（环境科学专业论文）海洋微生物抗肿瘤活性菌株的筛选及其活性物质的研究.pdf

王雪玲海洋微生物抗肿瘤活性菌株的筛选及其活性物质的研究 s c r e e n i n gf o rt h ea n t i - t u m o ra c t i v i t yf r o mm a r i n eb a c t e r i a a n dr e s e a r c ho nt h ea c t i v ep r o d u c t s a b s t r a c t d u et oi t s s p e c i a le c o l o g i c a le n v i r o n m e n t ，o c e a n i sr i c hi nb i o l o g i c a l s p e c i e s r e s o u r c e s ，a n dt h e s em a r i n eo r g a n i s m sc o n t a i nal o to fv a l u a b l eb i o l o g i c a u ya c t i v e s u b s t a n c e s m o r ea n dm o r ea t t e n t i o nh a v eb e e np a i do n t om a r i n em i c r o o r g a n i s m sb e c a u s e o f t h e i rh i g h e rs p e c i f i c i t ya n dt h ee a s eo f f e r m e n t a t i o n i nt h i sw o r k ，m t t a s s a yw a su s e d t os c r na n t i t u m o ra c t i v ea g e n t sf r o m2 51m a r i n eb a c t e r i a a n dt h e nap r e l i m i n a r ys t u d y a b o u tt h ei s o l a t i o na n di d e n t i f i c a t i o no ft h ea c t i v em e t a b o l i t e sf r o mn o 6 5 7f e r m e n t sw a s a l s oc o n d u c t e d t h em a i nc o n c l u s i o n so ft h es t u d ya r el i s t e da sf o l l o w s ： 1 i nt h i ss t u d y ，b yu s i n gm t t a s s a y ，w es c r e e n e df o rt h ea n t i t u m o ra c t i v i t yf r o ms o m e m a r i n eb a c t e r i a ls t r a i n sw h i c hw e r ei s o l a t e df r o ms a nj u a ni s l a n d ，t h eu s a t h er e s u l t s s h o w e dt h a t ，a m o n g2 51t e s t e db a c t e r i a li s o l a t e s ，5 4i s o l a t e s ( a b o u t2 1 5 ) s h o w e db e t t e r a n t i t u m o ra c t i v i t y t h e i ri n h i b i t i o nr a t e sa g a i n s th e l ac e l l a tt h ec o n c e n t r a t i o no f10 0 p , g m lw e r el a r g e rt h a n5 0 a n d7o ft h e ms h o w e ds t r o n g e ra n t i t u m o ra c t i v i t yw i t ht h e i n h i b i t o r yr a t eh i g h e rt h a n8 5 a m o n ga l lt h ea c t i v es t r a i n s ，b a c t e r i u mn o 6 5 7s h o w e dt h e m o s tr e m a r k a b l ea n t i t u m o ra c t i v i t i e s t h ea n t i t u m o ra c t i v i t i e s ( i c 5 0 ) o fi t sm e t a b o l i e s e x t r a c t e df r o ml i q u i df e r m e n t a t i o na n ds o l i d s t a t ef e r m e n t a t i o na r e3 6 5 31 t g m la n d3 19 r t g m lr e s p e c t i v e l y t h es o l i d - s t a t ef e r m e n t a t i o ns h o u l db eb e t t e rf o ri t sa c t i v em e t a b o l f f e s p r o d u c t i o n 2 t h i sa c t i v es t r a i nn o 6 5 7w a st h e ni d e n t i f i e da ss e r r a t i ap r o t e a m a c u l a n s ，a c c o r d i n g t oi t sm o r p h o l o g i c a lo b s e r v a t i o na n d16 sr d n a s e q u e n c ea n a l y s i s 3 t h es o l i df e r m e n t a t i o nc o n d i t i o n so fs t r a i nn o 6 5 7w e r ea l s os t u d i e d s i n g l ef a c t o r e x p e r i m e n t ss h o w e dt h a tt h eo p t i m u mf e r m e n t a t i o nc o n d i t i o n sa r e ：t e m p e r a t u r e2 0 - 2 3 。c ， i n i t i a lp hv a l u eo f6 7 ；b yh a c k e r b u r m a n ( p b ) d e s i g n ( n = 1 2 ) ，4i m p o r t a n tf a c t o r sf o r a f f e c t i n g a c t i v e c o m p o u n d sp r o d u c t i o n w e r ef i r s t l ys c r e e n e d o u t ,a n do r t h o g o n a l e x p e r i m e n tw a sf r r t h e rc o n d u c t e dt oa r r a n g et h ei m p o r t a n c eo ft h e4f a c t o r s ，w h i c hw a s n a c i p e p t o n e m g s 0 4 y e a s te x t r a c t t h eo p t i m u mm e d i u mc o n t a i n e d10 0go fp e p t o n e ， 1 1 1 扬州大学硕士学位论文 1 og o f y e a s te x t r a c t ，1 9 4 5g o f n a c la n d0go f m g s 0 4 4 w bc o n d u c t e dap r e l i m i n a r ys t u d yo nt h es e p e r a t i o na n di d e n t i f i c a t i o no fa c t i v e m e t a b o l i t e sf r o mt h es t r a i nn o 6 5 7 b yt h i nl a y e rc h r o m a t o g r a p h ya n ds i l i c ag e lc o l u m n c h r o m a t o g r a p h y , t h eo r g a n i ce x t r a c t so fb a c t e r i a lc e l l sc o l l e c t e df r o ms o l i d - p h a s ef e r m e n t s w e r ei s o l a t e da n dp u r i f i e d n em o b i l ep h a s eo fs i l i c ag e lc o l u m nc h r o m a t o g r a p h yw a s d e r t e r m i n e dt ou s ed i c h l o r o m e t h a n e ( d c m ) 一m e t h a n o ls o l v e n ts y s t e mb a s e do nt h et l c s p e e t n m a ，a n dt h es e p a r a t i o nc o n d i t i o n sw e r eg r a d i e n t l ye l u t e dw i m ：p u r ed c m ，t h e p r o p o r t i o no fd c ma n dm e o h1 0 0 ：1 ，9 8 ：1 ，9 5 ：1 ，9 0 ：1 ，7 0 ：1 ，4 0 ：1 ，2 0 ：1a n dp u r e m e o h a c ；t i v i t yg u i d e ds e p e r a t i o ns h o w e dt h a tt h ef r a c t i o n se l u t e dw i t h 10 0 ：1 - 9 5 ：1 d c m - m e o hh a v eb e t t e ra n t i t u m o ra c t i v i t i e s ，a n da m o n gt h e m9 8 ：1f r a c t i o ns h o w e dt h e s t r o n g e s ta c t i v i t yw i mt h ei c 5 0o f0 2 4 8i - t g m l n e a r l y 13t i m e sh i g h e rt h a nt h a to ft h e c r u d ee x t r a c t t l ca n a l y s i sa l s oi n d i c a t e dt h a tt h ep u r i t yo f9 8 ：1f r a c t i o nw a sh i g h e rt h a n o t h e rf r a c t i o n s 5 b yg a sc h r o m a t o g r a p h y m a s ss p e c t r o m e t r y ( o c m s ) a n dp r o t o nn u c l e a rm a g n e t i c r e s o n a n c es p e c t r o s c o p y ( 1 h - n m r ) a n a l y s i sf o rt h ec o m p o u n di d e n t i f i c a t i o n ，t h em a i n a c t i v es u b s t a n c ei nt h e9 8 ：1f r a c t i o nw a si d e n t i f i e da sp r o d i g i o s i n k e yw o r d s ：m a r i n em i c r o o r g a n i s m s ；a n t i t u m o r , a c t i v es u b s t a n c e s ；p r o d i g i o s i n ； i d e n t i 6 c a t i o n 王雪玲海洋微生物抗肿瘤活性菌株的筛选及其活性物质的研究 目录 摘j l j e i 第1 章前言1 1 1肿瘤及抗肿瘤药物。 。1 1 1 1癌症概述l 1 1 2 抗肿瘤药物概况1 1 1 3 微生物来源的抗癌药物2 1 2 海洋微生物抗肿瘤活性的研究。2 1 2 1 来源于海洋放线菌的抗肿瘤活性物质3 1 2 2 来源于海洋真菌的抗肿瘤活性物质3 1 2 3 来源于海洋细菌的抗肿瘤活性物质4 1 3 天然抗肿瘤活性物质的研究方法5 1 3 1 抗肿瘤活性物质的筛选方法5 1 3 2 抗肿瘤活性物质的确定7 1 3 3 活性物质的分离、纯化和检测8 1 4 论文的设计思路及研究目的。 第2 章海洋细菌抗肿瘤活性菌株的筛选及鉴定10 2 1 材料 2 1 1 供试菌株1 0 2 1 2 培养基1 0 2 1 3 肿瘤细胞株1 0 2 1 4 主要仪器1 0 2 1 5 主要试剂及常用溶液1 0 2 2 方法 2 2 1 菌株发酵及粗提物的获取1 l 2 2 2 肿瘤细胞培养1 1 2 2 3 抗肿瘤活性的筛选1 1 2 2 4 固体发酵及代谢物的提取1 2 2 2 5 活性菌株的鉴定1 2 2 3 结果与分析 2 3 1 阳性药物5 f u 试验浓度的确定。1 2 2 3 2 抗肿瘤活性的定性观察1 3 扬州大学硕士学位论文 2 3 3m t t 法活性初筛1 4 2 3 4 活性复筛1 5 2 3 5n o 6 5 7 固体发酵与液体发酵产物抗肿瘤活性的比较1 6 2 3 6 菌株n o 6 5 7 形态观察1 7 2 3 7 菌株n o 6 5 71 6 sr d n a 序列分析结果1 8 2 4 本章d 、结1 9 第3 章活性菌株n o 6 5 7 抗肿瘤活性固体发酵条件的优化2 0 3 1 材料2 0 3 2 方法2 0 3 2 1 固体发酵提取物的获取2 0 3 2 2 菌体生物量( 菌体干重) 的测定方法2 0 3 2 3 抗肿瘤活性的测定2 0 3 2 4 培养温度、培养基初始p h 值对菌株抗肿瘤活性的影响2 0 3 2 5 培养基成分的优化2 0 3 3 结果与分析。2 1 3 3 1 培养温度对菌株抗肿瘤活性的影响2 l 3 3 2 培养基初始p h 值对菌株抗肿瘤活性的影响一2 3 3 3 3 培养基组分的p l a c k e t t - b u r m a n 实验设计结果分析2 4 3 3 4 培养基组分的正交实验设计结果分析2 5 3 3 5 发酵条件优化后发酵产物与优化前发酵产物的比较2 7 3 4 本章小结。2 8 第4 章菌株n o 6 5 7 抗肿瘤活性产物的分离鉴定。2 9 4 1 材料2 9 4 1 1 供试菌株及细胞2 9 4 1 2 培养基2 9 4 1 3 主要仪器2 9 4 1 4 主要试剂2 9 4 2 方法2 9 4 2 1 菌株n o 6 5 7 的固体批量发酵及发酵产物的提取2 9 4 2 2 菌株n o 6 5 7 发酵产物的分离纯化2 9 4 2 3 活性成分的鉴定3 0 4 3 结果3 1 4 3 1 发酵产物分离的预实验3 1 4 3 2 发酵产物的分离纯化3 3 4 3 3 活性成分的鉴定- 3 6 4 4 本章小结 王雪玲海洋微生物抗肿瘤活性菌株的筛选及其活性物质的研究 第5 章讨论与结论3 9 5 1 海洋微生物抗肿瘤活性菌株的研究 5 2 菌株n o 6 5 7 发酵条件的研究 5 3 菌株n o 6 5 7 固体发酵的研究。4 0 5 4 灵菌红素的理化性质研究 5 5 结论与展望 4 1 参考文献4 3 附图4 9 附表5 2 致谢5 5 攻读学位期间发表的学术论文目录5 6 扬州大学学位论文原创性声明和版权使用授权书5 7 王雪玲海洋微生物抗肿瘤活性菌株的筛选及其活性物质的研究 1 第1 章前言 1 1 肿瘤及抗肿瘤药物 1 1 1 癌症概述 肿瘤是一种常见病、多发病，危害性极大，其中恶性肿瘤( 俗称“癌症”) 仅次于心血 管疾病成为威胁人类健康的第二类杀手，严重地危害着世界人民的生命健康，一直备受关 注。世界卫生组织专家预测，2 0 2 0 年全球人口8 0 亿，癌症新发病例将达到2 0 0 0 万人【堆】， 到2 0 3 0 年每年将有超过1 1 万人死于癌症【3 】，癌症将会成为全球最大的公共卫生问题。癌 症同样威胁着我国人民的健康，根据调查资料显示，我国一些省( 市) 如福建、浙江、江苏、 上海，癌症死亡居各类死因的首位，全国每年死于癌症的人数约9 0 万，占人口总死亡的 1 3 1 4 ；每年新发的癌症患者约1 2 0 万，现癌症患者约1 8 0 万【4 】。由于人口老龄化进程的 加快，城市人口比例的逐年增长，城镇工业生产的迅速发展，以及污染日趋严重的环境条 件等原因的存在，预计我国癌症的发生与死亡数目将会明显增加，更加威胁到人民健康和 生命【5 1 。 尽管与过去相比，人类的医疗卫生条件有了巨大的改善，但是人类征服癌症的步伐仍 然十分艰难，美国每年投资几十亿美元用于癌症研究。癌症的发病因素极其复杂，病因学 统计上达千百种，比如人类生存环境中存在的众多的化学致癌物质、各种物理辐射、病毒 以及各种生理损伤等因素，这些都有可能导致癌症的产生。人体自身的正常细胞，经过上 述一种或几种致癌因子的刺激和诱发，转变成了恶性的癌细胞，这是癌症发生的根本原因。 手术、化疗、放疗是目前癌症治疗的主要方法，其中最有把握的，还是当癌症病发初期手 术切除，但是一般来说病发初期极难发现。 1 1 2 抗肿瘤药物概况 用药物治疗癌症巳有悠久的历史，但对其进行系统研究则是本世纪4 0 年代后才逐步 开展起来的。按照药物性质和来源将抗肿瘤药物分为以下九大类：烷化剂，如氮芥类、乙 撑亚胺类、甲磺酸酯及多元醇类、亚硝基脲类；抗代谢药，如嘧啶拮抗物、嘌呤拮抗物、 叶酸拮抗物；抗肿瘤抗生素；植物类抗肿瘤药( 或称来自天然药物的抗肿瘤药) ；激素类； 金属铂类；其它抗肿瘤药；辅助抗肿瘤类药；免疫调节剂( 免疫增强剂类) 【5 1 。前7 种药物主 要应用于抗肿瘤治疗上，而后两种适应症较多，也广泛采用于治疗其他疾病【6 】。 按照作用机制，抗肿瘤药物可分为以下几类：干扰核酸生物合成的药物，如抗代谢药； 破坏d n a 结构和功能的药物，如烷化剂、丝裂霉素、博来霉素；嵌入d n a 中干扰转录 2 扬州大学硕士学位论文 r n a 的药物，如放线菌素类、柔红霉素、阿霉素等：影响蛋白质合成的药物，如秋水仙碱、 长春碱类等；影响体内激素平衡的药物，如雌激素、雄激素和肾上腺皮质激素等。近年来 国外开发上市了许多抗肿瘤药物新品种，如长春瑞宾、替尼泊苷、表柔比星、雌莫司汀和 亮丙瑞林等，这些药物由于受到专利保护，目前国内市场只能依赖进口并且价格昂贵，因 此市场上较为紧缺；目前药物市场上我国生产的几乎全是仿制药品，主要是一些已经经过 保护期的药物【_ 7 1 。2 0 世纪5 0 年代末，我国开始抗肿瘤药物的研究与生产，现在该类企业 已发展到近百家。目前我国年生产抗肿瘤药物约5 0 吨左右，主要分布在上海、江苏、浙 江和山东等地。同时，我国研究者对3 0 0 多种中草药进行抗癌筛选，有1 0 0 多种经过了临 床验证，2 0 多种已经投产，具有很好的开发与应用前景【8 1 。 1 1 3 微生物来源的抗癌药物 微生物代谢产物具有具有以下特点：化学结构多样、生物活性多样、类药性强，再生 性强等，因此可作为创新药物的重要来源【9 】。目前自然环境中的5 0 0 万种微生物仅有约3 被分离与报告出来。据统计，目前全球有1 4 的抗癌药物来自微生物及植物，而另有1 4 的抗癌药物源自其合成衍生物，即目前全球使用的抗癌药物中，有一半是直接或间接来自 微生物【1 0 j 。 1 2 海洋微生物抗肿瘤活性的研究 海洋覆盖了地球表面的7 2 ，海洋生物能够耐受海洋特有的高盐、高压、低养、低光 照等极端条件，这特异的环境导致其在物种、基因组成和生态功能上的多样性【1 1 1 。而由于 海洋生物栖息地的多样性，海洋是开发许多生物活性物质的重要药物来源，为了评估海洋 生物的价值，来自8 0 多个国家，2 7 0 0 多名科学家进行了海洋普查，结果发现潜在的新物 种超过6 0 0 0 种 1 2 。科学家预言，最有前途的抗肿瘤药物将来白海洋【l3 1 。美国每年有1 5 0 0 个海洋化合物单体被分离出来，其中1 具抗肿瘤作用【1 4 】，如今，自然来源的抗肿瘤药物 在抗肿瘤药物领域发挥着巨大作用【1 5 】。但是，由于海洋药物研究的特殊性，如深海采集技 术的限制和海洋来源化合物稳定性差等原因，海洋药物的开发研究具有巨大的困难【l 6 ，1 7 1 。 因此，海洋成为开发生物活性物质的重要来源。近二十年来，已从海绵、海鞘、海 兔、海藻、珊瑚等海洋生物中分离获得大量具有抗肿瘤活性的化合物【1 8 。2 1 】，这些化合物是 开发新的抗肿瘤药物的重要来源，如由海绵中抗肿瘤物质合成了药物e r i b u l i nm e s y l a t e 【2 2 1 ， 由海鞘中活性物质得到抗肿瘤药物t r a b e c t e d i n 2 3 1 。而现在越来越多的实验证明来自海洋动 植物的活性物质的真正生物源是海洋微生物，目前，该方面研究主要集中在海洋细菌、真 菌、放线菌抗肿瘤化合物的研究上，已经分离出许多具有开发价值的抗肿瘤化合物【2 4 。2 9 】， 王雪玲海洋微生物抗肿瘤活性菌株的筛选及其活性物质的研究 3 尽管如此，海洋来源的抗肿瘤药物在药物市场上的比重扔远远低于陆地来源，因此，新的 抗肿瘤药物的发展仍然需要更充足的、抗肿瘤性更强的海洋微生物活性物质。 1 2 1 来源于海洋放线菌的抗肿瘤活性物质 海洋放线菌是海洋抗肿瘤活性物质的重要来源，最先引起研究者的重视。海洋放线菌 具有很大的开发潜力，目前已发现大约有1 0 的海洋放线菌具有一定的细胞毒活性。 海洋链霉菌产生的抗肿瘤活性物质比其他放线菌要多，如a l t 睨 n i c i d i n ( 9 ) 是一种结构新 颖、含硫和氮的生物碱，具有单萜骨架，是从盐屋链霉菌s t r p e o t m y c e si o y a e n s i s a - 1 7 5 8 中 分离到的，它对l 1 2 1 0 淋巴瘤和i m c 癌细胞具有很强的毒活性，对两种细胞的i c 5 0 分别 为0 8 4 和o 8 2m g l ，但它对小鼠也有一定的毒性( l d 5 0 = 0 3m g l ) t 3 0 1 。 h a l i h c o m y c i n 是一种新的大环内酯类化合物，是从海鱼胃肠道中分离的吸水链霉菌 s h y g r o s c o p i c u s 中产生的，其对小鼠p 3 8 8 白血病细胞的e d 5 0 为0 1 3i t g m l t 3 1 1 。 f e n i c a l 研究组【3 2 1 2 0 0 1 年首次报道从海洋放线菌属m a r i n o s p o r a 中分离鉴定出一系列结 构新颖的化合物，命名为s a l i n o s p o r a m i d e s ，这些化合物具有很强的抗癌活性，如 s a l i n o s p o r a m i d e a ( 1 ) 对h c - t 1 1 6 细胞的i c s o 为0 0 1 6p g m l 。 从海洋小单胞菌中发现的抗肿瘤活性物质，越来越受到人们的重视。t h i o c o r a l i n e ( 1 6 ) 和i b 9 6 2 1 2 ( 1 7 ) 是从印度海域的小单孢菌属代谢产物中筛选得到的。t h i o e o r a l i n e ( 1 6 ) 是小 单饱茵l - 1 3 a c m z 0 9 2 ( 从软珊瑚分离) 中分离得到，它是一种结构复杂的含硫的 d e p s i p e t i d e 类化合物，其对p 3 8 8 、a 5 4 9 及m e l 2 8 细胞有极强的细胞毒性( i c s o 均为 0 0 0 2 r a g l ) ，但对h t 2 9 细胞有显著细胞毒性( i c s o 为o 0 1r a g l ) 。i b 9 6 2 12 是小单饱菌 l 2 5 e s 2 5 0 0 8 ( 从海绵分离) e e 分离得到，是一种结构新颖的大环内酯类化合物，对p 3 8 8 细胞有极强细胞毒性( i c 5 0 = 0 0 0 0 1r a g l ) ，对a 5 4 9 、h t 2 9 及m e l 2 8 细胞有显著细胞毒性 ( i c 5 0 = 1m g l ) 3 3 3 4 1 。 从海洋放线菌( c n h 0 9 9 ) 分离到的含倍半萜的新奈酯类抗生素n e o m a r i n o n e ( 1 8 ) ，对 h c t - 1 1 6 细胞有中等细胞毒性( i c s 0 = 0 8r a g l ) ，对n c i 的6 0 个人类肿瘤细胞群i c s o 平均值 为1 0m n o l l 3 5 1 。 1 2 2 来源于海洋真菌的抗肿瘤活性物质 许多海洋真菌可产生抗肿瘤活性物质，这些海洋真菌分离白海水或海洋沉积物，或者 来自其它海洋生物体。但相对于细菌、放线菌来说，从海洋真菌中分离得到的抗肿瘤活性 物质的数量较少，但结构新颖，目前主要是从青霉属曲霉属中的菌株代谢产物中分离得到 的。 4 扬州大学硕士学位论文 l 印t o s i n s 是一种新的多硫二氧代呱嗪类化合物，具有较强的细胞毒性，从与马尾 s a r g a s s u m t o r t i l e 共生的细球壳菌l e p t o s p h a e r i as p 中分离得到，在自然界中极为罕见【3 6 】。 9 a ，1 4 二羟基基6 p 对硝基苯甲酸肉桂酯具有很好的抗肿瘤活性，它是一种倍半萜硝基 苯酯化合物，从加勒比海绿藻p e n i c i l l u sc a p i t a t u s 体表分离的a s p e r g i l l u sv e s r i o c l o r 得到， 对n c i 的6 0 个人类肿瘤细胞群的i c 5 0 平均值为1 1 m g l ，且对5 种肾癌细胞( 7 8 6 0 a c h n 、 c a k - i 、t k - 1 0 、v o 3 1 ) 有选择性毒性【3 7 】。 c u r a c i n a 是一种具有潜力的抗有丝分裂药物，临床前试验表明它对人体肺植的小鼠有 很高的抑制率，从加勒比海真菌l y n g b r am a j u s c u l a 中分离得到【3 8 】。 王书锦等对从辽宁黄、渤海地区的海水、海泥及海洋体中分离的海洋真菌进行研究， 发现1 2 株能产生抗肿瘤活性先导化合物的菌株，其中一株海洋拟青霉菌 ( p a e c i l o m y c e s s i n e n s i s s p n o v ) 具有抗菌抗肿瘤活性，产业化前景较好3 9 1 。 t a n 等从海洋真菌e x s e r o h i l u mr o s t r a t u m 培养物中分离到4 种新型的细胞毒素二硫化物 r o s t r a t i n a d ，其化学结构是环二肽，它们在体外对人结肠癌细胞的i c 5 0 值分别为8 5 、1 9 、 0 7 6 和1 6 5 “g m l 【柏1 。 c u e t om 等【4 1 】在2 0 0 6 年从海洋真菌a s p e r g i l l u ss p 中分离得到t r o p o l a c t o n e sa d ，其中， t r o p o l a c t o n e s a c 对肿瘤细胞株h c t - 1 1 6 的i c 5 0 分别为1 3 2 ，1 0 9 和1 3 9p 酌 i d 。 1 2 3 来源于海洋细菌的抗肿瘤活性物质 b u r k h o l d e r 自1 9 6 6 年从海洋假单胞菌中分离到具有抗癌作用的硝吡咯菌素p y r o l n i r t i n ， 自此，从海洋微生物代谢产物中寻找新型抗肿瘤药物就成为药物研究开发的热点【4 2 1 。 b i s u c a b e r i n 是一种新型结构的s i d e r o p h o r e 类代谢物，是由交替单胞菌a h e r o m o n a s h a l o p l a n k t i s 中得到的，样品采自日本海北部约3 3 0 0 m 深的海泥，它对纤维肉瘤细胞、巨噬 细胞等显示出溶解细胞的活性 4 3 】。 噻唑生物碱化合物a g r o h e e l n i a ( 3 ) 是c a n e d o 对海洋土壤杆菌属细菌的抗肿瘤代谢物中 分离得到，可与z n 2 + 形成络合物，对小鼠白血病p 3 8 8 细胞、人肿瘤细胞a 5 4 9 、h t 2 9 、 m e l 2 8 有显著细胞毒活性( o 0 5 - 0 2m g l ) ，但其乙酰化衍生物( 4 ) 的细胞毒性却大大减少 ( 3 7m g l ) 【4 4 1 。 m a c o r l a c t i n s 是一种新的大环内脂化合物，从深海细菌分离得到，它既有抗菌活性又能 抑制黑色素癌细胞，还可以保护t 淋巴母细胞，防止人类免疫缺陷病毒( h ) 的复制等【4 5 1 。 h a l o b a c l l i n 是一种i t u r i n 族酰基化多肽，是由f e n i e a l 研究组从海洋芽饱杆菌中首次分 离得到的，其对人结肠癌细胞有中等细胞毒性( i c 5 0 = o 9 8m g l ) t 4 6 1 。 王雪玲海洋微生物抗肿瘤活性菌株的筛选及其活性物质的研究 m a r i n a c t a n 是一种由果糖、甘露糖和葡萄糖按7 ：2 ：1 组成的胞外杂多糖，是从海藻表 面分离得到的黄杆菌发酵时产生的，它对各种肿瘤细胞的抑制率高达7 5 9 5 【4 7 1 。 h o m o c e r e u l i d e ( 6 ) 和c e r e u l i d e ( 7 ) 是从从潮间带蜗牛体表分离的b 陀淞可产生两个具 有极强细胞毒性的脂溶性环肽，对p 3 9 9 和结肠2 6 细胞的i c 5 0 为l 3 5p g m l t 4 8 1 。 p m 9 4 1 2 8 ( 8 ) 是从海洋污泥中的芽抱杆菌( p h m p h i ) 0 9 0 ) 发酵液中分离到的，是一种新 i s o c o u m m i n 化合物【删。它能抑制d n a 及蛋白质合成( 对d n a 的i c 5 0 = 2 5l m m l l ，对蛋白 质的i c 5 0 = o 1i | m o v l ) ，对多种肿瘤细胞均有明显的细胞毒性，其中对p 3 8 8 、a 5 4 9 、h t 2 9 、 m e l 2 8 的i c 5 0 均为o 0 5p m o l l 。 b 1 是一种磷酸盐多糖，由m a s a h i r om 等于2 0 0 3 年从海洋细菌p s e u d o m o n a ss p 中分 离得到，对多种人类肿瘤细胞株均具有抑制作用，能诱导u 9 3 7 发生细胞凋亡，i c 5 0 = 6 3 2 p g 柚【4 9 1 。 2 0 0 6 年，t l u k es i m m o n s 从海洋藻青菌s y m p l o c as p 和中分离到抗肿瘤化合物 b e l a m i d e a 。b e l a m i d e a 是s y m p l o c as p 的主要代谢物，为高度甲基化的四肽，对h c t - 1 1 6 具有细胞毒活性，i c 5 0 = 0 7 4 t m a 。h a r tb 从l y n g b y am a j u s c u l a 中分离到化合物a u r i l i d c sb ， 它对人类肺癌细胞株n c i h 4 6 0 和鼠成神经原瘤细胞株n e u r o 2 a 的i c 5 0 均在0 0 1 o 1 3p m 之 间，对n c l 6 0 有极强的细胞毒性，i c 5 0 = 1 0n l n ，对白血病、肾和前列腺癌细胞等也具有较 强的抑制作用【5 0 1 。 1 3 天然抗肿瘤活性物质的研究方法 1 3 1 抗肿瘤活性物质的筛选方法 1 3 1 1 细胞水平筛选抗肿瘤药物 细胞水平的药物筛选模型具有以下几个主要的优点：材料用量少、药物作用机制比较 明确、易于实现大规模筛选等。目前，这类筛选方法应用的大致过程是：首先挑选几种肿 瘤细胞株，然后以培养细胞为实验模型，用m t t 法、s b r 法或者结晶紫染色测定法等测 定天然药物及其提取物的抗肿瘤活性，从而达到筛选的目的。 1 3 1 2 端粒酶活性为作用靶点的筛选方法 端粒是由富含g 的d n a 重复序列和端粒蛋白组成，是真核细胞染色体末端的一种特 殊结构，具有保护染色体完整性和维持细胞复制能力的作用【5 1 1 。端粒酶是一种特殊的逆转 录酶，它由r n a 和蛋白质组成的，其功能是合成端粒d n a ，使得端粒出现多个重复序列 从而不断延长【5 2 】。1 9 9 4 年k i m 等在研究中发现，在正常组织中，端粒酶没有活性表达或 活性很低，而在肿瘤细胞中端粒酶活性表达呈阳性。此后亦有实验证明端粒酶活性的表达 6 扬州大学硕士学位论文 与恶性肿瘤密切相关，因此端粒酶活性为作用靶点的筛选方法成为抗肿瘤活性筛选的重要 方法【5 3 。 1 3 1 3 以d n a 拓扑异构酶为靶点筛选天然抗肿瘤药物 d n a 拓扑异构酶( d n at o p o i s o m e r a s e s ) 广泛分布于细胞核内，是原核细胞和真核细胞 中的基本酶，它通过对d n a 链的切割、转移和再连接来实现改变d n a 的拓扑结构的目的 瞰】。在细胞代谢过程如d n a 复制、基因转录、d n a 重组和有丝分裂等中，d n a 拓扑异 构酶起着极其重要的作用。喜树碱( c a m p t o t h e c i n ) 是一种高效的抗癌药物，它及其衍生物的 作用靶点即是真核生物d n a 拓扑异构酶i ，而另外抗肿瘤药物如吖啶类化合物、鬼臼毒 素类化合物、异黄酮类化合物、多柔比星( d o x o m b i c i n ) 等则作用于真核生物d n a 拓扑异构 酶i i 。这些药物可以通过d n a 拓扑异构酶i 、引起d n a 双螺旋结构的断裂从而导致肿 瘤细胞的死亡【5 5 1 。 1 3 1 4 作用微管蛋白的天然抗肿瘤药物的筛选方法 微管( m i c r o t u b u l e ) 是由q1 3 微管蛋白异二聚体聚合而成的管状聚合物，是真核细胞骨 架的重要组成部分。微管参与许多细胞功能，包括维持细胞形态、细胞内运输、鞭毛和纤 毛的运动、染色体运动和细胞分裂等【5 6 1 。这类抗肿瘤药物通过抑制微管蛋白聚合，影响肿 瘤细胞的有丝分裂过程，使其生长受到抑制，从而达到治疗癌症的效果。因此，微管已成 为肿瘤的临床治疗的有效靶点。 1 3 1 5 应用调节细胞信号传导通路筛选方法 传统抗肿瘤药物多为细胞毒药物，近年来，一些研究者将目光转移到针对肿瘤细胞内 信号传导通路的新型抗肿瘤药物上。多种细胞内信号传导通路的关键组分间，正常细胞和 肿瘤细胞存在着巨大差异，因此靶向这些组分的抗肿