（食品科学专业论文）牛初乳IgG纯化及其抗体酶活力的研究.pdf

华南理工大学 学位论文原创性声明 b t l l l l l liiu l i i l l l i l ui iii i 1 l l l ti l l l y 1815 0 7 5 本人郑重声明：所呈交的论文是本人在导师的指导下独立进行研究所 取得的研究成果。除了文中特别加以标注引用的内容外，本论文不包含任 何其他个人或集体已经发表或撰写的成果作品。对本文的研究做出重要贡 献的个人和集体，均已在文中以明确方式标明。本人完全意识到本声明的 法律后果由本人承担。 作者签名： 新傩 日期：2 形年乡月仁日 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定，即： 研究生在校攻读学位期间论文工作的知识产权单位属华南理工大学。学校 有权保存并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许学位 论文被查阅( 除在保密期内的保密论文外) ；学校可以公布学位论文的全部 或部分内容，可以允许采用影印、缩印或其它复制手段保存、汇编学位论 文。本人电子文档的内容和纸质论文的内容相一致。 本学位论文属于： l l 保密，在 圣年解密后适用本授权书。 口不保密。 学位论文全文电子版提交后： 口同意在校园网上发布，供校内师生和与学校有共享协议的单位浏览。 ( 请在以上相应方框内打“ ) 一；一 本人签名：塑拯丝 日期： 2 竺差：笸：! 兰 导师签名：三茎蒌二芝垒二i 一 日期：盈垒：笪：! 三 目录 摘要 抗体酶，又称催化性抗体，其本质是一类具有催化活性的抗体，在可变区赋 予了酶的属性。乳中富含抗体，已有研究发现健康母乳中的部分抗体同时兼有酶 的性质。基于牛初乳来源充足且其抗体含量远大于常乳的事实，本论文系统研究 了牛初乳粉中i g g 的分离纯化、抗体酶活力筛选及其具有的脱氧核糖核酸酶 ( d n a s e ) 活性，并基于牛初乳中天然抗体酶的研究结果提出一种牛初乳l g g 免 疫功能性的新机制。 根据s d s p a g e 不连续凝胶垂直电泳结果，不断优化提取工艺，最终确定采 用蛋白质g 亲和层析与葡聚糖g 1 5 0 凝胶层析相结合的方法分离获得高纯度的 l g g ，r i d 测定结果显示此法纯化的活性l g g 含量为2 2 0 m g 1 0 0 m l 左右。 研究结果初步表明，牛初乳i g g 不具有a 淀粉酶、纤维素酶和溶菌酶活性； 但牛初乳i g g 与质粒p b r3 2 2d n a 酶切反应后，电泳谱带呈长条荧光状，说明 质粒已被水解切割为d n a 小分子片段，所以证实牛初乳i g g 具有d n a s e 活性。 初步判断牛初乳i g g 具有非特异性脱氧核糖核酸内切酶的性质，随机将d n a 分子切割为众多分子量不一定的小分子d n a 片段。随着酶切反应中i g g 剂量的 增加、反应时间的延长，牛初乳中抗体酶的酶切反应越彻底：酶切反应的最适缓 冲液为无盐缓冲液，略微受到m 9 2 + 的激活，而n a + 为反应的抑制剂；在l g g 未 变性的温度范围内，温度变化不会显著影响酶切反应；两批次分离纯化的牛初乳 l g g 所具有的d n a s e 比活力分别为1 1 2 u r a g 和1 7 6 u m g 。牛初乳i g g 具有d n a s e 活力的发现表明：牛初乳抗体可能通过水解外源病毒d n a 分子，从而减少机体 受到病原体感染的几率，增强机体自身的免疫功能。此前发现的牛初乳l g g 抗病 毒功能可能部分来源于牛初乳中天然抗体酶，是一种全新的i g g 免疫功能性作用 机制。 关键词：抗体酶；脱氧核糖核酸酶：免疫球蛋白g ：牛初乳 华南理工大学硕十学位论文 a b s t r a c t a b z y m e ，n a m e l yc a t a l y t i c a l l ya c t i v ea n t i b o d y , p o s s e s s e se n z y m ec h a r a c t e ra t v a r i a b l er e g i o n m i l kc o n t a i n sag r e a ta m o u n to fa n t i b o d i e s ，a n dr e s e a r c h e r sf o u n d t h a ta u t o a n t i b o d i e si nt h em i l ko f h e a l t h yh u m a nm o t h e r sc o u l dp o s s e s s et h ee n z y m i c a c t i v i t i e s t h es o u r c eo fb o v i n ec o l o s t r u mi sa b u n d a n t ，a n dt h ec o n t e n to fa n t i b o d i e si nt h e b o v i n ec o l o s t r u mi sg r e a t e rt h a nt h a to fc , o n i i l l o nm i l k t h ep u r i f i c a t i o no fi g gf r o mb o v i n e e o l o s t r u mp o w d e ra n dt h ei d e n t i f i c a t i o no fs o m ep o s s i b l ea b z y m e sw e r es t u d i e df o rt h ef i r s t t i m eh e r e i na d d i t i o n ，an e wi m m u n em e c h a n i s mo fi g gf r o mb o v i n ec o l o s t r u mw a s p u t f o r w a r db a s e do nt h ep r e s e n tw o r k c h e c k e db ys d s - p a g e ，i g gf r a c t i o nw a si s o l a t e d b yp r o t e i nga f f i n i t y c h r o m a t o g r a p h ya n dt h e nf o l l o w e db ys e p h a d e xg 一15 0c h r o m a t o g r a p h yt og e tl g g s a m p l e sw i t hh i g hp u r i t y t h ec o n t e n to fi g gw i t hi m m u n o r e a c t i v i t yw a se s t i m a t e dt o b ea b o u t2 2 0 m g l0 0 m l b yr i d n oa a m y l a s ea c t i v i t y , c e l l u l a s ea c t i v i t ya n dl y s o z y m ea c t i v i t yo fi g gf r o mb o v i n e c o l o s t r u mw e r ef o u n di nt h i sw o r k h o w e v e r , t h ed n a s e a c t i v i t yo fi g g w a sf o u n da c c o r d i n g t ot h ef a c tt h a ts u b s t r a t ep b r3 2 2d n aw a sc u tt on u m e r o u sd n a s e g m e n t s i g g f r o mb o v i n e c o l o s t r u m m i g h tp o s s e s sn o n s p e c i f i cd n a s ea c t i v i t y , i tc o u l d h y d r o l y z ed n ar a n d o m l yi n t os e g m e n t sw i t hd i f f e r e n tm o l e c u l a rw e i g h t w i t ht h ei n c r e a s e o fi g gc o n c e n t r a t i o na n dr e a c t i o nt i m e ，d n aw a ss h o w e dt ob eh y d r o l y z e dm o r et h o r o u g h l y t h eo p t i m u mr e a c t i o nb u f f e rw a sn o n - s a l tb u f f e r , a n di g gf r o mb o v i n ec o l o s t r u mr e q u i r e d m g 什t os h o waf u l ld n a s ea c t i v i t y , w h i l en a + a c t e da sak i n do fi n h i b i t o r t h e c h a n g eo ft e m p e r a t u r ew o u l dn o ta f f e c ta b z y m er e a c t i o ne v i d e n t l ya sl o n ga si g gw a s a c t i v e d n a s es p e c i f i ca c t i v i t yo ft h et w ob a t c h e so fi g ge x t r a c t e df r o mb o v i n e c o l o s t r u m w e r e1 12 u m ga n d1 7 6 u m gr e s p e c t i v e l y i tw a sr e a s o n a b l et oa s s u m et h a tt h e i g gw a sc a p a b l eo fh y d r o l y z i n gv i r a ln u c l e i ca c i db yt h ep r e s e n tw o r k t h ed n a s ea c t i v i t y a l s or a i s e dt h ep o s s i b i l i t yt h a ta b z y m em i g h tb ead e f e n s ec o m p o n e n ta g a i n s tp a t h o g e na n d c o u l dp l a yar o l ei nt h et r a n s f e ro f p a s s i v ei m m u n i t y t h u s ，an e wm e c h a n i s mo fi m m u n i t y o fl g gf r o mb o v i n ec o l o s t r u r nt h a td n a s e a b z y m eo fi g gc o n t r i b u t e dt ot h ea n t i v i r u s f u n c t i o nc o u l db ep u tf o r w a r d k e yw o r d s ：a b z y m e ：d n a s e ；i g g ；b o v i n ec o l o s t r u m 目录 目录 摘要”o oooo ooooooq 001i a b s t r a c t o oo eo l 00 000 00 00 00 00 0ai i 第一章绪论l 1 1 引言“”一”“0 0 0 qq o00 l 1 2 牛初乳中的免疫球蛋白l 1 2 1 牛初乳中i g 的结构2 1 2 2 牛初乳中的i g g 抗体3 1 2 3 牛初乳i g 抗体的功能机制7 1 2 4 牛初乳i g 的应用7 1 3 抗体酶o oo oooo oo 8 1 3 1 概念”8 1 3 2 抗体酶的结构8 1 3 3 抗体酶的化学及酶学性质9 1 3 4 抗体酶的应用；- - 9 。 1 4 母乳抗体酶的性质及其生理功能l l 1 4 1 母乳中的抗体酶0 0 0 000oooooo o ooo oq 1 1 1 4 2 母乳抗体酶的来源与生理机能1 3 1 5 本论文研究的立论依据和内容1 4 1 5 1 本论文立论依据和意义1 4 1 5 2 本论文的主要内容1 4 第二章牛初乳i g g 的分离纯化1 6 2 1 引言1 6 2 2 材料与仪器o o o oooqo0 0 0 oo oog001 6 2 2 1 材料与试剂1 6 2 2 2 仪器与设备1 7 2 3 方法o o ge do ”1 8 2 3 1 乳清的制备i o aoo 1 8 2 3 2 蛋白质g 亲和层析1 8 2 3 3 葡聚糖g 1 5 0 凝胶层析1 9 2 3 4 提纯i g g 的后处理1 9 2 3 5s d s p a g e 不连续垂直电泳0 000 00 m oo o m 2 0 2 3 6 琼脂单向免疫扩散实验( r i d ) 2 1 2 4 结果与讨论0 00000 00 0000 00 00 , 0 o oo , , o 2 2 i i i 华南理工大学硕士学位论文 2 4 1 不同方法分离纯化牛初乳i g g 的结果分析2 2 2 4 2i g g 含量的测定2 5 2 4 3 讨论2 7 2 5 刁、结8 q 6 o oooo o 一2 7 第三章牛初乳抗体酶活力的筛选2 9 3 1 引言”2 9 3 2 材料与仪器2 9 3 2 1 材料与试剂0 000 00io 2 9 3 2 2 仪器与设备3 0 3 3 方法3 1 3 3 1a 淀粉酶活力测定3 l 3 3 2 纤维素酶活力测定3 2 3 3 3 质粒d n a 的内切酶反应3 2 3 3 4d n a 的琼脂糖凝胶水平电泳3 3 3 3 5 溶菌酶活力的测定3 4 3 4 结果与讨论3 4 3 4 1 牛初乳i g g 淀粉酶活的筛选3 4 3 4 2 牛初乳i g o 纤维素酶活的筛选3 6 3 4 3 牛初乳l g g 的d n a s e 酶活的筛选3 7 3 4 5 牛初乳i g g 溶菌酶活的筛选3 8 3 5 本章小结3 9 第四章牛初乳抗体的d n a s e 活性研究4 0 4 1 弓i 言0 0 0 00 0o io 4 0 4 2 材料与仪器4 0 4 2 1 材料与试剂4 0 4 2 2 仪器与设备4 1 4 3 方法4 l 4 3 1 质粒d n a 的内切酶反应4 l 4 3 2d n a 的琼脂糖凝胶电泳4 l 4 3 3d n a s e 活力测定4 l 4 3 4 琼脂单向免疫扩散实验( r i d ) 4 2 4 4 结果与讨论4 2 4 4 1 质粒p b r3 2 2d n a 的构象分析4 2 4 4 2 不同剂量l g g 与质粒的酶切反应及其产物的电泳分析4 3 4 4 3 牛初乳i g g 与质粒在不同反应时间下的酶切反应及其电泳分析- - - - - - - - - - - - - - 4 6 i v 目录 4 4 4 温度对牛初乳i g g 与质粒酶切反应的影响及其电泳分析4 7 4 4 5 缓冲液对牛初乳i g g 与质粒酶切反应的影响及其电泳分析4 8 4 4 6d n a s e 活力测定4 9 4 4 7 牛初乳i g g 的d n a s e 酶活与初乳功能性机制5 2 4 5 本章小结0 0 000 0 0 00 00 5 2 结论与展望5 3 参考文献5 5 在学期间发表学位论文内容相关的学术论文5 9 致谢”“6 0 v 第一章绪论 第一章绪论 1 1 引言 初乳是一种非常特别的乳，是所有雌性哺乳动物产后2 3 天内所分泌乳汁的 统称。新鲜初乳色泽黄而浓稠，甚至混有血红色，具有特殊的乳腥味和苦味。由 于此阶段生理上的特殊性使得初乳的化学组成及特性与常乳有很大区别，初乳的 特殊性不仅在于它含有较之普通乳汁高含量的蛋白质、铁和部分维生素，较低含 量的脂肪和糖等，而且还在于其具有独特的生理功能。初乳的蛋白质大多数为免 疫球蛋白，它可能形成抗体，与病原微生物及毒素等抗原结合，在新生幼仔自身 免疫系统发育成熟、正常运作之前，保护其免受病原侵袭。近年来，已有动物以 及人体试验揭示口服初乳的一些主要功能，可概括为：直接在胃肠道内抵抗 部分食物致病原，赋予人体所谓“被动免疫力一；增强机体的系统免疫能力； 调节机体生理状态平衡，加速健康恢复过程等。这些功能主要源于初乳内存 在的各种蛋白性免疫因子、生长因子。 综合考虑伦理、宗教、消费习惯以及工业基础等因素，牛初乳被认为是迄今 为止最为现实的初乳资源。据统计，一头牛一个泌乳期的初乳量( 分娩4 天内) 平均约2 0 一2 5 k g ，牛犊出生后初乳实际喂养量在6 8 1 1 7 k g 之间。目前，我国约 有乳牛5 0 0 万头，这意味着存在约8 0 0 0 0 吨的宝贵牛初乳资源。因此，以牛初乳 为基料开发相关的初乳功能性食品和保健食品具有重要的现实意义。 关于初乳功能性机制研究一直是国内外热门课题。近年来，人们发现在健康 母乳中的部分免疫球蛋白具有催化淀粉、d n a 、r n a 、核苷酸水解和蛋白质、脂 肪磷酸化反应的性质，即部分免疫球蛋白抗体具有酶的活性，是所谓的“抗体酶 。 但是，目前国内外在牛等其它哺乳动物前期乳汁中抗体酶活性的研究尚属空白。 牛初乳中免疫球蛋白g 占免疫球蛋白总量的5 5 以上，是含量最高的免疫球蛋 白。考虑到牛初乳组成的特殊性和免疫球蛋白g 的重要生理功能，倘若通过研究 能够发现牛初乳中免疫球蛋白g 具有某些抗体酶的性质，这会为初乳生理机制的 诠释提供一个全新的方向。 1 2 牛初乳中的免疫球蛋白 l8 9 0 年b o e h r i n g e r 给动物进行免疫接种时，在动物血清中发现一种能中和 白喉毒素的物质，若将该物质转移给另一未接种过毒素的动物，能起到保护作用， 故将这种物质称为抗体。随着研究的深入，1 9 6 4 年w h o 的专题会议上将具有抗 体活性以及与抗体相关的球蛋白统称为免疫球蛋白( i m m u n o g l o b u l i n ，以下非特 殊说明均简称为i g ) 。 i g 均由b 淋巴细胞产生，最初是从血液中分离获得的。随后的研究发现，i g 主要存在于血浆中，少部分存在于组织间液。另外，粘液和乳汁中还存在由母体 华南理工大学硕士学位论文 特异转运而来的某些特异性i g 。研究表明，牛初乳中存在i g g 、i g a 、i g m 、i g e 和i g d 等5 类i g ，而初乳中的i g 含量明显高于常乳，表1 1 为普通牛乳和牛初 乳中i g 含量的比较。 表l l 普通牛乳和牛初乳中主要l g 含量的比较l i l t a b l el - lc o n c e n t r a t i o no f p r i m a r yi gb e t w e e nb o v i n ec o m m o nm i l ka n db o v i n ec o l o s t r u m 堑翌耋垫塾( m g m l )常乳( m g m l ) i g g i 5 2 0 8 7 0 0 31 - 0 5 9 i g g 2 1 6 - 2 1 0 0 2 0 5 9 i g a 3 2 - 6 20 0 4 0 14 i g m 3 7 - 6 10 0 3 。0 0 6 1 2 1 牛初乳中i g 的结构 1 9 6 2 年，p o r t e r 首先提出i g g 分子的化学结构模式，后来经过证实其他几类 i g 有着与i g g 相似的基本结构。 图1 1i g 的结构示意图 f i g u r ei 1s t r u c t u r eo fi g 2 区 第一章绪论 各种i g 组成为：2 条重多肽链，每条均有1 个由3 10 - 5 0 0 个氨基酸残基 ( 因类别不同而异) 组成的恒定区( c o n s t a n tr e g i o n ) 和1 个由1 0 7 - 1 1 5 个残基 ( 因可变区亚群不同而异) 组成的可变区( v a r i a b l er e g i o n ) ；2 条轻多肽链， 每条也分别含有1 个恒定区( 1 0 7 1 1 0 个氨基酸残基) 和1 个可变区( 1 0 7 - 1 1 5 个残基) 。i g 的轻链和重链之间依靠二硫键以及其他非共价键结合，形成一个整 体。 i g 分子中两条相同的重链和两条相同的轻链通过链间二硫键维系构成，其中 每条肽链又可被链内二硫键连接折叠成几个球形结构，这种结构使一系列对于i g 生物功能有贡献的氨基酸彼此靠近，集中在一个部位，称为i g 的功能区( d o m a i n ) 。 另外介于c h l 和c h 2 功能区之间的区域称为铰链区( h i n g er e g i o n ) ，此区含大量 脯氨酸和二硫键，可伸展1 8 0 。，此种结构适宜于抗体分子与不同距离的抗原决 定簇结合，也有利于补体结合部位的暴露，为补体活化创造条件【- 2 1 。 i g g 是牛初乳中含量最高的i g ，占i g 总量的5 5 以上，其分子质量1 4 9 6 8 0u 。 牛乳中i g g 至少包括两个亚类i g gn 和i g g 2 。i g gn 在初乳乳清中浓度超过 1 0 0 m g m l ，大多数i g g l 具有较大的净酸度和较低的等电电荷密度，因此在碱性 p h 条件下向正极迁移速率较大。所以有研究者采用术语“快( i g gn 组分) 和“慢 ( i g g 2 组分) 来区别不同l g g 组分。i g g 2 数量较i g g t 少，但其分子上存在一个 电化学性质较为独特的区域，在低盐浓度下不能结合到二乙基氨基乙基( d e a e ) 匕f i 】。 1 2 2 牛初乳中的l g g 抗体 1 2 2 1i g g 的抗体性质 i g g 是血清半衰期( 约2 3 天) 最长的i g ，同时分子较小，比其它类i g 更易 透过毛细血管壁转入组织液内。i g g 几乎可以在一切组织中与抗原反应，除此之 外还能激活补体或抑制补体结合，破坏肿瘤和病毒感染的靶细胞等，更是唯一能 够通过胎盘传递给胎儿的抗体。不仅如此，新生幼仔、新生儿一般在出生后3 个 月内不能合成i g g ，所以母体血液中的i g g 抗体进入初乳后，初乳中高含量的i g g 抗体将赋予吸吮婴儿“被动免疫力 ，在胃肠道抗感染方面发挥重要作用。 研究表明，天然牛初乳i g g 具有较广谱的抑菌效果，尤其对大多数导致胃肠 道疾病的病原微生物具有良好的抑制和杀灭效果。表1 2 列举出牛初乳i g g 可抑 制的主要致病性微生物。 3 华南理f t 大学硕士学位论文 表l - 2 牛初乳i g g 可抑制的致病性微生物及其可能导致的疾病【l l t a b l e1 - 2m i c r o o r g a n i s m sa n dd i s e a s e st h a tc a nb ei n h i b i t e db yi g gf r o mb o v i n ec o l o s t r u m 致病微生物可能导致的疾病 幽门螺杆菌( h e l i c o b a c t e r p y l o r i ) 空肠炎弯曲杆菌( c a m p y l o b a c t e r j e j u n i ) 白色念珠菌( c a n d i ua l b i c a n s ) 小肠结肠炎耶尔森氏菌( y e r s i n i ae n t e r o c o l i t i c a ) 埃希氏大肠杆菌( e s c h e r i c h i ac o l i ) 0 1 5 7 大肠杆菌( e s c h e r i c h i ac o b 0 1 5 7 ) 产单核细胞李斯特菌( l i s t e r i am o n o c y t o g e n e s ) 致肠炎沙门氏菌( s a l m o n e l l ae n t e r i t i d i s ) 伤寒沙门氏菌( s a l m o n e l l at y p h i m u r i u m ) 肺炎克雷伯氏菌( k l e b s i e l l ap n e u m o n i a e ) 痤疮丙酸杆菌( p r o p i o n i b a c t e r i u ma c n e s ) 无乳链球菌( s t r e p t o c o c c u sa g a l a c t i a e ) 肺炎链球菌( s t r e p t o c o c c u sp n e u m o n i a e ) 化脓链球菌( s t r e p t o c o c c u sp y o g e n e s ) 表皮葡萄球菌( s t a p h y l o c o c c u se p i d e r m i d i s ) 金黄色葡萄球菌( s t a p h y l o c o c c u sa u r e s u ) 流感嗜血杆菌( h a e m o p h i l u si n f l u e n z a e ) 艰难梭菌( c l o s t r i d i u md i f f i c i l e ) 弗氏志贺菌1a ( s h i g e l l a f l e x n e r i l a ) 胃溃疡 空肠炎 鹅口疮、败血症、心内膜炎 或髓膜炎 小肠结膜炎 泌尿系统感染、败血症、肺感染 食物中毒 成人髓膜炎、孕妇死产 副伤寒发热、肠胃炎 伤寒 严重肺炎、肺溃疡 痤疮 败血症、心内膜炎、泌尿系统感 染、肺炎、髓膜炎 肺炎 伤口感染 皮肤溃烂 食物中毒 流感 食物中毒 痢疾 1 2 2 2 各种物化因素对i g g 抗体活性的影响 维持i g g 的生物活性是研究和开发中必须解决的问题之一，而影响其活性 的主要因素包括：温度、压力、p h 、离子强度等等。 刘伟等人的研究报道证实，6 5 加热3 0 m i n 时，i g g 活性残存率约6 7 ；7 0 加热1 5 m i n 时，i g g 活性残存率约为4 3 ：7 5 加热5 m i n 时，活性残存率低于2 0 ； 8 5 加热2 5 m i n 时，l g g 基本完全失活。这一结果表明i g g 在低于6 5 范围内具有 较高的热稳定性。随着温度的升高，l g g 的稳定性下降的幅度增大，原因在于 i g g f a b 片段中的c h 区域相对热稳定性差，容易展开，使f a b 段结构发生变化，i g g 失 去免疫活性1 3 - - 5 1 。表1 3 显示出牛初乳l g g 热变性的d 值和z 值，其中d 值是指一定 4 第一章绪论 温度下9 0 i g g 变性所需的时间，z 值是指d 值降低9 0 的温度变化。 表1 - 3 牛初孚l i g g 热变性的d 值和z 值【3 1 f i g u r e1 - 3t h ev a l u e so fd a n dzf o rh e a td e n a t u r a t i o no fi g gf r o mb o v i n ec o l o s t r u m 高压技术是食品加工业中常用的方法之一，但高压容易使i g g 失去活性。 2 0 0 m p a 条件下处理2 0 m i n ，i g g 活性未发生变化；压力升至4 0 0 m p a 时，i g g 开始发 生变性；压力达到7 0 0 m p a 时，i g g 已完全变性。原因是高压使得蛋白质维持其三 级结构的疏水作用及离子键由于体积的压缩受到破坏，导致其变性哺。 不同p h 也是影响i g g 活性的主要因素之一。i g g 的等电点范围一般为5 5 8 3 ， 过酸、过碱均会导致其变性失活。牛乳中的i g g 在p h 1 0 0 时稳定性下 降，激发波长2 8 4 n m 下的最大发射波长显著增大，说明i g g 的构象发生变化，其内 部荧光有所暴露1 7 l 。 o 3 7 保温时间( h ) 图l - 2l g o 的酸碱稳定性( 一) f i g u r el - 2e f f e c to fp ho nt h es t a b i l i t yo fi g g 5 _ + 一p h 2 一p h 3 - 一p h 4 _ 卜一p h 5 卜一p h 6 i 。p h 7 0 o 0 0 o o o 2 o 8 6 4 2 一x一斛求陋皿答宕1 华南理工大学硕士学位论文 o 1 23 3 7 保温时间( h ) 图1 - 3l g g 的酸碱稳定性( 二) f i g u r e1 - 3e f f e c to fp ho nt h es t a b i l i t yo fi g g _ 卜一p h 8 一p h 9 - ，卜p i l l 0 一p h l l e - 一p i l l 2 除此之外，缓冲液、原料的加工工艺等都会对i g 的活性产生影响。 另外，研究证实一些糖醇化合物：如蔗糖、乳糖、葡萄糖、甘油及其混合物 浓度较高时，具有稳定球蛋白的性质。无论是在酸性条件还是在碱性条件下，以 及在加热条件、高压条件和变性剂存在的情况下，蔗糖对i g g 的变性都具有保护 作用。在蔗糖的存在下，i g g 溶液的最大荧光发射波长减小，且存在剂量关系， 这说明蔗糖的存在降低了i g g 分子内部色氨酸基团的暴露，使i g g 的构象趋于稳 定。蔗糖对i g g 在各种条件下变性的保护作用可能与其增加蛋白质内部的疏水作 用以及增加蛋白质分子的溶剂化作用有关i 乱孔。j 。其他糖醇化合物如葡萄糖、半乳 糖、果糖、麦芽糖、乳糖等对不同介质中的i g g 也表现出不同程度的保护作用。 一些氨基酸也在一定程度上加强了i g g 的热稳定性【i l 。 当然对i g g 进行化学修饰，也可以对其活性产生影响。例如，以三聚氯氰为 活化剂，单甲氧基聚乙二醇( p e g ) 5 0 0 0 为载体，对l g g 进行化学修饰。p e g 是非免疫性的化学惰性物质，以此为载体反应条件温和，易于保留蛋白及酶的活 性而不使其变性。结果显示，l g g 经p e g 修饰后其分子中加入p e g 直链，p e g 分子在i g g 表面形成一个屏蔽，能有效抵御外界条件变化对l g g 分子结构的破坏 作用，对p h 和温度变化的抵抗力增强。当然，p e g 的空间位阻作用阻碍了反应 位点的反应活性，所以偶联度越高，偶联l g g 的活性越 氐1 9 1 。 6 o 0 o 0 o o o 加 舳 们 o x一瓣隶忸姐誉h 第一章绪论 1 2 3 牛初乳i g 抗体的功能机制 i g 是牛初乳中最引人注目的免疫因子，具有多种生物学活性。在免疫反应中 i g 具有两个重要特性特异性和生物活性，分为分泌型和膜结合型，即s l g ， m l g i g 最主要的生物学特性就是与相应抗原特异性结合，在体内介导各种生理和 病理效应，在体外引起各种抗原一抗体反应，这种免疫反应一般被视为其发挥生 物学功能的主要机制。一些抗原被i g 特异性结合后便丧失破坏机体健康的能力。 另外，i g 还有激活补体的功能。i g g l 3 和i g m 与相应抗原结合后，可激活补体经 典途径，即抗原一抗体复合物刺激补体固有成分c i c 9 发生酶促连锁反应，产 生一系列生物学效应，最终发生细胞溶解作用的补体活化途径；i g a 和i g e 不能 通过经典途径激活补体，但它们的凝聚物能激活补体旁路途径。 i g 的另一个生物功能机制在于其可能与f c 受体粒细胞、淋巴细胞、血小板、 巨噬细胞以及乳铁蛋白、乳过氧化酶和溶菌酶等非特异性免疫因子协同作用。例 如i g 能够通过其f c 段与多种细胞结合，并通过与抗原结合而刺激这些细胞功能， 从而产生多种不同的生物效应：如促进吞噬细胞对细菌等颗粒性抗原的吞噬，即 抗体的调理作用：增强n k 细胞和触发吞噬细胞对组织靶细胞的杀伤破坏作用， 即产生抗体依赖性细胞介导的细胞毒作用；引起介导i 型超敏反应等等l - i o 。 1 2 4 牛初乳i g 的应用 目前，从初乳中提取出的i g 被用于包括食品、生物制药、免疫医学、饲料等 多个行业中。 将i g 作为功效因子用于食品中，增强人体抵抗力，已经成为许多功能性食 品、保健品的重要卖点。例如，将l g g 以溶液状态加入到饮料或制成口服液提高 防病抗病能力，促进生长；婴儿配方奶粉中通过添加i g g 及其他免疫活性成分， 使其更加趋于母乳化。 在临床医学上，有关利用牛初乳中特异性的i g 来预防和治疗人和动物肠道病 原微生物感染方面的报道很多，且均证明其效果良好。例如抗轮状病毒，b a r n e s 等研究表明给低体重婴儿1 3 服丫球蛋白可以保护婴儿轮状病毒感染导致的腹泻； b r u s s a w 用人轮状病毒( 4 个血清型) 对母牛进行免疫，收集头1 0 天的乳制成i g 浓 缩物( 含5 0 i g ) ，浓缩物对人四种血清型的轮状病毒都具有中和活性，体外中 和实验表明这种抗轮状病毒i g 浓缩物具有极强的抗病毒活性。又如抗大肠杆菌， b i c k e m a 币l j 用8 株大肠杆菌制成疫苗对牛进行免疫，并利用血清、乳、初乳制备i g 浓缩物用于口服治疗婴儿胃肠道大肠杆菌的感染；h i l p e r t 等( 19 7 5 ) 用牛乳i g 来 治疗婴儿大肠杆菌性腹泻，实验组有效率达7 6 9 ，而对照组达2 7 7 。在抗幽门 螺杆菌方面，c o r d l e 等( 1 9 9 3 ) 用幽门螺杆菌对乳牛进行免疫，收集初乳制成i g 7 华南理工大学硕士学位论文 浓缩物，在实验l o 天前用分离自人的幽门螺杆菌感染仔猪，然后分别喂以添加免 疫和非免疫初乳i g g 浓缩物的饲料，每天i g g 食入量为1 5 2 o g 只，连续饲喂2 0 - - 2 6 天，实验结果为实验组3 7 活体检查发现幽门螺杆菌，而对照组为8 4 ，这些 结果表明对幽门螺杆菌具有特异性的乳抗体可用于人胃炎及胃溃疡的治疗，而且 通过口服特异性乳抗体用于人体幽门螺杆菌感染的胃炎及胃溃疡的实验性治疗 已取得成功。在抗志贺氏菌方面，t a c k e t 等( 1 9 9 2 ) 用s f l e x n e r i ( 福氏志贺痢疾杆 菌) 2 a 脂多糖( l p s ) 对牛进行免疫，制得高滴度抗s f l e x n e r il p s 孚l i g 浓缩物，此 抗体浓缩物对s f l e x n e r i2 a 针对人体的攻击具有保护作用。此外抗霍乱毒素、抗破 伤风毒素、抗变异链球菌、抗空肠弯曲杆菌、抗艰难梭状芽孢杆菌、抗隐形孢子 虫乳抗体很多的应用研究表明i g 在预防和治疗人和动物肠道病原微生物的感染方 面有着重要的作用- ：】。 在生物技术领域，i g 被广泛用于免疫亲和层析法，免疫痕迹技术，免疫治疗 和免疫诊断等检测和提取过程。在医学诊断中由于i g 可与特异性抗原结合，因而 可用来标记抗原。而且一些血清i g ( 抗血清) 制品经过多年的研究，已有工业化 生产，如抗炭疽血清、破伤风抗狂犬病血清等。 i g 除了用于功能性食品领域之外，也被用为一种新型的活性添加剂用于饲料 中，促进动物生长，降低死亡率【i ，l 。 1 3 抗体酶 1 3 1 概念 抗体酶( a b z y m e ) ，又称催化性抗体( c a t a l y t i ca n t i b o d y ) ，是一类具有生物 催化性质的抗体分子，是抗体的高度选择性和酶的高效催化能力巧妙结合的产 物。 抗体和酶相似，它们都是蛋白质分子，并且都能高度专一性地与其配体( 抗 原或底物) 相结合。所不同的是，抗体是与抗原的基态结合，而酶是与底物的反 应过渡态结合。抗体的多样性赋予它几乎无限的识别能力。如果能制备抗某个反 应过渡态的抗体，这种抗体就有可能催化该反应。但过渡态是不稳定的，因此人 们选择和该过渡态结构相似的类似物作为半抗原，并合成抗原进行免疫，由此得 到和酶一样能特异性识别的过渡态，并催化特定化学反应的抗体，这种具有催化 能力的抗体就被称为抗体酶或催化抗体1 1 4 1 。 1 3 2 抗体酶的结构 抗体酶和所有的抗体一样，都是由两条轻链和两条重链构成，每条链都有可 变区和不可变区，重链和重链及重链和轻链之间通过二硫键相连，此外重链还有 连接枢纽。抗原与轻链和重链的可变区特异结合，可变区大约由1 1 0 个氨基酸 8 第一章绪论 组成，至少可产生1 0 8 个不同抗体，所以可变区氨基酸的排列决定了抗体分子的 特异性。抗体酶的本质是一类具有催化活性的i g ，在可变区赋予了酶的属性l i ，1 。 1 3 3 抗体酶的化学及酶学性质 抗体抗原分子间的识别与酶底物间的相互适应性有很大类似性，都是依赖 于双方的极性互补及立体互补。所以抗体酶常表现出与天然酶相似的酶学特征： 与非催化反应相比，大多数抗体酶能使催化活力提高1 0 3 1 0 4 倍，有些还接近于 天然酶的催化水平；遵守米氏动力学方程，具有识别底物的区域及立体特异性； 研究活性部位时，均可用化学