（植物学专业论文）包埋玻璃化法冰冻保存两种饵料硅藻的研究.pdf

包埋一玻璃化法冰冻保存两种饵料硅藻的研究 捅费 内容摘要：本文共分两章，第一章是以小新月菱形藻( n i t z s c h i ac l o s t e r i u m m i n u t i s s i m aa 1 l e ne tn e l s o n ) 和牟氏角刺藻( c h a e t o c e r o sm u e l l e r i ) 为实 验材料，用包埋一玻璃化法对两种材料进行了超低温( 一1 9 6 ) 保存研究。第二 章为植物种质资源超低温保存的综述。 包埋一玻璃化法是在包埋脱水法和玻璃化法基础上发展起来的超低温保存植 物种质的新技术。它结合了包埋脱水法和玻璃化法的优点于一身，具有能同时 处理大量材料，处理后恢复生长快，对材料的毒害作用小等优点，己在2 0 余种 高等植物的种质保存中获得成功。但此法在藻类方面的报道几乎没有，本实验 填补了此项空白，并证明了该法对藻类冰冻保存的可行性。 本实验中，探讨玻璃化溶液( p v s ) 配方、装载液浓度和装载时间、脱水时间 以及洗涤过程对冰冻保存存活率的影响。结果表明： 1 p v s 配方对冰冻保存存活率的影响 在本实验选定的7 种玻璃化配方中，p v s 2 配方适合两种硅藻的冰冻保存。 2 p v s 脱水时间对冰冻保存存活率的影响 将放入1 0 0 p v s 溶液中的胶球分别处理0 、2 0 、4 0 、6 0 、8 0 、1 0 0m i n 。结 果发现：对小新月菱形藻和牟氏角刺藻的最适时间都为6 0m i n 。 3 装载液浓度和装载时间对冰冻保存存活率的影响 在装载时间选取的五个点0 、2 0 、4 0 、6 0 、8 0 、1 0 0m i n 中，经实验证明： 在2 5 p v s 浓度装载的条件下，小新月菱形藻和牟氏角刺藻都处理6 0m i n 效果 最好；在5 0 p v s 浓度装载的条件下，小新月菱形藻处理6 0m i n 效果最好；牟 氏角刺藻处理4 0m i n 效果最好。对于装载液的浓度选择上看，采用稀释到5 0 的p v s 浓度最适合两种硅藻的冰冻保存。 4 洗涤液中蔗糖浓度、洗涤方法、洗涤时间对冰冻保存存活率的影响 复温后，根据蔗糖浓度不同选取五种洗涤液，经实验证明：小新月菱形藻 采用蔗糖梯度洗涤利于藻细胞的存活( 初始密度为l m o l l 。1 ) ：牟氏角刺藻采用 1 2m o l l 1 蔗糖洗涤利于藻细胞的存活。对于洗涤处理的时间，在我们选取的 0 、1 0 、2 0 、3 0 、6 0m i n 五个点中，处理3 0m i n 是最适合两种硅藻的冰冻保存。 综上，经优化组合，可得两种硅藻冰冻保存的最适条件： 小新月菱形藻在o c 下，经5 0 p v s 2 装载6 0m i n ，1 0 0 p v s 2 脱水处理6 0m i n ， 2 0 蔗糖梯度( 初始浓度1m o l l 1 ) 洗涤3 0m i n ，得最大存活率7 4 1 。 牟氏角刺藻在o 下，经5 0 p v s 2 装载4 0m i n ，1 0 0 p v s 2 脱水处理6 0m i n ， 2 0 1 2m o l l 1 1 蔗糖洗涤3 0m i n ，得最大存活率4 8 2 。 关键词：小新月菱形藻牟氏角刺藻包埋一玻璃化法冰冻保存存活率 包埋一玻璃化法冰冻保存两种饵料硅藻的研究 a b s t r a c t c o n t e n t ：t h i sp a p e rt a k e sn i t z s c h i ac l o s t e r i l l mm i n u t i s s i m aa l l e ne tn e l s o n a n d c h a e t o c e r o sm u e l l e r ia se x p e r i m e n tm a t e r i a l s , a n ds t u d i e st h ec r y p r e s e r v a t i o no ft h e t w ou n d e ru l t r a - l o wt e m p e r a t u r e ( - 1 9 6 c ) w i t he n c a p s u l a t i o n - v i t r i f i c a t i o nm e t h o d e n c a p s u l a t i o n - v i t r i f i c a t i o ni sai l e wt e c h n i q u ef o rt h ee r y o p r e s e r v a t i o no fp l a n t g e r m - p l a s m ， w h i c hi s d e v e l o p e d o n t h e b a s i s o fv i t r i f i c a t i o na n d e n c a p s u l a t i o n d e h y d r a t i o n i t h a s i n t e g r a t e d t h e a d v a n t a g e s o fb o t h e n c a p s u l a t i o n - d e h y d r a t i o na n dv i t r i f i c a t i o n ：t h ea b i l i t yt ot r e a tal a r g ea m o u n to f m a t e r i a l sa tt h es a m et i m e ，r a p i dr e c o v e r yg r o w t ha f t e rt r e a t m e n t ，l o wt o x i ca c t i o no n t 驰m a t e r i a l i th a sg a i n e ds u c c , e s si n t h eg e r m p l a s mp r e s e r v a t i o no fm o r et h a n t w e n t yk i n d so fa d v a n c e dp l a n t s h o w e v e r t h e r ea r ef e wr e p o r t so fi t sa p p l i c a t i o ni n a l g a e t i i i se x p e r i m e n tf i l l e dt h i sg a pa n dp r o v e dt h ef e a s i b i l i t yo ft h i st e c h n i q u ei n t h ec r y o p r e s e r v a t i o no fa l g a e i ne n c a p s u l a t i o n - v i t r i f i c a t i o ne x p e r i m e n t ，d i s c u s st h ei n f l u e n c eo fs u c hf a c t o ma s t h ec o m p o s i t i o no ft h ep v s ，t h ec o n c e n t r a t i o no fl o a d i n gs o l u t i o na n dt h el o a d i n g t i m e ，t h ed e h y d r a t i o nt i m ea n dt h ew a s h i n gm e t h o do nt h ev i a b i f i t yo ft h ea l g a ew a s s t u d i e d 1 1 1 l ei n f l u e n c eo ft h ep v sc o m p o s i t i o no nv i a b i l i t yi nc r y o p r e s e r v a t i o n ： a m o n gt h e s e v e ns e l e c t e dv i t r i f i c a t i o nf o r m u l a si nt h i se x p e r i m e n t ，p v s 2 f o r m u l a ( p v s 2 ：3 0 ( w v ) g l y c e r o l + 1 5 ( w v ) e t h y l e n eg l y c o l + 1 5 ( w v ) d i m e t h y l s u l f o x i d ei nf 2m e d i u m c o n t a i n i n g 0 4m o l l 0s u c )i ss u i t a b l ef b rt h e c r y o p r e s e r v a t i o no ft h et w oa l g a e 2 t h ei n f l u e n c eo fp v sd e h y d r a t i o nt i m eo nv i a b i l i t yi nc r y o p r e s e r v a t i o n ： s e td i f f e r e n tt r e a t m e n tt i m eo ft h e b t 增rb a l l si n1 0 0 p v ss o l u t i o n ：0 、2 0 、4 0 、 、1 0 0m i n r e s u l t ss h o wt h a tt h em o s ts u i t a b l et i m ef o rn i t z s c h i ac l o s t e r i u m m m u t i s s i m aa l l e ne tn e l s o na n dc h a e t o c e r o sm u e l l e r ia r eb o t h6 0m i n 3 t h ei n f l u e n c eo fl o a d i n gt i m ea n dl o a d i n gs o l u t i o nc o n c e n t r a t i o no nv i a b i l i t yi n c r y o p r e s e r v a t i o n ： c h o o s ef i v ep o i n t si nl o a d i n gt i m e ：0 、2 0 、4 0 、8 0 、1 0 0m i n e x p e r i m e n t r e s u l t ss h o w ：w h e nl o a d e dw i t h2 5 p v s ，t h et w oa l g a eg e tt h eh i g h e s tv i a b i l i t ya tt h e p o i n to f6 0m i n ；w h e n1 0 a d e dw i t h5 0 p v s n i t z s c h i ac l o s t e r i u mm i n u t i s s i m aa l l e n e tn e l s o ng e t st h eh i g h e s tv i a b i l i t ya tt h ep o i n to f6 0m i na n dc h a e t o c e r o sm u e l l e r i 4 0r a i n a sf o rt h el o a d i n gs o l u t i o nc o n c e n t r a t i o n i t sb e s tt ou s e5 0 p v sf o rt h e c r y o p r e s e r v a t i o no ft h et w oa l g a e 包埋一玻璃化法冰冻保存两种饵料硅藻的研究 4 t h ei n f l u e n c eo fs u c r o s ec o n c e n t r a t i o ni nw a s h i n gs o l u t i o n , w a s h i n gm e t h o da n d w a s h i n g t i m e0 1 1v i a b i l i t yi nc t y o p r e s e r v a t i o n ： a f t e rr e w a r m i n g , c h o o s ef i v et y p e so fw a s h i n gs o l u t i o nb a s e do nd i f f e r e n t s u c r o s ec o n c e n t r a t i o n e x p e r i m e n ts h o w s ：g r a d u a lw a s h i n gi ns u o r o s es o l u t i o ni s b e n e f i c i a lf o rt h ev i a b i l i t yo fn i t z s c h i ac l o s t e r i u mm i n u t i s s i m aa l l e ne tn e l s o nc e l l s ( o r i g i n a lc o n c e n t r a t i o no f t h es u c r o s es o l u t i o nb e i n g1 t o o l l 1 ) ；w a s h i n gi n1 2 t o o l l 1s u c i o s cs o l u t i o ni sb e n e f i c i a if o rt h ev i a b i l i t yo fc h a e t o c e r o sm u e l l e r ic e l l s a sf o rw a s h i n gt i m e 。a m o n gt h es e l e c t e df i v ep o i n t s ，0 、1 0 、2 0 、3 0 、6 0m i n , 3 0m i n i st h eb e s tt i m ef o r t h ec r y o p r e s e r v a t i o no ft h et w oa l g a e i nc p n c l u s i o n , c h o d s et h eb e s t ，t h em o s ts u i t a b l ec o n d i t i o n f o rt h e c r y o p r e s e r v a t i o no ft h et w oa l g a ea r c a sf o l l o w s ： t h eh i g h a s tv i a b i l i t yo fn i t z s c h i ac l o s t e r i u mm i n u t i s s i m aa l l e ne tn e l s o n , 7 4 1 i so b t a i n e dw h e nt h eb e a d sc o n t a i n i n gt h ea l g a lc e l l sa r el o a d e dw i t h 5 0 p v s 2f o r6 0m i nu n d e r0 ，t h e nd e h y d r a t e dw i t h1 0 0 p v s 2f o r6 0m i nu n d e r 0 a n dw a s h e dg r a d u a l l yb ys n c r o 辩f o r3 0m i na t2 0 t h eh i g h e s tv i a b i l i t yo fc h a e t o c e r o sm u e l l e r i ，4 8 2 ，i so b t a i n e dw h e nt h e b e a d sc o n t a i n i n gt h ea l g a lc e l l sa r el o a d e dw i t h5 0 p v s 2f o r4 0m i nu n d e r0 ， t h e nd e h y d r a t e dw i t h1 0 0 p v s 2f o r6 0m i nu n d e r0 a n dw a s h e db y1 2m o l + l - 1 s u c r o s e f o r 3 0 m i n a t 2 0 k e yw o r d s ：n t z s c h i ac 如s t e r i u mm i n u t i s s i m aa l l e n e tn e l s o nc h a e t o c e r o sm u e l l e r i e n c a p s u l a t i o n - v i t r i f i c a t i o nm e t h o dc r y o p r e s e r v a t i o n v i a b i l i t y 学位论文独创性声明 本人承诺：所呈交的学位论文是本人在导师指导下所取得的研究成果a 论文中除特别加 以标注和致谢的地方外，不包含他人和其他机构已经撰写或发表过的研究成果，其他同志的 研究成果对本人的启示和所提供的帮助，均已在论文中做了明确的声明并表示谢意a 学位论文作者签名 猢任 日 期：7 、5 、冶 学位论文版权的使用授权书 本学位论文作者完全了解辽宁师范大学有关保留、使用学位论文的规定，及学校有权保 留并向国家有关部门或机构送交复印件或磁盘，允许论文被查阅和借阅。本文授权辽宁师范 大学，可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库并进行检索，可以采用影印、缩印 或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。保密的学位论文在解密后使用本授权书。 学位论文作者蚴孙j 亿 指导教师签名：矛建窭# 日 期j 商7 一、歹罗 包埋一玻璃化法冰冻保存两种饵料硅藻的研究 第1 章包埋一玻璃化法冰冻保存两种饵料硅藻的研究 前言超低温保存是目前植物种质资源长期稳定保存的理想方法。在超低温( 通 常指液氮温度，一1 9 6 ) 条件下，几乎所有的细胞代谢活动和生长过程都停止了， 因而既排除了遗传变异的可能性，又保存了细胞的活力和形态发生的潜能。自 从1 9 4 9 年p o l g e “1 等首先发现，甘油可减轻鸟类精子的冷冻伤害，此后人们将低 温与冷冻防护剂的结合使用，冷冻保存方法才广泛应用于医学和畜牧业。7 0 年 代，n a g 和s t r e e t 将胡萝卜悬浮培养细胞保存在液氮后，观察到细胞的生长， 证明了植物细胞冷冻保存的可行性”1 。目前，国内外已经对近2 0 0 种植物材料进 行了超低温保存的研究“1 ，所采用的方法主要包括两步法、玻璃化法和包埋脱水 法。其中，玻璃化法和包埋脱水法是近2 0 年来建立的2 种超低温保存新技术， 毋需昂贵的降温设备，冷冻程序比较简单，在多种植物种质超低温保存中已显示 出巨大的应用潜力。 包埋一玻璃化法是在玻璃化法和包埋脱水法基础上发展起来的超低温保存植 物种质的新技术。它结合了包埋脱水法和玻璃化法的优点于一身，具有能同时 处理大量材料，处理后恢复生长快，对材料的毒害作用较小及成芽率高等优点。 近年来，随着海洋微藻在鱼、虾、贝类育苗生产中的广泛应用，有关饵料微 藻的超低温保存的研究日益受到重视。小新月菱形藻( n i t z s c h i ac l o s t e r i u t a m i n u t i s s i m na 1 l e ne tn e l s o n ) 和牟氏角刺藻( c h a e t o c e r o sm u e l l e r i ) 是海 产养殖中的优良饵料微藻，对其超低温保存的探索无论是理论上，还是实际应 用上都有重要的意义。与这两种硅藻相关的超低温保存的研究还不多：t s u r u 曾报道了1 0 d m s o 和1 0 甘油对小新月菱形藻的保护效果。马志珍”1 等探讨了在 不同降温速率下i o d m s o 和1 0 蔗糖对牟氏角刺藻存活率的影响。1 9 9 9 年王起 华等曾采用两步法冰冻保存小新月菱形藻和牟氏角刺藻，对影响存活率的内、 外因素作了详尽的报道，并分别获得了6 3 1 和9 1 5 的较高存活率嘲，但是他 们的方法需要采用特殊的降温设备和较为复杂的冷冻程序，其实际应用受到很 大的限制。近年来，我们也曾尝试用不需要特殊设备且操作比较简单的包埋脱 水法冰冻保存几种海洋饵料微藻，但得到的存活率都很低，如小新月菱形藻存 活率仅为1 8 3 。1 ，而牟氏角刺藻存活率为3 0 “，都明显低于两步法冰冻保 存的存活率0 1 ，效果并不理想。近l o 年来，新发展的包埋一玻璃化法则结合包埋 脱水法和玻璃化法的多种优点于一身，现已在2 0 余种高等植物的种质保存中获 得成功“”1 。目前，鲜有见到用包埋一玻璃化法保存藻类种质的报道。本文首次 采用包埋一玻璃化法冰冻保存小新月菱形藻和牟氏角刺藻，并探讨了玻璃化溶液 组成、脱水时间、装载液浓度和装载时i b j 以及洗涤过程对存活率的影响，以探 包埋一玻璃化法冰冻保存两种饵料硅藻的研究 求一条不需要特殊设备，操作简便而且存活率较高的冰冻保存两种饵料硅藻的 新方法。 1 材料和方法 1 1 材料、试剂和设备 1 1 1 材料来源及其培养 两种浮游硅藻：小新月菱形藻( n i t z s c h i ac l o s t e r i u mm i n u t i s s i 舾a l l e n e tn e l s o n ) 和牟氏角刺藻( c h a e t o c e r o s m u e l l e r j ) ，由辽宁省水产研究所提供， 并由辽宁师范大学藻类生理研究室纯化为单种。取2 5i l l l 生长6d 的实验材料， 接种于含有1 0 0 m l f 2 “”培养基的2 5 0 m l 的三角烧瓶中。培养条件为( 2 2 1 ) ， 光照强度( 4 3 3 ) p m o l m - 2 s 一，光周期( 光暗) 为1 4 1 0h 。取培养1 0d 的 材料( 静止期) 用于冰冻保存。 言 g g 瓤 霉 曩 培养天蠡( d ) 图1 小新月菱形藻生长曲线 f i gl t h eg r o w t hc u r v eo f 化c o s t e r i u mm i n u t i s s i m a 初始密度为1 7 xl o “个m l “，接种密度为8 1 4 x 1 0 6 个m 一 2 包埋一玻璃化法冰冻保存两种饵料硅藻的研究 言 g g 一 牛 重 量 图2 牟氏角刺藻生长曲线 f i g2t h eg r o w t hc u r v eo fcm u e l l e l i 初始密度为1 5 x 1 0 6 个ml _ 1 ，接种密度为7 5 8 1 0 个m l - “ 1 1 2 主要试剂及配制 6 褐藻酸钠( s i g m ac h e m i c a lc o ) 溶液：褐藻酸钠在3 0 n a c l 溶液中经磁 力搅拌器搅拌4 小时以上溶解，并进行高压灭菌( 1 5 p s i1 5 m i n ) 固定液：3 0 n a c i 的0 i mc a c i ：溶液 洗涤液：蔗糖溶液 叶绿素提取剂：1 0 0 丙酮 p v s ( 植物玻璃化溶液) 组成和配制： 以p v s 2 配方“”为基础，通过改变二甲基亚砜( d m s o ) 的浓度或用聚7 , _ - - 醇 ( p e g 2 0 0 0 0 ) 和聚乙烯吡咯烷酮( p v p k 3 0 ) 分别代替d m s o ，配成6 种不同配方。p v s 7 配方参照文献“”，并稍作改动。上述7 种p v s 配方的组成( w v ) 有： p v s i ：3 0 甘油( g l y ) + 1 5 乙二醇( e g ) + l o d m s o ，用含0 4 m o l l 1 蔗糖( s u c ) 的f 2 培养基定容 p v s 2 ：3 0 g l y + 1 5 e g + 1 5 d m s o ，用含0 4m o l l 1s u c 的f 2 培养基定容 p v s 3 ：3 0 g l y + 1 5 e g + 2 0 d m s o ，用含0 4m o l l 1s u c 的f 2 培养基定容 p v s 4 ：3 0 g l y + 1 5 e g + 2 5 d m s o ，用含0 4m o l l 。s u c 的f 2 培养基定容 3 包埋一玻璃化法冰冻保存两种饵料硅藻的研究 p v s 5 ：3 0 g l y + 1 5 e g + 6 p e g ，用含0 4m o l l 。1s u c 的f 2 培养基定容 p v s 6 ：3 6 g l y + 1 5 e g + 5 p v p ，用含0 4m o l l 。1s u c 的f 2 培养基定容 p v s 7 ：5 0 g l y + 5 0 s u c ，用f 2 培养基定容 2 5 p v s 装载的预备实验结果表明：p v s 3 对小新月菱形藻的冰冻保存效果最 好；p v s 2 对牟氏角刺藻的冰冻保存效果最好。因此未特殊说明，本文在脱水和 装载实验的处理上：小新月菱形藻采用p v s 3 配方；牟氏角刺藻采用p v s 2 配方。 1 1 3 主要仪器设备 磁力搅拌器( 上海南汇电讯器材厂) l d 4 2 a 离心机( 北京医用离心机厂) b d 2 0 2 电子天平( u s a g r e i f e n s e es w i t z e r l a n d ) s t 一8 0 c 数字照度计( 北京师范大学广电仪器厂) 小型三用水箱( 北京西域区医疗器械厂) u v 7 5 5 分光光度计( 上海分析仪器总厂) s p d j 水平净化工作台( 上海浦东屋里光学仪器厂) 1 2 实验方法 1 2 1 包埋 取上述培养1 0d 的藻类作为实验材料，离心后用灭菌海水悬浮至适当密度， 与3 0 n a c i 的6 褐藻酸钠( s i g m ac h e m i c a lc o ) 溶液等体积混匀后，将此混 合液滴入含0 1m o l l c a c l ：的溶液中，6 0m i n 后制成直径约2 5m m 的胶球。参 照王起华等“”的方法。将此胶球置于灭菌海水中，暗恢复ld 后备用。 1 2 2 装载和脱水 装载时，将每组4 5 个胶球分别置于装有2 0m l2 5 p v s 和5 0 p v s 溶液的5 0m l 三角瓶中，在o c 预冷后进行装载处理，时间分别为：0 、2 0 、4 0 、6 0 、8 0 和1 0 0 m i n 。 脱水时，将经过装载的胶球置于装有2 0m l1 0 0 p v s 溶液的三角瓶中，在0 1 3 预冷后进行脱水处理，时间分别为：0 、2 0 、4 0 、6 0 、8 0 和1 0 0m i n 。 未经特殊说明均在0 下操作。 1 2 3 冰冻及化冻 将脱水后的胶球每1 5 个为1 组，移入冻存管中，加入1m l 新鲜的1 0 0 p v s 溶液，快速投入到液氮中保存，放置2 4h 后，在4 0 恒温水浴下快速化冻。此 操作按王起华等“的方法进行。 1 2 4 洗涤 蔗糖浓度和沈涤方法实验( 时间3 0m i n ，2 0 ) ： 4 包埋一玻璃化法冰冻保存两种饵料硅藻的研究 ( 1 ) 蔗糖梯度洗涤时，将化冻后的每组胶球移入含2 0m l 初始密度为l m o l l 。蔗糖的三角瓶中2 0 振荡1 5m i n ，然后再加入2 0m lf 2 培养基振荡 稀释1 0m i n ，最后加入2 0i n lf 2 培养基振荡稀释5m i n 。( 2 ) 0 4m o l l 1 蔗 糖于2 0 下振荡洗涤3 0m i n 。( 3 ) 1m o l l 1 蔗糖于2 0 下振荡洗涤3 0m i n 。 ( 4 ) 1 2m o t l 。1 蔗糖于2 0 c 下振荡洗涤3 0m i n 。( 5 ) f 2 培养基于o c 振荡洗涤 3 0m i n 。 洗涤时间实验( 2 0 ) ： 小新月菱形藻采用蔗糖梯度( 初始密度为1m o l l - 。) 洗涤；牟氏角刺藻采 用1 2m o l l 1 蔗糖洗涤。洗涤的时间分别为0 、1 0 、2 0 、3 0 、6 0m i n 。 除特殊说明外，小新月菱形藻均采用蔗糖梯度( 初始密度为1m o l l 1 ) 洗 涤3 0m i n ；牟氏角刺藻均采用1 2m o l l 1 蔗糖洗涤3 0m i n 。 1 2 5 恢复培养和存活率的测定 将洗涤后的每组胶球放入装有2 0m lf 2 培养基的5 0m l 三角瓶中，在与 培养材料相同的条件下暗中恢复ld ，再光照培养4d 后，用丙酮提取叶绿素计 算存活率。具体方法参见王起华等“”。存活率的计算公式如下： 处理样品叶绿素a 含量一空白样品叶绿素a 含量 存活率= 对照样品： 空白样品： 1 0 0 对照样品叶绿素a 含量一空白样品叶绿素a 含量 包埋后的含藻胶球未经任何处理后，放入装有2 0m lf 2 培养基的 5 0m l 三角瓶中，在与培养材料相同的条件下暗中放置1 d ，再光照 培养4 d ，在玻璃匀浆器中，用丙酮研磨提取胶球中的叶绿素，并根 据j e n s e n 公式“”计算对照样品中的叶绿素a 含量。 采用冻杀死的含藻胶球。包埋后的含藻胶球未经装载和脱水处理， 直接投入液氮中冰冻1 h 后再化冻，如此反复冰冻一化冻，共3 次。 经上述处理后的胶球已褪色为白色。将此样品在与上述对照样品相 同的条件下放置1 d ，再光照培养4 d ，按照上述同样方法提取并计算 样品中的叶绿素a 含量。 处理样品：包埋后的含藻胶球经过装载一脱水一冰冻一化冻一洗涤处理后，在与培 养材料相同的条件下暗放置l d ，再光照培养4 d 后，按照上述同样方 法提取并计算样品中的叶绿素a 含量。 1 2 6 实验设计和数据处理 上述实验至少重复2 次，每次实验设置3 个平行样品，文中数据为6 个平 行样品的平均值和标准差。 5 包埋一玻璃化法冰冻保存两种饵料硅藻的研究 上述实验方法的操作过程如图3 所示： 褐藻酸钠藻细胞液 il 离心去除培养基 制胶l3 0 n a c ll 用消毒海水悬浮 1 lj 6 胶液悬浮后藻液 l 混合1 ：1 ( v ：v ) 含藻体的3 褐藻酸钠溶液 i 胶囊化l 用6 # 针头的l o m l 注射器滴入含3 0 o n a c l 上 的0 1 mc a c l ：溶液中，搅动6 0 m i n 含藻体的褐藻酸钙胶球( 胶球直径2 5 r a m ) ， 2 5 或5 0 p v s 溶液装载 装载后的胶球 i 1 l 1 0 0 p v s 溶液处理 脱水后的胶球 i 冰冻操作i 放入装有i m l i o o p v s 溶液的冻存管中 + 一步法投入液氮 冻存管一液氮保存 化冻 i4 0 c 恒温水浴 化冻后的胶球 洗涤j 洗涤后的胶球 恢复培养l 培养基中暗恢复2 4 h 再培养后测定存活率 ( 2 0 m lf 2 培养基培养4 天测定存活率) 图3 包埋一玻璃化法的操作过程 f i g3t h ep r o c e s so fe n c a p s u l a t i o n v i t r i f i c a t i o n 6 包埋一玻璃化法冰冻保存两种饵料石丰藻的研究 2 结果与分析 2 1p v s 脱水时间对藻细胞冰冻保存存活率的影响 2 1 1p v s 3 脱水时间对小新月菱形藻存活率的影响 嚣 、 鼍 1 g 件 4 0 o o2 04 08 01 0 0 脱水时问l a i n 图4 脱水时间对小新月菱形藻存活率的影响 f i g4e f f e c to fd e h y d r a t i o nt i m eo fp v so nt h ev i a b i l i t yo f c l o s t e r & m m j n u t d s s d m a 一：5 0 p v s 3 装载4 0m i n ，蔗糖梯度( 初始密度1m o l l “) 洗涤3 0m i n * ：2 5 p v s 3 装载4 0m i n ，蔗糖梯度( 初始密度im o l l 1 ) 洗涤3 0m i n 图4 为p v s 3 处理时间对小新月菱形藻存活率的影响。可以看出，经2 5 p v s 3 装载的材料在脱水2 0m i n 内，存活率极低；随着脱水时间的延长，存活率显著 提高，并在8 0m i n 时达最大存活率，为3 5 1 。经5 0 9 ( , p v s 3 装载的材料在脱水 6 0m i n 内存活率变化显著，并在脱水6 0m i n 时达最大存活率，为5 7 7 ；随着 脱水时自j 的延长，存活率开始下降。此外，由图4 可看出，5 0 p v s 3 装载后的6 个点的存活率都高于2 5 p v s 3 装载相对应的各点，5 0 预装载液浓度较适应小新 月菱形藻的冰冻保存。 7 包埋一玻璃化法冰冻保存两种饵料硅藻的研究 2 1 2p v s 2 脱水时间对牟氏角刺藻存活率的影响 喜6 0 螂 件 5 0 4 0 3 0 2 0 1 0 0 o2 04 06 08 01 0 0 脱水时问( m i n ) 图5 脱水时问对牟氏角刺藻存活率的影响 f i g5e f f e c to fd e h y d r a t i o nt i m eo fp v so nt h ev i a b i l i t yo f m u e l l e r i + ：5 0 p v s 2 装载4 0m i n ，1 2m o l l 。蔗糖洗涤3 0m i n o 一：2 5 p v s 2 装载4 0r a i n ，1 2m o l l - j 蔗糖洗涤3 0r a i n 图5 为p v s 2 处理时间对牟氏角刺藻存活率的影响。可以看出，经2 5 p v s 2 装载的材料随着脱水时间的延长，存活率显著提高，并在6 0m i n 时达最大存活 率，为2 4 6 。经5 0 p v s 2 装载的材料在脱水6 0m i n 内存活率变化显著，并在 脱水6 0m i n 时达最大存活率，为4 5 1 ；随着脱水时问的延长，存活率开始下 降。此外，由图5 可看出，5 0 p v s 2 装载后的6 个点的存活率都高于2 5 p v s 2 装 载相对应的各点，5 0 预装载液浓度较适应牟氏角刺藻的冰冻保存。 2 2 装载过程对藻细胞冰冻保存存活率的影响 2 2 1p v s 3 装载液浓度和装载时间对小新月菱形藻存活率的影响 8 包埋一玻璃化法冰冻保存两种饵料硅藻的研究 芝 8 0 静 蟾 雉 0 o6 08 01 0 0 装载时问l i n 图6 装载液浓度和装载时间对小新月菱形藻存活率的影响 f i g6e f f e c to fl o a d i n gs o l u t i o nc o n c e n t r a t i o na n dl o a d i n gt i m eo n v i a b i l i t yo fmc l o s t e r i u mm d n u t i s s i m a + ：5 0 p v s 3 装载( 1 0 0 p v s 3 脱水6 0m i n ，蔗糖梯度洗涤3 0m i n ) o 一：2 5 p v s 3 装载( 1 0 0 p v s 3 脱水8 0r a i n ，蔗糖梯度洗涤3 0m i n ) 在图4 确定的最适脱水时间下来进行装载实验。由图6 可以看出，两条 曲线在装载0 6 0m i n 时，存活率变化显著：在装载6 0 1 0 0m i n 时，存活率 变化不大。结果表明：2 5 p v s 3 和5 0 p v s 3 处理下的小新月菱形藻冰冻保存 后的存活率都在6 0m i n 时达到最高值，分别为4 2 7 和6 6 4 ，比对照样( 0 装载) 分别提高了1 2 7 和3 9 5 。可见，装载过程对小新月菱形藻存活率的 提高极为重要。 2 2 2p v s 2 装载液浓度和装载时间对牟氏角刺藻存活率的影响 9 包埋一玻璃化法冰冻保存两种饵料硅藻的研究 喜 藿 装载时问( m i n ) 图7 装载液浓度和装载时间对牟氏角刺藻存活率的影响 f i g7e f f e c t o fl o a d i n gs o l u t i o nc o n c e n t r a t i o na n dl o a d i n gt i m eo n v i a b i l i t yo fcm u e l l e r f 一：5 0 p v s 2 装载( 1 0 0 p v s 2 脱水6 0m i n 。1 2m o l l 。1 蔗糖洗涤3 0r a i n ) p ：2 5 p v s 2 装载( 1 0 0 p v s 2 脱水6 0m i n ，1 2m o l 一蔗糖洗涤3 0m i n ) 在图5 确定的最适脱水时间下来进行装载实验。由图7 可以看出，2 5 p v s 2 装载的材料在装载6 0m i n 时达最高值，为2 8 8 ，比对照样( 0 装载) 的藻细 胞存活率提高了1 0 6 ，在此后的6 0 一1 0 0m i n 内，存活率有所下降。5 0 p v s 2 装载的材料在装载0 4 0m i n 内，存活率变化非常显著，在装载4 0m i n 时达 最高值，为4 8 2 ，比对照样( 0 装载) 的藻细胞存活率提高了3 0 ，在此后的 4 0 - 1 0 0m i n 内，存活率有所下降。 由图6 、7 可得出，装载过程对于两种硅藻的冰冻保存是必不可少的。无 论是经2 5 p v s 装载还是经5 0 p v s 装载的藻细胞，对存活率都有不同程度的 提高。且对于选定的两种装载液浓度埘存活率提高的程度来看，5 0 的p v s 浓度优于2 5 的p v s 浓度，更适合对凛的冰冻保仔。 包埋一玻璃化法冰冻保存两种饵料硅藻的研究 2 3 玻璃化保护液配方对藻细胞冰冻保存存活率的影响 2 3 1p v s 保护液配方对小新月菱形藻存活率的影响 表ip v s 溶液配方对小新月菱形藻冰冻保存存活率的影响 t a b l e1e f f e c to fv a r i o u sp v sv i t r i f i c a t i o ns o l u t i o no nt h ev i a b i l i t y o f 朋c l o s t e r i u mm i n u t i s s i m a 高p v s 湍芝 2 5 p v s 装载6 0 r a i n5 0 p v s 装载6 0 m i n 保护液( w 订1 0 0 p v s 脱水8 0 m i n1 0 0 p v s 脱水6 0 m i n p v s l6 1 ( 1 5 )1 1 5 ( 2 7 ) p v s 2 2 0 3 ( 4 2 ) 7 1 9 ( 7 4 ) p v s 3 4 2 2 ( 4 5 ) 6 4 3 ( 5 3 ) p v s 41 4 5 ( 2 6 )1 8 7 ( 1 1 ) p v s 5 oo p v s 6o o p v s 76 7 ( 2 3 ) 2 4 7 ( 2 5 ) 蔗糖梯度洗涤3 0m i n ( 括弧内的数值为标准差) 。 根据上面小新月菱形藻装载和脱水处理的实验结果，对适合小新月菱形藻 冰冻保存的p v s 保护液配方进行筛选，结果表1 显示：2 5 p v s 装载时，采用p v s 3 可获得最大存活率，为4 2 2 。而用5 0 p v s 装载时，采用p v s 2 可获得最大存活 率，为7 1 9 。p v s l 4 所对应的处理结果如下：2 5 p v s 装载下的存活分别为 6 1 、2 0 3 、4 2 2 、1 4 4 ；5 0 p v s 装载下的存活分别为：1 1 4 、7 1 9 、6 4 3 、 1 8 7 。此外，采用p v s 7 保护液也有一定的存活率。而p v s 5 和p v s 6 的存活率 都为零。 2 3 2p v s 保护液配方对牟氏角刺藻存活率的影响 表2p v s 溶液配方对牟氏角刺藻冰冻保存存活率的影响 t a b l e2e f f e c to fv a r i o u sp v sv i t r i f i c a t i o ns o l u t i o no nt h ev i a b i l i t y o fcm u e l e r i 包埋一玻璃化法冰冻保存两种饵料硅藻的研究 高p v s 涨竺 2 5 p v s 装载6 0 r a i n5 0 p v s 装载4 0 m i n 保护液( w 7 订1 0 0 p v s 脱水6 0 m i n1 0 0 p v s 脱水6 0 r a i n p v s i 3 3