（食品科学专业论文）半硬质干酪附属发酵剂的筛选及其对干酪风味影响的研究.pdf

摘要 摘要 附属发酵剂是指为了改善干酪感官品质或( 和) 加速干酪成熟而特意添加的微生 物。本文从传统发酵食品中分离到1 2 株能在干酪成熟环境中良好生长的乳杆菌；然后 以菌株自溶能力和胞内总肽酶活力为指标，筛选出具有良好附属发酵剂应用潜力的菌 株s p 3 和s p - 4 。经进一步产香评定，s p 3 能够提高产品的风味强度和风味接受度，并 且能促进产品奶香风味和坚果风味的形成。因而选定s p - 3 为试验菌株。生物学特性研 究表明s p - 3 在p h 4 - - 6 及6 n a c l 浓度的液体m r s 中的生长几乎不受影响，并能耐受干 酪成熟的低温环境。经菌种鉴定，s p - 3 为植物乳杆菌。 采用无菌条件下生产的新鲜干酪凝乳制作干酪模型，并以反映蛋白质水解程度的 w s n 、1 2 t c a s n 以及游离氨基酸浓度等作为干酪成熟指标来快速评价添加植物乳杆 菌s p - 3 对干酪成熟的影响。水溶性氮浓度测定及干酪电泳分析表明，植物乳杆菌s p - 3 对干酪中蛋白质的初级水解无显著影响；1 2 t c a s n 的测定及r p h p l c 对干酪水溶 性提取物的分析表明影响了干酪中小肽的形成；总游离氨基酸浓度测定结果表明植物 乳杆菌s p 3 促进了体系中游离氨基酸的产生；个体游离氨基酸的分析显示亮氨酸、异 亮氨酸、缬氨酸的含量明显高于对照组，而苯丙氨酸、丝氨酸、酪氨酸的含量低于对 照组。以上结果表明，植物乳杆菌s p - 3 加快了干酪体系中蛋白质的水解进程，具有促 进干酪成熟的作用。 采用固相微萃取( s p m 匣) 富集干酪模型中的挥发性风味物质，并以气相色谱一质 谱联用仪( g c m s ) 检测结果来评定植物乳杆菌s p 3 对干酪挥发性风味的影响。结果 表明，添加植物乳杆菌s p - 3 的干酪模型中2 一丁酮、2 甲基1 - 丙醇、3 - 甲基- 1 - 丁醇、1 一 戊醇、4 甲基2 戊醇、3 羟基- 2 丁酮等具有坚果味、水果味和奶油味的物质明显高于 对照组，而二甲基硫化物和3 甲硫基1 一丙醇的浓度则低于对照组。 以植物乳杆菌s p 3 作为附属发酵剂应用于半硬质干酪的生产，测定了干酪生产过 程中的工艺参数，结果表明其对半硬质干酪的正常生产工艺无显著影响；试验组干酪 生产时添加s p 3 的浓度为4 0 x 1 0 4 c f i d m l ，成熟三个月时浓度达到最大( 3 4 x 1 0 5 c f u g ) ， 之后乳杆菌的浓度出现降低的趋势，这可能与乳杆菌发生自溶有关；植物乳杆菌s p 3 对于酪的成熟具有促进作用，成熟两个月后，添加s p 3 组干酪的总游离氨基酸含量几 乎是对照组的两倍；干酪产品感官评定及主成分分析结果表明，添加植物乳杆菌s p 3 对半硬质干酪的风味产生了影响，促进了干酪奶香风味和坚果风味的形成。 关键词：附属发酵剂，干酪成熟，干酪促熟，植物乳杆菌，风味改善 江南大学硕士学位论文 a b s t r a c t a d j u n c tc u l t u r e sc a l li m p r o v ed e v e l o p m e n to fc h e e s es e n s o r yq u a l i t ya n da c c e l e r a t e c h e e s er i p e n i n g 1 2s t r a i n so fl a c t o b a c i l l u sw e r ei s o l a t e df r o mt r a d i t i o n a lf e r m e n t e df o o d sf o r t h e i rg o o dg r o w t hp e r f o r m a n c ei nc h e e s er i p e n i n gc o n d i t i o n s t w os t r a i n sw h i c hl a b e l e da s s p - 3 a n d s p - 4 ”w e r es c r e e n e df o ri t sg l o b a lp e p t i d a s ea c t i v i t i e sa n d h i 【g hl y s i sc a p a c i t i e s s t r a i ns p 3w a sf i n a l l yd e t e r m i n e dt ob es e l e c t e df o rf u r t h e rs t u d yf o ri t sb e t t e rc o n t r i b u t i o n t oc h e e s em o d e lf l a v o u rd e v o l e p e m e n t i tw a sc l a s s i 丘e da sl a c t o b a c i l l u sp l a n t a r u mb ya p i i d e n t i f i c a t i o ns y s t e m c h e e s em o d e lw h i c hw a sm a d ea s e p t i c a l l yu s i n gf r e s hc h e e s ec u r dw a su s e dt or a p i d l y e v a l u a t e de f f e c to fs t r a i ns p 3o nc h e e s er i p e n i n g w s n 1 2 t c a s na n df r e ea m i n oa c i d s c o n t e n t se t c a st h ep r o t e o l y s i si n d e xw e r er e g a r d e da sr i p e n i n gi n d e x 耶硷v a l u eo fw s na n d t h ee l e c t r o p h o r e t i cp r o f i l ef o rc a s e i nd e g r a d a t i o ni nc h e e s em o d e li n d i c a t e ds p - 3h a dn o i n f l u e n c eo nc a s e i np r i m a r yp r o t e o l y s i s r e v e r s ep h a s eh p l co f w a t e r - s o l u b l ee x t r a c t so f t h e s l u r r i e si n d i c a t e dd i f f e r e n c e si np e p t i d ep r o f i l e sb e t w e e ns l u r r i e sw i t hn o n s t a r t e rc o m p a r e d w i t ht h ec o n t r 0 1 a n dt h es i g n i f i c a n td i f f e r e n c eo f1 2 t c a s na l s oa p p r o v et h i sr e s u l t t o t a l f r e ea m i n oa c i d sa n di n d i v i d u a la m i n oa c i d sc o n c e n t r a t i o n sa l s os u g g e s tv a r i e dp r o t e o l y t i c c a p a b i l i t i e sb e t w e e nn o n s t a r t e rs t r a i n si nc o n t r o la n do t h e rc h e e s e s s l u r r i e sc o n t a i n i n g l a c t o b a c i l l u sp l a n t a r u ms p 3r e l e a s e dm o r ea m i n oa c i d s ( 1 e u c i n e ，i s o l e n c i n e ，v a l i n e ) t h a nd i d c o n t r o ls l u r r y v o l a t i l ef l a v o u rc o m p o u n dp r o d u c e di nr i p c n dc h e e s es l u r r i e sm o d e lw a ss t u d i e db ug c m s a n dt h ed i f f e r e n c eo ff l a v o u rc o m p o u n d sb e t w e e ns l u r r i e sc o n t a i n i n gl a c t o b a c i l l u s p l a n t a r u ms p 3a n dt h ec o n t r o ls l u r r i e sw a sd e t e c t e d i nc o n t r a s tt ot h ec o n t r o ls l u r r i e s s l u r r i e sc o n t a i n i n gl a c t o b a c i l l u sp l a n t a m t ms p 一3h a dh i g hc o n c e n t r a t i o no f2 - b u t a n o n e 。2 m e t h y l - 1 - p r o p a n o l ，3 - m e t h y l - l - b u t a n o l ，3 - h y d r o x y - 2 - b u l a n o n ew h i c hc o n t r i b u t en u t t ya n d c r e a m yf l a v o u r s e m i - h a r dc h e e s e sw e t em a n u f a c t u r e di no p e nv a t st os t u d yt h ei n f l u e n c eo fa d j u n c t c u l t u r eo fl a c t o b a c i l l u sp l a n t a r u ms p 一3o np r o t e o l y s i sa n dt h ed e v e l o p m e n to fs e n s o r y c h a r a t e r i s t i c sd u r i n gr i p e n i n g l a c t o b a c i l l ii nt h ee x p e r i m e n t a lc h e e s e sr e a c h e dl n a x i n l a ( 3 4 + 1 0 6o f u g ) a t - 3m oa n dt h e nd e c r e a s e dt o1 0 0t o1 0 7 c f u ga t6m o n u m b e r so f l a c t o b a c i l l i i nt h ec o n t r o lc h e e s e sw e r el o w e rt h a ni nt h ee x p e r i m e n t a lc h e e s e su n t i l6m oo fr i p e n i n g a s s e s s m e n to f p r i m a r yp r o t e o l y s i sd u r i n gr i p e n i n gs h o w e de s s e n t i a l l yn od i f f e r e n c e sb e t w e e n t h ec o n t r o la n de x p e r i m e n t a lc h e e s e s h o w e v e r ，t h ee x p e r i m e n t a lc h e e s e sh a dc o n s i s t e n t l y h i g h e rl e v e l so ft o t a lf r e ea m i n oa c i d st h a nd i dt h e i rc o r r e s p o n d i n gc o n t r o l st h r o u g h o u t r i p e n i n g s e n s o r ya n a l y s i so ft h ec h e e s e s ( a t3a n d6m o ) s h o w e ds i g n i f i c a n td i f f e r e n c e s b e t w e e nt h ec o n t r o la n de x p e r i m e n t a lc h e e s e sw i t h r e s e c t t os o m ei m p o r t a n t s e n s o r y a t t r i b u t e s p r i n c i p a lc o m p o n e n ta n a l y s i so ft h es e n s o r yd a t ac l e a r l yd i f f e r e n t i a t e db e t w e e n f l a v o ro fc o n t r o la n de x p e r i m e n t a lc h e e s e s k e y w o r d s ：a d j u n c tc u l t u r e ，c h e e s er i p e n i n g , a c c e l e r a t ec h e e s er i p e n i n g , l a c t o b a c i l l u sp l a n t a r u m ，f l a v o u r i m p r o v e m e n t i l 独创性声明 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工 作及取得的研究成果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地 方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含 本人为获得江南大学或其它教育机构的学位或证书而使用过的材料。 与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明 确的说明并表示谢意。 签名：壑迄日期：刁年月，日 关于论文使用授权的说明 本学位论文作者完全了解江南大学有关保留、使用学位论文的规 定：江南大学有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和 磁盘，允许论文被查阅和借阅，可以将学位论文的全部或部分内容编 入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、 汇编学位论文，并且本人电子文档的内容和纸质论文的内容相一致。 保密的学位论文在解密后也遵守此规定。 签名：量也导师签名：五世 日期： 一司年月i 。日 第一章绪论 1 1 干酪及其成熟 第一章绪论 干酪俗称奶酪，英文名为 c h e e s e ，国人直译为鸡司或芝士。它是以乳或乳制品为 原料，通过添加乳酸菌发酵剂和凝乳酶，使乳中的蛋白质凝固，排除乳清，再经一定 时间成熟而制成的一种发酵乳制品【1 1 。干酪营养丰富，除蛋白质和脂肪外，还含有糖 类，有机酸，常量矿物质元素钙、磷，微量元素铁、锌，脂溶性维生素a 、胡萝b 素 和水溶性维生素等多种营养成分，是世界上乳制品的大宗产品之一1 2 j ，有“乳黄金”的称 号。干酪的主要成分是蛋白质和脂肪，其成熟过程是在一定的温度、湿度、p h 值、水 分含量等条件下，蛋白质、脂肪、糖在微生物和酶的作用下发生一系列复杂的生化反 应，从而形成干酪特有的风味，其组织状态和质地也得到进一步改善。 干酪成熟过程中主要有三类生化反应：蛋白质水解、脂肪分解和乳糖代谢。蛋白 质在干酪中残留的凝乳酶、乳内源性酶和微生物酶的作用下逐渐降解成大肽、小肽以 及氨基酸；脂肪在脂肪酶作用下水解成脂肪酸、醛类、醇类等一系列化合物：乳糖在 发酵剂的作用下，经糖酵解途径或异戊二糖途径产生乳酸。干酪成熟就是这些反应达 到一个理想程度的过程。 干酪成熟期间发生的三个最基本的生化发应中，蛋白质水解是最复杂也是最重要 的一种。干酪成熟过程中，蛋白质在一些酶类作用下逐步降解，使干酪风味和质构发 生变化( 包括硬度、流变性、黏结性、断裂性、延展性、熔化性、黏附性和乳化 性) 。干酪成熟过程中的蛋白质水解重要有以下酶类催化：凝乳酶、乳中的内源性酶 类( 血纤维素蛋白酶、组织蛋白酶d 、其它的体细胞蛋白酶) 、发酵剂和非发酵剂微 生物酶。干酪的品种不同，生产工艺不同，各种酶类在蛋白质水解中起的作用程度也 不同。 1 2 千酪中的微生物 许多种微生物与干酪有关，并且它们对干酪品质的形成是至关重要的。它们不仅 在生产和成熟阶段起作用，而且通常对形成各种特异干酪独特的风味、香气、外观与 质地有很大的作用。干酪的微生物群可以被简单的划分成两个主要区系：( 1 ) 发酵剂 和( 2 ) 次生菌群。此划分是基于于酪制作过程中发酵剂菌群会产生乳酸，而次生菌群 则不产生。 坚堡查堂婴主兰些堡苎 1 2 1 发酵剂 发酵剂可以进一步细分为一级发酵剂和二级发酵剂。一级发酵剂主要作用是产乳 酸，也参与干酪成熟过程中蛋白质和脂肪的降解。二级发酵剂是为了提供某些品种干 酪的特殊功能特征而添加到干酪中的一类发酵剂。如表面成熟干酪等。乳酸乳球菌、 嗜热链球菌、瑞士乳杆菌和德氏乳杆菌是在干酪生产中使用的主要发酵剂菌种。 1 2 2 次生茵群 次生菌群由细菌、霉菌和酵母茵的混合物组成。尽管不是绝对的，但通常特定的 混合菌群存在于特定种类的干酪中，而且它们有助于形成与其对应干酪的特定特性。 添加的次生菌群可以是菌种已知的培养物，但是许多情况下都由外源微生物组成，它 们或者由原料或者由环境进入到干酪中。这些微生物可以分为以下四个主要菌群： ( 1 ) 丙酸菌，例如费氏丙酸杆菌( p r o p i o n i b a c t e r i u mf r e u n d e n r e i c h i i ) ，它主要在瑞 士干酪的内部生长。 ( 2 ) 霉菌，例如娄地青霉菌，在青纹干酪的内部生长。 ( 3 ) 酵母菌，在涂抹的成熟干酪表面生长，比如t i l s i t e r 、m u n s t e r 、s a i n tp a u l i n 。 ( 4 ) 非发酵剂乳酸菌( n s l a b ) ，成熟期的许多不同种类的干酪的内部都含有 n s l a b ，它主要是由嗜温型乳杆菌组成，尽管片球菌属、肠球菌属和明串珠菌属也被 认为是n s l a b 混合物的一部分。n s l a b 定义为干酪中发现的不是发酵剂成分的乳酸 菌，也就是说，在干酪生产过程中，对于酸的产生不起作用。它们是在迄今为止所研 究的所有类型干酪中都能够生长的外源微生物。嗜温乳酸杆菌属可能是n s l a b 中最 常见的是一群微生物。对存放8 周的市售爱尔兰契达干酪的研究表明【3 】，其微生物群 落是由5 5 的类干酪乳杆菌( l b p a r a c a s e i ) 、2 8 的植物乳杆菌( l b p l a n t a r u m ) 和 1 4 弯曲乳杆菌( l b c u r v a t n s ) 组成。 在另外一系列研究】中，如m e s w e e n e y 等通过控制微生物的生长条件来生产契 达干酪，并且在生产过程中添加干酪乳杆菌干酪亚种( l b c a s e is s p c a s e i ) 、干酪乳杆 菌假植物亚种、弯曲乳杆菌和植物乳杆菌。在对照组的容器中检测到嗜温乳杆菌，其 数量最初为1 0 2e f u g ，在8 c 下成熟5 个月后数量增至1 0 6e f u g 。与此相对照的是，在 试验组干酪中，成熟初期的嗜温乳杆菌的数量就达到1 0 8e f u g 。据报道，含有嗜温乳 杆菌添加剂的干酪同对照组干酪相比，通常具有更强的风味而且风味更容易被人们所 接受。因此，大量证据支持以下这一猜测，即嗜温乳杆菌对干酪的品质的确有影响。 1 3 附属发酵剂的研究背景及现状 1 3 1 附属发酵剂的研究背景 1 3 1 1 新技术在干酪工业中的应用 2 第一章绪论 近年来，农场挤奶等技术及干酪生产技术、设备的发展使干酪生产用原料乳的微 生物数量非常低，特别是低温巴氏杀菌技术的应用，使原料乳几乎可达到无菌状态。 这对消费者食用乳制品的安全性是有利的，但这也导致了一些对产品风味品质有贡献 作用的非发酵菌的消失和数量的降低。干酪生产者必须寻求新的技术，从而提供给消 费者安全、品质稳定、高质量的产品，附属发酵剂应运而生。附属发酵剂是经过精细 筛选的，应用于干酪生产中可以提高产品的感官品质或加快干酪成熟从而降低生产成 本。与天然存在的n s l a b 相比，它是经过特别筛选、特意添加从而补充干酪的微生态 体系，起到全面提升产品品质的功效。 1 3 1 2 非发酵剂乳酸菌( n s l a b ) 对干酪品质的影响 m c s w e g n e yc t a l 和l y n c he t a l 使用巴氏杀菌技术( 7 8 ，1 7 s ) 以及在密闭容器内 进行干酪的生产的方法研究了非发酵剂乳酸菌( n s l a b ) 作用，结果发现它们对于酪 品质和风味有促进作用【铜。微滤是一种能够方便地将乳中固有微生物除去并避免伴随 巴氏杀菌产生的热诱导变化的技术。对利用原料乳，巴氏杀菌乳，微滤乳生产的契达 干酪进行的对比研究表明，用原料乳制作的干酪比用另外两种乳制作的干酪具有更浓 烈的风味。这表明，原料乳中的乳酸杆菌对风味的产生具有促进作用【4 】。 干酪中分离出来的嗜温乳杆菌对干酪品质的影响已经研究了几十年了。然而，这 些研究的结果是不确定的，一些研究表明它们对风味的形成有积极影响，而另一些研 究则表明有消极影响【7 一。产生这种结果的原因有可能是由于所选择的菌株潜在的形成 风味物质的能力不同，以及在干酪成熟过程中有外源菌株的影响存在。目前，关于这 个问题的大多数研究表明，嗜温乳杆菌添加剂对干酪风味的形成有促进作用 4 , 5 , 9 1 。 1 3 1 3 干酪工业发展的需要 干酪成熟是一个缓慢且昂贵的过程。加速干酪成熟可以降低干酪的生产成本，从 而受到人们普遍关注。在干酪生产中添加合适的附属发酵剂，可以加快干酪中生化反 应的进程，促进干酪风味物质的形成，从而可以起到加快干酪成熟的目的。 为了提供给消费者安全、品味一致并且在相对较短的成熟时间能形成高的感官品 质的干酪，干酪生产者和研究者开始研究并使用附属发酵剂( a d j u n c tc u l t u r e s ) 。筛选 合适的菌株作为发酵剂的辅助物添加，可以提高干酪的品质或加快干酪的成熟，给干 酪生产商带来可观的经济利益。适宜的菌株会通过在于酪中产生重要的风味化合物和 抑制有害菌的生长来提高干酪的风味，或者通过加快成熟过程中生化反应的进行起到 加快干酪成熟的作用。 1 3 2 附属发酵剂研究现状 嗜温乳杆菌属已经作为附属发酵剂在许多研究中使用。嗜温乳杆菌属在干酪牛奶 中的接种量在1 0 2 1 0 5 c f u m l 之间变化。在许多研究中，较高的接种量( 1 0 5c f u m l ) 被使用在巴氏杀菌干酪乳中，以便于使n s l a b 的数量与原料干酪乳中的数量相似。嗜 垩堕查兰堡主兰垡笙苎 温乳杆菌属，已经被单独地或以化合物形式的附属物来研究，包括l b c 础e i 、 l b p a r a c a s e i 、l b p l a n t a r u m 、l b b r e v i s 、l b c u r v a t u s 、l b r h a m n o s u s 。l y n c h 等l 研究添 加的嗜温乳杆菌属对控制微生物条件下生产的契达干酪中蛋白分解与风味产生的影 响。在试验干酪的磨制阶段，乳杆菌属的数量为1 0 4c f u g ，4 周后增加到5 x 1 0 7e f u g 。 对照干酪在1 0 0 天内没有乳杆菌属的存在，即使有其数量也不超过5 x 1 0 5e f u g 。比起 对照干酪，在试验干酪中将附属物添加到干酪牛奶中增加了其游离氨基酸的含量。 p u e h a d e s 等i l o j 分别以lc a s e i 、l 册嘲船p f 、lp l a n t a r u m 和lb r e v i s 作为附属发酵剂 应用于半硬质干酪的生产，结果发现lc a s e i 、lp a r a c a s e i 、lp l a n t a r u m 对于酪的风 味有贡献作用，而l b r e v i s 却引起干酪不良风味的产生。 筛选其他的n s l a b 或从非乳来源筛菌用作发酵剂辅助物的研究是有限的，但是一 般来说，可以利用与筛选嗜温乳杆菌辅助物类似的方法。m a r t i n 等【1 l 】研究了1 5 株非乳 源乳杆菌( 人体肠道菌) 和1 8 株乳源乳杆菌作为附属发酵剂应用于半硬质干酪的生产 的潜力，发现其中9 株可以在干酪环境中生长并在成熟过程中成为优势菌群，添加组 的产品与对照组相比感官品质得到提高。 1 4 附属发酵剂的筛选标准 ( 1 ) 所选菌株能够在干酪高选择性环境( 2 6 n a c i 浓度，p r i 5 0 ，5 - 1 3 ) 中生 长。关于理想的附属发酵剂对干酪成熟贡献作用的详细机理还不甚清晰，但一般认 为，合适的附属发酵剂在于酪成熟过程中应保持一定的浓度。 ( 2 ) 根据菌株具有的酶的水平及酶的特异性进行筛选。 从文献报道中可以看出，乳酸菌内含有的蛋白酶、肽酶和酯酶浓度因属、种及菌 株的不同而有很大的差异。l a m a 等【1 2 】研究了p h 、n a c i 和c a c l 2 浓度对乳杆菌和乳球 菌氨肽酶活力的影响，并评价了这些酶对干酪成熟过程中蛋白质水解的作用。结果表 明，非发酵剂乳酸菌对于酪的成熟起着重要作用，它们的存在对于干酪全部风味的形 成是必不可少的。 对一些附属发酵剂菌株胞内酶的研究发现，附属发酵剂提高干酪风味和品质的能 力是由于在干酪成熟过程中其氨肽酶对酪蛋白及其降解产物作用的结果。据报道，附 属发酵剂乳杆菌比乳球菌胞内酶活高5 - 1 0 0 倍，具有降解疏水性氨基酸和降低苦味的潜 力。近来，m e ls o d a 等1 1 3 研究了添加乳杆菌的半硬质干酪中蛋白质水解和风味形 成。研究结果表明，具有高的肽水解潜力尤其是低产酸能力的乳杆菌作为附属发酵剂 生产的半硬质干酪蛋白质水解水平最高，风味最好，并且对生产工序和干酪品质未产 生不利的影响。因此，高的胞内酶活力特别是氨肽酶活力的乳杆菌具有比较大的作为 优良附属发酵剂应用的潜力。 ( 3 ) 菌株的自溶速率 菌体胞内酶对干酪品质及风味的形成有着重要影响作用。菌株只有发生溶解后， 4 墨= 兰堡堡 胞内酶才能释放出。k a w a b a t a 等 1 4 】和l 印e u p l e 等指出乳球菌细胞的及早溶解可以使 胞内肽酶释放并且在干酪中保持活性。发酵剂细胞溶解的程度与蛋白水解的程度可能 有关。发酵剂的溶解导致游离氨基酸的增多和苦味的降低【1 6 1 。对发酵剂和非发酵乳酸 菌自溶性质的研究显示细胞的自溶倚赖于菌株 1 7 , 1 8 , 1 2 0 。 1 5 本课题的立题依据 为了提供给消费者安全、品味一致并且在相对较短的成熟时间能形成高感官品质 的干酪，干酪生产者和研究者开始研究并使用附属发酵剂( a d j u n e tc u l t u r e s ) 。筛选合 适的菌株作为发酵剂的辅助物添加，可以提高干酪的品质或加快干酪的成熟，给干酪 生产商带来可观的经济利益。适宜的菌株会通过在干酪中产生重要的风味化合物和抑 制有害菌的生长来提高干酪的风味，或者通过加快成熟过程中生化反应的进行起到加 快干酪成熟的作用。 干酪是一种高热量、高营养的食品，有着“奶黄金”的称号，一公斤干酪相当于十 公斤液体牛乳的营养价值。每日摄入少量干酪就可提供人体所需的营养，因此干酪是 一种高营养的方便食品。随着人们生活节奏的加快，大都市的消费习惯西化趋势的增 强，可以预见干酪在中国发展的潜力非常大。目前国内消费的干酪主要来源于进口。 由于进口干酪价格高、风味浓烈等因素限制了其快速发展。通过添加合适的附属发酵 剂可以改善产品的风味和降低成本( 加快干酪成熟，缩短成熟时间，从而降低成本) ，从 而使生产适合中国消费者口味且价格合理的干酪产品具有可行性。 国外对于干酪附属发酵剂的研究较多，但其筛选来源主要是干酪、生乳等，近年 来也有其它来源的乳酸菌作为附属发酵剂应用的研究报道，如m a r t i ne ta 1 【l ”( 2 0 0 2 ) 研 究了1 5 株非乳源乳杆菌( 人体肠道菌) 作为附属发酵剂应用于半硬质干酪的生产的潜 力，发现其中5 株可以在干酪环境中生长并在成熟过程中成为优势菌群，添加组的产 品与对照组相比感官品质得到提高。国内对干酪附属发酵剂的研究几乎为零，这可能 与我国干酪工业的发展缓慢有关。为了促进我国干酪产业的发展及满足消费者对高品 质、价格适中干酪产品的需求，筛选加快干酪成熟和改善风味的附属发酵剂菌株具有 定必要性。 中国传统发酵食品，因其特有的风味而备受青睐。这些食品中具有丰富的微生物 来源，它们对这些食品风味的形成具有重要作用。从中筛选具备附属发酵剂特征的乳 酸菌具有一定的可行性。国内许多研究者从中筛选特定的微生物用于发酵食品的生产 取得了一定效果。上海酿造研究所从中国传统豆酱中筛选得到一种植物乳杆菌( 沪酿 1 0 8 植物乳杆菌) ，将其作为附属菌种应用于豆酱制作中，短期发酵产品风味可与传统 长期自然发酵产品媲美，植物乳杆菌的添加促进了产品中风味物质的形成1 6 2 1 。另外， 从菌种安全性考虑，这些发酵食品中的菌是经长期食用被证明安全的菌种，因此应用 这些菌生产的干酪可保证干酪的安全性问题。 翌亘奎兰塑主兰垡堡苎 鉴于以上原因，从腐乳、豆酱、泡菜等我国特色的发酵食品筛选合适的乳酸菌作 为附属发酵剂应用于干酪的生产具有一定可行性，本研究对我国干酪产业的发展及传 统乳酸菌的开发利用具有一定意义。 1 6 本课题的主要研究内容 本课题的目标是从腐乳、豆酱、泡菜等我国特色的发酵食品中筛选出合适的干酪 附属发酵剂菌株，其能够在干酪高选择性成熟环境中生长并能够加快干酪中蛋白质的 水解进程，起到促进干酪成熟或风味改善的效果。具体研究内容如下： ( 1 ) 干酪附属发酵剂的分离、筛选、初步鉴定及部分生物学特性的研究； c 2 ) 干酪模型中附属发酵剂蛋白质水解特性的研究； ( 3 ) 干酪模型中附属发酵剂产挥发性风味物质的研究； ( 4 ) 附属发酵剂在半硬质干酪中的应用。 6 第二章干酪附属发酵剂的筛选 2 1 前言 第二章干酪附属发酵剂的筛选 我国有着非常丰富的乳酸菌资源，将其应用于干酪生产，无论是对传统乳酸茵的 开发应用还是我国乳品行业的发展都具有重要意义。传统的乳酸菌经过了长期的应 用，具有安全及易被国人接受等特点，因此，筛选合适的菌株应用于干酪的生产，有 望研制出风味独特、适合中国人膳食口味的干酪产品。 为了提供给消费者安全、品味一致并且在相对较短的成熟时间能形成高感官品质 的干酪，干酪生产者和研究者开始研究并使用附属发酵剂( a d j u n c tc u l t u r e s ) 。附属发 酵剂可以定义为特意筛选的添加到干酪中的微生物，它们提高干酪的感官品质或 ( 和) 加快干酪的成熟。与n s l a b 相比，它们是被特意筛选并有意添加到干酪中的。 筛选合适的菌株作为发酵剂的辅助物添加，可以提高干酪的品质或加快干酪的成 熟，给干酪生产商带来可观的经济利益。适宜的菌株会通过在干酪中产生重要的风味 化合物和抑制有害菌的生长来提高干酪的风味，或者通过加快成熟过程中生化反应的 进行起到加快干酪成熟的作用。 文献报道，附属发酵剂一般是具有良好的产肽酶活性和自溶能力并能在干酪成熟 环境中生长的乳杆菌，因此本章实验主要目标是从泡菜、腐乳、豆酱等我国传统发酵 食品中筛选具备以上特征的乳杆菌，然后将其添加到干酪模型中，对能产生较好风味 的菌株进行菌种鉴定和部分生物学特性研究。 2 2 材料与设备 2 2 1 实验材料 泡菜汁：东北农家自制，将菜叶和汁水一起均质得到的匀浆； 腐乳：国内多家腐乳工厂生产的腐乳产品； 豆酱，辣酱，辣白菜：内蒙农家自制。 2 2 2 试剂与药品 2 2 2 1 试剂 名称规格 产地和厂家 7 江南大学硕士学位论文 结晶紫 生化试剂b r 氯化镉 生化试剂b r 氯化钠生化试剂b r 茚三酮分析纯a r n a h 2 p 0 4 1 2 h 2 0 分析纯a r k h 2 p 0 4分析纯a r 凝乳酶 分析纯a r 脱脂乳粉 食品级 亮氨酸 分析纯a r 柠檬酸钠 分析纯a r 2 2 2 2 培养基 上海试n - - 厂 上海试剂二厂 国药集团化学试剂有限公司 上海试剂二厂 国药集团化学试剂有限公司 国药集团化学试剂有限公司 法国罗地亚公司 新西兰乳业有限公司 国药集团化学试剂有限公司 国药集团化学试剂有限公司 调整的r o g o s a 琼脂培养基( m r o g o s a ) ：3 n a c l 浓度，p h 值为5 0 ( 用醋酸 调p h ) ，用于乳杆菌的选择性筛选； m r s 琼脂培养基：用于菌种的纯化及平板计数； m r s 液体培养基：用于菌种的增殖培养； 1 0 ( w v ) 脱脂乳培养基：用于菌种生长及产酸曲线的测定。 2 2 3 实验仪器与设备 仪器名称规格型号生产厂家 匀浆机 精密恒温水浴槽 高速冷冻离心机 电子天平 电子天平 p h 计 可调式移液器 u l t r at u r r a x t w 2 0 u n i v e r s a l3 2 p b 5 0 0 1 - s e l 2 0 4 3 2 0 s 1 m l l k a 德国j u l a b o 公司 德国h e t t i e h 公司 m e t t l e r t o l e d o 公司 m e l l l e r t o l e d o 公司 m e t t l e r t o l e d o 公司 德国e p p e n d o r f 公司 第二章干酪附属发酵剂的筛选 立式压力蒸汽灭菌器l s b 5 0 l上海华线医用核子仪器有限公司 隔水式电热恒温培养箱 p y x d h s 一5 0 x 6 5 一s上海市跃进医疗器械一厂 旋涡混合仪 超净台 w h 2 t h c b 4 0 2 紫外分光光度计i n - 7 5 4s w c j 2 3 实验方法 2 3 1 干酪附属发酵剂乳杆菌的初步筛选 上海沪西分析仪器厂 l a b c o n c o 公司 样品采集并经预处理后，以p n 6 8 的p b s 缓冲溶液浸泡混匀并梯度稀释，吸取合 适稀释度的溶液液倾注于调整的r o g o s a 琼脂平板( 3 n a c l 浓度，p u 值为5 0 ，近 似干酪成熟环境) 上，挑取典型菌落转接到m r s 平板纯化，镜检选取目的菌株转接入 m r s 液体增菌，获得乳杆菌菌株并保存。 2 3 1 1 平板倾注法分离培养 吸取1 0 0 p l 样品，无菌p h 6 8 的p b s 缓冲溶液梯度( 按1 ：1 0 ，1 ：1 0 0 ， 1 ：1 0 0 0 ，) 稀释，吸取合适稀释度的溶液1 0 0 v l l 于无菌培养皿，倒入5 0 c 左右的 调整的r o g o s a 琼脂培养基，立即混匀。凝固后倒置于厌氧箱3 0 ( 2 培养3 6 - 7 2 h ，长出 单个菌落。 2 3 1 2 菌株纯化 无菌条件下，挑取r o g o s a 平板上典型菌落，在m r s 平板上划线分离纯化，倒 置于厌氧箱3 0 培养2 4 h 。挑取单菌落进行镜检，直至确定所得的菌株已经纯化，作 为实验菌株。 2 3 1 3 镜检 无菌操作，挑取单个菌落，进行革兰氏染色，油镜观察菌体形态是否单一，并选 取g + 无芽孢杆菌为目标菌株。 9 江南大学硕士学位论文 2 3 1 4 菌株增菌 挑取m r s 平板上的单个菌落，转接到l m l m r s 液体，3 0 ( 2 静置培养2 4 h 左右， 再按2 接种量将培养液转接到新的m r s 液体，3 0 c 静置培养2 4 h ，再在液体m r s 中 重复扩增2 次，所得培养液4 c 保存，作为实验菌株进行以下实验。 2 3 2 干酪附属发酵剂乳杆菌的复筛 2 3 2 1 乳酸菌自溶度的测定 当乳酸菌的菌体细胞发生自溶时，自溶酶裂解细胞壁从而造成原生质体溶解，因 此菌体悬浊液在可见光范围内的吸光值下降了，根据这个实验结果，我们用检测菌体 悬浊液吸光值的减少来衡量菌体自溶的程度【2 n 。 将2 3 1 初步筛选得到的能在干酪成熟高选择性环境中生长的菌株接入m r s 培养 基中3 0 培养2 4 h ，连续活化两代，以2 0 o ( v v ) 的接种量接入液体m r s 中进行增殖培 养1 8 h ，将菌体培养液取出，冷冻离一q , ( 5 0 0 0 9 ，1 5 m i n , 4 ) ，将离心所得到的菌体悬浮 于0 0 5 m o l l 的p h 5 4 的柠檬酸钠盐缓冲液( 含1 5 9 l 的n a c i ) 中，调整初始 0 1 ) 6 5 0 m n 为o 8 1 0 。将带菌体的缓冲液置于1 3 培养箱内培养，每隔一定时间测定 o d 6 5 0 h m 吸光度的变化。自溶度的计算公式如下： 自溶度惭归1 0 0 - ( a t a o ) 1 0 0 a t 为菌体不同培养时间时的吸光值；a o 为起始菌体悬浮液吸光值。 2 3 2 2 菌体无细胞提取液的制备 将2 3 1 初步筛选得到的能在干酪成熟高选择性环境中生长的菌株接入m r s 培养 基中3 0 c 培养2 4 小时，连续活化两代，以2 ( v v ) 的接种量接入液体m r s 中进行增 殖培养1 8 h ，将菌体培养液取出，冷冻离心( 5 ，0 0 0 x g ，1 5 m i n ，4 ) ，收集菌体。将菌 体重新悬浮于o 0 5 m o l l 的p h 7 0 的磷酸缓冲液中，在冰浴中用超声波破碎菌体。冷冻 离心( 2 0 ，0 0 0 x g ，1 0 r a i n ，4 。o ) ，收集上清夜，即为菌体无细胞提取液( c f e ) ，2 0 下 储存备用。 2 3 2 3 蛋白质含量的测定 采用考马斯亮蓝g - 2 5 0 法测定蛋白质含量。以牛血清白蛋白为标样，测定不同浓 度下的a 5 9 5 。，制作标准曲线。 j o 第二章干酪附属发酵剂的筛选 0 8 0 7 0 6 0 5 l 0 4 0 3 此 n l 0 0 加柏卯 牛血清白蛋白( p 曲 图2 1 考马斯亮蓝g - 2 5 0 法测定蛋白质含量标准曲线 2 3 2 4 菌体无细胞提取液总肽酶活力的测定 ( 1 ) 镉茚三酮法测定总游离氨基酸含量 取1 9 氯化镉溶解于i m l 去离子水中，o 8 9 茚三酮溶于8 0 m l 的9 0 k , 醇和l o m l 的冰醋酸混合液中，两溶液混合摇匀，即得镉茚三酮试剂。精确配制2 o m m o l l 的亮 氨酸溶液，用蒸馏水稀释得到一系列不同浓度的亮氨酸溶液，加入2 m l 镉茚三酮试 剂，8 4 水浴中保温5 m i n ，取出室温下保持l o m i n ，在a , = 5 0 7 r m a 处测定吸光度圈。 0 511 5 亮氨酸浓度( t o o l l ) 图2 - 2 亮氨酸含量标准曲线 ( 2 ) 菌体无细胞提取液总肽酶活力测定底物的制作 以1 0 9 l 的浓度将酪蛋白溶解于0 0 5 m o l l 的柠檬酸钠溶液( p h 5 4 凝乳酶最适p h 值，含2 9 l 的叠氮钠) 中，8 5 下加热1 0 m i n ，水浴中冷却至3 0 c ，以1 2 0 m g 1 0 0 m l i 1 0 l 0 o o n 一邑g田一晕装昏 垩堕查堂堕主兰垡堡塞 的量加入凝乳酶( 凝乳酶加入前以1 ：2 0 的比例溶解于p h 5 4 ，0 0 5 m o l l 柠檬酸钠溶 液中) ，3 0 条件下酶解解2 4 h ，热处理( 8 5 ，1 0 m i n ) 使凝乳酶失活。用p h 7 0 、 o 0 5 m o l l 的柠檬酸钠溶液调节p n 为6 0 ，所得溶液通过o 2 岫的膜过滤，所得滤液 即为总肽酶活力测定的反应底物，- 2 0 c 储存备用田】。 ( 3 ) 菌体无细胞提取液总肽酶活力的测定 将1 0 0 l x g 蛋白含量体积的菌体无细胞提取液接种子1 0 0 此的底物中，在1 3 c 下培 养2 3 h ，测定溶液中总游离氨基酸的浓度，依此衡量各菌株总肽酶活力的高低幽。 2 3 3 菌株产香能力评定 取未成熟新鲜凝乳8 5 9 装入无菌拍打机专用无菌袋中，再加入1 0 m l 的灭菌蒸馏 水、1 5 m l 的待选菌株脱脂乳悬浮液( 菌体浓度1 0 9 c f u m l ) 和3 9n a c i ，与