（环境工程专业论文）海洋微藻的诱变育种及其脂肪酸的测定.pdf

南京理工大学硕士论文 海洋徽蕞的诱变育种及其脂肪酸的测定 摘要 本文采用两种方法( 化学诱变剂甲基磺酸乙酯e m s 、6 0 c o 叫射线辐照) 对两种 海洋微藻( 海水小球藻、等鞭金藻) 进行诱变育种，揭示了化学诱变处理对两种海洋 微藻的生长繁殖速度及二十碳五烯酸( e i c o s a p e n t a c n o i ca c i d ，简称e p a ，2 0 ：5 n - 3 ) 和 二十二碳六烯酸( d o c o s a h e x a e n o i ca c i d ，简称d h a ) 在两种海洋微藻细胞中含量的 影响：”c o - - 射线辐照诱变处理对两种海洋微藻的生长速度及e p a 和d h a 含量的影 响，为培养高产e p a 和d h a 并且生长快速的海洋微藻新品种提供了理论依据。 研究结果表明，两种诱变处理方法都使海洋微藻的细胞在群体生长水平上受到了 抑制，其中”c o y 射线辐照诱变处理的抑制作用更为显著：但是，两种诱变处理方法 都对提高海洋微藻细胞中的e p a 和d h a 的含量起到了一定作用，其中化学诱变处理 的效果更加明显。经化学诱变剂e m s 处理后，海水小球藻中的e p a 和d h a 的含量 分别提高了4 4 6 9 和7 2 6 1 ，等鞭金藻的e p a 和d h a 含量分别是对照组的1 8 倍 和1 4 倍。同时，经过两种诱变方法处理后，部分饱和脂肪酸的含量与对照组相比较 也有不同程度的提高。比较这两种诱变方法对海洋微藻的生长繁殖速度和脂肪酸含量 的影响，结果证明采用化学诱变的处理方法更好。 关键词：海洋微藻，e p a 和d h a ，甲基磺酸乙酯，6 0 c o - 7 射线辐照，气相色谱 南京理工大学硕士论文 海洋般藻的诱变育种及其脂肪藏的涌定 a b s t r a c t b yt r e a t i n gt w ok i n d s o ft h eo c ea ：e m i c r o a l g a ew i t he m s ( s h o t t e df r o me t h y l m e t h a n e s u l p h o n a t e ) a n d6 0 c o wm y r a d i a t i o n , w er e v e a l e dt h ee f f e c to f t h et w om u t a g e n e s i s o nt h er a t ec o n s t a n to ft h ec e l lp o p u l a t i o no fc h l o r e l l aa n di s o c h r y s i sg a l b a n a , a n dt h e e f f e c to ft h et w om u t a g e n e s i so nt h ee p a ( s h o r t e df r o me i c o s a p e n t a e n o i ca c i d ) a n d d h a ( s h o r t e df r o md o c o s a h e x a e n o i ca c i d lc o n t e n t si nt h et w oo c e a nr n i c r o a l g a ec e i l s n l e e x p e r i m e n t a t i o np r o v i d e dt h et h e o r yo fc u l t i v a t i n ga n e wo c e a i 1m o c r o a l g a ev a r i e t yr i c hi n e p aa n dd h aa n di n c r e a s i n gr a p i d l yi nc e l ln u m b e r t h er e s u l t sd e m o n s t r a t e dt h a tb o t he t h y lm e t h a n e s u l p h o n a t ea n d ”c o vr a yr a d i a t i o n h a v ea na d v e r s ee f f e c to nt h ei n c r e a s ei nt h ee e l ln u m b e ro fc h l o r e l l aa n di s o c h r y s i s g a l b a n a ，e s p e c i a l l yw i t h ”c o - 1 r a yr a d i a t i o n ，b u tt h et w om u t a g e n e s i sc a na l s oi n c r e a s et h e e p aa n dd h ac o n t e n t si nt h et w oo c e a nm i c r o a l g a ec e i l s e s p e c i a l l y 砸me m s w e i n c r e a s e dt h ee p aa n dd h ac o n t e n t si nc h l o r e l l ae e l lb y4 4 6 9 a n d7 2 6 1 w i t h e m s r e s p e c t i v e l y a tt h es a n l et i m et h ee p aa n dd h a c o t e n t si ni s o c h r y s i sg a l b a n ac e l l a r e1 8t i m e sa n d1 4t i m e sa sm u c ha st h ei n i t i a le e l lw h i c hw 锄tt r e a t e dw i t h e m s ，r e s p e c t i v e l y w h a t sm o r e _ ，s o m es a t u r a t e df a t t ya c i d sc o n t e n t sw e r ea l s oi n c r e a s e di n c h l o r e l l aa n di s o c h r y s i sg a l b a n ac e i l si nac e r t a i ne x e n t t h ee f f e c to f t h et w om u t a g e n e s i s t ot h er a t ec o n s t a n to ft h et w om i c r o a l a g ec e l la n dt h ee p aa n dd h ac o t e n t si nt h et w o m i m a l a g ec e i l sp r o v e dt h a te m s w a st h eb e t t e rm u t a g e n k e y w o r d s ：m i c r o a l g a e ，e p aa n dd h a ，e t h y lm e t h a n e s u l p h o n a t e ，6 0 c o - 7r a yr a d i a t i o n , g a sc h r o m a t o g r a p h y i i y 7 6 3 5 9 4 声明 本学位论文是我在导师的指导下取得的研究成果，尽我所知，在本 学位论文中，除了加以标注和致谢的部分外，不包含其他人已经发表或 公布过的研究成果，也不包含我为获得任何教育机构的学位或学历而使 用过的材料。与我一同工作的同事对本学位论文做出的贡献均已在论文 中作了明确的说明。 研究生签名：丝堡区酝渺i 年飞日 学位论文使用授权声明 南京理工大学有权保存本学位论文的电子和纸质文档，可以借阅或 上网公布本学位论文的全部或部分内容，可以向有关部门或机构送交并 授权其保存、借阅或上网公布本学位论文的全部或部分内容。对于保密 论文，按保密的有关规定和程序处理。 研究生签名垫堡缝沁辟汨舶 f j 南京理t 大学碗。 ：论文 海洋微藻的诱变育种及其脂肪酸的测定 1 绪论 地球上有三万多种不同的微藻，分布在淡水和海洋里，在各种土壤( 包括酷暑和 寒冷的荒芜环境) 里也都有微藻存在。长期以来，人们仅仅是把微藻作为鱼、虾、贝 类幼体或成体的直接或间接的活饵料。近几十年来，人类越来越重视海洋生物资源 中天然的功能成分的研究与开发，其中，海洋藻类尤其是单细胞海洋微藻由于富含蛋 白质、脂肪、碳水化合物和人体所需的不饱和脂肪酸等多种营养成分和多种生物活性 物质，特别是富含一3 系列高度不饱和脂肪酸，如：二十碳五烯酸( e i c o s a p e n t a e n o i c a c i d ，简称e p a ，2 0 ：5 n 一3 ) 和二十二碳六烯酸( d o c o s a h e x a e n o i c a c i d ，简称d h a ，2 2 ：6 n 一3 ) 及a 。亚麻酸( 1 i n o l e n i ca c i d ，简称a l a ，1 8 ：3 n 3 ) 等，由于这些( 0 3 系列高度不饱和 脂肪酸具有降血压、抗血栓、降低胆固醇、预防老年痴呆、改善脑机能、提高智力等 作用【2 】，因此海洋微藻在开发功能食品、保健品、药物等方面占极重要的地位。 1 1 关于小球藻和等鞭金藻 1 1 1 小球藻 小球藻属( c h l o r e l l ab e i j e r i n c k ) 是第一个被人工培养的微藻。1 8 9 0 年，荷兰生 物学家b e i j e r i n c k 3 1 首先在琼脂平板上成功分离到了一种叫做小球藻( c h l o r e l l a ) 的纯 培养物，另一科学家o t t ow a r b u r g 3 1 于1 9 1 9 年将这一纯培养物在实验室里作为研究植 物生理学的工具。小球藻属于绿藻门( c h l o r o p h y t a ) 绿球藻目( c h l o r o c o c c a l e s ) 卵 囊藻科( o o c y t a c e a e ) 小球藻属。此属自1 8 9 0 年以来，迄今己发现了许多种，现在 被广泛培养的有：小球藻( c v u l g a r i s ) 、椭圆小球藻( c e l l i p s o i d e a ) 和蛋白核小球藻 ( c p y r e n o i d o s a ) 等，以及它们的众多品系。 如果以细胞干重来计算，小球藻细胞中的灰分含量在1 3 6 2 0 2 1 之间，在 除掉灰分以外的干物质中，碳、氢、氮、氧所占的比率为：碳4 9 5 1 7 0 7 1 ，氢 67 8 1 0 5 3 ，氮1 1 7 1 4 1 1 ，氧1 7 8 7 3 4 4 0 ；蛋白质含量为7 3 0 8 8 0 0 ，碳水化合物为5 7 0 3 8 0 0 ，脂类为4 5 0 8 6 0 0 1 3 1 。小球藻细胞中 的总脂类经皂化后可分为三个组分：脂肪酸，难皂化物质和水溶性的皂化产物，其中 不饱和脂肪酸的含量明显高于许多植物【3 1 。 l 。1 。2 等鞭金藻 等鞭金藻( i s o c h r y s 括g a l b a n q ) 在分类上属金藻门( c h r y s o p h y t a ) 普林藻纲 ( p r y m n e s i o p h y c e a e ) 等鞭藻目( i s o c h r y s i d a l e s ) 等鞭藻科( i s o c h r y s c d c e a e ) 等鞭藻 属( i s o c h r y s i s ) 【4 】。等鞭金藻细胞可合成并富集含量高达总脂肪酸4 0 的3 p u f a ， l 南京理t 大学硕= 匕论文海洋微藻的污变育种及其脂肪酸的测定 其中e p a 和d h a 占总脂肪酸的2 5 o 和8 5 ，是良好的e p a 和d h a 生物资源。 培养海洋单细胞金藻等鞭金藻来生产e p a 和d h a 具有很好的应用前景嘲。 1 2 海洋微藻的研究概况及发展趋势 1 2 1 对多不饱和脂肪酸( p u f a ) 的研究 脂肪是生物体的能量来源及能量贮存物质，也是身体组织的重要组成部分。脂肪 酸是组成脂质的基本成分，分为饱和脂肪酸和不饱和脂肪酸，其中脂肪的碳键上存在 有两个或两个以上双键的脂肪酸称为多不饱和脂肪酸( p o l y u n s a t u r a t e df a t t ya c i d s ，简 称p u f a ) ，是指含有两个或更多个双键的长链脂肪酸。根据碳原子靠近双键的位置， p u f a 可分为c o 一3 、0 3 6 和( 0 9 等系列脂肪酸。所谓一3 系列p u f a 就是指双键的位 置从碳链甲基端第三个碳原子开始【6 】，主要包括二十碳五烯酸( e p a ) 、二十二碳六烯 酸( d h a ) 和c t - 亚麻酸( a l a ) 等。o ) 3 高度不饱和脂肪酸( p u f a ) 及其代谢产物 不仅是构成高等动、植物细胞的重要成份之一，而且在人体内还具有多种重要的生理 功能f 6 1 ，它与降低血脂及降低心脏疾病的发病率有着紧密的联系f7 1 ，还可改善烧伤症 状、减轻脓毒症病情，并在抗衰老、改善老年人记忆以及器官移植方面都发挥着作用， 可代替非甾体抗炎药治疗免疫异常疾病【8 l 。在哺乳动物体内e p a 和d h a 等高度不饱 和脂肪酸( p u f a ) 表现出的独特生理功效早已受到科学界、医学界、健康食品业及 消费者的重视一j 。 d h a 在我国有“脑黄金”之称，它具有以下几方面的生理功能：( 1 ) 预防和治 疗心血管疾病，哺乳动物体内的d h a 主要用于合成前列腺素，其功能是减少前列凝 素a ：，增加前列环素的含量，降低血管阻力，减低血液粘稠度，降低血小板凝集与 粘着功能；( 2 ) 预防和治疗癌症，日本学者实验发现，。在喂食不同性质的脂肪后， 将致癌物注射于老鼠身上，食用d h a 的老鼠患乳癌、大肠癌、肺癌的发生率均很低， 因此推断，d h a 与癌症的预防和治疗有关：( 3 ) 调节中枢神经系统功能，d h a 主 要存在于大脑狄质中，是人脑中3 多不饱和脂肪酸的重要成分【l ，大脑中d h a 含 量的降低可导致学习、记忆能力减退；( 4 ) 对视觉系统的调节作用，d h a 是视网膜 组织的重要组成成分，如果视网膜中d h a 含量下降，可导致视网膜电图失常1 3 3 。而 e p a 则具有调整血脂，抑制血小板聚集，降血压和抗炎等作用，该制品用于防治心 血管疾病已取得显著疗效【l “。 1 2 2 利用海洋微藻生产多不饱和脂肪酸( p u f a ) 的研究 一般认为，除了鱼和其它一些海产品外，牛、猪、禽肉及鸡蛋、谷物、水果、蔬 菜中不含有e p a 和d h a 幢l 。传统上工业鱼油是d h a 和e p a 等多不饱和脂肪酸的主 2 南京理_ t 人学碗：l 论文 海洋微藻的诱变育种及其脂肪酸的铡定 要来源，尤其是深海鱼油，然而从鱼油中提取p u f a 时却经常面临着这样的问题：( 1 ) 鱼油中的一3 型p u f a ( 主要是d h a 和e p a ) 的构成和含量随着鱼的种类、季节、 地理位置等的变化而变化；( 2 ) 从鱼油中提取的p u f a 胆固醇含量高，并带有腥味， 极大地影响了产品的品质：( 3 ) 在鱼油加工过程中的氢化处理工艺降低了鱼油中的 p u f a 产量：( 4 ) 复杂的加工处理过程，使得p u f a 的价格极为昂贵【1 3 】。 随着研究的继续深入，e p a 和d h a 新的生理功效及作用机理将不断被发现和揭 示，然而短缺的p u f a 生物资源却始终制约着e p a 和d h a 的广泛应用。近年来虽然 也发现了许多真菌中有积累d h a 和e p a 的现象，但是利用真菌生产d h a 和e p a 的 工作还处于尝试和探索阶段，如果仅采用现有的真菌菌种和技术生产d h a 和e p a 则 存在成本偏高、工艺流程不成熟、对外界因子干扰敏感、产量有限等问题。因此，积 极开发廉价的e p a 和d h a 生物资源、研究便捷的培养和生产方式便成为了广大商家 和科学工作者们共同关心的问题 1 4 , 1 5 1 。 研究发现，微藻是海洋中p u f a 的原始生产者，鱼类本身并不能合成p u f a ，它 们通过食物链的关系( 海洋微藻一浮游动物一鱼) 在其体内大量积累p u f a 。因此， 培养海洋微藻生产- 3 型多不饱和脂肪酸应该是一条更为直接的途径。一方面，海洋 微藻可以快速生长繁殖、自身合成并富集高浓度的p u f a ，在某些微藻体内p u f a 的 含量高达细胞干重的5 6 ，其相对含量远远高于鱼体内p u f a 的含量【1 6 1 。另一方 面，从藻体内提纯p u f a 比从鱼油中提取的工艺简单，并且不带腥味，适合于做优质 食品添加剂。同时，它不合胆固醇成分，克服了服用鱼油胶囊时摄入大量胆固醇的缺 点。另外，有些微藻还可以直接食用，大大减少了p u f a 在提纯过程中的氧化分解。 利用培养微藻生产多不饱和脂肪酸的研究始于8 0 年代初期，并且多以自养的方 式生产e p a 和d h a ，以海产藻种为主，有三角褐指藻( p h a e o d a c t y l u mt r i c o r n u t u m ) 、 紫球藻( p o r p h y r i d i u mc r u e n t u m ) 、盐生微小球藻( n a n n o c h l o r o p s i ss a l i n a ) 、前沟藻 ( a m p h i d i n i u mc a r t e r i ) 、和黄绿等鞭金藻( i s o c h r y s i sg a l b a n a ) 等。美国、日本、以 色列等曾率先采用户外开放式大池培养这些自养微藻用以生产p u f a ，但结果并不尽 人意。c o h e n 和h e i m e r 报道【1 7 1 ，在户外培养红藻( p o r p h y r i d i u mc r u e n t u m ) 生产e p a ， 其产量冬天为o 5 m g ( l d ) ，夏天为1 0 m g ( l d ) 。r i c h m o n d 和v o n s h a k 【l 列曾于l9 8 2 年报道过户外培养微藻的最高产量为5 0 9 ( m 2 d ) - 1 jl o p e z a l o n s o 等人也于1 9 9 2 年 的实验研究报告中称自养微藻品系中3 型多不饱和脂肪酸最高含量值在l s o c h r y s i s g a l b a n a 中占干重6 7 ，b a r e l a y 等人1 1 3 j 据此对户外培养积累多不饱和脂肪酸的光合 自养微藻最高产量进行了理论推断，其值也仅为1 6 7 m g ( l d ) 。 我国微藻养殖方面发展较快，养殖方式比较一致，都是采用开放式或半开放式的 南京理丁大学硕士论文海洋镟藻的诱变育种及其脂肪酸的测定 培养方式，培养一些可以作为生物饵料或者食品添加剂的藻种【l8 】：对于开放式大池培 养微藻用以生产p u f a 研究得不多，戴俊彪等【l9 】曾对开放式大池培养球等鞭金藻 ( i s o c h r y s i sg a l b a n a ) 生产d h a 和e p a 进行过初步的探讨。利用开放式大池培养微 藻，产量极低，并且难以对一些高纯度、高价值的产品进行纯种培养，另外细胞培养 密度偏低，p u f a 含量不高，采收成本过高，这些缺陷佼其在推广微藻大规模培养上 受到诸多因素的限制。 为解决开放式大池培养中出现的问题，人们设计出了密闭光生物反应器，并通过 控制培养液浓度实现了连续培养。现在的光生物反应器已经发展成为柱式光照发酵 罐、管式及板式恒化反应器，以及可实现培养条件计算机在线控制的光纤式光生物反 应器等多种类型【】引。利用密闭式光生物反应器培养微藻，能够最大限度的控制养殖环 境，减少污染发生，提高产量。据c o h e n 和a r a d 2 0 j 手艮道，利用这一技术可使红藻 ( p o r p 咖i d i u m ) 的产量增加6 0 3 0 0 ，同时还可以降低收获成本。但是利用密闭 式光生物反应器进行微藻自养培养生产e p a 和d h a 普遍存在以下问题：( 1 ) 培养后 期，由于细胞浓度升高，使光照效率降低：( 2 ) 反应器内易于累积氧气，降低脂肪酸 的不饱和程度：( 3 ) 反应器内壁易发生附着现象。另外，e m g r i m a 等人【23 】于1 9 9 4 年采用户外光反应器对富含e p a 的等鞭金藻a l i i 4 株进行了培养，结果获得高达 8 2 m g ( l d ) 。1 的e p a 。 为解决密闭光生物反应器中出现的问题，可利用那些以依靠有机碳( 葡萄糖、醋 酸盐) 为唯一碳源和能源的微藻进行异养培养来解决上述问题，异养培养具有广阔的 研究开发前景，主要方式有：分批异养培养、分批流加异养培养、恒化异养培养、膜 过滤细胞循环系统等。微藻异养培养具有以下优点：( 1 ) 可实现培养条件的自动控制； ( 2 ) 易进行纯种培养；( 3 ) 可实现细胞高密度培养，提高底物及设备利用率；( 4 ) 由于实现了细胞高密度培养，可大大降低下游精制工艺的消耗。此外，对培养基进行 彻底灭菌、严格实施无菌操作及优化培养条件可解决异养培养系统易污染的问题。目 前m a r t e k 公司( c o l u m b i a ，u s a ) 已筛选出硅藻种n i t z s c h i aa l b a 作为e p a 生产藻种， e p a 的最终产量为0 2 5 9 ( l - d ) ；以隐甲藻c r y p t h e c o d i n i u mc o h n i i 作为d h a 的生产 藻种，d h a 的产率为1 2 9 ( l d ) 。该公司己建成1 5 0 m 3 规模的工业化异养培养设备， 以生产富含d h a 的微藻饲料。在日本川崎制铁公司也已筛选到d h a 的生产藻种隐 甲藻c r y p t h e c o d i n i u mc o h n i i ，并申请了专利【2 2 】。 前人的研究工作主要包括三个方面：( 1 ) 选育生长速度快、p u f a 产量相对较高 的藻种；( 2 ) 研究影响藻细胞生长速度、细胞生化组成的各种环境因素，确立合适的 环境条件，建立藻细胞生长动力学模型，在环境因素中主要从稀释速率、光照强度、 温度、n 源和p 源的浓度、n a c l 的浓度及c 0 2 供给量等条件出发，控制藻细胞在合 4 南京删工人学硕i ：论文海洋微藻的诱变育种及其脂肪陵的测定 适的生长速度和生长阶段，可人为控制藻体内p u f a 的合成量及其在总脂、总生物量 中所占的比例【2 2 】；( 3 ) e p a 和d h a 提纯和精制工艺的深入研究口3 1 。利用海洋微藻来 生产e p a 和d h a 是一个新领域，因此建立一套较为完整、简便有效并且适宜工业化 生产的从藻细胞的培养到e p a 和d h a 提取、分离和纯化的技术，在生物技术领域， 既是一种挑战，又具有重要的科学价值和应用前景。 1 2 3 海洋微藻育种技术的研究 海洋微藻所含有的独特的药理活性物质使得它们具有多种药用价值和保健功能， 利用海洋微藻生产多不饱和脂肪酸方兴未艾，成为各国科研人员的研究开发热点。由 于不同的藻种不但生长速度不同，而且组成成分也有一定的差异，而一般在微藻的生 产中不仪要获得高产量，还需要提高微藻产品质量，也就是提高有经济价值的生物活 性物质的含量，因此必须改进海洋微藻的育种技术，从而对微藻的种质进行改良以培 养出高产e p a 和d h a 的新品种，满足人们对e p a 和d h a 目益增长的需求。 目前，大多数生产厂采用的藻种多为从自然界直接分离获得，后代的性状单一、 稳定，容易出现诸如对温度的适应能力差、藻种退化等一系列急需解决的问题【2 4 l 。为 解决这些问题，选育出能满足多种用途、适用于多种培养环境的藻株，以丰富海洋微 藻的种质资源，选育新品种，可以借鉴农作物育种上常用的诱变技术来对藻种进行改 良。现在一般是采用物理的、化学的或生物的手段，以引起细胞核染色体断裂、缺失、 碱基置换、基因重组等生物学效应，从而使后代性状发生变异【”】，其中化学诱变方法 主要是采用诱变剂，物理诱变手段主要采用激光、离子束、射线辐照等方法，而生物 学的方法主要有细胞融合、转基因等。 1 2 3 1 化学诱变育种 化学诱变始于2 0 世纪初，1 9 4 3 年o c h l k e r s 2 6 1 用脲脘处理月见草以后，化学药剂 的诱变作用得到肯定，5 0 年代末得到广泛的研究并逐渐取得成果。化学诱变剂种类 很多，在诱变育种方面应用较广泛的是甲基磺酸乙酯( e t h y lm e t h a n e s u l p h o n a t e ，简写 为e m s ) 、亚硝基胍( n m e t h y l - n7 n i t r o s o g u a n i d i n e ，简写为m n n g ) 、叠氮化钠( n a n ) 和平阳霉素( p y m ) 等“。 化学诱变是一种迅速发展的育种途径，具有以下特点【2 q ( 1 ) 诱变突变率较高， 具有位点特异性；( 2 ) 染色体畸变的比例相对较少，很少有致死型发生，对处理材料 损伤轻：( 3 ) 有迟效作用，即诱变引起的损伤和染色体断裂，但有的并不立即断开； ( 4 ) 存在残留药物的后效作用，在m 代引起的生物损伤大；( 5 ) 引起的突变范围广， 后代选择需要足够大的群体；( 6 ) 价格便宜，操作简单，不需要特殊设备。 5 南京理t 大学硕士论文海洋微藻的诱变育种及其脂肪酸的测定 化学诱变育种所特有的优点，使其得到了广泛的应用。1 9 9 0 年张学成、谭桂英 等1 2 8 利用e m s 对钝顶螺旋藻( s p u f i n ap l a t e n s i s ) 进行诱变处理，然后在群体及个 体水平上进行形态学观察及生长速度的测定，结果表明，螺旋藻在诱变处理后不但在 形态( 藻体长度、螺距、螺旋数等) 及生长速度产生了遗传的变异，而且耐低温性能 也有所改进。1 9 9 5 年s i v a n 等用m n n g 诱变紫球藻( p o r p h y r i d i u m c r u e n t u m ) ，得到 了抗除草剂d c m u 的突变品系；殷春涛等 2 9 1 1 9 9 7 年用m n n g 处理钝顶螺旋藻，得 到藻丝形态明显改变，能够耐受低温的一株突变品系。陈峰等人1 3 0 川也曾用m n n g 和e m s 对螺旋藻及角刺藻( c h a e t o c e r o s ) 进行了化学诱变及克隆筛选，结果表明诱 变后微藻的细胞形态及生理特性都发生了变化，说明化学诱变可以在微藻优良品系的 筛选中得到应用。 虽然化学诱变育种优点很多，但是它也有其不足的一面，主要表现为：( 1 ) 突变 频率尚不够高；( 2 ) 突变方向难以掌握，具有很大的随机性；( 3 ) 对后代突变体的鉴 定所需工作量大；( 4 ) 化学诱变剂毒性大，具有残留效应。因此，将生物技术与化学 诱变育种相结合，对突变体的遗传研究和定位突变会更加有效和准确【2 7 】。 1 2 3 2 射线辐照诱变育种 1 9 2 7 g m u l l e r d 2 1 利用x r a y 诱导果蝇突变获得成功，从此开辟了辐射诱变育种新 领域，在此后几十年的诱变育种工作中，人们尝试了许多诱变手段，如x r a y l 、y - r a v 、 中子束、电子束等，并取得很大的成绩。1 9 9 8 年汪志平等3 3 1 采用6 0 c o 吖射线照射不同 品系和形状的螺旋藻丝状体，结果表明低剂量可刺激藻细胞生长，藻丝的辐射敏感性 又因品系和形态的不同而存在显著差异，并得到了细胞宽大、低温下能良好生长的突 变体。传统的辐射诱变育种技术虽然成效显著，但在育种工作中普遍存在m 1 代存活 率低，m 2 代突变谱窄，重复性、方向性差和诱变效率低等不足。 1 2 3 3 激光诱变育种 激光诱变育种技术广泛运用于微生物育种上【3 4 】，在藻类育种上则运用较少，陈必 链等【35 】用半导体激光技术对钝顶螺旋藻进行辐照，结果表明诱变处理对藻体形态、叶 绿素a 含量和p 胡萝卜素的含量等均有促进或抑制作用，具有明显的诱变效应。2 0 0 1 年，黄鹭强、王明兹等f 3 6 】采用波长6 5 0 r i m 、功率4 0 m w 和功率密度1 3 w e r a 2 的半导体 激光对紫球藻进行诱变，结果表明，适当的诱变时间对加快紫球藻的生长和提高胞外 多糖含量都有促进作用。虽然诱变结果是正向的，但是半导体激光辐照对细胞和细胞 壁都有一定程度的损伤，因此采用合适的波长、功率和照射时间是必须考虑的因素。 1 2 3 4 离子束诱变育种技术 南京理t 大学硕i ：论文海洋微藻的诱变育种及其脂肪酸的铡定 离子注入是8 0 年代广泛应用于金属材料表面改性的一项高新技术。在8 0 年代中 期，我国创立了低能重离子生物学，并证实注入离子对植物和微生物均有良好的诱变 效应【3 ”。离子注入生物体集能量沉积、动量传递、质量沉积和电荷的中和与交换4 种 作用于一体【3 龇，同时又具有集束性好、射程可控、能量沉积和质量沉积区域集中以及 质、能、荷组合多等特点，因此与目前其他的诱变源相比，具有损伤轻，突变率高和 突变谱广的特点，还具有一定的方向性和可控性，是人工诱变方法的一个新发展。 2 0 0 1 年古绍彬、姚建铭等【3 9 】以球等鞭金藻( i s o c h r y s i s g a l b a n a3 0 1 1 ) 为材料，对 其进行离子注入诱变体系的建立及注入后的生物学效应的初步研究。离子注入的诱变 结果与紫外线、7 射线等其他射线辐照生物有机体存活曲线呈“肩型”或“直线型” 不同，而是与离子注入陆地生物有机体后的存活曲线相近，这项研究为探讨离子束生 物技术应用于海洋生物体遗传改良中的可行性提供了科学依据。由于离子注入工艺和 注入参数对生物体的诱变效率有很大影响，因此，选择离子注入条件以及深入了解离 子注入剂量与微藻存活的关系对确定最佳注入离子的种类、能量和注入剂量都有重要 的指导意义，并且还为海洋微藻育种工作提供了科学依据。 1 2 3 5 紫外线诱变技术育种 紫外线是应用广泛的多功能物理诱变剂，它在工业微生物育种领域取得了令人瞩 目的成效。2 0 0 1 年，庄惠如、王明兹等 4 0 l 利用紫外线对雨生红球藻( h a e m a t o c o c c u s p l u v i a l i s ) 进行了诱变育种处理，结果显示，两个突变株与出发株相比，不仅营养细 胞的个体较大，而且周质空间较宽，形成的大孢子也较多。两个突变株生长速率也比 出发株的提高了8 2 1 1 8 ，并且虾青素累积能力明显得到增强。1 9 9 2 年，陈声明、 董淡如等【4 l 】采用紫外线诱变进行了选育优质的高产海藻酸产生茵的研究，结果显示诱 变后，海藻酸的纯度也得到了提高。其它参数也很理想。 1 2 3 6 紫外线、激光复合诱交育种技术 2 0 0 1 年，庄惠如、陈必链等【4 2 1 用紫外线和激光复合诱变用来生产虾青素的雨生红 球藻，以适宜条件下的生长速率和亚适宜条件下的虾青素累积能力为筛选指标，结果 表明，紫外线诱变后的色素累计能力与原始出发株比，提高了3 7 ，8 ，但生长速率与 原始出发株相比有所下降；经紫外线、激光复合诱变后，雨生红球藻的生长速率提高 了1 1 1 ，培养1 个月时虾青素累积量提高了5 2 2 ，电镜观察结果表明，激光可刺激 叶绿体发育，从而改善了紫外线诱变后的生长抑制状况，展示了复合诱变是筛选高产 虾青素藻株的有效方法。 1 2 3 7 细胞融合育种技术 7 南京理工人学硕上论文海洋微藻的诱变育种及其脂肪陵的测定 海洋微藻生长快、周期短、可塑性强，是进行生物工程的良好材料和载体，不同 种、不同属甚至不同门之间藻细胞的融合较其他遗传工程的操作更加容易进行。沈继 红等人【4 3 】利用细胞化学融合法，将生长迅速的兼养徽藻四鞭藻( t e t r a s e t m i ss p ) 和 富含e p a 矛 i d h a 的自养微藻绿色巴夫藻( p a v l a v av i r i d i s ) 进行融合。根据两种亲本 藻的不同生长特性和脂肪酸组成差异，筛选出一种新型的微藻。利用随机扩增多态性 d n a 技术( r a p d ) ，对融合子进行鉴定，确认融合子为一种新型的微藻。实验所得 到的融合藻株，虽然比亲本兼养藻株各方面的指标均有明显提高，但比亲本自养藻株， 总脂及e p a 和d h a 的含量还不够理想，需要进行优化培养方面的工作，进一步提高融 合藻株的e p a 和d h a 含量，为工业化生产打下基础。 1 2 4 多不饱和脂肪酸( p u f a ) 的提取及分析测定方法的研究 1 2 4 1p u f a 的提取方法研究 从微藻中提取、分离和纯化p u f a ，特别是用来生产高含量的e p a 牙 i d h a 的方法 有：溶剂提取法、尿素包含法、真空蒸馏法、分子蒸馏法、高效液相色谱法、超临界 c 0 2 提取法、低温冷冻法、金属盐形成法和脂肪酶浓缩法等【4 4 1 ，为了进一步提高e p a 和d h a 的浓度，一般是将几种方法结合起来使用。 e m ，g r i m a 等人比较了几种常用萃取体系对球等鞭金藻细胞中p u f a 的萃取 效率，从脂肪酸分析结果可以看出，采用氯仿，甲醇1 水体系来提取p u f a 的效率是所有 体系中最高的。除此以外，正己烷乙醇体系的提取效率也比较高，并且两者都是符 合食品工业溶剂标准的试剂，因而该体系有望为实际生产所采用。另外，从脂类萃取 及直接皂化结果来看，两者所获得的p u f a 的量并没有发生较大的改变，但直接皂化 减少了脂类的提取过程节约了时间和开支，大大地提高了提取分离的效率，是为一种 值得借鉴的好方法。目前有望在实际中得以应用的，相对比较完整、经济的提取工艺 是a r o b l e sm e d i n a 和c a r t e n s m 等 5 】提出的三步法，即首先利用直接皂化法从藻细胞 中提取脂肪酸组分，然后用尿素结晶法对p u f a 进行浓缩，最后利用高压液相色谱进 行e p a 平i d h a 的分离纯化。而此前z v ic o h e n 等1 9 9 1 年提出的方法工艺过程较为复杂， 因此没有太大的实际意义忙j 。 从微藻体内提纯p u f a 的工艺尚不成熟，在选择分离方法时，除考虑成本、效果 等因素外，应以反应条件温和、不会造成油脂的氧化为原则；在选择萃取溶剂时应避 免使用氯仿、甲醇等有毒试剂( 虽然其萃取效率相对较高) ，而首先选用符合食品工 业溶剂标准的如乙醇、正已烷等溶剂【3 l 。因此，研究出一套简便有效、可以用于工业 化大量制备的提纯方法是目前工作的重点。 1 2 4 2p u f a 的分析测定方法研究 8 南京理工人学硕士论文海洋微藻的诱变育种及其脂肪馥的测定 快速、简便、准确地测定微藻中的p u f a 对加快和促进从微藻中提取p u f a 的 研究有着现实的意义。气相色谱是一种高效能，选择性好，灵敏度高，操作简单，应 用广泛的分离分析方法，在环境监测、药物分析及工业分析上都得到了广泛的应用。 但是由于它适用于沸点在5 0 0 以下，热稳定性好，相对分子质量在4 0 0 以下的物质， 因此对于海洋微藻中的脂肪酸，用g c 直接分析有困难，往往拖尾严重，或被吸附、 热解等，为解决这个问题，可采用衍生化技术1 4 ”，即将脂肪酸制成具有一定挥发性的 衍生物，使之可以用g c 进行测定。经常使用的是甲酯化试剂，与羧基作用生成相应 的甲酯，即可进行g c 分析。采用毛细管柱作为气相色谱柱的毛细管气相色谱法 ( c a p i l l a r yg a sc h r o m a t o g r a p h y ，c g c ) 已成为g c 中的主流，它具有高效、快速、渗 透性好、灵敏度高等优点。但是必须对仪器和操作条件要求严格，特别是对进样和捡 测器，死体积要小，如连接不当就会影响柱效m j 。 蔡阿根等 4 6 1 曾经以正十九酸( c 1 9o ) 作为内标，用h c l 一c h 3 0 h 对( 海洋微藻) 三角褐指藻进行抽提酯化后作毛细管气相色谱分析，方法的重现性好，各脂肪酸的相 对偏差为0 | 3 1 1 ，6 ，脂肪酸回收率在8 5 7 1 0 3 3 ，仪器稳定性的相对偏差为 0 2 3 1 。廖启斌等1 4 7 l 也曾以正十九酸( c 1 9 0 ) 作为内标，对三角褐指藻、盐生 杜氏藻、小球藻和等鞭金藻抽提酯化后进行毛细管气相色谱分析测定，方法的重现陛 好，相对偏差为o 5 3 5 4 9 ，回收率很高，在9 5 1 1 0 2 3 之间，检测限为 o 0 0 7 2 l _ t g 。气相色谱分析方法比较简便，所需样品量少( 5 m g t o m g ) ，为大批量分 析海洋微藻中的脂肪酸，开发和利用海洋微藻资源及植物化学、药物化学等领域的研 究，提供了一种实用的分析方法。 虽然利用气相色谱分析方法来测定海洋微藻中脂肪酸的含量有诸多优点，但是传 统的定量分析方法一般是采用正十九酸作为内标。当试样中某些组分不能流出色谱峰 ( 如不汽化、不分解或检测器检测不到信号) 或只需测定试样中某几个组分时才采用 内标法定量，并且采用内标法时，内标物的选择至关重要，每次分析都要准确称取试 样和内标物的质量，因此不宜于作快速控制分析h ”。如果采用操作简单、不需要校正 因子的外标法，只要严格控制操作条件及进样量，就可以方便、快速的得到准确结果。 1 3 论文研究的目的及惹义 目前，国内外对于p u f a 的作用机理和用途研究得很多，但在利用微藻生产p u f a 方面，仍然存在许多没有攻克的技术难题：( 1 藻种选育方面，功能成分的含量不 高，淡水小球藻的生长因子( c h l o r e l l ag r o w t hf a t o r ，简称c g f ) 等含量和产量虽然 高于海水小球藻，但不饱和脂肪酸含量低，因此将两者优良性状有机结合、取长补短 是研究和开发中的重要问题；( 2 ) 培养技术方面，功能成分的含量强烈受到环境条 9 南京n u l l 大学硕i ：论文海洋微藻的诱变育种及其腊肪酸的测定 件、营养因子的影响，后代性状不稳定，培养技术有待完善；( 3 ) 提取和分离方法 上，以溶剂浸提取为主，没有形成系统的将所有功能成分综合分离的技术体系，因此 功能成分产出率低、成本高、生理活性较差，加工后的废弃物未能进行有效回收和利 用。 针对目前在培养海洋微藻生产p u f a 上遇到的技术难题，主要进行以下几方面的 研究： ( 1 ) 在藻种选育方面，研究的关键是分别采用化学诱变剂e m s 和”c o - 射线 辐照两种育种技术对两种海洋微藻( 海水小球藻和等鞭金藻) 进行诱变处理，并以未 作诱变处理的藻种为对照组，以培育出性状稳定、富含功能成分的新品种，突破了目 前普遍采用的培养筛选技术； ( 2 ) 利用生物统计学的检验方法来确定诱变处理组与对照组的藻细胞生长繁殖 速度的差异显著性及诱变处理组之间的藻细胞生长繁殖速度的差异显著性，这种分析 方法比简单的图表分析更具科学性和说服力； ( 3 ) 在对海洋微藻中的脂肪酸进行气相色谱分析时，采用绝对标准曲线法( 即 外标法) 来进行定性分析，比以往普遍采用的内标法进行定性分析更加简便、快速， 并且不失准确； ( 4 ) 针对诱变育种的不足之处，计划利用细胞融合技术，将诱变后e p a 或d h a 含量较高但生长速度缓慢的新藻种与生长迅速的淡水小球藻和螺旋藻相融合，培育出 更加优良的新品种。 1 0 南京理工大学顶士论文海洋微藻的诱变育种及其脂肪酸的测定 2 化学诱变处理对海洋微藻生长的影响 实验中所使用的化学诱变剂甲基磺酸乙酯e m s 是一种烷化剂，目前已成为在作 物诱变育种中应用最广泛、诱变效果最好的一种化学诱变剂【4 8 i 。e m s 的烷化作用主 要发生在d n a 的鸟嘌呤n 一7 位置上，烷基取代h 离子后，使之成为一个带正电荷的 季铵基团，从而发生两种遗传效应：一是烷化的鸟嘌呤与胸腺嘧啶配对，代替胞嘧啶， 发生转换型的突变；二是由于鸟嘌呤的n 一7 烷基活化，糖苷键断裂造成脱嘌呤，脱去 鸟嘌呤的d n a 分子，在进一步复制时，原来的鸟嘌呤的位置成了一个空位，其互补 位置上的碱基就不