（食品科学专业论文）应用PEF杀菌的冷藏绿茶饮料新工艺研究.pdf

江南人学硕士论文 摘要 传统的热灭菌在对绿茶饮料杀菌的同时，也对绿茶饮料的品质产生了许多不利影 响。例如，热灭菌会导致茶饮料的颜色加深、产生蒸煮味、热敏性物质损失等，也因此 导致了纯绿茶饮料发展的滞后。本文探讨了应用高压脉冲电场灭菌的冷藏绿茶饮料的新 型生产工艺，并重点研究了高压脉冲电场的杀菌效果和对茶汤中主要成分的影响。 首先研究了绿茶茶汤的提取工艺和稳定方法。研究结果表明，浸提的温度和时问均 对茶汤的色泽、茶多酚含量有较大的影响，茶多酚浸出量随着温度和时间的延长而直线 上升，而氨基酸基本无变化。最终确定浸提条件为温度4 5 。c ，时间2 0 r a i n ，茶水比1 1 0 0 。 z n c t 2 、v c 、p c d 和p h 值对茶汤的色泽影响显著，添加0 4 9 l 的v c 、0 4 l 的p c d 、 3 m g l 的z n c l 2 和调整p n 值为6 0 左右，可使茶汤保持较好的色泽。经过对茶汤挥发性 物质的分析，发现添加0 4 l p c d 具有很好的香气物质包埋作用，其对挥发性物质保 护作用可使挥发性物质总量比对照增加1 8 4 0 。 研究了电场强度分别为1 8 1 、2 7 4 和3 8 4k v c m 及处理时间为4 0 、8 0 、1 2 0 和1 6 0 、 2 0 0 a s 的高压脉冲电场处理对绿茶饮料的杀菌效果，结果表明，杀菌效果与电场强度和 处理时间有关，随着电场强度和处理时间的增加，杀菌效果提高。p e f 处理对于杀灭绿 茶饮料中的大肠杆菌和金黄色葡萄球菌非常有效，当电场强度为3 8 4 k v c m ，处理时间 1 6 0 1 _ t s 和2 0 0 9 s 时，p e f 处理分别可达到大肠杆菌5 6 个l g 和会黄色葡萄球菌4 9 个l g 的杀灭量。 通过分析p e f 处理前后绿茶饮料的多项理化指标的变化，发现p e f 处理对绿茶饮 料中的茶多酚、氨基酸几乎没有影响，处理后绿茶饮料基本保持了原有色泽和风味。实 验发现，p e f 处理与低温结合，加上茶多酚本身的抑菌作用，可有效地使未完全灭活的 菌体进一步失活，得到的绿茶饮料在4 。c 冷藏6 个月后，品质没有发生明显变化。经过 以上工艺生产出的绿茶茶汤，不仅清亮透明，且汤色黄绿、稳定，香气持久，具有较好 的消费接受性。 关键词：绿茶饮料，高压脉冲电场，茶多酚 江南人学硕士论文 a b s t r a c t t h et r a d i t i o n a lt h e r m a lp a s t e u r i z a t i o np r o c e s s e sa r ee f l b c t i v eo ns t e r i l i z a t i o no f t h eg r e e n t e ae x t r a c t h o w e v e r , t h e y 晰n ga b o u tm a n ya d v e r s ee f f e c t s f o re x a m p l e ，t h e ym a yd a r k e n t h ec o l o ro ft h et e ae x t r a c t ，c a u s et h eu n d e s i r a b l ec o o k i n gf l a v o r ，a n dd e s t r o ys e n s i t i v e c o m p o n e n t s ，e t c t h el o s so fs e n s o r yq u a l i t i e s ( c o l o r ，t l a v o ra n dt a s t e ) d u r i n gh e a tp r o c e s s i n g ， e s p e c i a l l yt h es t e r i l i z a t i o n ，h a sr e t a r d e dt h ed e v e l o p m e n to f g r e e nt e ab e v e r a g e ， t h ep r o c e s s e sf o re x t r a c t i n gg r e e nt e aa n ds t a b i l i z i n gt h ee a t r a c t sw e r ei n v e s t i g a t e d t h e r e s u l t ss h o w e dt h a tt h et i m ea n dt e m p e r a t u r eo fe x t r a c t i o nh a ds i g n i f i c a n te f f e c t so nt h ec o l o r a n dc o n c e n t r a t i o no ft e ap o l y p h e n o l s g r e e nt e al e a v e sw e r ea s c e r t a i n e dt os t e e pi nw a t e ra t 4 5o cf o r2 0m i n u t e s ，w i t hat e a w a t e rr a t i oo f1 1 0 0 ( w w ) z n c l 2 ，v c ，p - c da n dp hv a l u e h a ds i g n i f i c a n te f f e c t so nt h ec o l o ro fg r e e nt e ae x t r a c t a d d i n g0 4 9 lv c ，0 4 9 ld c d ， 3 m g lz n c l 2a n da d j u s t i n gt h ep hv a l u et o6 0c o u l dm a k et h ee x t r a c tk e p ti nc l e a r , g r e e n i s h - y e l l o wc o l o r i ti sa l s oo b s e r v e dt h a ta d d i n g0 4 9 r cb - c dw a sa b l et oa v o i dt h el o s t o ff l a v o rc o m p o n e n t sd u r i n gt h ep r o c e s s i n g t h et o t a lf l a v o rs u b s t a n c e so ft h e0 一c d a d d e d f o 4 9 l ) t e ae x t r a c ti n c r e a s e d1 8 4 0 c o m p a r e dt ot h e “n o n - p c d ”o n e e f f e c t so fp e ft r e a t m e n to nt h ei n a c t i v a t i o no f kc e l la n d a u r e u si ng r e e nt e ab e v e r a g e a n de f f e c t so f p e fo nt h ec o l o r ，g r e e nt e ap o l y p h e n o l sa n dt o t a lf r e ea m i n oa c i d sw e r e i n v e s t i g a t e d t h ei n o c u l a t e ds a m p l e sw e r et r e a t e du s i n gab e n c h s c a l ep e fs y s t e mw i t l l e l e c t r i c f i e l ds t r e n g t h so f l 8 1 ，2 7 4 ，a n d3 8 4 k v c m a n d t o t a l t r e a t m e n t t i m e so f 4 0 ，8 0 ，1 2 0 ， 16 0a n d2 0 0 斗s t h ei n a c t i v a t i o no f e c o l ia n dsa u r e u sb yt h ep e ft r e a t m e n ta t3 8 4k v c m f o r1 6 0i x sa n d2 0 0 9 sr e a c h e di n5 6a n d4 9l o gr e d u c t i o n ，r e s p e c t i v e l y i nt h i sc o n t e x t ，p e f h a sa p r o m i s i n gf u t u r ei ns t e r i l i z a t i o no f g r e e nt e ab e v e r a g e p e fp r o c e s s i n gd i d n tc a u s es i g n i f i c a n tc h a n g e si nc o l o r ，c o n t e n to fg r e e nt e a p o l y p h e n o l sa n dt o t a lf r e ea m i n oa c i d s t h er e s u l t so fs t o r a g ee x p e r i m e n ts h o w e d t h a t s y n e r g i s t i ce f f e c to f p e fa n dl o wt e m p e r a t u r es t o r a g ea n dt h ee f f e c to f a n t i m i c r o b i a lo f t e a p o l y p h e n o l sm a d e as i g n i f i c a n td e c r e a s eo np e ft r e a t e dc e l l s ，a n db r o u g h tt h et e ab e v e r a g ea s t a b i l i t yi ns t o r a g em o r et h a n 6m o n t h si n4o c k e yw o r d s ：g r e e nt e ab e v e r a g e ，p u l s e de l e c t r i cf i e l d s ，t e ap o l y p h e n o l s 独创性声明 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工 作及取得的研究成果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地 方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含 本人为获得江南大学或其它教育机构的学位或证书而使用过的材料。 与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明 确的说明并表示谢意。 签名：至盏日期：抄m 年夕月，口e l 关于论文使用授权的说明 本学位论文作者完全了解江南大学有关保留、使用学位论文的规 定：江南大学有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和 磁盘，允许论文被查阅和借阅，可以将学位论文的全部或部分内容编 入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、 汇编学位论文，并且本人电子文档的内容和纸质论文的内容相一致。 保密的学位论文在解密后也遵守此规定。 签名：互薹。 导师签名：燃1 日期：伽年7 月，。日 第一章绪论 第一章绪论 1 1 绿茶中的主要成分及其功能 茶是世界上最普遍饮用的饮料之一， 程度可分为红茶、乌龙茶、绿茶三大类， 龙茶为半发酵茶，而绿茶为不发酵茶。 尤其在亚洲。在商品茶叶中，茶叶根据其发酵 红茶是经过完全加工或完全发酵处理而成，乌 茶叶含有丰富的生物活性物质，到目前茶叶内己被鉴定出来的化学成分有5 0 0 多种， 这些物质对人体的药理功能是茶叶作为人类重要饮料的决定因素。在1 9 9 1 年日本召开 的“国际茶叶研讨会”上，与会专家一致认为绿茶的营养价值及其药理作用高于任何一 种茶叶，绿茶较之红茶和乌龙茶等具有更为特殊的保健作用，在清除自由基和抗衰老方 面有着明显功效j 。 绿茶的营养成分众多：主要有茶多酚、氨基酸、维生素、矿物质、碳水化合物、蛋 白质、脂肪等。氨基酸的总量多于其他茶类，到目前为止，绿茶中已测的有维生素1 0 余种，其中含量最多的为维生素c ，每1 0 0 克茶叶中含有1 0 0 1 5 0 毫克，优质绿茶大多 在2 0 0 毫克以上，其含量比等量的柠檬、菠萝、苹果、番茄、桔子等水果还多，医学界 认为，成人每天对维生素c 的需要量为6 0 毫克左右，这样，在正常饮食情况下，每天 饮茶3 - 4 杯，基本上可以满足人体对维生素c 的需求【2 j 。 绿茶中还含有几十种矿物质元素。钾的含量最高，相当于紫菜和海带的含量水平。 钾是细胞中的主要阳离子，对细胞的新陈代谢有着重要作用。绿茶中的硒的含量也较高， 能刺激免疫蛋白和抗体的产生，增强人体对疾病的抵抗力，并对治疗冠心病有效，还能 抑制癌细胞的发生和发展 2 1 。 据测定，绿茶中含糖量为1 0 0 , - 1 2 5 。其中，有葡萄糖、果糖等单糖；有蔗糖、麦 芽糖等双糖；也有淀粉、纤维素等多糖，但这些糖分中，能溶解于茶汤的仅占4 0 , - 5 2 1 ， 因此，绿茶属于低热量饮料，适合糖尿病及忌糖患者饮用。 绿茶中的咖啡碱一般含量在2 - 4 ，其作用一是兴奋中枢神经，消除睡意，清醒头 脑，提高思维能力，提高效率；二是利尿、消浮肿，尤其在炎热天，饮茶有利于稳定体 温，促进人体健康，是治疗人体机能失调的好方法；三是强心、扩张血管，使人体脉压 增高，血流增速，进行有效循环；四是帮助消化，增进食欲；五是解毒，净化消化器官， 排除多余的残留物【l l 。 绿茶中含有大量的茶多酚，茶多酚又称茶单宁、茶鞣质，是茶叶中所含的一类多羟 基类化合物的总称，约占绿茶干重的1 0 2 5 。其主要成分为黄烷醇类、黄酮类、黄酮 江南大学硕士论文 醇类、花青素类、酚酸、缩酚酸类及聚合酚类等。其中儿茶素为茶多酚的主体成分，约 占茶多酚总量的6 5 - 8 0 t 3 , 4 1 。茶多酚具有抗氧化( 直接清除活性氧自由基、抑制脂质 过氧化反应、整合金属离子、激活细胞内抗氧化防御系统) ，抗肿瘤，抗菌，抗病毒以 及延缓衰老等等功能1 5 | 7 j 。 随着生活节奏的加快，传统的冲泡及慢饮细品的饮茶方式已经不能适应现代生活的 需要，发展方便、健康的绿茶茶饮料是大势所趋。绿茶饮料将成为国际市场增长快，发 展潜力大的饮料产品之一。 1 2 国内外茶饮料的发展及消费状况 茶饮料是以茶叶浸提液或其浓缩汁、速溶茶粉为原料加工而成的液态饮料。茶饮料 于1 9 7 2 年最早出现于美国，近年来风靡于日本和我国台湾地区，以2 0 世纪8 0 年代日 本成功开发出罐装乌龙茶水为标志，茶饮料行业步入快速发展的轨道，日本是目前茶饮 料最大生产国1 8 j 。 红茶、乌龙茶、绿茶这三类茶的罐装饮料以其天然、保健、方便等优点适应了当今 社会日益加快的生活节奏，在饮料行业中异军突起，尤其在国际市场上表现更为突出， 已逐步成为一些国家和地区人们日常生活中的主要饮料之一。1 9 9 7 年，日本茶饮料销售 量为3 7 9 4 万吨，7 5 亿瓶( 罐) ，销售额7 4 0 0 亿日元，其中绿茶饮料占2 3 。2 0 0 1 年 日本绿茶饮料的市场增长率达2 0 3 0 ，2 0 0 4 年市场规模达到了9 0 0 0 亿日元1 9 1 。台 湾1 9 9 9 年茶饮料的销售额为2 2 6 亿新台币，超过了可口可乐的销售额，居各类饮料之 榜首嘲。 我国内地在即饮茶饮料方面起步较晚，目前规模生产厂家为数不多。我国内地从7 0 年代末开始，对茶叶的深加工和开发新产品开展了一系列研究，各种茶饮料相继而出， 如中国农科院茶叶研究所的茶可乐、广东的柠檬茶、牛奶茶，福建的乌龙茶浓缩汁、湖 南的山楂茶、猕猴桃茶等。但是茶饮料的真正发展起步于二十世纪八十年代初的碳酸型 含茶饮料，经过一番波折后，于九十年代才得以再次发展；目前，国内已经有5 0 余家 公司生产茶饮料，1 9 9 2 年茶饮料产量不足2 0 万吨，1 9 9 8 年达4 4 万吨，2 0 0 0 年达1 8 5 万吨，茶饮料产值己占当前我国茶叶总产值的1 3 【8 】。从2 0 0 1 年开始，包括娃哈哈、可 口可乐等国内外饮料巨头继康师傅和统一之后相继进入茶饮料行业，极大推动了国内茶 饮料的发展，2 0 0 5 年茶饮料总产量达到了3 0 1 1 8 万吨。2 0 0 4 年，中国饮料1 0 强企业各 种饮料产销量中，茶饮料只占总量的5 不到。即使按1 0 公斤的人均消费量计，国内茶 饮料市场容纳量约为1 2 0 0 万吨，产值在4 0 0 亿元左右，巨大的市场空间吸引各大饮料 厂商不断加入茶饮料生产行业，生产规模不断扩大。 现今国内茶饮料的主要品种为两大类，一是低糖绿茶茶汤型：另一种是柠檬味冰红 第一章绪论 茶调味茶饮料。上述两种品种在市场销售多年，已完全取代了最早的含汽冰茶，成为当 前国内茶饮料的主导品种。而茶饮料主要品种中的另一大品种乌龙茶，仅在个别区域市 场销售，并未成为全国流行的品种。各厂商进入茶饮料领域主要以此两大类产品为主， 个别成功的新品，也是在此两大类基础上进行延伸，如在冰红茶中添加清凉剂等进行扩 展，口味上仍未脱离主流冰红茶的类型。近两年来，各厂商曾先后开发了一些新的品种， 包括娃哈哈的纯绿茶、可口可乐的茶研工坊系列、康师傅的优健美纯绿茶、统一公司的 无糖纯茶和2 0 0 6 年5 月上市的今麦郎清茶系列等，但都跳不出低糖绿茶和冰红茶的范 围。 随着消费者对天然、健康理念的不断提升及各饮料生产企业的推进，香高、味醇、 茶韵充足的无糖纯茶饮料尤其是纯绿茶将是茶饮料市场未来的主要品种，此类产品也是 现今日本和台湾市场上的茶饮料品种的主流。 1 3 存在的问题 绿茶由于具有以上延缓衰老、抗疲劳、减脂、抗辐射、抗癌除血脂等多种保健功效 而深受青睐，消费者对清澈、天然、营养、方便的绿茶饮料的需求也越来越高。多少年 来，研究者及生产商一直致力于罐装绿茶饮料的开发，但是国内外市场上以绿茶和水为 原料制成的天然绿茶饮料尚不多见。绿茶饮料的生产面对的难题远比红茶及乌龙茶饮料 要多【1 0 】，国内和国际上红茶和乌龙茶饮料的保色和防褐变技术较为成熟，而绿茶饮料的 褐变、沉淀等问题尚未完全解决。 绿茶茶汤具有其独特的感官品质，不能很好地与添加剂混合，一旦主要的风味丧失 就很难再恢复原有品质i 儿l 。传统的绿茶饮料n t 工艺是用高温灭菌来使绿茶达到要求的 货架期。绿茶饮料在高温作用下易出现茶汤颜色褐变，且经高温杀菌后会产生不良风味， 影响绿茶饮料的品质。z h u q y ( 1 9 9 7 ) 、c h e l a z y ( 2 0 0 1 ) 和d i n g y s ( 2 0 0 2 ) 指出， 绿茶汤在热加工( 尤其是高温杀菌) 过程中感官品质的丧失，大大限制了绿茶饮料在饮 料市场上的发展 1 2 - 1 4 l ，这成为绿茶饮料生产的关键问题之一。 因此，寻找一种非热杀菌技术来代替传统的热杀菌工艺，从而解决绿茶饮料中热敏 性物质的变化所带来的一系列问题、保证绿茶饮料安全、营养、天然的品质，是十分必 要的。 1 4 非热杀菌技术 2 1 世纪消费者对食品的要求是天然、营养、安全和方便。“天然”和“营养”要求 食品加工过程对食品原料本身的营养和色、香、味物质的影响应尽可能小，即尽量少加 工，使食品尽可能少地遭受加热和冷冻等对品质的伤害；“安全”要求食品加工过程不 江南大学硕士论文 会产生有害物质，并确保产品中没有致病微生物；“方便”要求食品成品的配送、贮藏 和销售不需要特殊条件而且食用方便，可以即开即食。然而，食品加工要同时满足消费 者对以上的所有要求并不容易。 杀菌是获得贮藏和食用方便的安全食品的必不可少的操作。在传统的食品加工中， 为使食品具有期望的货架寿命，通常采用加热的方法来杀灭能引起食品变质的腐败微生 物和会引起消费者疾病的病源微生物。然而，加热通常会给食品带来一系列的不利影响， 例如，食品中热敏性营养物质( 如维生素、具有生物活性功能的蛋白质和色素等) 遭到 破坏，挥发性风味物质损失，天然色泽和质构改变 j s j 。因此，近年来，国际食品界对 非热食品加工技术倍加关注，相继出现了一系列新的非热杀菌技术【l 引引，如超高压杀菌、 高压脉冲电场杀菌、强磁脉冲杀菌、脉冲强光杀菌、超声波杀菌、高能射线杀菌、膜分 离和活性包装等。美国食品科技学会( i n s t i t u t eo f f o o dt e c h n o l o g i s t s ) 在1 9 9 9 年专门成 立了非热食品加工分会，非热食品加工( 主要是冷杀菌) 己成为国际食品科技界最为活 跃的研究领域之。 在所有的非热食品加工技术中，超高压( h i g hp r e s s u r e ) 技术和高压脉冲电场( p u l s e d e l e c t r i c a lf i e l d s ，以下简称p e f ) 技术最受重视和研究得最为广泛。两种技术不仅都具 有良好的杀菌效果，而且都能比较完好地保留食品的营养成份、色泽、风味和质构【l “忡 2 1 1 ，产品有望打上“准新鲜”( f l e s hl i k e ) 的标签。两种技术互为补充。互有优缺点。 前者非常适合己包装食品和高价值食品的杀菌，但是设备要求高，投资大，难以实现大 规模化和连续化。后者适合于几乎所有的可以流动的食品等物料的杀菌田j ，投资相对 较少，运行费用较低，易于实现工业化和连续化，但在杀菌过程中可能会发生电化学反 应和出现电极材料泄漏等问题田】。超高压杀菌技术经过近2 0 年的发展，在日本、美国 和欧洲的一些发达国家已应用于部分食品的商业化生产。p e f 杀菌技术的发展则相对滞 后，目前还没有应用于商业化生产，但是，一个由科研、设备制造及技术应用等单位组 成的联合体正在进行该技术的商业化，并取得重大进展，2 0 0 2 年在美国的俄亥俄州立 大学建成一条生产能力达到2 0 0 0l h 的准商业化生产线【2 ”。 1 4 1p e f 技术的起源和发展 p e f 杀菌技术作为一项在国际上得到公认的食品高新技术，已成为当前最有前途实 现工业化应用的冷杀菌方法之一。p e f 几乎适合于所有可以流动的食品等物料的杀菌， 投资相对较少，运行费用较低，易于实现工业化和连续化。 最初使用电灭菌方法是在1 9 世纪2 0 年代和3 0 年代美国的一些农场，他们将此方 法用来牛奶的灭菌，当时采用的是2 2 0 v 低压交变电场而非脉冲电场阱j 。2 0 世纪5 0 年 代，又产生了一种叫液内放电法的灭菌方法，它是通过浸在液体内的电极快速释放高压 电，产生瞬时的高压脉冲、电弧光以及电化学反应来灭菌，但由于会造成食品电污染( 因 4 第一章绪论 电极的腐蚀) 和食品中颗粒的瓦解( 因冲击波的作用) ，目前仅用于污水处理1 2 “。 2 0 世纪6 0 年代，学者s a l e 和h a m i l t o n 率先进行了高压电脉冲灭菌效果的研究【2 ”， 他们认为电场强度和作用时间是影响电灭菌效果的两个最主要的因素，并通过实验证明 了产生灭菌作用的既非电解产物也非热力学的原因，并提出了电穿孔的机制。2 0 世纪 8 0 年代以后，h u l s h e g e r 、z i m m e r m a n n 等学者对电脉冲杀菌机理做了进一步的探讨，并 开始了用于工业生产的设备研究瞄l 。从8 0 年代开始，p e f 作为一种新型的冷杀菌技术， 一直受到美国、德国、法国、加拿大、西班牙、比利时、荷兰等发达国家的政府、企业 和研究单位的广泛重视。许多食品科学家、微生物学家、工程专家、机械和电器工程师 通力协作，对p e f 杀菌的设备、工艺、杀菌效果、杀菌机理、产品风味变化和货架寿命 等进行了全面的研究。国际上在高压脉冲电场技术领域比较著名的研究小组有 h u l s h e g e r ，p o t c l & n i e m a n n ( 1 9 8 1 1 9 8 3 ) ：s i t z m a n & g r a h l ( 1 9 8 5 - 1 9 9 6 ) ；d u n n ，h o f m a n n & b u n s h n e l l ( 1 9 8 2 现在) ；b a r b o s a - c a n o v a s & s w a n s o n ( 1 9 9 2 - 现在) 和z h a n g ( 1 9 9 4 - 现在) 等领导的研究小组。至2 0 世纪9 0 年代后期，大功率p e f 加工设备的制造取得突 破性的进展，目前设备开发和某些产品( 如酸性果汁) 的加工工艺均已发展到准工业化 阶段；加工的果汁产品的色泽、风味、营养等质量指标明显好于传统的采用热杀菌的产 品，在常温下保藏3 个月后仍然具有接近于新鲜果汁的品质【2 1 , 2 4 , 2 7 1 。脉冲杀菌与低浓度 的杀菌剂如臭氧、h 2 0 2 、溶菌酶等结合，杀菌效果将更显著，有望在食品工业中得到大 力应用。 1 4 2 国内外研究现状 1 4 2 1 脉冲电场对微生物的作用 微生物活细胞和外环境之间进行着活跃的物质交换，细胞膜的完整性对保证细胞生 命活动的正常进行有着极其重要的作用。脉冲电场的杀菌作用与脉冲电场对微生物细胞 膜的影响密切相关。当微生物被置于高压电脉冲电场中时，细胞膜会被破坏，从而导致 细胞内容物外渗，引起细胞死亡。关于脉冲电场杀菌机理的解释，人们曾提出了好几种 理论，其中有两种模型被认可的程度较高 2 6 2 引。 ( 一) 细胞膜的电崩溃( e l e c t r i cb r e a k d o w n ) 微生物细胞膜由镶嵌蛋白质的磷脂双分子层构成，它有一定的电荷，具有一定的通 透性，也有一定的强度。膜的内外表面间具有一定的电势差，当细胞膜上外加一个电场 时，这个电场将使膜内外的电势差增大。由于细胞膜两表面堆积的正负电荷相互吸引， 引起膜的挤压；当电场强度增大到一个临界值时，细胞膜的通透性剧增，腹上出现许多 小孔，使膜的强度降低；进一步的作用使细胞膜产生不可修复的大穿孔，使细胞组织破 裂、崩溃，导致微生物失活。 江南大学硕士论文 ( 二) 细胞膜的电穿孔( e l e e t r o p o r a t i o n ) 电穿孔现象是指细胞暴露在高电压脉冲电场下出现的细胞膜脂质双层和蛋白质出 现的暂时失稳并在细胞膜上形成小孔的现象。细胞暴露在电场中时，细胞质膜变得对小 分子呈通透性，由于细胞内的渗透压高于细胞外，通透性的增加导致细胞吸水膨胀，并 最终导致细胞膜的破损。 电场对微生物细胞膜的影响主要体现在由于膜受压和穿孔导致膜的通透性增加。孔 的形成一般经过两个阶段，当将细胞置于电场中，细胞所受的电势差超过一定的值时细 胞膜上即会出现初步的小孔，然后随着时间的推移，孔逐渐变大。增大电场的密度、脉 冲时间和降低介质的离子强度均有助于孔的增大。 由于细胞膜对离子的通过具有选择性以及其磷脂分子的固有特性，使得细胞膜对电 场比较敏感，电场会引起细胞膜的电学和热学效应。磷脂双分子层由于具有两性特性而 易受电场的影响，使得电场能够改变磷脂分子层的结构，扩大细胞膜上原有的膜孔并产 生新的疏水性膜孔，这些疏水性膜孔最终转变成结构上更为稳定的亲水性膜孔，亲水性 膜孔能够导电并产生局部的焦耳热。细胞膜的局部温度可在微秒到毫秒的时间内升高数 度，紧接着会导致磷脂双分子层从凝胶结构转变为液晶结构，削弱细胞膜的半通透特性。 细胞膜上存在有蛋白质通道、膜孔和离子泵，它们对跨膜电场很敏感，在外电场的 作用下它们可能成为发生电穿孔的初始位点。许多蛋白质通道的闭合与电势差有关。正 常生理状态下，蛋白质通道的开启的电压在5 0 m v 以内，远低于导致膜崩溃的临界电势 差v e 。当外电场存在时，对电压敏感的蛋白质通道将会打开，一旦蛋白质通道打开， 就会通过大量电流，远远超过正常生理状态，从而导致了蛋白质通道的不可逆变性。这 可能是由于局部焦耳热或其功能团亚基，如羟基、羧基、巯基或氨基等发生了电修饰。 因此，可以认为由于细胞膜电穿孔使磷脂双分子层和蛋白通道都发生了改变，最终引起 了细胞死亡。 p e f 的强度一般为2 0 - - 5 0k v c m ，脉冲宽度为o 2 0 岫，脉冲频率为o - - 2 0 0 0p p s 。 影响高压脉冲电场灭菌的因素【2 9 】有： 1 ) 内在微生物特性的影响。p e f 灭菌效率首先取决于微生物的种类、大小、生理周期 以及初始含菌量。菌种对电场的承受力有很大的不同。无芽孢菌比有芽孢菌更易杀 灭：革兰氏阴性菌比阳性菌易于杀灭田】。食品常见菌中，相同条件下用电场灭菌， 存活率由高到低为：霉菌、乳酸菌、大肠杆菌、酵母菌。同时，对象菌所处的生长 周期也对杀菌效果有一定的影响，处于对数期的菌体比处于稳定期的菌体对电场更 为敏感。初始含菌量对灭菌效果的影响没有一定规律，如啤酒酵母初始含菌量升高， 灭菌效率也会提高，而对大肠杆菌研究时未发现此现象。 第一章绪论 2 ) 介质或食品特性的影响。很多因素，如电导率、离子强度、p h 值、水分活度、黏度、 气泡含量、固体颗粒和油滴存在等。当介质电导率和离子强度低时，灭菌效率通常 会得到加强( 离子的存在对于穿透膜电位的增加是必需的) 。蛋白质、脂类和黄原胶 等成分含量的增加能导致微生物对电脉冲抵抗能力的增加。近期研究发现，p h 在脉 冲电场杀菌中起着重要的作用【2 阳o j 。k r i s t i n a a r o n s s o n 、v e g a - m e r e a d o 等人的研究结 果表明，当p h 降低时，p e f 对大肠杆菌的处理效果明显增强 3 0 , 3 “。但a l v a r e z 认为 p h 对脉冲电场杀菌的影响仍不清楚，因为实验观察到沙门氏菌在p h3 8 时比在p h 7 0 时具有更强的抵抗力【3 2 】。通常情况下，降低水分活度可以增强脉冲电场的灭菌 效果。对于大肠杆菌，降低水分活度要比降低p h 值的影响显著。1 9 9 5 年，h o 发现 细胞膜渗透压增大( 加入蔗糖) 可降低脉冲电场临界场吲刀】。 3 ) 脉冲电场参数的影响。电脉冲灭菌效果显著地受到电加工参数的影响，其中电场强 度和处理时间是最主要的两个参数【1 6 , 3 4 , j 引，此外还有温度和输入能量的影响等。一 般说来，电场强度越大和处理时间越长，灭菌效果越好。温度的影响是比较复杂的 【2 5 】，脉冲能量的输入会引起介质温度增加，升温取决于电场强度、脉冲数和脉冲形 状等。对于相同的输入能量，不同的电压和波形也有不同的灭菌效果。连续流动的 处理比单批次的处理效果要好，这可能是由于物料、微生物受到了更加均匀的电场 处理。 国际上曾经研究过的p e f 处理对象微生物有：枯草芽孢杆菌( b a c i l l u ss u b t i l i s ) ，德 氏乳杆菌( l a c t o b a c i l l u sd e l b r u e c k i i ) ，单核细胞增生李斯特菌( l i s t e r i am o n o c y t o g e n e s ) ， 荧光假单胞菌( p s e u d o m o n a s f l u o r e s c e n s ) ，啤酒酵母( s a c c h a r o m y c e sc e r e v i s i a e ) ，金黄 色葡萄球菌( s t a p h y l o c o c c u sa u r e u s ) ，嗜热链球菌( s t r e p t o c o c c u st h e r m o p h i l u s ) ，都柏 林沙门氏菌( s a l m o n e l l a d u b l i n ) ，埃希氏大肠杆菌( e s c h e r i c h i a c o l i ) ，埃希氏大肠杆菌 0 1 5 7 ：h 7 ( ec o l i0 1 5 7 ：h 7 ) ，霉菌，酵母菌和孢子等等。p e f 的抑菌效果一般可达4 6 个对数级及以上，其处理时问极短，最长不超过1 s ，且处理对食品的感官质量不造成影 响，其货架期一般都可延长4 6 周【2 0 2 4 ，3 6 。3 引。 q i n 等人证实在脉冲电场强度为1 2 4 0k v e m ，脉冲时间为1 8 肛2 0 炉的条件下， 可有效地对食品进行灭菌，且以双矩形波最为有效p 9 】。邓元修等利用脉冲高压杀灭酵 母和大肠杆菌，取得良好的实验结果，且能耗低，试液温升小于2 ，因而可有效保存 食品的营养成分和天然特征【帅】。1 9 9 7 年，陈健用2 2 5 k v c m 的电场，脉冲5 0 次，使脱 脂乳中的9 9 的大肠杆菌失洲4 “。为了提高脉冲的杀菌效果，i u 等人指出，高压脉冲与 中等程度的热处理相结合或与溶菌酶、乳链球菌素等天然抗微生物制剂相结合处理苹果 汁，能有效地减少0 1 5 7 ：h 7 大肠杆菌 4 2 1 。h o 地i n s 等人用低能脉冲电场处理柑桔汁，结 果表明用8 0 k v c m 的电场，脉冲2 0 次，p h3 5 ，4 4 ，添加i o o u m l 乳链球菌素能 减少微生物1 0 6 c f u m l ，维生素c 保留9 7 5 ，果胶甲酯酶的活性减少9 2 1 ，气相色 江南大学硕士论文 谱显示芳香物质在脉冲前后无显著差别【4 3 1 。e v r e n d i l e k g a 曾研究了不同p e f 处理装置 对苹果汁中大肠杆菌0 1 5 7 ：h 7 和脱脂牛奶中金黄色葡萄球菌的灭活动力学特性，在 3 0 k v c m 、1 7 2 p s 和3 5 k v c m 、4 5 0 1 1 s 条件下分别得到了5 和3 7 个对数的活菌降低，还 研究了p h 、温度在脉冲处理中的作用及电脉冲的亚致死作用 2 羽。 1 4 2 2 脉冲电场对酶的作用 传统使酶失活的方法是热处理，处理的温度因酶的不同而不同，但大都是在6 0 9 0 之间的高温短时或者超高温瞬时灭酶的方法。热处理的优点是灭活效果好，但高温 处理一定程度上损害了食品原有的风味、品质和营养物质。相比于微生物失活研究， p e f 使酶失活的研究并不多。 酶对脉冲电场的抗性比微生物的要强，且影响效果可以是正面、负面的，或者根本 没有影响。酶在脉冲电场中失活的机制还不是非常清楚，基本上都是一些实验结果的推 论。一种观点是脉冲电场影响或破坏了酶原有结构：脉冲电场作用可能导致维持酶空间 结构的力受到影响或者改变了球状蛋白的构造，另一种观点认为脉冲电场影响的是酶的 活性部位。脉冲电场可能破坏了酶与底物的结合，增大或改变了酶的活性部位，导致酶 的活性发生变化。 h o ( 1 9 9 7 ) 等报道，p e f 会使脂酶、葡萄糖氧化酶、甜淀粉等酶失活( 7 0 8 5 ) ， 但不仅不会使胃蛋白酶失活，反而会使其活力成倍增加 4 4 1 。v a nl o e y 等报道，在正常 用于杀灭微生物的剂量范围内，p e f 不会使脂肪氧合酶、多酚氧化酶、果胶甲酯酶和过 氧化物酶的活力显著减少【4 5 】。y e o m 等( 1 9 9 9 ) 的研究表明，p e f 会导致木瓜蛋白酶的 不可逆失活。b e n d i c h o 等报道，当电场强度和处理时间分别为3 5 5k v c m 和8 6 6g s 时，牛奶中的蛋白酶的活力下降8 1 4 “。2 0 0 2 年，史梓男等利用脉冲高电压电源对西 瓜汁施加脉冲处理，测定了2 0 、3 0 和4 0 k v c m 和不同处理时间下西瓜汁中细菌含量和 酶的活性，试验发现p e f 对西瓜汁中酶的活性有一定影响，但不能确定其效果是正面 还是负面的【嗍。杨瑞金等人的研究表明，当处理时间为1 2 6 邺，电场强度为3 7 0k v c m 和4 1 8k v c m 时，分别有5 1 7 和8 3 8 的胃蛋白酶失活；而当电场强度和处理时间分 别为4 1 8k v c m 和1 2 6 邮时，p e f 不会使溶菌酶失活，但能使胃蛋白酶几乎完全失活 【4 9 】。 1 4 2 2 其他方面的研究 随着p e f 杀菌设备和应用技术的不断进步，人们对p e f 对食品组分的影响和食品 安全性问题越来越关心，近年来这方面的研究报道有增多的趋势。m o r r e n 研究了p e f 处理过程中的基本的电化学和电极材料泄漏问题，认为可以通过改进处理腔的设计和使 用尽可能短的脉冲使这两个问题得到一定程度的解决【矧。l i 等报道，在使微生物数目 8 第一章绪论 减少5 3i g 数的作用剂量下，p e f 对牛奶免疫球蛋白( i g g ) 的活性和结构的影响不显 著1 5 0 l 。张鹰、曾新安等人研究了高强脉冲电场处理对脱脂牛乳中游离氨基酸和乳糖含 量的影响，结果表明经电场处理后牛乳中游离氨基酸含量有所增加，且处理时间越长增 加越多，而经电场处理后牛乳中的乳糖含量几乎不受影响5 1 1 。 1 5 立最意义 茶叶是世界三大饮料之一，更是我国的传统饮料，在我国有着2 0 0 0 多年的发展历 史。随着人们生活水平的提高和生活节奏的加快，液态茶饮料以其方便、健康、天然的 特点越来越受到人们的喜爱。市售罐装、瓶装茶饮料的出现，不仅满足了人们审美情趣、 舒适轻松、快捷方便等的追求，也满足了人们在安全卫生方面的需求。绿茶为不发酵茶， 茶叶营养成分丰富且具有许多独特的保健功效，从2 0 世纪8 0 年代尤其是9 0 年代以来， 绿茶饮料一直是饮料行业中的开发热点。 绿茶饮料为低酸性饮料，微生物极易在其中生长繁殖，为了保证饮料的安全性和贮 藏性，必须对绿茶饮料进行杀菌处理。但由于绿茶茶汤组分的复杂性和体系的不稳定性， 茶汤氧化还原电位最低，经热加工尤其是杀菌处理后，其感官品质变化很大 1 3 , 1 4 。传统 的绿茶饮料生产工艺中常常添加人工香精和色素来掩盖这种变化，来提高产品的接受 性，但却脱离了消费者对茶饮料天然、健康的要求。这种在热杀菌中的不稳定性大大限 制了天然绿茶饮料的发展，导致9 0 年代以来罐装绿茶饮料的研究几乎进入了停滞期。 若采用传统的加热杀菌方法处理茶汤，将会大大降低茶汤的色、香、味和口感。因此寻 找新的茶饮料杀菌技术，最大限度地保证绿茶饮料的原有色香味品质，发展天然健康的 纯茶饮料将是非常重要且具有实际经济意义的。 p e f 杀菌技术作为一项在国际上得到公认的食品高新技术，已成为当前最有前途实 现工业化应用的冷杀菌方法之一。p e f 杀菌技术的投资相对较少，运行费用较低，易于 实现工业化和连续化。国际上对p e f 在食品保藏中应用的研究多集中在酸性果蔬汁的杀 菌上，也有一些对牛奶、色拉调料、啤酒等中性或微酸性食品杀菌的研究报道，但关于 p e f 对中性冷藏绿茶饮料杀菌方面的应用国内外均未见报道。我国学术期刊上只有少量 有关p e f 在食品保藏中应用的文章，食品中组分( 如叶绿素、多酚、维生素、多糖、蛋 白和脂质) 等的影响的研究则非常少。可以说，我国在p e f 在食品保藏中应用的研究还 没有真正起步。在绿茶饮料生产中，以p e f 技术代替传统的热杀菌工艺不仅是对新型纯 绿茶饮料工艺的开拓性研究，也是将p e f 技术扩大应用于液态低酸性冷藏食品加工中的 初步探索，为p e f 技术的进一步发展和工业化进程增添理论支持和实验数据支持，同时 对高压脉冲电场灭菌法在其它液态食品尤其是低酸性食品中的运用也具有借鉴意义，具 有较大的理论和实际意义。 9 江南大学硕士论文 1 6 主要研究内容 研究的内容包括： 1 优化绿茶饮料生产工艺，解决绿茶饮料在生产中出现的变色、浑浊和沉淀现象； 2 在茶汤中接种茶叶中常见致病菌，研究p e f 对绿茶茶汤中微生物的杀灭效果； 3 确定p e f 对绿茶茶汤的最佳杀菌条件，生产出具有较长货架寿命、色泽较为稳定的 绿茶饮料； 4 研究p e f 对绿茶饮料主要成分的作用及绿茶饮料品质在冷藏中的变化。 1 0 第二章绿茶饮料浸提和护色工艺研究 2 1 前言 第二章绿茶饮料浸提和护色工艺研究 国内外液态茶饮料的品种颇多，据其特点可归结为两大类：一类为调味液态茶饮料， 该产品除含有茶叶成分外，还佐入相应的果味、可乐味、糖、酸等辅料，属于低热值的 饮料，另一类为纯液态饮料茶，这类饮料茶多为不添加其他辅料，基本上保持茶叶原有 的色香味，是适合清饮的无热量饮料。近十几年来，绿茶水的研究日益增多，罐装绿茶 水继乌龙茶水后成为风靡世界的时尚饮料【s ，5 ”。 目前市场上以绿茶和水为原料制成的纯天然绿茶饮料尚不多见，这是因为液态绿茶 饮料的生产还存在着许多尚未完全解决的问题，绿茶在制造、存放过程中茶液褐变、白 色混浊产生严重影响了人们对绿茶饮料的感官要求，这阻碍了它的进一步发展。茶饮料 加工工艺是影响茶水品质的直接重要因素，故为保证茶水的品质，探讨合理的加工工艺 具有重要意义。 2 2 材料 2 2 1 材料与试剂 炒青绿茶特级 酒石酸钾钠 a r l 半胱胺酸 a r b 一环糊精 a r 茚三酮 a r 茶多酚 9 8 其他试剂均为分析纯。 2 2 2 仪器 9 0 2 型定时恒温磁力搅拌器 p hs - 2 型酸度计 离心沉淀机 h h - 4 型数显恒温水浴锅 青岛利丰茶叶公司 中国医药( 集团) 上海化学试剂有限公司 上海市生化研究所 国药集团化学试剂有限公司 国药集团化学试剂有限公司 无锡世纪生物药业有限公司 上海沪西分析仪器厂 上海第二分析仪器厂 上海医用分析仪器厂 江苏金坛荣华仪器制造有限公司 江南大学硕士论文 t c p i i g 全自动测色色差计 s t z - a 2 4