（果树学专业论文）苹果茎沟病毒传播途径研究.pdf

独创性声明 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究 成果。据我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经 发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得逦曼量壅些太堂或其他教育机构的学位 或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中 作了明确的说明并表示谢意。 学位论文作者签名：。费魄风 签字日期：2 0 1 1 年月占日 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解洹j 匕壅些太堂有关保留、使用学位论文的规定，有 权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅。 本人授权泣j 匕壅些太堂可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行 检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。 ( 保密的学位论文在解密后适用本授权书) 学位论文作者签名：聋i 魄风 导师签名： 诅 签字日期：知f 7 年z 月亏日 签字日期：丑j 7 年g 月占日 学位论文作者毕业后去向： 工作单位： 通讯地址： 电话： 邮编： 摘要 苹果病毒具有危害性强、传播扩散快和难以治愈等特点。目前苹果病毒的危害在 我国节果生产上呈现上升势头，苹果茎沟病毒是潜隐性病毒中危害重、脱除难的重要 病毒之一，研究该病毒传播途径，尤其是明确种子传毒的几率迫在眉睫。本试验以携 带苹果茎沟病毒红富士苹果树产的果实及种子为材料，研究了苹果不同部位成熟组织 r n a 的提取，并以r t - p c r 为检测手段研究了此种病毒在果实及种子内部的分布； 以携带该病毒的八棱海棠种子为材料，利用r t - p c r 为检测手段研究了苹果茎沟病毒 的种子传毒率；以脱毒的王林苹果继代组培苗为材料，采用r t - p c r 技术为检测手段 研究了该病毒是否能通过汁液传播o 主要结果如下： 1 同一提取液提取苹果不同部位总r n a 时，植物材料最佳用量不同；不同提取 液提取苹果同一部位总r n a 时，植物材料最佳用量也不相同。r n a i s op l u s 和 r n a i s o m a t ef o rp l a n tt i s s u e 搭配使用时，植物材料的最佳用量为：种皮0 0 2 5 9 ，胚 0 0 5 9 。使用r n a p l a n t 植物总r n a 提取试剂时，植物材料最佳用量为：果皮0 0 7 5 9 ， 果肉0 2 5 9 ，种皮0 0 15 9 ，胚0 0 2 5 9 。 2 苹果茎沟病毒侵染的苹果树生产的果实，其果皮、果肉均携带病毒。 3 苹果茎沟病毒通过侵染种皮表面组织致使种子带毒，但是种胚不带毒。氢氧化 钠或磷酸三钠可以有效灭活种皮表面携带的苹果茎沟病毒，磷酸三钠表面处理后，种 子的发芽率显著高于氢氧化钠处理后种子的发芽率。 4 苹果茎沟病毒在八棱海棠上可以通过种子传播，携带有该病毒的母树生产的种 子实生苗带毒率为5 8 9 。 5 在组织培养条件下，a s g v 可以通过汁液进行传播，通过汁液传播的几率为 2 0 8 。 关键词：苹果茎沟病毒传播途径种子传毒 r t - p c r s t u d y o nt h ev e r t i c a lt r a n s m i s s i o nr o u t eo f a p p l es t e mg r o o v i n gv i r u s a u t h o r ：c a ox i a o - f e n g m a j o r ：p o m o l o g y s u p e r v i s o r ：s u nj i a n - - s h es h a oj i a n - z h u a b s t r a c t a p p l e v i r u sw a sc h a r a c t e r i z e db yi t ss t r o n gh a r m ，f a s ts p r e a d i n g ，h a r dt oc u r ea n ds o o n t h ei m p a c t so fa p p l ev i r e so nc h i n aa p p l ep r o d u c t i o ni si n c r e a s i n ga tp r e s e n t t h e a p p l es t e mg r o o v i n gv i r u s ，w h i c hh a ss t r o n gh a r m t oa p p l ep r o d u c t i o na n di sd i f f i c u l tt o r e m o v e ，i so n eo ft h ei m p o r t a n ta p p l el a t e n tr e c e s s i v ev i r u s t h e r e f o r e ，t h er e s e a r c ho nt h i s v i r u ss p r e a d i n gw a y si sv e r yi m p o r t a n t w h e t h e rt h ev i r u si st r a n s m i t t e dt h r o u g hs e e d s ，a n d e s p e c i a l l yc l e a t i n gt h ep r o b a b i l i t yi si m m i n e n t t h er n a e x t r a c t i o no fm a t u r et i s s u ef r o m a p p l es k i n ，f r u i tf l e s h ，s e e dc o a ta n de m b r y o s ，a n dt h ed i s t r i b u t i o no fa p p l es t e mg r o o v i n g v i r u si n f r u i ta n ds e e d sb ym e a n so fr t - p c rt e c h n i q u ew e r es t u d i e dw i t hf r u i ta n ds e e d s f r o mv i r u s - c a r r i e dr e df u j ia p p l et r e e s m e a n w h i l e ，t h ev i r u ss e e d - s p r e a d i n gr a t ew a s s t u d i e dw i t hs e e d so fm a l u sm i c r o m a l u sm a k i n o ( m a l u ss p e c t a b l i sv a r m i c r o m a l u s k o i d z ) c a r r i e da p p l es t e mg r o o v i n gv i r u s a n dt h ev i r u ss a p s p r e a d i n gp o s s i b i l i t yb y m e a n so fr t - p c rw a sa l s os t u d i e dw i t hv i r u s - - f r e ea n dv i r u s - - c a r r i e do r i na p p l es e e d l i n g s c u l t u r e di nv i t r or e s p e c t i v e l y t h em a i nr e s u l t sw e r ea sf o l l o w s ： 1 o nt h eo n eh a n d ，t h eo p t i m u ma m o u n to fm a t u r ep l a n tt i t u s s ew a sd i f f e r e n tw h e n t h et o t a lr n ao fd i f f e r e n to r g a n sw e r ee x t r a c t e dw i t ht h es a m er n ae x t r a c t i o nr e a g e n t o n t h eo t h e rh a n d ，t h eo p t i m u ma m o u n tw a sa l s od i f f e r e n tw h e nt h et o t a lr n ao ft h es a m e a p p l ep a r tw a se x t r a c t e dw i t hd i f f e r e n tr n a e x t r a c t i o nr e a g e n t t h er e s u l t ss h o w e dt h a tt h e o p t i m u ma m o u n to fm a t u r ep l a n tt i t u s s ew e r e ：0 0 2 5 9s e e dc o a t ，0 0 5 9e m b r y o sw i t h r n a i s op l u sa n dr n a i s o m a t ef o rp l a n tt i s s u em i x e dr n ae x t r a c t i o nr e a g e n t h o w e v e r , t h eo p t i m u ma m o u n tw e r e ：0 0 7 5 9a p p l es k i n ，0 2 5 9f l e s h ，o 015 9s e e dc o a t ，0 0 2 5 9 e m b r y o sw i t ht h et o t a lr n ap l a n te x t r a c t i o nr e a g e n t 2 b o t ht h ea p p l es k i na n df r u i tf l e s hc a r r i e da p p l es t e mg r o o v i n gv i r u sw h e nt h ea p p l e t r e e sw e r ei n f e c t e d 3 s e e d sc o u l da l s oc a r r yt h i sv i r u s ，b e c a u s ei ti n f e c t e dt h es u r f a c et e x t u r eo fs e e dc o a t b u tt h ee m b r y o sw e r ef r e e t h i sv i r u sc a r r i e db yt h es u r f a c et e x t u r eo fs e e dc o a tc o u l db e k i l l e db yn a o ho rn a 3 p 0 4 12 h 2 0 n eg e r m i n a t i o nr a t eo fs e e d ss o a k e dw i t hn a 3 p 0 4 12 h 2 0w a ss i g n i f i c a n t l yh i g h e rt h a ns e e d ss o a k e dw i t hn a o h 4 t h ea p p l es t e mg r o o v i n gv i r u sc o u l db et r a n s m i t t e dt h r o u g hs e e d so fm a l u s m i c r o m a l u sm a k i n o ( m a l u ss p e c t a b l i sv a t m i c r o m a l u sk o i d z ) t h er a t eo fv i r u s c a r r i e d s e e d l i n g st h a tf r o ms e e d so fv i r u s c a r r i e dm o t h e rt r e e sw a s5 8 9 5 t h i sv i r u sc o u l db et r a n s m i t t e dt h r o u g hs a pw h e np l a n t sw e r ec u l t u r e di nv i t r o ，a n d t h er a t e w a s 2 0 8 k e y w o r d s ：a p p l es t e mg r o o v i n gv i r u s ；s p r e a d i n gw a y s ；v i r u ss e e d - s p r e a d i n g ；r t - p c r 目录 l 弓i 言1 1 1 苹果病毒概述。l 1 2 苹果病毒分布。l 1 2 1 我国苹果潜隐性病毒的分布情况1 1 2 2 河北省苹果潜隐性病毒的分布情况2 1 3 苹果病毒的传播途径2 1 4 病毒对果树的危害一2 1 4 1 对树体生长的影响：。3 1 4 2 对产量的影响3 1 4 3 对果实品质的影响3 1 4 4 对树体生理代谢的影响_ 4 1 4 5 病毒危害果树生长的机理。4 1 5 苹果病毒病的危害特点。4 1 6 苹果病毒检测技术简介5 1 6 1 生物学检测法5 1 6 2 电子显微镜技术5 1 6 3 血清学方法5 1 6 4 分子杂交技术6 1 6 5 双链r n a ( d s r n a d o u b l e - s t r a n d e dr n a ) 分析法6 1 6 6 聚合酶链式反应( p c r - p o l y m e r a s ec h a i nr e a c t i o n ) 一6 1 7 国内外无毒化苗木生产研究现状7 1 8 本研究的目的意义7 2 材料与方法9 2 1 试剂与主要仪器9 2 1 1 试剂9 2 1 2 主要仪器9 2 2 总r n a 的提取9 2 2 1 几种提取液对苹果成熟叶片k n a 提取质量的影响。9 2 2 2 苹果果实不同部位r n a 的提取。1 0 2 2 3 琼脂糖凝胶电泳法检测r j q a 净度和完整性。ll 2 2 4 分光光度计法检测r n a 纯度ll 2 2 5r n a 浓度检测l l 2 2 6r t p c r 检验苹果茎沟病毒1 2 2 3 果实、种子各个部位带毒情况检测1 3 2 3 1 材料l3 2 3 2 种皮种胚样品带毒情况检测1 3 2 3 3 果实各部位带毒情况检测13 2 3 4 苹果茎沟病毒在种子中的定位1 3 2 3 5 层积对种子带毒率的影响13 2 3 6 药剂处理后种子的出芽率1 4 2 4 种子传毒鉴定1 4 2 4 1 材料14 2 4 2 方法1 4 2 5 病毒携带植株汁液传播病毒试验1 4 2 5 1 材料1 4 2 5 2 方法：15 3 结果与分析1 6 3 1 几种提取液对苹果成熟叶片r n a 提取质量的影响16 3 1 1 不同方法提取总r n a 的纯度l6 3 1 2r n a 完整性检测l6 3 1 3r t p c r 检测结果1 7 3 2 果实不同部位r n a 的提取1 7 3 2 1 果皮r n a 的提取17 3 2 2 果肉r n a 的提取18 3 2 3 种皮r n a 的提取19 3 2 4 种胚r n a 的提取2 0 3 3 种皮种胚带毒情况检测2l 3 4 果实种子各部位带毒情况检测2 2 3 5 苹果茎沟病毒在种皮中的定位2 2 3 6 层积对种子带毒率的影响2 4 3 7 药剂处理后种子的出芽率2 5 3 8 种子传毒鉴定2 6 3 8 1 携带有a s g v 的八棱海棠单株生产的种子繁苗带毒率检测2 6 3 8 2 常规繁苗带毒率检测2 7 3 9 汁液传播2 7 4 讨论2 9 4 1 关- j - r n a 提取2 9 4 2 关于a s g v 在种子中的分布部位和种子传毒率2 9 4 2 1 种子传毒与病毒在种子上分布部位的关系2 9 4 2 2 关于种子传毒率3 0 4 3 关于汁液传播3 0 5 结论3 2 参考文献。3 3 在读期间发表论文3 8 作者简历3 9 致谢4 0 缩写 b p c d n a d d h 2 0 d e p c 烈t p e b p c r a m v 英文名称 b a s ep a i r s 缩略词表 c o m p l i m e n t a r yd n a 中文名称 碱基对 互补d n a c e t y l t r i m e t h yl a m m o n i u mb r o m i d e 十六烷基三甲基澳化铵 d o u b l ed i s t i l l e dw a t e r d i e t h y p y r o c a r b o n a t e 双蒸水 焦碳酸二乙酯 d e o x y n u c l e o t i d et r i p h o s p h a t e s脱氧核苷三磷酸 e t h i d i u mb r o m i d e 嗅化乙锭 p o l y m e r a s ec h a i nr e a c t i o n 聚合酶链式反应 p r i m e s c r i p te e v e r s et r a n s c r i p t a s e 反转录酶 u p s t r e a mp r i m e r 上游引物 p hd o w n s t r e a mp r i m e r s 下游引物 r n a s e r t p c r r p m t b e t r i s a c l s v a s g v a s p v r n a e n z y m e 核糖核酸酶 r e v e r s et r a n s c r i p t i o n - p c r 逆转录p c r r o t a t i o n a ls p e e dp e rm i n u t e 每分钟转速 t f i s - b o r a t e - e d t a t b e 缓冲液 t r i s ( h y d r o x y m e t h y l ) a m i n o m e t h a n三( 羟甲基) 氨基甲烷 a p p l e c h l o r o t i cl e a fs p o tv i r u s 苹果褪绿叶斑病毒 a p p l e s t e mg r o o v i n gv i r u s 苹果茎沟病毒 a p p l es t e mp i t t i n gv i r u s 苹果茎痘病 苹果摹沟病毒传播途径研究 1 引言 苹果是我国的主要果树之一，其栽培面积和总产量均居世界第一，但却单产低、品质差，病 毒病的危害是造成这一现象的重要原因之一【l 】。苹果病害分为细菌病害、真菌病害和病毒病害三 种。与前两种病害相比，病毒病的发生有其自身特点：系统传染，一经感染，终身带毒，长期受害。 病毒病用常规防治方法难以根除，目前尚无有效的化学药剂和生物制剂进行防治。2 0 世纪4 0 年 代国外即开展了对苹果病毒病的研究，几个主要苹果生产国基本上实现了苹果的无毒化栽培。我 国对苹果病毒病的研究起步较晚，1 9 7 8 年从国外引进病毒指示植物后才开始对苹果病毒病进行系 统研究，目前已初步明确了我国苹果主要产区病毒病的种类、分布，并在病毒检测方面取得了一 定的进展，果树无毒化栽培成为现代果树产业发展的方向1 2 】。 1 1 苹果病毒概述 苹果病毒分为非潜隐病毒( n o n l a t e n tv i r u s ) 和满隐病毒( l a t e n tv i r u s ) 两大类。目前世界 上报道的苹果病毒病有3 9 种，其中1 f 渐隐性病毒有2 5 种，潜隐性病毒1 4 种。我国现已鉴定明 确的苹果病毒病有6 种，分别为： 苹果锈果类病毒( a s s v a p p l es c a rs k i dv i r o i d ) 、苹果花n l 病 毒( a p m v a p p l em o s a i cv i r u s ) 、苹果绿皱果病毒( a g r c v a p p l eg r e e nr u c kc r i n k l ev i r u s ) 、苹 果褪绿叫斑病毒( a c l s v a p p l ec h l o r o t i cl e a fs p o tv i r u s ) 、苹果誉沟病毒( a s g v a p p l es t e m g r o o v i n gv i r u s ) 和苹果茎痘病毒( a s p v - a p p l es t e mp i t t i n gv i r u s ) 。其中，前三种属非潜隐性病毒， 后三种为潜隐性病毒。另外还有两种可疑病毒( 苹果小果病和苹果扁枝病毒) 正在鉴定之中【i 3 4 j 。 非潜隐病毒侵染苹果后，大部分栽培品种都表现明显症状，病树易识别。这类病毒侵染后， 除少数引起减产外( 如花叶病) ，大多数病树丧失栽培价值。但由于病树较少，而且一般为零星发 生，且易识别，故及时清除病树便可解决病毒的再侵染问题，从整体上来说危害性较小。后三种 则属丁潜隐病毒，潜隐病毒在栽培品种上不表现明显症状，必须经过鉴定才能明确果树的带毒状 况，这些病毒也是推广苹果无毒化栽培过程中需重点检测和控制的对象。 1 2 苹果病毒分布 苹果潜隐性病毒发生普遍，国内目前的苹果主栽品种及砧木普遍带有病毒，带毒率一般为 6 0 8 0 。有些品种如金冠、红星等品种的带毒株率几乎达1 0 0 ，且多为复合侵染，复合侵染率 为6 0 - - - 1 0 0 。苹果花叶病和苹果锈果病在全国各苹果产区均有发生，苹果绿皱果病仅在河南、甘 肃、陕西、辽宁等地有报道【5 1 。 1 2 1 我国苹果潜隐性病毒的分布情况 苹果潜隐性病毒在我国各苹果产区普遍存在。据1 9 8 0 - - 1 9 8 6 年中国农科院果树所和西北农业 大学对渤海湾、黄河故道、西北高原3 大苹果产区的研究表明，国内目前的苹果主栽品种及矮化 砧木普遍带有病毒，而不同的产区病毒种类及带毒率不同。渤海湾产区苹果带毒率一般为 l 河北农业大学硕+ 学位( 毕业) 论文 6 0 1 0 0 ，其原有主栽品种( 金帅、国光) 上a c l s v 侵染率为5 7 9 - 1 0 0 ：a s g v 为3 3 8 6 6 ： a s p v 为5 2 6 - 1 0 0 。黄河故道产区3 种病毒的侵染率分别为9 0 1 0 0 ，4 0 1 0 0 及 9 0 0 0 1 0 0 。i h i 北地区苹果混合侵染率为2 0 8 0 。主栽品种( 红星、金冠、国光) 也普遍带有 潜隐性病毒，其中a c l s v 侵染率为6 6 7 v 1 0 0 ，a s p v 为5 0 , - - 1 0 0 ，a s g v 为3 3 3 一1 0 0 ， 复合侵染率为6 0 一1 0 0 。我国从国外引入的m 系及m m 系砧术普遍潜带褪绿叶斑病毒、茎痘 病毒和茎沟槽病毒 6 - 2 1 】。因此，我国现栽培的品种，虽外观看去生长正常，但普遍潜带病毒，有 些品种如金冠、红星等品种的带毒株率几乎达到1 0 0 。 1 2 2 河北省苹果潜隐性病毒的分布情况 据河北农业人学2 0 1 0 年对河北省7 个市，1 2 个县，2 9 个采样果园的调奄结果表明，河北 省生产果园均不同程度地受到苹果潜隐性病毒的侵染。由此可见，河北省的各个苹果产区果园受 满隐性病毒侵染十分普遍，且非常严重，果尉带病毒率为1 0 0 。 三种苹果潜隐性病毒在不同果园、不同品种中的整体发生率分别为：9 1 6 3 、8 8 4 8 、8 1 4 5 ： 总体混合侵染率为6 8 0 4 。三种苹果潜隐性病毒( a s g v 、a s p v 、a c l s v ) 在不同品种间的侵 染情况也有一定的差异性。常见品种中，富+ 、红星、金冠、王林的病毒侵染率要普遍高于国光、 嘎拉、乔纳金二个品种。其中，金冠和富士的病毒侵染率相对较高，三种苹果滞隐性病毒的侵染 率均高t - 9 0 ；国光的病毒侵染率相对较低，三种苹果潜隐性病毒的侵染率在7 0 8 5 之间。在 地区分布上，张家口地区的苹果满隐性病毒侵染率普遍高于其他地区，三种病毒的侵染率均在 9 0 以上，个别果圃或区域高达1 0 0 ，病毒混合侵染率为8 4 9 6 t 2 j 。 1 3 苹果病毒的传播途径 潜隐性病毒的传播途径有：嫁接传播，沾染汁液传播，丁具传播，根系交接传播【i3 1 。其中 苹果褪绿叶斑病毒( a c l s v a p p l ec h l o r o t i cl e a fs p o tv i r u s ) 希l 苹果茎痘病毒( a s p v - a p p l es t e m p i t t i n gv i r u s ) 不通过种子传播，苹果茎沟病毒( a s g v a p p l es t e mg r o o v i n gv i r u s ) 可经种子传播 给昆诺藜及百合【l 引。非满隐性病毒中，锈果病通过嫁接传播，搭贴传播，昆虫传播，带病植物传 播，而病株汁液、花粉和种子不能传病，嫁接后，潜育期为3 2 7 个月。结果树发病时，先是个别 枝条表现症状，经过2 3 年才扩展剑全树【i 卯。苹果花叶病毒主要要通过嫁接传染。用汁液磨擦接 种法，可以传到黄瓜、长春花、- 豇豆、蓝猪草和日本木瓜等多种草_ 术植物上。接穗或砧木带病毒， 是病毒主要侵染来源。种子一般不传染 2 6 1 。 1 4 病毒对果树的危害 苹果潜隐性病毒在世界各地广泛分布，在我国各苹果产区普遍存在，几乎所有的苹果产区都 有其危害。 2 苹果茎沟病毒传播途径研究 1 4 1 对树体生长的影响 病毒对果树树体生长的影响十分明显，苹果感染病毒后，可使叶片变小、畸形、失绿，营养 生长受阻，树体衰弱，一般使树体生长量减少1 6 - - 3 6 ，产量降低1 6 9 - - 4 5 0 ，总生长量减 少1 6 - - 4 0 ，需氮量增加2 0 - - 4 0 ，氮肥需用量增多。如果树体生长状况不良或利用了对病毒 较敏感的砧木和品种时，就会使植株衰弱死亡，造成果园残缺不全，甚至全园毁灭f i7 1 。美国的密 执安州，1 8 9 0 年该州的桃树由于感染桃树黄化病毒而导致桃树死亡率达9 3 。以后，美国的加州 发现梨衰退病毒，致使在1 9 5 9 年到1 9 6 2 年的3 年里毁掉了1 0 0 万株梨树 1 7 a s 。英国尔茂林试验 站( 1 9 7 9 ) 对6 年生金冠、桔苹等四个品种的带毒和无病毒树进行调查，无病毒树的千周生k 量 比同晶种带毒对照树多2 1 8 ，3 年生无病毒乔纳金树比有毒树的树高多1 1 5 ，干径多3 2 5 ， 树冠直径大8 2 。辽宁果树所连续八年调查了无病毒富士、金矮生及甜黄魁，各品种相应比对照 树高3 7 、一1 0 0 ，干径多5 9 - - 1 1 9 ，每株树的新枝数多1 4 7 , - - 3 0 0 1 1 9 1 。 1 4 2 对产量的影响 病毒严重的影响果实的产量，苹果感染病毒后产量可降低1 7 q 5 甚至更多。研究表明， 无病毒果树不仅产量增加，而且优质果率一般增加3 0 , 6 0 1 2 2 1 。2 年生、3 年生和4 年生甯 士无病毒树平均株产分别为0 5 k g 、2 1 k g 和3 5 k g ：而同龄同品种对照分别为0 1 k g 、1 0 k g 和1 6 k g 。 英国尔茂林站( 1 9 7 9 ) 对6 年生金冠、桔苹等4 个苹果品种带病毒与无病毒果树的调究发现，带 病毒果树的产量比无病毒果树的产量低2 8 9 一2 8 0 o ，6 0 c m 以上果所f 与的比例2 9 4 p 5 3 1 9 。 据辽宁果树所调夯，3 年生无病毒乔化国光的结果株率达6 4 0 ，而对照则为0 1 1 9 j 。而加拿大大 不列颠哥伦比省发现了樱桃小果病毒，致使该省甜樱桃总产量下降9 0 1 2 0 1 。 1 4 3 对果实品质的影响 病毒侵染严重影响到苹果品质，感染病毒后会引起果实畸形变小、着色不良、风味淡、不耐 贮藏，商品果率下降1 6 9 - 6 0 。无病毒果树在果个大小，可溶性固形物含量及果实着色方面， 均显著高于带毒果树。无病毒乔纳金果实的可溶i 古i 形物含量为1 6 4 ，对照则为1 5 2 ；着色度 l 级的为5 0 0 ，而对照为2 8 2 l l 酬。根据英国、新西兰和荷兰的试验，无病毒树的果实个头大， 果锈少，光沽度提高1 3 尸2 6 。辽宁果树所连续8 年对无病毒和带毒富士、金矮生果实进行比 较，发现无病毒树果实的总含糖量高达0 4 1 8 5 - - 0 8 4 6 8 ，总酸高达0 0 5 3 6 , - - 0 0 7 3 9 ，维生素 c 高达1 2 7 1 2 8 m g 1 0 0 9 ，从而使风味更加浓郁【1 7 j 。近期，m c i e g l i f i s k a 、t c p r u t k o w s k i 研究了 a c l s v 对苹果产量和质量的影响，结果表明：以m 9 为砧木嫁接的所有品种的无病毒树的平均产 量均高于相应的感毒植株，并且其单果重相应增加，无毒植株生产的果实着色率要优于感毒植株 的果实，无病毒金冠的果实锈斑发生率明显低于感毒植株的果实 2 3 , 2 4 】。另外，果实的品质还取决 于品种、生长季节、树体的健康状况等因素。 3 河北农业大学硕十学位( 毕业) 论文 1 4 4 对树体生理代谢的影响 有研究表明：脱毒苹果树比朱脱毒苹果树，叶片厚度增加4 6 4 - - - 1 6 3 8 ，比叶鲜重增加 3 9 8 1 3 6 8 ，叶绿素含量提高4 5 8 一2 3 1 7 ，光合速率增高，蒸腾速率加快。同时光合酶活 性发生很人变化。脱毒苹果树叶片内源激素( g a 3 、c t k 、i a a ) 的含量也明显升高，如富士苹果病 毒侵染树g a 3 、c t k 、i a a 的含量分别比无病毒树低4 7 2 、1 6 9 、1 1 4 。叶片中蛋白质、氨 基酸与核酸( r n a 、d n a ) 也存在明显差别，在成叶中蛋白质含量降低2 2 7 2 0 0 - - 2 6 2 8 ，氨基酸含 量下降3 9 2 一8 ，在幼叶中，蛋白质含量升高1 9 7 8 一3 9 5 5 ，氨基酸含量降低8 1 7 p 1 1 3 5 。 r n a 增加2 6 6 4 。3 7 6 3 ，d n a 降低l6 18 之0 3 3 ，由丁病毒抑制蛋白质的合成过程，脱毒 苹果树生长迅速和建造许多新器官，需要较多的蛋向质和氨基酸，故在脱毒苹果树成熟州片中氨 基酸与蛋白质含量均低于未脱毒树。但在幼叶中，病毒抑制蛋白质的合成过程，使氨基酸人量积 累，冈此，氨基酸含量未脱毒树比脱毒树高1 2 鼻2 6 1 。另外，脱毒苹果树n l 片中的n 、p 、k 等矿质 元素也显著高于未脱毒苹果树【z 丌。 1 4 5 病毒危害果树生长的机理 当病毒侵染果树树体后，都在树体的活细胞中迅速传播、增殖。既需要消耗人量的能量，又 需要从果树体细胞中获取人量的核糖体、核酸及蛋白质构建病毒的新个体，必然会影响剑树体细 胞的正常代谢和生长发育。 同时，有的病毒在代谢中能产生人量的醛类、醌类或其他大分子的有毒物质，促进了树体活 细胞的衰老和死亡【2 引。还有的病毒代谢产物能激活某些氧化酶，破坏活细胞中叶绿体的形成。造 成叶片沿叶脉失绿或形成许多褪绿叶斑。另外，有的病毒产物能促进某些输导组织细胞迅速增生， 而长成一些瘤状突起。这些都能破坏果树的正常代谢，抑制树体的正常生长，降低果实的产量、 质量，同时还能增加树体对肥料的消耗1 2 只2 7 j 。 此外，病毒还影响苗术质量，引起砧穗不亲和、苗木根系发育不良，病毒对苹果根系对土 壤营养物质的吸收和利用也产生不良影响。 1 5 苹果病毒病的危害特点 苹果病毒病害感染的特性与真菌、细菌引起的病害完全不同，其区别在于： ( 1 ) 通过田间喷药无法防治； ( 2 ) 为系统性传染，一旦感染病毒，就会终身带毒，长期受害，破坏树体的正常生理功能， 不能恢复； ( 3 ) 用带病毒树的任何部位作为繁殖材料，其后代均带病毒； ( 4 ) 病毒自身不会传播。苹果病毒病主要通过嫁接传染，目前还未发现任何传播介质【5 】。 4 苹果茎沟病毒传播途径研究 1 6 苹果病毒检测技术简介 1 6 1 生物学检测法 生物学检测法又称指示植物检测法，是借助于对某些病毒敏感的植物而进行的病毒鉴定方 法。指示植物是指对某一种或某几种病毒及类病毒具有的敏感反应，一旦被感染能很快表现出明 显症状的植物【2 9 1 。常用的接种方法包括汁液摩擦接种3 0 和嫁接传染洲。生物学法优点是结果准确 可靠、直观简单、不需要仪器、灵敏度较高，但所需时间较氏，占用土地较多，费用较高，检测 速度慢。 王国平等报道鉴定和检测苹果褪绿叫斑病毒、苹果茎痘病毒和苹果茎沟病毒，可分别采用苏 俄苹果( r 1 2 7 4 0 - 7 a ) 、光辉( r 6 5 7 6r a d i a n t ) 汞l 弗吉尼亚小苹果( v i r g i n i a ) ，利用这三种木本指示植 物，其检出频率分别为9 5 ， 1 0 0 ，9 5 p2 。王焕玉等利用温室进行苹果潜隐性病毒的检测， 把苹果潜隐性病毒的鉴定由大田改在1 6 2 7 的温室内进行，使检测时间由原人田鉴定的l 3 年 缩短到了2 5 周1 3 3 1 。 1 6 2 电子显微镜技术 电子显微镜广泛应用于植物病毒的检测和研究，它能直接观察到病毒粒子的形态特征，其优 点就是快速直观、灵敏度很高【3 4 , ”】。但电镜观察需要一定的病毒形态结构的基础知识和操作技能 及一定的设备，初学者往往易受剑破碎的细胞器的干扰而影响其精确度；电镜检测：l ：作餐也相对 集中，不适合多个样本处理；同时电镜成本高，难以在实际生产中普及。但此法与血清学方法结 合使用【1 4 , 2 3 1 ，能直接看到抗原、抗体之间特异性反应和免疫复合物的形态学特征，具有分辨率高， 特异性强的优点，在检测小样本时比较实用。由于果树病毒浓度低，分布不均匀，加之电镜检测 法所需设备昂贵，因此电镜在果树病毒检测中应用较少。 1 6 3 血清学方法 目前应用最广泛的血清学检测方法是酶联免疫吸附测定法( e l i s a e n z y m el i n k e d i m m u n o s o r b e n ta s s a y ) 。酶联免疫吸附测定法( e l i s a ) 是在不影响酶活性和免疫球蛋白分子的反应 条件下，使酶分子和免疫球蛋白分子共价结合成酶标记抗体。酶标记抗体可直接或通过免疫桥与 包被在同相支持物上待测定的抗原或抗体特异性结合，米特异的定性、定量的检测病毒的存在 3 6 1 ，这一技术现已成为植物病毒病诊断的标准方法。目前，e l i s a 可以检测多种苹果病毒3 7 , 3 8 1 ， 我国已制得了褪绿叶斑病毒、茎沟病毒抗血清，可利用e l i s a 快速检测这2 种病毒。 另外，常用的血清学检测方法还有：斑点免疫测定法( d o ti m m u n o b i n d i n ga s s a y ，d i b a ) 、快速 免疫滤纸测定法( r a p i di m m u n o f i l t e r p a p e ra s s a y , r i p a ) 等。 血清学方法检测病毒的基础是利用病毒外壳蛋白的抗原性，但是类病毒缺乏外壳蛋白，如苹 果锈果病毒，而且目前多数果树病毒未能制备出特异抗血清，因此血清学检测方法在应用范围上 有很大的局限删。 5 河北农业人学硕+ 学位( 毕业) 论文 1 6 4 分子杂交技术 核酸分子杂交技术( t e c h n i q u eo f n u c l e i ca c i dh y b r i d i z a t i o n ) 是苹果病毒检测常用的基本技术 方法之一m , 4 1 1 。该方法灵敏度高、特异性强、检测病毒范嗣广、可批量检测，但需要制备探针， 这就需要较高的试验技术和试验条件，且操作繁琐。核酸探针的来源有四种：克隆的基因组d n a 、 e d n a 、r n a 和寡核昔酸探针。常用的杂交方法有点杂交，s o u t h e r n ( s o u t h e r nb l o th