（食品科学专业论文）庐山云雾茶色素的提取、纯化及应用.pdf

中国农业大学硕士学位论文 摘要 本研究以中国地方茶庐山云雾茶为对象，深入研究了庐山云雾茶色素的提取、纯化 和应用工艺。在研究过程中，首先对提取物进行了分离纯化研究和理化性质的测定，然 后关于茶色素在医药及食品中的应用技术进行了探讨，最后，针对庐山云雾茶色素在酸 乳饮料中的应用研究，并设计了可行性工艺方案制成了色、香、味俱佳的功能性饮品。 其中以异丙醇为溶剂，选择异丙醇浓度、浸提温度、浸提时间、浸提次数四个因素做单 因素实验，并通过响应面实验得出最佳提取工艺条件为：异丙醇浓度为7 5 ，浸提温度 为8 0 ( 2 ，浸提时间为1 5 r a i n ，浸提次数为2 次。将在此最佳条件下得到的浸提液用旋转 蒸发仅减压浓缩，然后根据主要成分的理化性质。采用转溶法、萃取法、色层法等分离 方法进行分离纯化，得到了初步纯化的茶绿素、茶黄素和茶红素产品；随后进一步采用 柱层析法、薄层层析法和纸层析法作迸一步的分离和鉴定。最后采用高效液相色谱法对 庐山云雾茶粗提取物及茶黄素进行了分离和分析，尤其对所提取的庐山云雾茶黄索进行 了较为详细的研究，分析认为该茶茶黄素中含有多种成分，其中有四种主要成分，分别 为茶黄素( t f ) 、茶黄素一3 没食子酸酯( t f m g ) 、茶黄素一3 - 没食子酸酯( t f m g ) 、 茶黄素一3 ，3 双没食子酸酯( t f d g ) 。另外本研究还对庐山云雾茶色素的理化性质诸如 热稳定性、光稳定性、对金属离子稳定性等性质进行了测定。通过对本课题的研究和生 产中的应用探讨，将对国内相关绿茶类深加工企业具有指导意义。 关键词：庐山云雾茶，色素，提取，纯化，应用 l i l 中国农业大学硕士学位论文 a b s t r a c t t h i sp a p e rm a i n l ys t u d i e do i ll n s h a ny u n w u c h a o o ft h et o pc h i n e s et e a s t h ea u t h o rs t u d i e d t h e e x t r a c t i n gt e c h n i q u e so ft e ap i 乎嘲i ，s e a r c h e da f t e rt h ei s o l a t i o na n dp u r i f y i n go ft h ec a u d e e x t r a c t i v e so f t e ap i g m e n ta n da n a l y m i $ o m cp h y s i c o c h e m i c a ip r o p e r t i e so ft h e s ec x t r a c t i v e s t h e n , t h e a u t h o rs t u d i e di t sa p p l i o i lm e d i c i n ea n df o o d , a n dg a i n e dt h eo p t i m u mt e c h n o l o g i c a lc o n d i t i o n s f i r s t ，u s i n gi s o p r o p a n o l ( c o n t a i n i n gs o m cw a t e r ) a s 帅c n s e l e c t i n ge t h a n o lc o n c e n t r a t i o n ， e x t r a c t i n gt e m p e r a t u r e , e x t r a c t i n gt i m ea n de x t r a c t i n g t i m e sa sm o n o - f a c t o r s , t h ea u t h o r sd i d m o n c l f a c t o re x p e r i m e n t s t h e n 姐t h eb a s i so ft h er e s p o n s es l n f a c em e t h o d , o b t a i n e dt h eo p t i m u m t e c h n o l o g i c u lc o n d i t i o n s ：t h ec o n c e n t r a t i o no fi s o p r o p a n o l7 5 o s o p r o p a n o lt o w a t e rv v ) , e x t r a c t i n gt e m p e r a t u r e8 0 ，e x t r a c t i n gt i m e1 5 m i na n de x t r a c t i n gt i m e s2 s e c o n d , 邺i n gr o t a t i o n e v a p o r a t o rc o n c e n t r a t e dt h ee x t r a c t i v eh q u i d sa n da p p l y i n gs e v e r a lo t h t e c h n i q u e si n c l u d i n g t r a n s - r e s o l v i n g , e x l r a c f i o n , c h r o m a t o g r a p h y , c i c 。t h ea u t h o ro b t a i n e ds o m er e l a t i v e l yp u r i f i e dp r o d u c t s o ft e ag r a e np i g m e n t ，t h e a f l a v l n sa n dt h e a r a b i g i n 1 h i r d ，u s i n gc o l u m nc h r o m a t o g r a p h y , t h i n - l a y e r c h m a t o 芦a p h y a n d p a p e rc h r o m a t o g r a p h y , t h e a u t h o rf u r t h e ri s o l a t e da n di d e n t i f i e dt h e p r o d u c t s l a s t l y , u s i n gh p l ca n dh p l c e s i - m s ，t h ea n t h o ns t u d i e dt h ec r u d ee x t r a c t i v eo ft e a p i g m e n ta n dt h e a f l a v i n s , e s p i c a l l yr e s e a r c h e dt h e a f l a v i n si n d e t a i lt h er e s u l ti n d i c a t e d t h a tt h e r eh a d m a n yc o n s t i t u e n t si nt h e a f l a v i n s 唧) ，t h e s f l a v i n - 3 - m o n o g a l l a t e ( t f m o ) ，t h e a f l a v i n - 3 - m o n o g a l l a t e f r f m g ) ，t h e a f l a v i n - 3 , 3 - d i g a l l a t eo f d g ) a r ef o u rm a i nc o n s t i t u e n l s i na d d i t i o n ，t h ea u t h o ra n a l y z e dt h e r m a ls t a b i l i t y , p h o t o s t a b i l i t y , m e t a li o ns t a b i l i t ya n da l s os t u d i e d s o m eo t h e rp h y s i c o c h e m i c a lp r o p e r t i e so ft e ap i g m e n t f i n a l l y , t h ea u t h o rs t u d i e dt h ea p p l l c a y i no ft h ep i g m e n to nm e d i c i n ea n df o o d ，a n da n a l y z e dt h e t e c h n o l o g i c a lc o n d i t i o n sa c c o r d i n gt ot h er e s e a c h i n gr e s u l t s k e yw o r d s ：l u s h a ny t m w u c m ，p i g m e n t ，e x t r a c t i o n ，p u r m c a t 女m , a p p l i c a t i o n i v 中国农业大学硕士学位论文 独创性声明 本人声明所呈交的论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成 果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发 表或撰写过的研究成果，也不包含为获得中国农业大学或其它教育机构的学位或证书 而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明 确的说明并表示了谢意。 研究生签名时间：& 肋多年夕, e l ，汐日 关于论文使用授权的说明 本人完全了解中国农业大学有关保留、使用学位论文的规定，即：学校有权保留 送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅，可以采用影印、缩印或扫描等复 制手段保存、汇编学位论文。同意中国农业大学可以用不同方式在不同媒体上发表、 传播学位论文的全部或部分内容。 ( 保密的学位论文在解密后应遵守此协议) 研究生签名 导师签名 f 新 嬲 时间：跏石年罗月8 日 时间：z 口形年矿月夕日 中国农业大学硕士学位论文 第一章前言 第一章前言 1 1 研究茶色素的目的和意义 茶叶是我国的传统饮品，资源相当丰富，尤其是近年来每年都有1 0 万多吨低档茶 积压滞销，另外我国每年在加工茶叶过程中形成的茶末、筋毛、梗朴等副产物有2 万吨 以上，再加上茶树更新和整枝修剪下来的树枝每年约有3 万多吨，以上均可作为茶色素 加工的原料【1 4 l ，极具开发优势本课题采用绿茶中的庐山云雾茶为试验对象，该茶属 于中国十大名茶之外的地方茶，产于江西省游览胜地庐山，并且低档的庐山云雾茶每年 有一定量的粗老茶。以这些低档茶为原料进行天然茶色素的提取研究，开发安全优质的 天然茶色素，为综合利用茶叶提出了一条新途径，以及至少超百亿元的市场前景，具有 重要的经济价值和社会效益州，并且据医学研究表明茶色素具有极高药用保健价值，对 心脑血管疾病患者的治疗和预防起到极其重要的作用。但由于目前茶色素纯化技术较 低，直接影响到茶色素的品质和功效。因此本实验主要是对庐山云雾茶中天然茶色素进 行提取纯化方法的研究，对不同提取纯化方法进行比较，寻求提取、纯化最理想的操作 条件。同时。对提取物进行分离纯化，探讨合理的分离纯化方法，并对提取物及分离纯 化后的一些试样的组成性质进行鉴定，该研究的开展具有较强的应用价值，对从事茶色 素生产企业的产品质量和经济效益有促进作用，以及为对庐山云雾茶的深度开发具有重 要意义。 1 2 茶色素的特性 1 2 1 茶色素的组成叫 茶色素是从茶叶中提取出来的以色素物质为主的一类混合物。茶色素分为水溶性色 素和脂溶性色素，水溶性色素主要是对茶汤有影响，而脂溶性色素主要对茶叶干茶色泽 及叶底色泽起作用0 0 - 1 3 1 茶叶中水溶性色素一般是指花青素、花黄素和多酚氧化产物( 茶黄素、茶红素、茶 褐素) 。它们都是类黄酮化合物，在茶叶中含量较多，约为1 一2 。具有c 似3 c 6 的基本骨架结构茶叶中已发现有几十种花黄素、花青素，是茶叶中水溶性色素的主体。 花青素l 。又名花色素，邸花色苷，在茶叶中含量约为0 5 一l ，是一种性质稳定的色 原烯衍生物茶叶中发现的花翠素( 飞燕草素) 、飞燕草甙、花自素、飞燕草花白素、 蔷薇药青素等均属于花青素；花黄素，主要包括黄酮醇和黄酮，它们均是色原酮的衍生 物。花黄素中的黄酮类化合物在茶叶中含量低，仅占干茶叶千重的0 0 2 ，但它们对茶 叶品质( 主要是汤色) 有着一定的影响；其它水溶性色素是除了原色素物质外，还有一 1 中国农业大学硕士学位论文第一章前言 些物质本无色( 如儿茶素、糖、维生素等) ，在加工过程中经过氧化缩合形成一些有色 的可溶于水的物质，特别是由于茶叶中含有大量的儿茶素，经氧化缩合后形成较多的茶 黄素和少量的茶红素及茶褐素 1 3 , x 5 i 。这些氧化缩合的产物与茶叶中原有的水溶性色素 物质一起构成了茶色素。我们将茶叶中存在的一些无色的化合物，经过加工发生化学 变化，生成有色物质，统称为色素原。色素原主要包括：( 1 ) 儿茶素类：儿茶素类为白 色泽，在茶叶中含量很高，达1 0 一2 5 ，几茶素氧化后生成橙黄的茶黄素( t h e a f l a v i n s ， 简称t f ) 和棕红色的茶红紊( t h e a r a b i g i n 简称t r ) ，也可进一步氧化缩合成褐色的 茶褐素( t h e a b r o w n i n ，简称t b ) ；( 2 ) 糖：茶叶加工过程中在无含氮化合物存在下， 糖类经过焦糖化作用，变成褐色的物质，影响茶叶汤色及外形色泽。( 3 ) 维生索c ：又 称抗坏血酸，白色结晶，茶叶中含量8 0 2 0 0 m g l o o g ，易氧化生成褐色物质 茶叶中含有大量的儿茶素类物质，在茶叶加工过程中，包括生茶叶的炒制及干茶叶 的浸提都要经受热的作用，大量的儿茶紊容易氧化，生成有色物质，主要生成相对较稳 定的茶黄素，其次还生成少量的茶红素和茶褐紊 1 6 - 1 s l 。茶黄素是由成对的儿茶素等经 氧化结合而形成1 1 只”j 七种常见的几茶素分别为儿茶素( c ) 、表儿茶素( e c ) 、没食子儿 茶素( g c ) 、表没食子儿茶素( e g c ) 、没食子儿茶素没食子酸酯( 6 c o ) 、表没食子儿茶素 没食子酸酯( e g c g ) 、表儿茶素没食子酸酯( e c g ) ，其结构式如图1 - 1 一图1 7 ，图中的g 表示没食子酰基没食子酰基的结构式如图1 - 8 圈卜l 儿茶素( c )圈1 2 寰儿蓑素( 即) 田1 - 3 缦食子儿茶囊o c )田1 - 4 囊没食于几茶素( e g c ) 田卜5 没食子儿茶素没食于酸( e c q )啊l o 囊没食于儿茶素没食子酸醢( e e c e ) 2 八 一硭 中国农业大学硕士学位论文第一章前言 田1 - 7 衰儿荼素澄食子麓蠢证o 町田 - 8 投量子t 羹c - g ) b 环上具有三个连位羟基的儿茶素，它们之间氧化后易聚合形成二苯基型二聚物， 但b 环上有二个邻位羟基与b 环上有三个连位羟基的几茶素共同存在时，氧化后b 环之 间易聚合形成二羟基苯骈卓酚酮结构，均为重要的生色团m l 。其氧化反应分别为吲： l e c + l e g c 一茶黄素( t h e a f l a v i n ，t f ) l - e c + l e g c g 一茶黄素一3 一没食子酸酯( t h e a f l a v i n 一3 一m o n o g a l l a t e ，t f m g ) l e c g + l e g c 一茶黄素一3 一没食子酸酯( t h e a f l a v i n 一3 一s o n o g a l l a t e ，t f m g ) l e c g + l e g c g 一茶黄素双没食子酸醋( t h e a f l a v i n 一3 ，3 一d i g a l l a t e ，t f d g ) l e c + d c 一异茶黄素( i s o t h e a f l a v i n ) d c + l e g c 一新茶黄素( n e o t h e a f l a v i n ) d c + l e g c g 一新茶黄素一3 一没食子酸酯( n e o t h e a f l 8 v i n 一3 一g a l l a t e ) d c + g a 一茶黄酸( t h e a f l a v i ca c i d ) l e c + 6 a 一表茶黄酸( e p i t h e a f l a v i ca c i d ) l e c g + g a 一表茶黄酸一3 一没食子酸酯( e p i t h e a f l a v i ca c i d 一3 一g a l l a t e ) 事实上茶黄素中主要有四种物质“，分别为茶黄素( t f ) ，茶黄素一3 一没食子酸 酯( t f g g ) 、茶黄素一3 一没食子酸酯( t f m g ) 和茶黄紊一3 ，3 一双没食子酸酯( t f d g ) 其结构式如图卜9 t f ：r 1 f r 2 f h t i a m g - r 1 = hr 2 = 没食子酰基 t f m g ：r l - 没食子酰基r 2 = h 1 阳i g ：r l = r 2 f f i 没食子酰基 田卜9 蓉黄曩结构式 另外茶黄素中还含有少量的表茶黄酸、表茶黄酸一3 一没食子酸酯、异茶黄素、新茶 黄素，茶黄酸、c a t e g a l l i n ，p y r o g a l l i n 等l “所有茶黄素的最大吸收峰都出现在3 8 0 n m 和4 6 0 r i m 处【“j 茶黄素分子中的苯骈卓酚酮基是重要的生色团茶黄素的水溶液呈橙色 亮黄，提纯后成结晶状粉末，色泽金黄。在水中重结晶得到橙黄色针状晶体，熔点2 3 7 - 2 4 0 ( 分解) 易溶于热水、醋酸乙醣、正丁醇、异丁基甲酮、甲醇等。呈很弱的酸性，颜 3 4 中国农业大学硕士学位论文第一章前言 色不为茶汤提取液的p h 值所影响在茶叶中茶黄素含量一般为0 3 - i 5 ，高可达1 7 以上，是茶汤的主要黄色色素，滋味颇辛辣，具有强烈的收敛性b ” 茶红素( ”l 主要由茶黄素进一步催化而成，主体是二聚物，是一类差异极大的异源性 物质，它既包括有儿茶素的酶促氧化而产生的化合物，又有儿茶素及其聚物与蛋白质、 氨基酸和糖类之间的非酶性催化作用的产物茶红素在3 6 0 3 8 0 n s 处有吸收峰茶红素 的分子结构中有两个羧基，因而显酸性茶红素的阴离子颜色比未离解的酸颜色深，因 此茶汤中若加入不同物质会使其颜色深度发生变化茶红素色棕红，是茶汤中红色物质 的主要成分，刺激性没有茶黄素强烈，收敛性较弱茶红素含量在红茶中较绿茶中高得 多，在红茶中含量一般为干物质总量的5 一1 1 ，而在绿茶中的含量一般只占干物质总 量的0 0 5 一1 4 茶褐素【2 “2 7 l 系非透析性高聚物，主要组份是多酚类、多糖、蛋白质和核酸等茶褐 素在分光光度分析中会随波长缩短而增大吸收，未出现吸收高峰非透析性多酚类随茶 汤发热而增加干燥过程中，因水热的作用会促使茶黄素和茶红素含量减少，而茶褐素 含量增加茶中茶褐素吉量0 4 一0 9 。 茶绿色寨为脂溶性茶绿色素。主要成分是叶绿素，还含有黄酮醇及其衍生物呈现 为黄绿色或墨绿色粉末，易溶于水和含水乙醇茶叶中的脂溶性色素主要有叶绿素和类 胡萝 素等i z s - 3 “茶叶中叶绿素含量一般为0 3 一0 8 ，主要由蓝绿色的叶绿素8 和 黄绿色的叶绿素b 组成，纯净的叶绿素a 是蓝黑色的粉末，熔点约为1 1 8 ，叶绿素a 的异丙醇溶剂溶液呈蓝绿色；纯净的叶绿素b 是深绿色粉末，熔点约为1 2 5 c ，它的异 丙醇溶剂溶液呈绿色或黄绿色i ”j 茶叶中的类胡萝b 素是一类黄色或橙色的物质，已经 发现和鉴定的有1 5 种左右，主要包括叶黄素和胡萝h 素类，叶黄素含量约为0 0 1 - 0 0 7 ，胡萝h 素含量约为0 0 2 一0 1 。这类色素对热较稳定，但因含有许多双健，因此 易被氧气和某些酶( 如脂肪氧化酶、过氧化酶) 所氧化而变褐色，尤其是在p h 和水分过 低时。更易被氧化0 0 1 2 2 茶色素的性质 1 3 , 1 4 , 2 5 l 茶叶色素是一类结构复杂、分子差异很大的异源性色素物质【3 ”b a i l e y r g 分离到茶 红素褐色高聚物。经红外光谱和核磁共振分析证明为多酚高聚物一没食子基儿茶素 聚合物，k u h r s 等报道，茶红素分子量为7 0 0 4 0 0 0 0 ，甚至更大些为探求茶叶色素分子量 分布状况，江西南昌大学吕虎等对所制得的茶色素进行了膜分离试验，证明茶色素中含m w i 0 万的酚性高聚物，经紫外光谱分析，高聚物主要为茶褐素。对婺源绿茶叶1 0 0 c 水 浸提液。茶色素氨基酸分析结果显示，茶色素中所有氨基酸含量均有所减少，8 种氨基酸未 检出有报告指出，将纯化红茶汤中非透析性色素进行缓和水解( 0 1 t o o l l , 8 0 ( 2 ，1 h ) ，从水 解液中检出丙氨酸、天冬氨酸、茶氨酸、谷氨酸等，提示茶叶中的某些氨基酸参与了茶 色素的形成。 4 中国农业大学硕士学位论文 第一章前言 茶汤显绿色、柠檬黄色或黄绿色，这是由水溶性色素黄烷醇类及其甙类和黄烷酮等 多酚类及其氧化产物综合表现的结果国外有资料认为：构成茶汤色的主体物质是黄酮 类，甚至提出黄酮类的含量夏茶比春茶少是夏茶汤色不如春茶的缘由绿茶中的黄酮醇 类物质至少有2 3 种，溶于水后显黄色，不稳定，见光易分解，氧化产物呈橙黄色或棕红， 使茶汤暗黄或泛红黄烷酮类易溶于水，显深黄绿色，是形成绿茶汤色的重要组分，黄 烷酮在绿茶加工过程中发生氧化聚合等变化，其产物部分溶于茶汤呈黄色或棕红，如果 在加工过程中操作不当，氧化程度加大，会使茶汤发暗泛红在强光和高温下生长的芽 叶花青素含量高，茶的芽叶呈紫红色，影响品质，尤其对绿茶的品质不利绿茶在加工 过程中，叶绿素水解生成叶绿酸，溶于水，显绿色，是组成茶汤的重要物质有人认为 在绿茶茶汤中还含有极微量的叶绿素，象油悬于水中一样，在一定程度中影响茶汤色泽 1 3 茶色素的典型应用 1 3 1 茶色素的功用 茶色素色泽艳丽、着色效果好、稳定性佳，同时茶色素租提取物中含有多种营养保 健物质，如儿茶素、v c 、v d ，v e 及氨基酸等，而且茶色素耐热、耐酸抗酶、能抑制微 生物的繁殖。是用于食品加工理想的色素来源，并对食品中的维生素有防降解的保护作 用1 3 3 1 。因此，茶色素可广泛用于食品、饮料、医药、化工、纺织等行业茶色素将是 继茶多酚、咖啡碱等茶叶生化产品后又一具有实用性、前途光明的产品而且，从茶叶 中提取出的茶基新产品一一茶色素，经过大规模的临床验证，并进入药品产业化，这对 促进茶叶的综合利用，推动我国茶叶的发展必将产生重大影响，其前景将十分广阔 3 4 - 3 s 1 茶色素还具有医疗保健功能据临床研究表明【3 ”，茶色素具有以下功能：1 能调节 血脂紊乱；2 能治疗高纤维蛋白原血症；3 对血液流变学与血液凝固性具有重要作用 茶色素可降低血粘度、血浆粘度与最大血小板聚集率，并有抗凝作用，故可作为防治急 性冠脉综合征与脑血管意外的有效药物；4 对甲襞微循环的作用，茶色素可改善微循环， 间接起到防治各种疾病的效果；5 对免疫功能的作用，茶色素有增强免疫力的作用，故可 作为恶性肿瘤放疗、化疗的辅助治疗；6 对血管内皮功能的作用，茶色素能扩张心脑血 管，降低血小板聚集，增加心脑供血，改善心脑缺血的临床症状事实上服用茶色素后， 病人的一般症状如头昏、头痛，胸闷、心悸、耳鸣、注意力不集中，构音不良、步态不 稳等均有不同程度的改善；7 对氧自由基的作用，茶色素可提高s o d ( 超氧化特歧化酶) 活力，降低m d a ( 二亚甲基双氧安非他明) 含量，从而可防止疾病的形成及防止病情进 一步发展总之。茶色素对预防和治疗心脑血管疾病、恶性肿瘤、糠尿病、肾病综合症、 脂肪肝、高原性肺心病、老年性痴呆症等都具有怠好作用基于茶色素具有重要的保健 功能，茶色素，尤其是从绿茶中提取的茶黄素、茶绿素和从红茶中提取的茶黄素、茶红 5 中国农业大学硕士学位论文第一章前言 素和茶褐素已趋向药用型【”1 1 3 2 茶色素在医药中的应用 当前。癌症、心脑血管疾病和糖尿病是当今危害人类健康的三大主要疾病，也是发 达和发展中国家共同的主要死亡原因据世界卫生组织( w h o ) 公布的材料，全世界每年 大约有1 2 0 0 万人死于心脏病，占整个死亡率的2 5 心血管病，特别是冠心病，是经 济发达国家的首要死亡原因，占总死亡率的4 0 一5 0 在中国，近2 0 年来，心血管疾 病明显增多，而脑中风已位列我国十大主要死因的首位。肿瘤是危害人类健康的另一大 杀手，每年有数百万人死于肿瘤。据美国肿瘤协会统计，1 9 8 8 年美国的肿瘤患者有9 8 5 万人，死亡人数高达4 9 4 万人。据不完全统计，我国现有癌症患者1 5 0 万人以上，每年 新发现肿瘤患者近百万人鉴于心脑血管疾病和肿瘤严重威胁着人类的生命健康，许多 国家和我国将其列为重要课题进行研究 桩床使用茶色素对冠心痛、高血压及高脂血症进行治疗，可以明显降低高低切变率、 全血牯度与血浆粘度，改善心，脑、肾微循环异常、组织灌流及器官功能，并且茶色素 能改善血脂、降低纤维蛋白原、抗凝、溶纤、清除氧自由基、改善血管内皮功能，故可 用于预防、治疗冠心病、防止急性冠脉综合症( 不稳定心绞痛、急性心梗猝死) 的发生， 预期可减少发病率与死亡率 1 3 2 1 产品形式 在医药工业上，从低档茶及其茶副产品中提炼天然茶色素等作为制药原料，生产的 产品以茶色素胶囊类为主，目前已被广泛用于癌症，心血管病、糖尿病、龋齿、消化系 统疾病的预防和治疗 3 2 2 茶色素制药的独特优势 从绿茶中提得的茶色素是植物性天然色素，是茶叶中以儿茶素为主的多元酚类物质 经过化学结构的转化而成的水溶性色素。药用茶色素为茶叶中多元酚类及其衍生物的混 合物主要成分为茶黄素、茶绿素、茶红素和茶褐素茶色素不同于一般药品，它不单 纯作用于机体的特定组织器官，而是调整机体的机能、代谢平衡，从而改善机体的机能 状态，保持和恢复人体健康主要通过降血脂、改善微循环、消除自由基、调节免疫功 能等调动人体自身潜力，扶正祛邪，影响疾病的基本病理过程而促进健康，起到即治标 又治本的作用。提高机体健康水平茶色素胶囊既能防治疾病，又能益寿强身，其关键 之处还在于久用无毒副作用，所以可广泛使用于人群的医疗保健 6 中国农业大学硕士学位论文 第一章前言 1 3 3 茶色素在食品中的应用 茶色素在食品中的应用研究早在4 0 年前已经开始，作为较好的食品着色剂及良好的 抗氧化性放应用在食品生产中由于茶色素的色泽艳丽，以及富含维生素、氮基酸和其 它营养物质，并且着色稳定性好、纯天然、无毒无副作用，越来越受到食品加工者和消 费者的亲睐。目前已广泛应用于面包、蛋糕、饼干、果冻、果酱，冰激淋、火腿、色拉 油的、口香糖、饮料等的产品中，既赋予产品亮丽的颜色，又增强了营养保健功能，同 时也延长了产品的货架期 1 4 国内外研究茶色素的现状 目前，茶色素的研究国内外以红茶中提取的色素较多，而对绿茶研究较少自1 9 5 7 年r o b e r t s e a h 最早从红茶中发现茶黄素【“l ，并在1 9 6 1 年r o b e r t s 等人又提出了茶黄 素的分析方法”“j ，将茶黄素溶液在3 8 0 n m 和4 6 0 n m 波长下用分光光度计比色测定， 由于其方法简单、试剂价格便宜，并同时可以测定茶红素的含量，国内外的许多国家多 采用此方法，但该方法也存在一些缺点，如重复性差、测定含量值偏低等之后 c a s s o n l “，布库恰瓦1 4 6 1 u l a h m r t 7 l 对r o b e r t s 分析法进行改良，使测定的可靠性的 高了提高但是，1 9 9 9 年夏涛、高丽萍【，1 借助h p l c 对r o b e r t s 法进行了分析，对茶黄 素含量测定值的准确性提出质疑 而1 9 7 3 年h i t o n 提出了另一种快速测定法【“，该法根据茶黄紊分子中的苯并卓酚酮 可与f l a v o g n o s t 试剂( 二苯基硼酸2 氨基乙醇) 产生特异性反应，生成绿色络合物，测 定其吸光度换算成茶黄素的含量，这种方法具有更好的再现性，被推荐为国际红茶最低 质量标准检测方法。但由于f l a v o g n o s t 试剂很难买到，l i k o l e c b e - n k h o m a 等人于1 9 8 8 年 提出了用a i c l 3 代替f l a v o g n o s t 试剂的方法1 。】，其结果与f l a v o g n o s t 方法相近 同样，1 9 7 3 年竹尾忠一【”】提出了s e p h a d e xl i - i 2 0 柱层析法，洗脱得到的色谱峰图 用求积仪测峰面积可得相对含量，该法能有效地分离茶黄素，提高了分析的精确度，但 操作复杂，而且s c p h a d e xl h 2 0 在市场上很难买到。 1 9 9 1 年b a i l e y r g 等舯i 使用光电二极管阵列检测器的反相h p l c 研究红茶浸出物的 性质，四种茶黄素能够得到分离纯化由此提出了i - i p l c 法测定茶黄紊主要组分及其它 物质的方法，该法更精确，并能使各茶黄素单体得到较理想的分离，但该法需要高纯度 的茶黄素标样1 9 9 2 年w h i t e h e a d 等p l l 利用色素极性大小差异，提出了一种快速的茶黄 素总量测定方法，该法更快捷，适于实验室和工厂化的常规检测，但此法不能将茶黄素 有效分离，测定值偏高2 0 0 0 年b e e 1 a n l e e 等t ”l 首次法采用毛细管电泳测定儿茶素类化 合物和茶黄素类化合物，该法的灵敏度稍差，但分析速度快2 0 0 0 年、2 0 0 2 年江和源等 【5 ”1 采用高速逆流色谱法分离纯化茶黄素，取得一定的成功，但此法尚未成熟，还需进 一步探讨。 7 中国农业大学硕士学位论文 第一章前言 茶红素的结构和特性比茶黄素复杂得多，而且缺乏分离与纯化的最有效的方法和技 术，仅作一类较复杂的化合物的混合物加以分离【”1 r o b e r t s ( 1 9 6 2 年妒6 l 指出茶红素是 酸性的褐色色素，是由茶黄素氧化而成的；b r o w nc ta 1 ( 1 9 6 9 年) 【”】认为茶红素是花青素 先质的聚合物。在分析方法上，r o b e r t se ta l 最早用h p l c 法分离了茶红素，并把茶红素 分成溶于乙酸乙酯的si 和洛于丁醇的s l i 【2 9 s a - 6 e l ；b a i l e yr g 等( 1 9 9 0 ，1 9 9 1 ，1 9 9 2 年) 对 红茶茶汤也进行了反相h p l c 分析，但未能获得高质量的色谱图 6 1 - 6 3 j 1 a nm c d o w e l l 等 ( 1 9 9 0 年) 用配有光电二极管矩阵检测器的h p l c 测得茶红索在水相中3 8 0 r i m 处的吸收， 黄酮甙占7 2 ，茶黄素占5 ，茶红紊占2 3 s , t - ”】 国内外对绿茶的茶色素的研究少之又少，据资料显示：静刚等( 1 9 6 7 ，1 9 7 0 年) 用纸层 析和用纤维素粉层析柱及2 的乙酸为洗脱剂分离了绿茶茶汤中2 1 种色素，鉴定出1 9 种属于黄酮烷色素；津志田藤二郎等在1 9 8 7 年利用葡聚糖凝胶l h 2 0 柱，聚乙烯毗咯烷 酮f p v p ) 柱及高效液相色谱再次分离和鉴定了绿茶中的黄酮醇类物质，已查明1 1 种黄酮 醇，分离出了4 种主要黄酮醇，并鉴定其中两种为山奈酚3 鼠李糖甙，互为异构体，另 两种为槲皮素3 鼠李糖甙，也是互为异构体 长期以来，虽然国内、外学者对茶色素的形成机制，组分、结构、色谱和光谱进行 了大量研究，我国安徽农业大学在实验室里从低档茶和茶末、茶灰中制备了系列茶色素， 包括茶黄色素、茶绿色素、茶橙色素、茶红色素和茶褐色素等p “，但迄今茶色素的组分、 化学结构仍不十分清楚 6 6 1 , 有待进一步探索 1 5 研究内容和方法 本课题采用绿茶中的庐山云雾茶为试验对象，通过对该茶特性的研究，提出庐山云 雾茶中天然茶色素的最佳提取方法。首先，采用单因素实验和分析探求庐山云雾茶色素 的提取工艺。确定最佳工艺；将在此最佳条件下得到的浸提液用旋转蒸发仪减压浓缩， 然后根据主要成分的理化性质，采用转溶法、萃取法、色层法等分离方法进行分离纯化， 得到了初步纯化的茶绿素茶黄素和茶红素产品；随后进一步采用柱层析法、簿层层析 法和纸层析法作进一步的分离和鉴定最后采用高效液相色谱法对庐山云雾茶租提取物 及茶黄素进行了分离和分析，尤其对所提取的庐山云雾茶黄素进行了较为详细的研究 其次，对提取物及分离纯化后的一些试样的组成性质进行鉴定最后，对茶色素的典型 应用进行探讨和研究，并对庐山云雾茶色素在酸乳饮料中的应用工艺作出分析 8 中国农业大学硕士学位论文 第二章庐山云雾茶叶色素的提取 第二章庐山云雾茶色素的提取 2 1 茶色素的标样光谱特性 2 1 1 试验原料 庐山云雾茶江西庐山产 2 ，1 2 试验方法 2 ，2 1 试验试剂 茶黄素标样色谱纯s i 伽公司 茶绿紊标样 色谱纯s i “公司 乙腈色谱纯f i s h e r 公司 三氟乙酸色谱纯北京化工厂 本实验中应用的其它试翔：异丙酵，乙醇、丙酮、石油醚、乙酸乙酯，乙酸铜、4 一 甲基一戊酮( i b 腿) 、层析氧化铝( 中性) 、氯仿、氢氧化钙、无水硫酸钠、t r i s i t c l ，碳 酸氢钠、甲醇、碱式乙酸铅、酒石酸亚铁、磷酸二氢钠、磷酸氢二钠、水合茚三酮，氯 化亚锡、氯化锌、氯化镁、氯化铜、氯化错、氯化铁等试剂，均为分析纯 2 1 2 2 主要实验仪器 l c 1 0 a t 高效液相色谱仪 t u 1 8 0 0 p c 紫外可见分光光度计 t d l - 4 0 c 低速离心机 l a b o r 0 1 a 4 0 0 0 旋转蒸发仪 z 1 0 8 2 a 型真空干燥机 b s 2 0 0 s 电子天平 p h 1 0 型精密p h 计 层析柱f f 2 0 m m x 3 0 0 r a m ) f z l 0 2 植物粉碎机 日本岛津公司 北京普析通用仪器有限责任公司 上海安亭科学仪器厂 德国h e i d o l p h 公司 上海市实验仪器厂 北京塞多利斯天平有限公司 北京塞多利斯天平有限公司 上海市实验仪器厂 河北省黄骅市齐空务科学仪器厂 2 1 2 3 检测方法 ( 1 ) 茶黄素标样的光谱特性 样品的配制：称取茶绿素标样0 1 克，以8 0 的异丙醇溶剂为溶剂定容至1 0 0 a l ，配成 0 1 的标准样品溶液备用。 光谱特性的测定：以8 0 5 的异丙醇溶剂溶液为空白对照液，用t u - 1 8 0 0 紫外可见分光光 9 中国农业大学硕士学位论文 第= 章庐山云雾茶叶色素的提取 度计分别测定其光谱特性 ( 2 ) 茶黄素标样的光谱特性 样品的配翻：称取茶黄素标样0 1 克，以8 0 的异丙醇溶剂为溶剂定容至l o o n l ，配成 0 1 的标准样品溶液备用 光谱特性的测定：以8 0 的异丙醇溶剂溶液为空白对照液，用t u 一1 8 0 0 p c 紫外可见分光 光度计分别测定其光谱特性 2 1 3 结果与讨论 2 1 3 1 荼绿素标样的光谱特性 ，一，一 、 、 -_h 。 田2 1 蓉绿蠢的瑷收光谱曲线 h 乒n 2 d 却群咖- v k - 0 1 h g 憎p _ 由图2 - 1 可以看出茶绿素标样在4 3 8 n m 和6 6 3 n m 处有吸收峰，我们选择4 3 8 n n 处的 吸光度作为判断茶绿素含量的的指标 2 1 3 2 茶黄素标样的光谱特性 田2 _ 2 茶黄蠢的段收光谱曲线 f f 啊a e 2 - 2 却h 酗d r b m 岫 由图2 - 2 可以看出茶黄素标样在4 6 8 n m 处有特定吸收峰，我们选择4 6 8 n n 处的吸光 度作为判断茶黄素含量的指标 1 0 “ 一 中国农业大学硕士学位论文第二章庐山云雾茶叶色素的提取 2 2单提取因素对庐山云雾茶色素的影响 2 2 样品制备 2 2 1 1 庐山云雾茶茶取样咿嘲 按照g b t 8 3 0 2 2 0 0 2 茶取样的规定取样，密封保存 按照g b t 8 3 0 3 2 0 0 2 茶磨碎试样的制备及其干物质含量测定的规定，将茶样 磨碎，过4 0 目筛，密封保存 2 2 1 2 庐山云雾茶色素的提取 将茶预处理后，以不同浓度的异丙醇溶剂为溶剂在不同温度、不同浸提时间、不同 浸提次数等因素下进行浸提，过滤所得浸提液，再进行减压浓缩，经真空干燥至衡重， 称量并计算总提取率然后将干燥至恒重的样品溶解，用紫外可见分光光度计测定4 3 8 n s 和4 6 8 n m 处的吸光值。再以单因素实验结果为基础，采用响应面设计软件设计实验方案， 按实验方案这完成实验，分析实验结果并确定最佳提取的工艺条件。 2 2 1 3 庐山云雾茶色素提取工艺流程“”“1 通过实验和文献查阅，实验采用异丙醇为主的溶剂 茶叶一取样一磨碎( 过4 0 目筛) 一溶剂浸提一过滤一滤渣一加溶剂二次 浸提一过滤一合并滤液一减压浓缩一真空干燥至恒重一称量 2 2 2 异丙醇溶剂浓度对提取率的影响 2 2 2 1 试验方法 称取茶叶样品l o g ，加入浓度分别为0 、2 0 、4 0 5 、6 0 、7 0 、8 0 、1 0 0 的异丙醇 溶剂溶剂l o o m l ，常温下浸泡3 0 m i n ，再在8 0 恒温水浴浸提1 5 m i n ，过滤，渣渣再用l o o m l 同样浓度的异丙醇溶剂溶剂在8 0 恒温水浴中浸提1 5 m i n 过滤。合并两次滤液，采用 旋转蒸发仪在8 0 恒温水浴下减压浓缩至呈膏状，然后转至蒸发皿中，于4 0 卞真空干 燥至恒重，称量并计算得率，分析异丙醇溶剂浓度对总提取率的影响将干燥至恒重的 样品用8 0 的异丙醇溶剂溶解，以8 0 的异丙醇溶剂作为空白对照液，采用紫外可见分光 光度计测定4 3 8 n e 和4 6 8 r t s 处的吸光值每组试验重复三次，取平均值 2 2 2 2 结果与讨论 异丙醇溶剂浓度对茶色素提取的影响，所得结果如表2 - 1 所示； 1 1 中国农业大学硕士学位论文 第二章庐山云雾茶叶色素的提取 罂坐丝塑塑曼凼型磐型塑磐磐竺墼堂! 竺! 璺篁! 塑! 竺蔓! ! ! e ：1 2 1 1 1 1 苎熙溶剂浓度( s oo ( 纯水) 2 04 06 07 0 8 01 0 0 茶色素髋率“) 蔬1 6 删麓珈嘶冀垃柏微叮黝螂伽蹦1 眺嘴 僻曲o ? 州s , m e q d 铆m 砌时 茶色素吸光度( 1 a 4 3 8 9 m 2 7 7 - 蜘t 63 l 7 蛆7 显锄5s t j 瞳f l o 1 2 5 9 咀3 场8 自叮2 1 7 3 s 0 5 1 0 0 0 t e a 脚, , o , o 4 6 8 i ml 盯触sl 铝删们蝴左舢墨加邺 2 n 5 9 a 1 3 珥钉蛇 不同异丙醇溶剂浓度下茶色素的提取率变化图如2 3 所示： 术 将 甾 篓 + 茶绿蠢吸光度 + 一茶黄素吸光度 0 2 04 06 07 08 01 0 0 。4 异丙醇溶剂浓度( ) 总提取宰 圈2 3异丙醇藩荆浓度对提取率的髟 ，l _ _ 弹2 d _ 吐0 p _ m a 矗删嵋h _ t 瞳啪- d e r 棚面删州嘲叫n 岫0 - n p 岫 由图2 - 3 可看出，异丙醇溶剂浓度对提取率的影响较大，提取率随着异丙醇溶剂浓 度的提高先升后降，在异丙醇溶剂浓度7 0 左右提取率较高，而茶绿素的提取率随异丙 醇溶剂浓度的增大而提高，茶黄素的提取率随异丙醇溶剂浓度的提高先升后降，在异丙 醇溶剂浓度7 0 左右提取率较高综合考虑，在响应面设计时选定异丙醇溶剂浓度的范 围为6 0 ，8 0 。 2 2 3 浸提温度对提取率的影响 2 2 3 1 试验方法 称取茶叶样品l o g ，加入浓度为8 0 的异丙醇溶剂溶剂l o o m l ，常温下浸泡3 0 m i n ， 再分别在2 0 c 、4 0 c ，6 0 、8 0 c 、1 0 0 c 温度下恒温水浴浸提1 5 m i n ，过滤，滤渣再用 l o o m l 浓度为8 0 的异丙醇溶剂溶剂在各自的温度中恒温水浴浸提1 5 m i n ，过滤，合并两 次滤液，采用旋转蒸发仪在各自温度的恒温水浴下减压浓缩至呈膏状，然后转至蒸发皿 中，于4 0 下真空干燥至恒重，称量并计算得率，分析浸提温度对总提取率的影响将 干燥至恒重的样品用8 0 的异丙醇溶剂溶解，以8 0 的异丙醇溶剂作为空白对照液，采用 紫外可见分光光度计测定4 3 8 n m 和4 6 8 n m 处的吸光值每组试验重复三次，取平均值 2 2 3 2 结果与讨论 惦柏为侣 中国农业