 6 t o t a lr n aw a se x t r a c t e df r o ma b o r t e da n t e n a t a lc e r e b r a ic o r t e xa n dc d n af r a g m e n to fn t - 6w a sa m p l i f i e dt h r o u g hr t - p c r t h eo b t a i n e dn t - 6g e n ew a sc l o n e di n t op b k - c m v- 3 -p l a s m i dt oc o n s t r u c tn t 6g e n ee x p r e s s i o nv e c t o ra n di t se x p r e s s i o ni nt h ep r o c a r y o t i cc e l lw a so b s e r v e d u s i n gt h ec o m p l e t eg e n eh a v i n gb e e nc l o n e da st e m p l e t ，w ec o n s t r u c t e df u s i o ne x p r e s s i o nv e c t o ro fh u m a n - d e r i v e dn t - 6g e n et h a te n c o d e dm a t u r ep e p t i d ep g e x1 - n t 一6 a f t e ri n d u c e db yi p t g ，t h ef u s i o np r o t e i nw a se x p r e s s e di ne s c h e r i c h i ac o l i t h em a t u r ep e p t i d eo fn t 一6w a sc o l l e c t e da n dp u r i f i e d o nt h ec u l t u r e dh i p p o c a m p a ln u e r o n sa n dt h er a t sw i t hf a c i a ln e r v et r a n s e c t e d ，w ei d e n t i f i e dt h ef u n c t i o no fm a t u r ep e p t i d eo fn t 一6 t h en t - 6g e n ee x p r e s s i o nv e c t o rw a ss u c c e s s f u l l yc o n s t r u c t e da n de s c h e r i c h i ac o l iw i t hr e c o m b i n a n tv e c t o re x p r e s s e dd i s t i n c t i v ep r o t e i n s e q u e n c eb l a s ta n dt e r t i a r ys t r u c t u r ec o m p a r i s o ni n d i c a t e dt h a tt h eh u m a n - d e r i v e dn t - - 6p o s s e s s e dt h ei n h e r e n tc h a r a c t e r i s t i c so fn t sf a m i l y e s c h e r i c h i ac o l iw i t hr e c o m b i n a n tv e c t o rp g e x1 n t 6e x p r e s s e df u s i o np r o t e i no fn t 一6m a t u r ep e p t i d ea f t e ri n d u c e db yi p t g t h ep u r i f i e dm a t u r ep e p t i d eo fn t 一6c o u l de n h a n c et h es u r v i v a n c eo ft h ec u l t u r e dh i p p o c a m p a ln u e r o n sa n da n t a g o n i z et h er e t r o g r a d e d e g e n e r a t i o ni n d u c e df r o mt h en e r v et r a n s e c t i o n t h i ss t u d yc o u l dn o to n l yi n c r e a s eo u rc o m p r e h e n s i o no nt h en e u r o b i o l o g i c a lc h a r a c t e r i s t i c so fn t s ，b u ta l s op r o v i d et h et h e o r e t i cb a s i sf o rp r e v e n t i o na n dt r e a t m e n to fd i s e a s ei nt h en e r v o u ss y s t e m k e yw o r d s ：n e u r o t r o p h i n 一6 ：c l o n e ；p r o c a r y o t i ce x p r e s s i o n ；n e u r o n s ；f a c i a ln u c l e u s ；d e g e n e r a t i o n人源性神经营养素6 的基因克隆丧垫塑盟篮鉴宣二= 士l 喧日u青神经系统疾病对人类健康危害极大。在临床上，较常见的神经系统疾病包括神经退行性病变、理化因素引起的神经系统损伤等。由于哺乳动物神经元前体细胞的有丝分裂在动物出生后不久即告终止，所以发育成熟的神经元是终末分化细胞。也就是说，一旦神经元发生病变或受损伤，其再生修复相当困难。因此，如何延缓或防治神经细胞的病变、促进受损伤神经再生，一直是临床及基础神经生物学家探讨的热点问题。大量的研究结果表明，神经营养素、细胞黏附分子、胶原蛋白、白介素、甲状腺激素等都对神经系统具有营养和保护作用；在这诸多因素中，神经营养素由于其对神经系统特异性的作用而成为人们关注的焦点。神经营养素( n e u r o t r o p h i n ，n t ) 是一类由神经组织或其靶组织产生的小分子蛋白质。研究表明，n t 在促进神经元的发生、分化、存活、对抗神经元的凋亡、保护并修复发生病变或受损伤的神经元等诸多方面均具有重要作用。自从上世纪5 0 年代初发现神经生长因子以来，关于n t 的研究一直受到神经科学界的高度重视，是神经生物学领域的热点研究课题。经过近5 0 年的研究，人们已经发现了神经生长因子( n g f ) 、脑源性神经营养因子( b d n f ) 、神经营养素3 ( n t 3 ) 、神经营养素- 4 5 ( n t - 4 5 ) 、神经营养素- 6 ( n t 一6 ) 和神经营养素7 ( n t 7 )共六种n t 家族成员【卜4 】。目前关于n g f 、b d n f 、n t 。3 和n t 4 5的研究较多，结果表明，它们都是碱性蛋白，分子量在1 3 0 0 0 1 6 0 0 0之间，彼此之间有大约5 0 的同源性，氨基酸序列中都含有6 个半胱氨酸残基；它们的结构域主要排列在半胱氨酸残基周围，通过形人源性神经营养素6 的基因克堕室鲨塑垡自l 鳖宣二二盟童成3 个二硫键使分子构成三维的结构并具有生物活性。n t 通过与酪氨酸蛋白激酶受体( t r k a 、t r k b 、t r k c ) 或p 7 5 受体结合而发挥它们对神经系统特有的作用【5 ，6 1 。n g f 、b d n f 、n t 一3 及n t - 4 5不仅可以促进体外培养神经元的存活和分化，还可以对受损伤的神经元起到保护作用；此外，它们还可以促进中枢或外周损伤神经轴突的再生 t q o 】。其中某些由生物工程技术合成的n t 已试用于临床上神经系统疾病的治疗。尽管如此，为了进一步揭示n t 的实际应用价值，有必要对n t 家族成员的组成和神经生物学特性进行深入研究。到目前为止，关于n t 一6 的研究报道很少。1 9 9 2 年，b e r k e m e r i e r等【1 1 1 首次报道，在人的1 9 号染色体上有一个新基因，它与n t 5基因的开放阅读框有7 5 的同源性，b e r k e m e t i e r 等称之为n t 6 基因；但由于没有关于该基因进一步的研究报道，所以当时n t 6 并没有引起人们的重视。1 9 9 4 年，g o t z 等1 2 】在对硬骨鱼的n g f 基因进行克隆时，偶然得到一段新的基因片段，该基因不同于当时任何一个已经报道的n t 家族成员的基因，他们也将其称为n t 6 基因。随后，g o t z 等对该基因进行克隆表达，发现硬骨鱼的n t 6 具有其他n t 家族成员所共有的信号肽和保守的氨基酸序列，而且能促进鸡交感神经节和背根神经节细胞的存活。1 9 9 7 年，g o t z 实验室进一步研究报道，硬骨鱼的n t 6 能够诱导鸡背根神经节细胞轴突的定向生长l l 引。已有研究证明，在不同种属动物之间n t 的差别很小”。那么硬骨鱼的n t 6 基因与人的n t 6 基因之间有多大的同源性? 对g o t z 等和b e r k e m e r i e r 等报道的结果进行比较可见，硬骨鱼n t - 6 基因与人n t 6 基因在碱基序列方面有很大差别。这就提示，人源性n t 一6 在结构和功能方面也可能不同于包括鱼n t 6 在内的人源性神经营养素6 的基因克隆表述塑堕壁鳖g - - 前士其它n t 家族成员。经系统查阅文献，除了这几篇文章之外，我们未见其他有关n t 6 的报道。可见，人们对于n t 一6 的认识还是非常初步而粗浅的，尤其是关于人源性n t 6 的结构和功能等重要问题知之甚少。因此，我们拟对人n t 一6 的结构和功能进行深入研究。在本研究中，我们将采用逆转录多聚酶链反应方法，由流产胎儿脑组织的r n a 中获取人源性n t 6 基因，然后将其克隆进原核表达载体，观察n t 一6 在大肠杆菌中的表达情况，并对人源性n t 6基因和由该基因编码的氨基酸序列进行分析。在此基础上，构建编码人源性n t 6 成熟肽基因的亚克隆，纯化由大肠杆菌表达的人源性n t 一6 成熟肽片段。最后，在细胞水平和整体动物水平对n t 6的功能进行研究。通过本课题的研究，可使人们系统了解人源性n t - 6 的结构和功能，进而拓展对n t 这一类重要小分子蛋白质的神经生物学特性的认识。人源性神经营养素6 的基因壹堕塞鲨塑垫堕鳖塞二塑二韭坌! ! ! 直第一部分n t 6 基因的克隆及在原核细胞的表达引言将目的基因重组到表达载体上，是得到该基因所编码的蛋白质及进一步研究其结构和功能的基础。p b k c m v 具有原核启动子序列( t a c ) ，可在原核细胞中进行表达；它同时含有l a c 启动子及l a c z 的部分区段，在i p t g 诱导下能表达b 一半乳糖苷酶的氨基末端片段，并与宿主菌所编码的缺陷型b 一半乳糖苷酶实现n 一互补，在含1 p t g 和x _ g a l 的培养基上形成蓝白相间的菌落，从而为重组质粒构建过程中阳性克隆的快速筛选提供了方便【b 】。除此之外，p b k c m v 多克隆位点的两侧含t 3 和t 7 通用测序引物序列，便于对目的基因进行直接的测序鉴定，因此，p b k c m v 是一种实用高效的载体。n t 6 是n t 家族中发现较晚的成员，到目前为止，只有少量有关鱼n t 6 的研究旧13 1 ，还未见有关人源性n t - 6 结构和功能的报道。本研究将人源性n t 一6 的基因克隆到高效表达质粒p b k c m v 中，构建原核表达载体p b k - n t 一6 ，测序鉴定所克隆n t 6 基因序列；进一步观察n t 一6 在带有重组载体大肠杆菌中的表达情况；通过氨基酸序列比较和三维结构分析，将人源性n t - 6 编码的蛋白质与n t 家族的其他成员进行比较，以明确人源性n t 6 具备的家族固有特性及其个体特异性。人源性神经营养素6 克基因的隆表鲨塑生自l 鳖宣二= 蔓二塑坌! 盟整皇直鲨材料与方法1 材料1 1 菌株和质粒大肠杆菌j m l 0 9 及p b k c m v 质粒由本校分子生物学开放实验室保存。1 2 总r n a总r n a 由流产胎儿脑组织提取。1 3 主要试剂、x g a l 、i p t g 、d n am a r k e r 、蛋白质m a r k e r 、t a q d n a 聚合酶、限制性内切酶、t 4 d n a 连接酶、r n a 抽提试剂盒、r t p c r 一步法试剂盒、胶回收试剂盒均由t a k a r a 公司提供，其余常用试剂为进口及国产优级分析纯。2 方法2 1 引物的设计与合成根据g e n b a n k 中b e r k e m e r i e r 等所报道的n t 6 基因序列设计并由t a k a r a 公司合成引物。引物包含限制性内切酶b a m hi 的酶切位点gig a t c c 和e c o ri 的酶切位点gla a t t c 。引物的碱基序列如下：p 15 g c a c 鱼鱼篁显c a a g t c c t l 嘣i g g a g t c c c3 p 25 c a a c 鱼世辽! c a c c a g t t c ct gg g t a t a a g t c3 2 2n t 6 基因片段的获得用r n a 抽提试剂盒由流产胎儿大脑皮层提取总r n a ，通过r t p c r 扩增获取n t 6 基因的c d n a 片段，r t p c r 的反应体系为：1 0 r t p c rb u f f e r5ul ，2 5 m m o l ld n t p5ul ，2 5 m m o l lm g c l 25 “l ，r n a a s e i n h a b t i o r lu l ，逆转录t a q d n a 聚合酶l 仙l ，r n a lu l ，9 厶鳗丝塑丝萱菱童：! 塞蕉塑笪堕壅垄塑垫丝鳖室二塑二翌坌! 盟型皇互鲨引物p 1 、p 2 ( 1i tm o l 1 ) 各1ul ，加入灭菌双蒸水至总体积5 0 ul 。将反应体系置于b i o m e t r au n oi i 型p c r 扩增仪上进行扩增，循环参数为：5 0 * ( 2 3 0 分钟，9 4 预变性3 分钟，然后9 4 。c 变性4 5 秒，5 8 。c 复性4 5 秒，7 2 。c 延伸1 分钟，3 3 个循环，末次循环自动延伸7 分钟，取5l l1 扩增产物进行1 琼脂糖凝胶电泳检测。2 3r t 。p c r 扩增产物的柱式胶回收纯化当r t p c r 扩增产物以1 琼脂糖凝胶电泳检测发现明显阳性扩增带后，切下含目的基因的凝胶块，放入一洁净1 5 m le p 管中，按柱式胶回收纯化试剂盒说明书进行p c r 扩增产物的纯化，纯化后的产物以1 琼脂糖凝胶电泳检测纯化效果。2 4p b k - c m v 质粒的制备和纯化( 碱裂解法)用接种环挑取含质粒p b k - c m v 的甘油保存菌种，划线接种于l b平板固体培养基的表面( 含卡那霉素5 0ug m l ，表层涂有2 0 0 m g m l的i p t g 4i tl ，2 0 m g m l 的妊g a l4 0i t1 ) ，3 7 倒置平板孵育过夜。第二天挑取单个蓝色菌落接种于2 m l l b 液体培养基( 卡那霉素5 0i tg m l ，四环素1 2 5i tg m 1 ) ，置3 7 c 摇床振摇培养1 2 一1 4 小时，菌液转入1 5 m l离心管，1 0 0 0 0r m i n 离心3 0 秒集菌，去除培养液，菌体加入1 0 0i tl冰预冷的溶液i ( 5 0 m m o l l 葡萄糖，2 5 m m o l lt r i s h c i ，1 0 m m o l le d t a ，p h 8 o ) ，在漩涡振荡混匀器上充分振荡混匀，室温放置5 分钟，加入新鲜配制的溶液i i ( 0 2 m o l ln a o h ，i s d s ) ，快速颠倒离心管5次混匀，冰浴5 分钟，加1 5 0 i tl 溶液i l l ( 5 m o l l 乙酸钾6 0 m l ，冰乙酸1 1 5 m l ，水2 8 5 m 1 ) ，颠倒离心管1 0 秒钟混匀，置冰浴5 分钟，1 2 0 0 0r m i n 离心5 分钟，上清转入另一洁净1 5 m l 离心管中，用等体积的酚：氯仿和氯仿各抽提1 次，上清加2 倍体积的无水乙醇冷沉淀，7 0 7 ,醇洗涤，沉淀置真空冻千机中冻干，用5 0u 1t e 溶解，取1 0u l厶塑丝塑丝萱鲞鲞：! 塞茎旦塑堕壅鲨塑垫丝些塞= = 釜二麴坌! 塑型墨友鎏一稀释后用紫外分光光度计测其o d 2 6 0 。和o d 2 8 0 n m 值，计算d n a 含量，并分析其纯度，加入r n a a s e ( 1 0 m g m 1 ) 3ul ，- 2 0 c 贮存备用。方法参考分子生物学实验技术( 第二版) 1 6 1 。2 5 制备大肠杆菌感受态细胞用接种环挑取甘油保种的大肠杆菌j m l 0 9 株菌液划线接种于l b 平板固体培养基表面，3 7 c 倒置平板过夜，次日挑取单菌落接种于2 m ll b液体培养基，置3 7 。c 摇床振摇培养1 0 小时以上，取o 5 m l 菌液接种5 0 m ll b 液体培养基，3 7 继续振摇培养3 小时，将菌液转入灭菌的1 0 0 m l离心管中，冰浴1 0 分钟，4 c 以4 0 0 0r r a i n 离心1 0 分钟，用冰预冷的0 1 m o l lc a c l 2 溶液重悬菌体，冰浴1 0 分钟，4 0 0 0r r a i n 离心1 0 分钟，沉淀加o 1 m o l lc a c l 2 溶液2 m l 悬浮细菌，按每份2 0 0l a1 分装于1 5 m l离心管中，4 贮存备用。具体方法参考分子生物学实验技术( 第二版) 1 6 1 。2 6 重组质粒的构建和转化将获得的人n t 6 基因片段和p b k c m v 质粒分别经e c o ri 和b a m hi 酶切后用柱式胶回收法进行纯化；酶切片段在t 4 d n a 连接酶作用下，在1 2 。c 水浴中经1 6 h 重组。取1 0 ul 连接产物加入2 0 0 l a1 感受态细菌j m - 1 0 9 中，将转化后的j m 1 0 9 细菌涂在含有i p t g 、x g a l 及卡那霉素的固体培养基上，倒置平板孵育过夜。2 7 重组质粒的鉴定待细菌长出后，选取白色菌落在含有卡那霉素的l b 培养基中培养。碱裂解法提取质粒，并经e c o ri 和b a m hi 酶切，琼脂糖电泳进行初步分析，然后对重组载体进行测序鉴定。2 8 重组质粒在原核细胞中的表达分别将含有重组质粒p b k - n t 一6 和未经重组的p b k c m v 质粒的单人源性神经营养素6 克基因的隆表达和功睦鳖宣二蔓= 塑坌! 塑整量直鲨菌落接种到2 m ll b 培养基中( 含终浓度为5 0 n m l 卡那霉素) ，3 7 v 振摇过夜；各取o 1 m l 培养基转种到1 0 m ll b 培养基中，3 7 v 振摇3 4 h ，加入i p t g 至终浓度为l m m o l l ，诱导3 h ，4 1 0 0 0 0 f f m i n 离心1 分钟收集细菌。在收集的细菌中加入1 0 0ul 凝胶加样缓冲液振荡混匀，沸水浴1 0 m i n ，1 2 0 0 0f f m i n 离心1 0 分钟，取上清行s d s p a g e 电泳( 分离胶浓度1 5 ，积层胶浓度5 ) ：用o 1 考马斯亮兰( r 2 5 0 ) 染色，直至兰色条带清晰可见，脱色液( 含4 0 甲醇、1 0 醋酸) 脱色，照相后经真空干燥仪将凝胶制成千胶保存。具体方法见参考文献17 。2 9 氨基酸序列和三级结构比较分析将n t 一6 基因编码的氨基酸与n t 家族成员n t 3 和n t 5 进行序列比较分析；在计算机上用s s s p d b v i e w e r 软件对人源性n t 6 三级结构进行模拟，并将其与已报道的n t 3 和b d n f 的三级结构进行比较( 经查阅，未见有关n t 5 三级结构的报道，所以在此与b d n f 进行比较) 。人源性神经营养素6 的基因克隆表达和功能鉴定第一部熊：结果结果1 总r n a 及人源性n t 6 基因电泳结果以流产胎儿大脑皮层提取的总r n a ( 图1 ) 为模板，用n t 一6 引物行r t p c r ，扩增产物电泳后为一清晰的条带，其大小为8 3 0 b p 左右，与文献报道的人的n t 6 基因片段的大小一致( 图2 ) 。f i g1e l e c t r o p h o r e s i so ft o t a lr n ae x t r a c t e df r o ma b o r t e da n t e n a t a lc e r e b r a lc o r t e x 1 ，2 ：6u1 ，3u1s a m p l er n a r e s p e c t i v e l y f i g2e l e c t r o p h o r e s i so fp b k - c m v , r e c o m b i n a n tv e c t o ra n dt h e i rd i g c s t e dp m d u c t s 1 ：p c rp r o d u c to fn t - 6 ；2 ：p b k c m vp l a s m i d ；3 ：r e c o m b i n a n tv e c t o rp b k - n t 6 ；4 ，5 ：d i g e s t e dp r o d u c to fp b k - c m va n dp b k - n t 6 ，r e s p e c t i v e l y ；6 ：d n am a r k e rd l - 2 0 0 0 1 3 -人源性神经营养素6 的基因克隆衰鲨塑堕自l 鳖宣二二蔓二堡坌! 堕墨2 重组载体的构建及鉴定结果扩增得到的n t 6 片段与p b k c m v 质粒重组后，转化致敏感受态大肠杆菌j m l 0 9 ，在含有x g a l 和i p t g 的固体培养基上，3 7 c 培养1 2 1 6 小时，得到白色菌落：而未经重组的p b k c m v 质粒转化j m l 0 9 ，在相同的选择性培养基上形成蓝色菌落。挑取白色菌落，经l b 培养基小量培养后提取质粒，做电泳观察：重组质粒经双酶切做琼脂糖电泳，结果显示前后两个清晰的条带，其中前端条带的大小为8 3 0 b p 左右，与r t p c r 扩增产物一致；对照口b k c m v 质粒，酶切后只有拖后的一条带而没有前端的条带，如图2 所示。3 原核表达产物的s d s p a g e 电泳结果经i p t g 诱导3 小时后，由含有重组质粒的菌液中提取的蛋白质与由未重组质粒的菌液中提取的相比多了一条带，以蛋白质m a r k e r 作参照，该蛋白质的分子量为2 1 0 0 0 ( 2 l k d ) 左右( 图3 ) 。f i g3s d s - p a g ea n a l y s i so fn t 一6p r o t e i ne x p r e s s e di ne c o l iw i t hp l a s m i dp b k - c m va n dr e c o m b i n a n tv e c t o rp b k n t 61 3 ：p b k - n t - 6i n d u c e db yim m o l li p t g7p1a n d5u1 ，r e s p e c t i v e l y ；2 ：p b k n t 6 ，n o ti n d u c e d ；4 ：p b k - c m vi n d u c e db yi p t g ；m ：p r o t e i nm a r k e r 人源性神经营养索6 的基因克隆表达和功能鉴定第一部分：结果4 氨基酸序列及三维结构比较分析结果n t 6 包含有1 9 9 个氨基酸，将n t 一6 基因所编码的氨基酸序列与其他人源性n t 家族成员( 本研究中为n t 3 【1 4 】和n t 5 1 5 1 ) 进行b l a s t比较分析【l “，结果显示，n t 6 基因所编码的氨基酸序列中包含n t 家族成员中所共有的保守序列( 图4 黑色及灰色背景) ，同时它又在多个氨基酸位点上与其他家族成员有所不同( 图4 白色背景) 。在计算机上用s w i s s p d b v i e w e r 软件对其三级结构进行模拟后，可见n t 6 的三级结构与已报道的n t 3 和b d n f l l 卅的结构具有较大的相似性，如图5 所示。f i g4c o m p a r i s o no f t h ea m i n o - a c i ds e q u e n c eo f n t - 6a n dt h a to f n t 5a n dn t - 3人源性神经营养素6 的基因克隆表达和功能鉴定第一部分：结果f i g5t h r e ed o m a i ns t r u c t u r eo f n t - 6 ，n t - 3a n db d n f1 6 -人源性神经营养素6 的基因克隆麦述塑堕鳇鳖宣二二整二塑坌! 塑丝讨论将目的基因重组到表达载体上，是得到该基因所编码的蛋白质及进一步研究其结构和功能的基础。p b k c m v 是一种既可在原核细胞又可在真核细胞高效表达的质粒。我们成功地将一神经营养素家族成员n t 一6 的基因重组到p b k c m v 质粒上，构建了包含有人源性n t - 6基因片段的p b k o n t 6 重组质粒。酶切结果显示，重组载体中的插入片段与人的n t 一6 基因片段大小一致。对所得到的重组质粒经聊 承a 和上海基康两家公司进行测序鉴定，所得测序结果完全一致。与b e r k e m e r i e r 等【l l l 报道的人n t 一6 碱基序列相比，两者之间有一定的差异，同源性为9 4 。存在差异的原因尚不清楚，经r t p c r 所得到的n t - 6e d n a 片段在重组及细菌传代培养的过程中会发生碱基的突变，这可能是影响我们的实验结果与文献报道结果【8 的一致性的原因之一。在基因序列方面，人源性n t 一6 与已报道的鱼的n t 一6 之间同源性为6 0 ，这可能决定于基因来源之间的种属差别。为了进一步证明重组质粒的有效性，我们观察了重组质粒在原核细胞的表达。与未重组质粒相比，由含重组质粒的细菌中提取的蛋白质经电泳显示多了一条分子量为2 1 0 0 0 ( 2 1 1 d 3 ) 左右的条带，与预期的分子量大小一致。与人源性n t 3l 1 8 1 及n t 5 t 1 9 1b l a s t 比较分析结果表明，在本研究中，人n t - 6 基因所编码的氨基酸序列中包含n t 家族成员中所共有的保守序列( 图3 黑色及灰色背景) 同时它又在多个氨基酸位点上与其他家族成员有所不同( 图3 白色背景) 。其中最显著的一点是，包括n t 3和n t - 5 在内的其他n t 家族成员都含有6 个半胱氨酸残基，而n t 家族的结构域就主要排列在半胱氨酸残基周围，通过形成3 个二硫键使分子构成三维的结构并具有生物活性，但与它们相比，n t 6 缺少了两人源性神经营养素6 的基因克隆表达和功能鉴定第一部分：谜个半胱氨酸残基。用s w i s s p d b v i e w e r 软件【2 1 】对人源性n t 6 三级结构进行模拟，结果表明n t 一6 三级结构与n t 3 和b d n f 2 3 】丰日比也既有一定的相似性，又有其自身的特异性。以上结果均表明，n t 6 在结构上属于n t 家族的一员，提示它应具有促进神经细胞的生长、分化以及保护并修复受损伤的神经元等功能；但n t 6 氨基酸序列及三级结构的特异性提示，它还可能具有其他n t 家族成员所不具备的特异性功能。本研究对人源性n t 6 基因的克隆表达及n t 6 三级结构的分析，为今后进一步研究n t 6 的结构和功能奠定了基础，有助于增加人们对n t 这一类重要的蛋白质分子的认识。小结1 通过t r - p c r 扩增得到了人源性n t 6 基因。2 成功构建了人源性n t 6 基因原核表达载体，并在大肠杆菌中获得了稳定表达。3 人源性n t 一6 在结构上具备n t 家族的固有特性，但也具有其自身的特异性。这为今后深入研究n t 6 的结构和功能奠定了基础。人源性神经营养素6 的基因克隆表碴塑垫墼鉴宣二箜三壑坌! 曼! 直第二部分n t 6 成熟肽编码区基因融合表达质粒的构建和表达产物的纯化引言成熟肽片段是n t 结构中发挥生物学作用的关键部分。本部分研究利用已获得的人源性n t 6 全基因为模板【2 4 1 ，通过p c r 扩增得到编码n t - 6 成熟肽基因片段，并将该片段克隆到原核表达质粒p g e x - 1 t ，构建融合表达载体p g e x - n t 6 。p g e x 一1 九t 是目前使用较多的原核表达载体，其组成成分基本上与其它表达载体相似，含有启动子( t a c )及1 a c 操纵基因、s d 序列、l a ci 阻遏蛋白基因等 2 5 】。这类载体与其他表达载体不同之处是s d 序列下游就是谷胱苷肽巯基转移酶基因，而克隆的外源基因则与谷胱苷肽巯基转移酶基因相连。当进行基因表达时，表达产物为谷胱苷肽巯基转移酶和目的基因产物的融合体。这个载体系统具有如下优点：可诱导高效表达；载体内含有l a ci 阻遏蛋白基因；表达的融合蛋白质纯化方便；使用凝血酶( t h r o m b i n ) 就可从表达的融合蛋白中切下所需要的蛋白质或多肽；可进一步对该重组质粒在大肠杆菌中的表达产物进行分离纯化2 6 1 。经g s t ( g l u t a t h i o n es - t r a n s f e r a s c ) 试剂盒纯化所获得的n t 6 成熟肽为研究人源性n t 一6 的生物功能奠定基础。材料和方法1 。材料1 1 菌株和质粒大肠杆菌j m l 0 9 由本校分子生物学开放实验室保存，p g e x l xt质粒购自p h a r r n a c i ab i o t e c h 公司，含有入源性n t 一6 全基因的重组质粒p b k - n t 一6 由本研究组制各保存。1 2 主要试剂异丙基一9 一d 一硫代半乳糖菅( i s o p r o p y lb d t h i o g a l a c t o s i d e ，i p t g ) 、d n am a r k e r 、蛋白质m a r k e r 、限制性内切酶、t 4 d n a 连接酶、p c r 反应试剂盒、胶回收试剂盒均由t a k a r a 公司提供，g s t - 纯化试剂盒购自g i b c o 公司，其余常用试剂为进口及国产优级分析纯。2 方法2 1p c r 引物的设计根据测序鉴定的n t - 6 成熟肽编码区基因序列设计并由t a k a r a 公司合成引物。引物的碱基序列如下：p 1 ：5 a a a q 蛩丝幽g c a a g g g c t t c c c c a t a a3 p 2 - 5 a c t 鱼王至c a c a c g g c c a g c c t c a c c c 3 引物包含限制性内切酶b a m hl 的酶切位点g ；g a t c c 和e c o ri 的酶切位点g l a a t t c 。2 2 扩增编码n t 6 成熟肽的基因片段以人源性n t 一6 全基因的重组质粒p b k - n t 6 为模板，p c r 扩增编码n t 一6 成熟肽的基因片段。p c r 扩增体系为：1 0 p c rb u f f e r5pi ，d n t p 4l tl ( d a t p , d g t p , d c t p , d t t p 各2 5 r e t o o l l ) ，g i 物p 1 、p 2 ( 0 12 0 人源性神经营养素6 的基因克隆表达和功睦鳖宣二二蔓三塑坌! 盟整量查鲨u m o l u 1 ) 各1u l ，t a q d n a 聚合酶2 5 u ，重组质粒p b k - n t - 6 1u l ，加超纯水至总体积为5 0ul ，于b i o m e t r au n oi i 型p c r 扩增仪上进行p c r 扩增，循环参数为：先9 4 预变性3 分钟，然后9 4 变性4 5 秒，5 8 复性4 5 秒，7 2 延伸1 分钟，3 0 个循环，末次循环自动延伸7 分钟，取1 0 ul 扩增产物进行1 琼脂糖凝胶电泳检测。2 3 p g e x l 一 t 质粒的制备用接种环挑取含质粒p g e x l 一 t 的甘油保种j m l 0 9 大肠杆菌划线接种于l b 平板固体培养基表面( 含氨苄青霉素5 0ug m 1 ) ，置3 7孵育过夜，次日挑取单菌落接种2 m l l b 液体培养基( 氨苄青霉素5 0ug m 1 ) ，3 7 振摇培养1 2 小时后，菌液转入1 5 m l 离心管，1 0 0 0 0转分离心3 0 秒集菌，通过碱裂解法制备质粒( 方法同第一部分中p b k c m v 质粒的制备和纯化) 。2 4 重组质粒的构建将获得的n t 6 成熟肽基因片段和由碱裂解法得到的p g e x l 一九t质粒分别经e c o ri 和b a m hi 酶切，然后用柱式胶回收试剂盒进行纯化；回收产物在t 4 d n a 连接酶作用下，在1 2 水浴中经1 6 小时重组。取1 0 u1 重组质粒转入2 0 0 ul 冰冷c a c l 2 致敏的感受态细菌j m 一1 0 9 ( 感受态细菌的制备同第一部分) 。2 5 重组质粒的筛选鉴定将转化后的j m 一1 0 9 细菌涂在含终浓度为5 0 n m l 氨苄青霉素固体培养基上，待细菌长出后，挑取单菌落在l b 培养基培养。将阳性克隆进一步培养放大，提取质粒并经e c o ri 和b a m i - ii 酶切，以p g e x l 一 t 质粒作为对照，经琼脂糖电泳进行比较分析。2 6 重组质粒在大肠杆菌j m l 0 9 中的表达分别将含有重组质粒p g e x i n t 6 和p g e x l 一九t 质粒的单菌落接2 1 人源性神经营养索塔的基因克隆表达狂碴壁! 望瞳= = 蔓三塑熊! 塾整璺复鎏种到2 m ll b 培养基中( 含终浓度为5 0 n g m l 氨苄青霉素) ，3 7 。c 振摇过夜；各取o 1 m l 培莽基转种翻1 0 m ll b 珞莽基中，3 7 0 扳摇3 4 小时，加入i p t g 至终浓