（食品科学专业论文）白刺果实色素结构及性质的研究.pdf

y 。6 0 1 7 奢2 关于学位论文原创性和使用授权的声明 本人所呈交的学位论文，是在导师指导下，独立进行科学研 究所取得的成果。对在论文研究期间给予指导、帮助和做出重要 贡献的个人或集体，均在文中明确说明。本声明的法律责任由本 人承担。 本人完全了解山东农业大学有关保留和使用学位论文的规 定，同意学校保留和按要求向国家有关部门或机构送交论文纸质 本和电子版，允许论文被查阅和借阅。本人授权山东农业大学可 以将本学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可 以采用影印、缩印或其他复制手段保存论文和汇编本学位论文。 保密论文在解密后应遵守此规定。 论文作者签名：奎垄强 导师签名：垂堡鱼躬卜 山东农业大学硕士学位论文 摘要 花色营是一种重要的天然食用色素。本文以西伯利亚白刺( n i t r a r i a s i b i r i c ap a l l ) 果实为原料，采用0 3 7 的盐酸溶液提取花色菅，通过单 因子实验确定了从白刺果实中提取花色苷的单个工艺参数，并进一步通过 四因子二次通用旋转实验设计进行研究筛选，确定了最佳提取参数：同时， 对该花色昔的稳定性进行了研究。在对该花色苷分离纯化的基础上，对其 进行了定性和定量研究。本研究主要试验结果如下： 1 、白刺果实花色苷最佳提取条件的确定通过四因子二次通用旋转 实验设计，确定白刺果实花色苷粗产品最佳提取条件为：温度：6 0 。c ：盐 酸溶液浓度：0 3 ；提取时间：1 6 r a i n ；次数：3 次。 2 、白刺果实花色苷的稳定性研究研究表明：该花色苷在弱光和较 低的温度下稳定性较好，对大部分金属离子较稳定，还原剂和碳水化合物 对花色苷有一定的保护作用，山梨酸钾对花色苷的稳定性影响不大，v c 和过氧化氢对花色营的影响较大。 3 、白刺果实花色苷的分离纯化利用纸层析对花色苷进行分离纯化， 得到了六种花色苷衍生物，可知白刺果实花色苷最少由六种不同的组分组 成。 4 、白刺果实花色苷的定性分析对花色苷衍生物进行光谱和色谱两 方面的研究，通过观察纯化的花色苷衍生物的颜色、加入5 三氯化铝甲 醇( w ：v ) 溶液后最大吸收波长是否发生变化、a 4 , o a 鼬，等光谱性质和对其 完全酸水解、受控酸水解以及层析r r 值等色谱数据确定了其糖苷配基的类 型以及糖基的种类和糖苷的连接方式，确定了l 号、3 号和4 号花色苷衍 生物分别为：1 号色素为天竺葵色素- - 3 - - 葡萄糖鼠李糖苷，3 号色素为矢 车菊色素- - 3 - - 葡萄糖鼠李糖苷，4 号色素为飞燕草色素- - 3 - - 半乳糖苷。 5 、白刺果实花色苷的定量分析通过各种花色苷衍生物消光系数的 平均值，依据公式，确定了自刺果实花色苷的含量为1 9 9 1 2 m g 1 0 0 9 。 关键词：白刺果实；花色苷；稳定性；纯化；结构：含量 鱼型墨壅垒鲞笙塑墨壁垦塑竺塞 k b s t r a e t ， a n t h o c y a n i n s a r e i m p o r t a n tn a t u r a l f o o d p i g m e n t s t h i sp a p e r u s e d n i t r a r i as i b i r i c ap a l l f r u i ta sm a t e r i a la n de x t r a c t e da n t h o c y a n i n sw i t ho 3 7 h c l b a s e do nt h es i n g l ef a c t o re x p e r i m e n t s ，t h es i n g l ee x t r a c t i o np a r a m e t e s w e r ee s t a b l i s h e d t h r o u g hq u a t e m i o nb i sc u r r e n c yc u r c u m g y r a t ed e s i g nt h e o p t i m u me x t r a c t i o np a r a m e t e r sw e r eo b t m n e d f u r t h e r m o r e ，t h es t a b i l i t y o f a n t h o c y a n i n sw a si n v e s t i g a t e d b yp u r i f i c a t i o n ，t h eq u a l i t a t i v ea n dq u a n t i t a t i v e a n a l y s e so ft h ea n t h o c y a n i n sw e r ec a r r i e do u t t h ec h i e fe x p e r i m e n tr e s u l t s w e r ea sf o l l o w s ： 1 t h r o u g hq u a t e r n i o n b i sc u r r e n c y c u r c u m g y r a t ed e s i g nt h eo p t i m u m e x t r a c t i o nc o n d i t i o n so f c r u d ea n t h o c y a n i n sf r o mn i t r a r i cs i b i r i c ap a l l f r u i t w e r ee s t a b l i s h e d ：t h et e m p e r a t u r ei s6 0 4 c ；t h ec o n c e n t r a t i o no fh c i i so 3 7 ： t h ee x t r a c t i o nt i m ei s1 6r a i n ；t h ee x t r a c t i o nt i m e si s3 2 s t u d i e si n d i c a t e dt h a ta n t h o c y a r t i n sw e r es t a b l ei nw e a k l i g h t , l o w t e m p e r a t u r ea n d m o s tm e t a li o n s b e s i d e s ，r e d u c t a n ta n d c a r b o h y d r a t ec o u l d p r o t e c ta n t h o c y a n i n s t h es o r b i ca c i dp o t a s s i c u mh a df e wi n f l u e n c eo n a n t h o c y a n i n s ，b u tv c a n dh 2 0 2w e r e o p p o s i t e 3 t h ea n t h o e y a n i n sw e r e s e p a r a t e d a n d p u r i f i e db yp a p e rc h r o m a t o g r a p h ya n ds i x a n t h o c y a n i n sd e r i v a t e sw e r eg a i n e d ，s ob ya n a l y s i s , a tl e a s ts i xd e r i v a t e sw e r ee x i s t e di n t h e a n t h o c y a n i n so f n i t r a r i c s i b i r i c ap a l lf r u i t 4 b yt h es p e c l a t n na n dc h r o m a t o g r a p h ya n a l y s i s ，t h ea n t h o c y a n i n s d e r i v a t e s s p e c t r u mp r o p e r t i e sw e r ei n v e s t i g a t e d ，t h r o u g hs t u d yt h ec o l o u r , t h ec h a n g e so fm a x i m u ma b s o r p t i o na f t e r a d d i n g5 a 1 c 1 3 m e t h a n o l ( w v ) a n da 4 4 0 a m a xo fp u r i f i e ds i xa n t h o c y a n i n sd e r i v a t e s ；t h e t y p eo fa g 1 y c o n e s ，s u g u r sa n di n d i c a nc o n n e c tf a s h i o n sw e r ed e t e r m i n e db yc o m p l e t ea c i dh y d r o s i sa n dc o n t r o l l e da c i d h y d r o s i s a tl a s t ，t h ec o n c l u s i o n w e r e ：t h en o 1 p i g m e n ti sp e l a r g o n i d i n 3 一r h a r r m o g l u c o s i d e ，t h en o 3 p i g m e n ti sc y a n i d i n 3 r h a m n o g l u c o s i d e ，t h en o 4p i g m e n ti s d e l p h i n i d i n - 3 一g a l a c t o s i d e 5 t h r o u g ht h ea v e r a g eeo f t h ei n d i v i d u a la n t h o c y a n i nd e r i v a t ea n dt h e 2 山东农业大学硕士学位论文 c a l c u l a t i o nf o r m u l a , t h ec o n t e n t o f a n t h o c y a n i n so f n i t r a r i cs i b i r i c ap a l l f r u i t w a so b t a i n e d i ti s1 9 9 1 2 m g 1 0 0 9 k e y w o r d s ：n i t r a r i cs i b i r i c ap a l l f r u i t ；a n t h o c y a n i n s ；s t a b i l i t y ；p u r i f i c a t i o n ； s t r u c t u r e ；c o n t e n t 3 自刺果实色素结构及性质的研究 1 引言 1 1 花色苷概述 花色昔是人们最熟悉的水溶性天然食用色素，在自然界中广泛分布， 构成了植物王国中绝大多数品种的蓝色、红色、紫色和黄色等。花色苷作 为一种天然食用色素，安全、无毒、资源丰富，而且具有一定的营养和药 理作用，在食品、化妆品和医药领域有着巨大应用潜力。关于花色苷的提 取和稳定性，许多学者已经做了大量的研究( 陆国权等，1 9 9 7 ：侯曼玲等， 2 0 0 0 ：周红，2 0 0 0 ) 。目前，除了开发新的花色苷色素资源之外，人们对 其结构性质和生物学功能的研究越来越多，花色苷已经成为一种重要的天 然食用色素和功能食品资源。 1 1 1 花色苷的结构和性质 由于花色苷象其它天然黄酮类化合物一样，具有特征性很强的c 6 c 。c 。 碳骨架和相同的生化合成来源，因此，人们也将花色苷视为黄酮类化合物， 但花色苷因强烈吸收可见光而区别于其它天然黄酮类化合物。花色苷的配 基为花色素( 图1 ) ，后者与各种糖结合形成不同的配糖体。 子 图1 天然花色素结构图 f i g 1t h es t r u c t u r eo fn a t u r a la n t h o c y a n i d i n 由于花色素很不稳定，在植物中主要以花色苷( 配糖体) 的形式存在。 花色苷的颜色与连接在母体g c 。c 。核上的取代基和环境有关。 花色素是具有类黄酮典型的结构一2 一苯基苯并吡喃阳离子结构的衍 4 鸥砖 剩 山东农业大学硕士学位论文 生物( 又称花销；盐) ，目前已知有2 0 种花色素，但在食品中最常见的有6 种，分别是天竺葵色素( p e a r g o n i d i n ) 、矢车菊色素( c y a n i d i n ) 、飞燕 草色素( d e l p h i n i d i n ) 、芍药色素( p e o n i d i n ) 、牵牛花色素( p e t u n i d i l 3 ) 和锦葵色素( m a l v i d i n ) ( 图2 ) ；与花色素成苷的糖主要有葡萄糖、半乳 糖，阿拉伯糖、木糖、鼠李糖和由这些单糖构成的均匀或不均匀二糖和三 糖，其中3 一单糖苷、5 一双糖苷、3 ，5 一二糖苷和3 ，7 二糖苷是最常见的。 花色素及其糖苷也存在甲氧基化形式，甲氧基化的位置多数位于c 一3 和 c - 5 。花色苷也经常以酰化的形式存在，引起酰化的主要有机酸有咖啡酸、 对香豆酸、芥子酸、对羟基苯甲酸、阿魏酸、丙二酸、苹果酸、琥珀酸和 乙酸，最常见的酰化形式是酰化取代基与c 一3 位的糖键合，或与c 一6 位的 羟基酯化( m a r k a k i s ，1 9 8 2 a ) 。 影谫谘o h 置竺参色辜失车蕾色素 心瞄 芍药邑素 聿牛花色素 蓝色加强 铺簧色索 图2 食品中常见的六种花色素及它们红色和蓝色增加的次序 西g 2t h ef a m i li a rs i xa n t h o c y a n i d i n si nf o o d dt h e i ri n c r e a s es e q u e n c e o fr e da n db l u e 白刺果实色素结构及性质的研究 1 1 2 花色苷的生理活性功能 1 1 2 1 抗氧化及清除自由基的功能 花色苷具有抗氧化作用是近1 0 年来发现的。据报道，在某些品种的 马铃薯里面，有的品种清除自由基能力主要是来自花色苷，有的品种主要 来自多酚，前者含有大量的芍药色素配基，后者含有大量矢车菊色素配基 ( t o k ie t a 1 ，2 0 0 2 ) 。某些学者还发现，在l d l ( 1 0 w d e n s i t y li p o p r o t e i n ) 系统中，花色苷的配基比该花色苷的抗氧化活性高，而在 脂质体中，花色苷比其配基的抗氧化活性高( m a r i a pe ta l ，2 0 0 3 ) 。另 外，肉桂酸酰化的花色苷可以导致颜色紫移，但是能提高其抗氧化能力。 在5 号位置取代的花色苷，降低了自由基清除能力，在3 号位置取代基增 加糖的数量对自由基清除能力也有影响( f l o r i a nc e ta l ，2 0 0 2 ) 。 1 1 2 2 降低血清及肝脏中脂肪含量的作用 花色苷能够降低肝脏中胆固醇含量，间接起到改善肝脏的作用。在添 加飞燕草色素的食品中，食用者除了可以保持血清中总胆固醇的浓度降低 以外，还可以使三酰基甘油含量下降。此外，某些花色苷还具有预防动脉 硬化的作用( 唐传核等，2 0 0 0 ) 。 1 1 2 3 抗变异及抗肿瘤的作用 果实中提取的花色苷，具有抑制苯并芘、氨基氟的变异活性，修复人 体血液中淋巴球的作用，还具有抑制人体内形成及游离出超氧化自由基的 作用a 有报道，红色糯米中的花色苷对肿瘤有抑制作用( 唐传核等，2 0 0 0 ) 。 1 1 2 4 其它生理功能 花色苷能抑制胃溃疡，还能抑制肺、肝脏、小肠中的过氧化作用，期 待在临床上可作为胃保护素材。此外，花色苷还有延迟血小板凝集作用、 提高视力、改善微循环等功能。还有学者对花色苷作为防腐剂进行了研究 ( 马庆一等，2 0 0 2 ) 。 1 2 花色苷研究进展 1 2 1 花色管的提取和纯化 1 2 1 1 花色苷的提取 花色苷的提取方法国内外许多学者都做了大量的研究( 陆国权等， 1 9 9 7 ：侯曼玲等，2 0 0 0 ：周红，2 0 0 0 ：l g a o ，1 9 9 6 ：v i c t o rh o n g ，1 9 9 0 a ) 。 山东农业大学硕士学位论文 花色苷提取方法的选择取决于提取的目的和花色苷本身的组成。如果提取 出来的花色苷还要进行定性或定量分析，那么应该选择一种使花色苷尽可 能处于天然状态的提取方法：如果提取出来的花色苷仅用于食物着色，那 么就更应关注其最大产率、着色力和稳定性。 花色苷在中性和弱碱性溶液中不太稳定，因此，提取过程通常要采用 酸性溶剂。对于提取溶剂，酸性甲醇是最佳选择，因为甲醇提取效率比乙 醇高2 0 ，比水高7 3 ( r p m e t i v i e r ，1 9 8 0 ) 。酸性溶剂在破坏植物细 胞膜的同时溶解出水溶性色素。最常用的提取溶剂是l 的盐酸甲醇溶液 ( m a r k a k i s ，1 9 8 2 e ) ，但是用于食品着色时，考虑到甲醇的毒性，可以选 择l 的盐酸乙醇溶液。 用盐酸酸化可以保持低p h 值，获得较好的提取率，但能改变花色苷 的原始状态。因此，为了获得更接近于天然状态的花色苷，可采用中性溶 剂做初步提取，可采用的中性溶剂有6 0 甲醇、正丁醇、乙二醇、丙二 醇、冷丙酮、丙酮甲醇水混合物和水：另外，也可使用弱有机酸，如甲 酸、乙酸、柠檬酸和酒石酸等。如果既要考虑花色苷的产量，又要尽量保 持其原始状态，可以选择有机酸和甲醇提取花色苷，其中，柠檬酸是最好 的，其次是酒石酸、甲酸、乙酸和丙酸( r p m e t i v i e r ，1 9 8 0 ) 。 经初步浸提和过滤的花色苷提取物浓度通常很低，因此在纯化之前或 用于食品着色之前需要浓缩。为了减少色素的降解，浓缩通常采用真空浓 缩，温度不要超过3 0 ( m a r k a k i s ，1 9 8 2 c ) 。 1 2 1 2 花色苷的纯化 工业化生产花色苷，利用吸附树脂纯化比较经济，国内许多学者利用 大孔吸附树脂对花色苷的纯化进行了研究( 陈勇等，2 0 0 1 ；徐忠等，2 0 0 2 ； 马银海等，1 9 9 9 ) 。为分析目的纯化花色苷时，1 传统方法是纸色谱 ( m a r k a k i s ，1 9 8 2 c ) ，薄层色谱和柱色谱也可用于花色苷的纯化 ( j b 。h a r b o r n e ，1 9 5 8 a ；t i b e rf u l e k ie t a l ，1 9 6 8 ) 。z a p s a l i s 和f r a n c i s 曾用乙酸铅沉淀法和离子交换树脂法纯化花色苷( c z a p s a l i se ta l ， 1 9 6 5 ) ，f r a n c i s 和a n d e r s e n 曾用微滴逆流色谱( d c c c ) 纯化花色苷 ( f r a n c i s ，g w ，1 9 8 4 ) 。目前，国外许多学者利用s e p p a kc a r t r i d g ec ，。 柱反相高效液相色谱( r p h p l c ) 和半制备高效液相色谱对花色苷成功进 白刺果实色素结构及性质的研究 潞。“衅q 谬”瞄： 山东农业大学硕士学位论文 1 9 8 2 a ) 。对于一个给定的p h 值，在花色苷的4 种结构之间存在着平衡： 蓝色的醌式( 脱水) 碱( a ) 、红色的花锑正离子( a h + ) 、无色的甲醇假 碱( b ) 和查尔酮( c ) ( 图3 ) 。非酰化和单酰化的花色苷在p h 值很低时， 其溶液呈现最强的红色，随着p h 值的增大，花色苷的颜色将褪至无色， 最后在高p h 值时变成紫色或蓝色：但是，具有两个或两个以上酰基的花 色苷在整个p h 范围内都表现出了相当好的颜色稳定性。另外，酰化部分 的性质对花色苷的稳定性也有影响( 任玉林等，1 9 9 5 ) 。 1 2 2 3 温度 花色苷无论是在天然体系还是在模拟体系，其稳定性都会明显的受到 温度的影响。花色苷的热稳定性与其结构、p h 值、氧以及体系中其它化 合物的反应有关。糖苷配基的羟基化使花色苷稳定性降低，面甲基化、糖 基化和酰基化能增强其稳定性。在图3 的四种形式中，加热会使花色苷向 着无色的查尔酮式结构移动。 文献报道( m a r k a k i s ，1 9 8 2 b ) ，在1 0 0 。c 2 1 热1 h ，会使草莓中的花色 苷降解一半；而在3 8 c 储存时，花色苷降解一半的时间是1 0 天；在2 0 储存，花色苷降解一半的时间是5 4 天，而在o 。c 储存花色苷降解一半 所需的时间是1 1 个月，可见，花色苷在低温下稳定性较好。对于食品加 工领域，有的学者提出在1 0 0 c 加热低于1 2 m i n ，花色营的损失可忽略不 计，所以提倡高温瞬时加热。 1 2 2 4 酶 在花色苷降解过程中，涉及到的酶有糖苷酶和多酚氧化酶这两大类。 糖苷酶可水解花色苷至游离的糖和花色素，花色素很不稳定，可自发生成 无色的物质。多酚氧化酶作用于存在邻一二酚羟基的花色苷，产生的中间 产物一邻醌能通过化学氧化作用使花色苷转化为氧化的花色苷及其降解 产物( 任玉林等，1 9 9 5 ；m a r k a k i s ，1 9 8 2 b ) 。 在加工储藏和包装之前，初步蒸气漂白对果品蔬菜中的花色素酶可起 到破坏和抑制作用。葡萄糖、葡萄酸和葡萄糖一6 一内酯是糖苷酶的竞争性 抑制剂。多酚氧化酶的活性可有效的被s 0 2 、亚硫酸盐、苯肼、半胱氨酸 和桔单宁所抑制。 1 2 2 5 光照 9 自刺果实色素结构及性质的研究 光照对花色苷有两种作用，一是有利于花色苷的生物合成，二是能引 起花色苷的降解。在光照下，酰基化的二糖苷比非酰化的二糖苷稳定，二 糖苷又比单糖营稳定。花色苷自身缩合或与其它有机物缩合后，根据环境 条件的不同，可能提高或降低花色苷的稳定性。多羟基黄酮、异黄酮等对 花色苷的光降解有抗性，因为带负电荷的磺酸基与带正电荷的花专善离子 相互吸引，使这些分子与花色昔形成了复合物( m a r k a k i s ，1 9 8 2 b ) 。 1 2 2 6 氧和抗坏血酸 分子氧可引起花色苷的降解，产生无色的或褐色的物质( g a f h e n d r g ，1 9 9 2 ) 。早在1 9 8 6 年b e a t t i e 和p e d e r s o o n ( m a r k a k i s ，1 9 8 2 b ) 就观察到在储存的果汁中氧和抗坏血酸的量同时减少，这是因为抗坏血酸 被氧化后能产生h 2 0 ：，h 2 0 。能引起花色苷的降解。另外，在有铜离子存在 的条件下，能加速抗坏血酸和花色苷的降解。温度较低时，抗坏血酸对花 色苷起稳定作用，温度较高时，抗坏血酸对花色苷结构的破坏作用加速。 1 2 2 7 糖及其降解产物 在高浓度的糖存在下，由于水分活度降低，花色苷生成假碱式结构的 速度减慢，所以花色苷的颜色得到了保护；在低浓度的糖存在下，花色苷 的降解或变色却加速( g a fh e n d r g ，1 9 9 2 ) 。果糖、阿拉伯糖、乳糖和 山梨糖的这种作用比葡萄糖、蔗糖和麦芽糖更强。花色苷的降解速率和糖 本身降解时生成糖醛类化合物的速率有关，温度和氧能加快这种作用。 1 2 2 8 二氧化硫 二氧化硫在食品工业中常用作防腐剂和漂白剂。二氧化硫对花色苷的 漂白存在可逆或不可逆反应。当二氧化硫用量在5 0 0 - - 2 0 0 0 p p m 时，这种 漂白是可逆的，在后续的加工中，通过大量水洗脱后，颜色可部分恢复。 对不可逆漂白的反应研究较多，认为二氧化硫在果汁中酸的作用下形成亚 硫酸氢根，它对花色苷4 一位碳亲核攻击生成了无色的花色苷亚硫酸盐复 合物( m a r k a k i s ，1 9 8 2 b ) 。 有学者研究，用3 0 p p m 的低浓度的二氧化硫可抑制酶对花色苷的降解 而不会对花色苷有漂白作用( m a r k a k i s ，1 9 8 2 b ) 。t i m b e r l a k e 和b r i d l e 发现在提取花色苷时加入适量的二氧化硫可显著提高其产量( m a r k a k i s ， 1 9 8 2 b ) ，g a o 和m a z z a 发现从紫色向日葵壳中提取花色苷的最优条件是 1 0 山东农业大学硕士学位论文 含有2 0 0 p p m 的二氧化硫水溶液( l g a oe t a l ，1 9 9 6 ) ，m a z z a 和m i n i a t i 在提取葡萄皮中的花色菅时也证明含有二氧化硫的水溶液有较好的提取 效果( m a z z a ge ta l ，1 9 9 3 ) 。加入二氧化硫改善了花色苷提取的机制还 不是十分清楚，可能的原因是花色苷和亚硫酸根离子反应改善了细胞壁的 渗透能力，提高了色素的溶解度( b r o u i l l a r d r e ta l ，1 9 8 0 ) 。 1 2 2 9 金属离子 花色苷与钙、铁、铜、铝、锡或其它金属离子的络合对颜色也能起稳 定性作用。但是，只有那些在b 一环上含有邻位羟基的花色苷才能与金属 离子络合，因此，可以通过向花色苷添加某种金属离子，再观察萁最大吸 收波长是否移动，来区别具有这种特定结构的花色苷和其它结构的花色 苷。例如通过加三氯化铝的醇溶液来判断所分离的花色苷是否b 一环上含 有邻位二羟基( j b h a r b o r n e ，1 9 5 8 a ；m a r k a k i s ，1 9 8 2 c ) 。 虽然金属离子对花色苷具有一定的稳定和保护作用，但其效应也不是 有益无害的，因为在增色的同时形成的金属一单宁络合物可导致褪色。 1 2 2 1 0 辅助成色 如果只考虑p h 值，普通的花色苷不会产生很深的颜色，因为在一个 很大的p h 值范围内都以无色的形式存在。在自然界中，花色苷有时有很 强的着色能力，这意味着它的有色结构受到了某些理化因素的影响，这些 因素之一就是辅色素( c o p i g m e n t ) 的辅助成色作用，这些辅色素多数是 黄酮类、氨基酸和核苷酸。花色苷本身也可以作为其它花色督的辅色素， 但是在一般情况下，花色苷自身作为辅色素对于染色并无多大意义。 对于绝大多数的天然花色苷来说，辅助成色作用主要是在适当条件下 使花色苷的最大吸收波长红移，使其在可见波段的吸收增加。辅助成色受 到若干因素的影响，其中p h 值是一项重要因素，已经证明，辅助成色作 用从p h 值接近l 到中性时才发生。其它的影响因素还有花色苷的类别和 浓度、辅色素的浓度、温度和金属离子的种类( 任玉林等，1 9 9 5 ) 。 1 2 2 1 1 亲核试剂 非酰化和单酰化的花色萤对c - 2 位和c 一4 位的亲核进攻特别敏感。对 于氨基酸和碳亲核试剂，进攻往往都发生在亲电的c - 4 位上，这些生成物 的活性都很高，根据c 一4 位取代基的性质还会发生进一步反应，它们最终 白刺果实色素结构及性质的研究 都使花色苷褪色。c 一4 位被甲基或苯基取代的花铀；盐对亲核进攻具有抵御 作用，这表明c 一4 位被取代是使花色苷稳定化的有效措施( 任玉林等， 1 9 9 5 ) 。 1 2 3 花色苷的定性分析 花色苷的结构表征一般包括：糖苷配基的鉴定、糖和酰化基团( 如果 有的话) 的鉴定以及糖和酰化基团的连接位置的确定。 花色苷的结构鉴定最早由b a t es m i t h 引入纸色谱方法进行的 ( e c b a t e s m i t h ，1 9 4 8 ) ，后来，h a r b o r n e 系统地总结了花色苷利用纸 色谱定性的方法，并提供了大量有价值的数据( j b h a r b o r n e ，1 9 5 8 a ) 。 目前对花色苷定性的研究方兴未艾，对此国内外均有大量报道( d a n g l e s ， 1 9 9 3 ：j b h a r b o r n e ，1 9 5 8 a ；m a r k a k i s ，1 9 8 2 b ：l g a oe ta l ，1 9 9 6 ： m a z z a ge ta l ，1 9 9 3 ：v i c t o rh o n ge ta l ，1 9 9 0 a ，b ：吕晓玲，1 9 8 5 ：成 漠等，1 9 9 8 ：江南生等，1 9 9 0 ：钟丽玉等，1 9 9 6 ) 。 1 2 3 1 光谱法 1 2 3 1 1 紫外可见光谱法紫外一可见光谱很早就被人们应用于花 色苷的结构鉴定( j b h a r b o r n e ，1 9 5 8 a b ：m a r k a k i s ，1 9 8 2 c ) ，该法主 要有如下几点： ( 1 ) 花色苷的最大吸收波长一个在可见光区的5 0 0 - - 5 4 0 n m 附近，另一个在 紫外2 7 5 n m 附近，通过测定色素的最大吸收波长即可判断是否为花色苷类 色素。 ( 2 ) 如果向花色苷的0 0 1 盐酸甲醇溶液中滴加3 5 滴5 ( w ：v - - 5 ：9 5 ) a i c i ，甲醇或乙醇溶液，如果最大吸收波长出现红移，即最大吸收波长增 加，说明b 一环有邻位酚羟基，即可区分b 一环无邻位酚羟基的天竺葵色 素、芍药色素、锦葵色素和b 一环有邻位酚羟基的矢车菊色素、牵牛花色 素、飞燕草色素。 ( 3 ) 根据花色苷4 4 0 n m 处的吸光度和最大吸收波长处的吸光度的比值 a m a 。，参考文献后，可以判断糖苷的位置。 “) 根据花色苷在3 0 0 - - 3 3 0 n m 间有无吸收峰可判断该色素分子是否有酰 基，如果有吸收峰，表明该花色苷有酰基存在。 ( 5 ) 根据花色苷在4 4 0 h m 处是否有肩峰，可以判断该色素5 号位的羟基是 些查查些查茎堡主兰堡丝苎一 否被取代。如果5 号位的羟基没有被取代，则该色素在4 4 0 n m 处有肩峰。 ( 6 ) 根据花色萤在紫外光下是否有荧光，可判断该色素是否在5 号位有取 代基，如果有荧光则表明该色素在5 号位有取代基。 1 2 3 1 2 红外吸收光谱法 目前，红外吸收光谱应用于花色苷的结构鉴定不太广泛，花色苷的红 外光谱主要有苯环、含氧杂环、糖和羟基以及甲氧基四部分( 姜平平等t 2 0 0 3 ) ：李景琳、吴信子曾用红外吸收光谱对蓝靛果花色苷的结构进行了 研究( 李景琳等，1 9 9 3 ：吴信子等，2 0 0 1 ) 。 1 2 3 2 色谱法 利用色谱法进行花色苷的结构鉴定需要对花色苷进行酸水解、碱降解 和过氧化物降解等处理，使花色苷中的糖苷配基、糖和有机酸游离出来， 再通过标准的糖苷配基、糖和有机酸作对照或参考文献数据，进行色谱分 析( m a r k a k i s ，1 9 8 2 c ；) 。传统的色谱方法有纸色谱、漳层色谱和柱色谱， 近来气相色谱、h p l c 和r p - - h p l c 应用于花色苷结构鉴定也逐渐增多( 钟 丽玉等，1 9 9 6 ：钟立人等，2 0 0 1 ：v i c t o rh o n ge ta l ，1 9 8 6 ；m m o n n i c a g i u s t i e ta l ，1 9 9 6 1l g a oe ta l ，1 9 9 5 ：l g a oe ta l ，1 9 9 4 ) 。 1 2 3 3 其它方法 目前随着仪器分析技术的发展，越来越多的方法应用于花色苷结构鉴 定，如气相色谱质谱联用( g c m s ) 分析花色苷与氯代三甲基硅烷反应后的 产物，快速原子轰击质谱( f a b - m s ) 可以精确测定花色苷的分子量，h - n m r 和c - - n i v i r 适用于丙二酸酰基化的花色苷结构鉴定( 钟丽玉等，1 9 9 6 ；钟立 人等，2 0 0 1 ；v i c t o rh o n ge ta l ，1 9 8 6 ；m m o n n i c ag i u s t ie ta l ，1 9 9 6 ； l g a oe ta l ，1 9 9 5 ) 。g a o 和m a z z a 利用h p l c 和g l c 发现了快速测定花 色苷结构的方法( l g a oe ta l ，1 9 9 4 ) 。h o n g 和w r o l s t a d 介绍了r p - h p l c 光二极管阵列检测器( p h o t o d i o d ea r r a yd e t e c t i o n ) 鉴定花色苷结构的 方法( v i c t o rh o n ge ta l ，1 9 9 0 ) 。 1 2 4 花色苷的定量分析 根据待分析花色苷的特性和分析需要，定量方法可分为三类 ( m a r k a k i s ，1 9 8 2 c ) ： 1 2 4 1 含有很少或者不含有干扰物质的体系中花色苷总量的测定 白刺果实色素结构及性质的研究 花色苷的最大吸收区在5 0 0 - - 5 5 0 n m 范围内，而离这一范围最近的类 黄酮的最大吸收范围在3 5 0 - - 3 8 0 n m 。在新鲜的植物提取物中，因为很少 含有在花色苷的最大吸收区发生吸收的干扰物质，花色苷总量可以利用比 耳定量通过适当波长处的吸光度来测定( t i b o rf u l e k i e ta l ，1 9 6 8 a ) 。 该方法铡定花色苷总量需要在一个恒定的p h 介质中进行，除了需要 在定性的基础上确定各种花色苷衍生物的种类，还需要测定单个花色苷衍 生物的最大吸枚波长下的摩尔消光系数e 或比消光度e 。由于单个花色 苷衍生物的差别很小，而且组成的比例未知，所以一般用平均比消光度 a ve 来测定花色苷总量，该方法误差一般小于0 2 ( m a r k a k i s ，1 9 8 2 c ； t i b o rf u l e k ie ta l ，1 9 6 8 a ) ，但是由于单个花色苷衍生物的比消光度e 很难得到，所以我们可以参考文献提供的数据( z a p s a l i se ta l ，1 9 6 5 ) 来测定花色苷总量；f u l e k i 和f r a n c i s 利用该方法对红莓子中花色苷总 量进行了测定( t i b o rf u l e k ie ta l ，1 9 6 8 a ) 。 1 2 4 2 含有干扰物质的体系中花色苷总量的测定 在食品加工或储藏过程中，会产生褐色物质，这些物质和花色苷具有 相同的能量吸收范围。这类花色苷总量的测定通常有两种方法( m a r k a k i s ， 1 9 8 2 c ；t i b o rf u l e k ie ta l ，1 9 6 8 b ) 。 1 2 4 2 1p h 示差法该法依据之是花色苷发色团的结构转换是p h 的 函数，依据之二是起干扰作用的褐色物质的特性不随p h 而变化。通过实 验，确定两个对花色苷吸光度差别最大但是对花色苷稳定的p h 值，根据 f u l e k i 的公式可以计算出花色苷总量( t i b o rf u l e k ie ta l ，1 9 6 8 b ) 。刘 云和冯建光曾用该法铡定荔枝果皮和葡萄皮总花色苷的含量( 刘云等， 2 0 0 3 ；冯建光等2 0 q 2 ) 。 1 2 4 2 2 差减法差减法就是先测定样品在可见光区最大吸光度，经二 氧化硫或亚硫酸盐漂白或过氧化氢氧化后，再测其吸光度，二者的差值就 是花色苷的吸光度：用标准花色瞢绘制工作曲线，将吸光度换算成浓度就 可以测定样品中的花色苷总量。但是，差减法因所使用的漂白剂也能降低 某些干扰组分的吸光度而使总花色苷浓度偏高( m a r k a k i s ，1 9 8 2 c ：t i b o r f u l e k ie ta l ，1 9 6 8 b ) 。 1 2 4 3 单个花色苷的定量 1 4 山东农业大学硕士学位论文 在新鲜的植物提取物中含有其它的类黄酮色素、花白素和糖类等杂 质，在加工或储藏的食品中除了含有上述杂质外，还含有褐色物质，我们 可以利用重复洗脱和色谱除去这些杂质，但是由于每一步操作都会产生误 差，所以理想的纯化方法是先除去花色苷的干扰物质，得到花色苷的浓缩 液，然后再进一步分离定量( m a r k a k i s ，1 9 8 2 c ；t i b o rf u l e k i e t a l ，1 9 6 8 d ) 。 对于单个花色苷的定量分析，分离纯化是其关键。早期单个花色苷纯 化的方法有乙酸铅法、聚酰胺法、聚乙烯吡咯烷酮法和离子交换树脂法， 其中以离子交换树脂法为最佳，以a m b e r l i t ec g 一5 0 离子交换树脂比较常 用。f u l e k i 曾用i ns i t u 方法对红莓子单个花色苷进行了分离纯化( t i b o r f u l e k ie ta l ，1 9 6 8 d ) ，而m a n l e y 和s h u b i a k 在1 9 7 5 年首次将h p l c 应用 于单个花色苷分离( m a r k a k i s ，1 9 8 2 c ) ，也有学者利用t l c 和g l c 方法用 于单个花色苷的分离。目前，h p l c 已广泛应用于总花色营和单个花色苷 的定性定量分析( m a r k a k i s ，1 9 8 2 c ；t i b o rf u l e k ie ta l ，1 9 6 8 d ：v i c t o r h o n ge ta l ，1 9 8 6 ：m m o n n i c ag i u s t ie ta l ，1 9 9 6 ：l g a oe ta l ，1 9 9 5 ： l g a oe ta l ，1 9 9 4 ) 。 1 2 5 花色苷的植物细胞培养生产 用食品生物工程技术，可以实现花色苷工业化生产。作为一种植物次 生代谢物质，可用植物组织培养技术进行生产。天然植物中花青素含量很 少，为了提高产率，研究人员做了大量工作，研究了细胞悬浮培养条件与 细胞生物和花青素产率的关系( 钱建江，1 9 9 5 ：杜金华等。1 9 9 7 a ，b ；朱 新贵等，1 9 9 9 ) 。 1 3 花色苷在实际应用中存在的问题 随着社会的进步，人们更加崇尚绿色，追求自然花色苷作为一种重 要的天然食用色素，其应用将越来越广泛，因而具有很好的发展前景。目 前花色苷在实际应用中主要存在如下问题： 1 3 1 不断开发新的花色苷资源 大多数植物中的色素都是花色苷，据估计，全世界的植物7 0 还没 有研究，只有0 5 的植物作过彻底的研究( w i s s o t t u ，1 9 9 6 ) ，从这 个方面看我们对花色昔的研究才bj j br j 开始，这就要求我们努力开发新的稳 旦型墨窒鱼鲞堕塑墨垡堕塑堡塞 一 定性和色泽等方面都比较好的花色苷资源。 1 3 2 改善现有花色苷的稳定性 花色苷的稳定性易受外界因素的影响，使其应用受到一定的限制，花 色苷在提取后经过浓缩、精制可使稳定性得到改善：通过对花色苷进行改 性，也可改善其稳定性：另外，在实际应用中，我们还要避免花色苷和其 敏感因素的接触。 1 4 本课题研究的目的、内容和意义 1 4 1 研究目的 通过本研究，达到如下目的： 1 确立白刺果实花色苷的最佳提取条件； 2 研究白刺果实花色苷的稳定性； 3 对白刺果实花色苷进行初步定性分析： 4 对白刺果实花色苷进行定量分析。 1 4 2 研究内容 1 通过单因子实验和四因子二次通用旋转试验设计，确立白刺果实中花 色苻的最佳提取条件； 2 在不同条件下研究白刺果实花色苷的稳定性； 3 利用纸层析对白刺果实花色苷分离、纯化并结合光谱数据对其初步定 性： 4 在定性的基础上进行定量分析。 1 4 3 本课题的研究意义 本课题的研究材料是西伯利亚白刺( y i t r a r i e $ i b i r i c ap a l l ) 果 实。西伯利亚白刺是蒺藜科( z y g o p h y l l a c e a e ) 白刺属的一个品种，落叶小 灌木，耐早、耐盐碱、喜沙，其果实又名酸胖，有“沙漠樱桃”之称。核 果浆果状，肉质，呈现暗红或紫红，7 8 月份成熟。生长于盐碱化低地 及干旱低山坡，分布蒙古、俄罗斯及中国西北、华北、东北各省区。( 刘 金荣等，2 0 0 2 ；赵克昌等，1 9 9 5 ) 自刺除了具有防风固沙的作用外，其果 实还有较高的食用价值和药用价值。白刺果实含有19 种氨基酸( 包括 全部人体不能合成的8 种必需氨基酸) 和22 种微量矿质元素；白刺种 子含油l29 6 ，种子油中的脂肪酸以不饱和脂肪酸为主：自刺果可健脾胃、 山东农业大学硕士学位论文 滋补强壮、调经活血，主治脾、胃衰弱，具有很高的药用价值；白剌果 的黄酮含量很高，可以延缓衰老：另外，白刺果实还含有很高的维生素、 有机酸、糖类，鲜果美味可口，甜酸适度，是具有发展前景的第三代水果 ( 姜明等，1 9 9 4 ) 。 目前，白刺果实在应用上仅局限于一些初级产品的开发和入药。对其 深加工产品进行研究的还很少( 刘金荣等，2 0 0 2 ；赵克昌等，1 9 9 5 ) ，而 对白刺果实色素的提取及结构测定尚未见报道。自刺果实色素具有亮丽的 玫瑰红色，可以作为良好的天然食品色素。因此，本研究通过对白刺果实 中花色苷最佳提取条件的确定、稳定性研究以及结构的初步鉴定，为