（食品科学专业论文）花生红衣中白藜芦醇、原花色素提取工艺研究.pdf

湖北工业大学硕士学位论文y 芦亏8 分乒 摘要 我国花生资源极其丰富，是世界上花生产是最高、出u 量最多的圜家。花生 及红农中含有具重要生理活性作用的多酚类物质自攀芦醇( r e s v e r a t r 0 1 简称 r e s ) 和原花色素( p r o c y a n i d i n s ，简称p c ) ，利用花生红衣资源提取其中的天然活 性成分，具有良好的经济效益及深远的意义。花生的膂莽价值、保健功能，使它 成为继大豆 发后国际植物资源研究利用的新热点。 本课题蕾先对越声波辅助提毅花生红农中i 墨藜芦酵、原花色素的工艺进行了 研究。从5 种常用试剂中选择出乙醇作为提取剂，并在单因素实验的基础上，通 避矛交实验优化了岛藜芦酵、原花色巢的提取条柠：料液托i ：6 ，温度7 0 ，乙 醇浓度6 0 ，提取时间2 0 m jn ，p h 3 ，提取次数1 次。在照佳工艺条件下，白藜芦 醇、蹶花色素的提墩得率分别为0 0 3 6 、4 9 6 。 对花生红衣提取物中白饕芦醇、琢花色素的分离工艺进行了探讨。通过静态 吸附、解吸实验筛选出a l l8 大孔树脂作为层析柱填料，通过单因素、难交实验优 化了自藜芦醇、原花色素的富集、分离条件。萁吸附最佳条件为：上柱液流速 l m l m i n 、p h 7 、白藜芦醇、原花色素的浓度分别为2ug m l 和0 6 m g m l ；解吸最 适条件为：流速1 5 m l m i n 、洲5 ；翻2 0 甲醇溶液解吸其中豹鑫攀芦醇，4 0 、6 0 甲醇溶液解吸原花色素，合并相同组分，经浓缩、冷冻干燥制得纯度较高的白藜 芦醇、原花色素产品，白藜芦醇的含量为4 3 6 0 ，原花色素含量达9 30 5 。 通过羟自由基清除实验、油船抗氧化实验考察白藜芦醇、原花色素对羟自出 基的清除效果及对油脂的抗氧化性能。结果表明，白婪芦醇及原花色素对羟自出 基具有较强的清除效槊，对淮1 有一定的抗氧化作用。 关键词：白藜芦醇：原艳色素；花生l 。农；提取；精制分离：抗氧化性 湖北工业大学硕士学位论文 a b s t r a c t p e a n u tr e s o u r c e ，w h i c hi s r a n k i n gt h e f i r s t p l a c e i nt h e y i e l d a n de x p o r t ，i s a b u n d a n ti nc h i n a r e s v e r a t r o la sw e l la sp r o c y a n i d i n si sr i c hi np e a n u t sa n d e s p e c i a l l y i nt h er e ds k i no fp e a n u t s b o t hm a t e r i a l sa r e p o l y p h e n o l i cc o m p o u n d sa n d h a v e i m p o r t a n tp h y s i o l o g yf u n c t i o n s oi ti sh i g i l l yp r o f i t a b l ea n dp r o f o u n d l yr e m a r k a b l et o e x t r a c ta n dr e f i n et h en a t u r a la c t i v ec o m p o n e n t sf r o mt h er e ds k i no fp e a n u t s t h g n u t r i t i o n a lv a l u ea n dh e a l t h yf u n c t i o no fp e a n u t sm a k ei t s e l ft ob en e wh o t s p o ta f t e rt h e d e v e l o p m e n to fs o y b e a ni n t h ef i e l do fr e s e a r c ha n dd e v e l o p m e n to fn a t u r a l p l a n t m a t e r i a l s r e s e a r c hh a db e e nc a r r i e do u to nt h et e c h n o l o g yo fe x t r a c t i n gr e s v e r a t r o la n d p r o c y a n i d i n sa s s i s t e db yu l t r a s o n i cf r o mt h e r e d s k i no fp e a n u t s e t h a n o lh a db e e n s e l e c t e df r o m5k i n d so fc o m m o ns o l v e n t st oe x t r a c tt h e s et w om a t t e r s b a s e do nt h e s i n g l ef a c t o re x p e r i m e n t s ，t h ee x t r a c t i o nc o n d i t i o n sh a db e e no p t i m i z e db yo r t h o g o n a l a n a l y s i s t h eo p t i m u me x t r a c t i o n c o n d i t i o n sw e r ea sf o l l o w s ：t h er a t eo fs o l i dt o s o l u t i o ni s1 ：6 ，t h et e m p e r a t u r ei s7 0 ，t h ec o n c e n t r a t i o no fe t h a n o li s6 0 ，e x t r a c t i o n t i m ei s2 0 m i n ，p hi s3a n dt h et i m e so fe x t r a c t i o ni s1 u n d e rt h eo p t i m i z e dc o n d i t i o n ， t h ey i e l d so fr e s v e r a t r o la n d p r o c y a n i d i n sw e r er e s p e c t i v e l y0 0 3 6 a n d 4 9 6 。 r e s e a r c hh a db e e nm a d eo nt h e t e c h n o l o g y o f s e p a r a t i n g r e s v e r a t r o lf r o m p r o c y a n i d i n si nt h e e x t r a c to ft h er e ds k i no f p e a n u t s t h em a c r o p o r o u sa d s o r p t i o nr e s i n a b 一8h a db e e ns e l e c t e df r o m3k i n d so fc a r r i e r sb ys t a t i ca d s o r p t i o na n dd e a d s o r p t i o n t e s t s t h es i n g l ef a c t o rt e s t sa n do r t h o g o n a le x p e r i m e n t sh a db e e na p p l i e dt oo p t i m i z e t h ee n r i c h m e n ta n ds e p a r a t i o nc o n d i t i o n so fr e s v e r a t r o la n dp r o c y a n i d i n s t h eb e s t a d s o r p t i o nc o n d i t i o n sw e r e a sf o l l o w s ：f e e d i n gr a t ei sl m l m i n ，p hv a l u ei s7 0a n dt h e c o n c e n t r a t i o no fr e s v e r a t r o la n dp r o c y a n i d i n si sr e s p e c t i v e l y2ug m la n do 6 m g m l t h eo p t i m u me l u t i o nc o n d i t i o n sw e r ee l u t i o nr a t e1 5 m i d m i na n dp hv a l u e5 0 r e s v e r a t r o la n dp r o c y a n i d i n sc a nb ep u r i f i e da n ds e p a r a t e db yd i f f e r e n tc o n c e n t r a t i o n o fm e t h a n 0 1 r e s v e r a t r o lw a se l u t e db y2 0 m e t h a n o lw h i l ep r o c y a n i d i n sw a sb y4 0 a n d6 0 a f t e rc o m b i n et h es a m ec o m p o n e n t s t h ep r o d u c t sc a nb eo b t a i n e db y i i 湖北工业大学硕士学位论文 c o n c e n t r a t i o na n dl y o p h i l i z a t i o n t h ec o n t e n t so fr e s v e r a t r o la n dp r o c y a n i d i n sw e r e r e s p e c t i v e l y4 3 6 0 a n d 9 3 0 5 w i t ht h ee x p e r i m e n to fs c a v e n g i n gh y d r o x y lr a d i c a l sa n da n t i o x i d a t i n gr a p e s e e d o i la n dl a r d t h ea n t i o x i d a n ta c t i v i t i v e sh a db e e ni n v e s t i g a t e d t h e r e s u l t ss h o wt h a tb o t h r e s v e r a t r o la n dp r o c y a n i d i n sh a v eg o o de f f e c to ns c a v e n g i n gh y d r o x y l r a d i c a l sa n d a n t i o x i d a t i n g o i l s f a t s k e yw o r d s ：r e s v e r a t r o l ，p r o c y a n i d i n s ，r e ds k i no fp e a n u t s ，e x t r a c t i o n ，r e f i n e m e n ta n d s e p a r a t i o n ，a n t i o x i d a t i o n i i l 湖北工业大学硕士学位论文 1 1 前言 第1 章绪论 随着食品工业的迅速发展和人们消费水平的提高，食品消费观念也不断发生 着变化，消费趋势逐渐转向具有合理营养和保健功能的营养保健食品，保健食品 被誉为“2 1 世纪食品”。因而具有调节机体功能、预防疾病和促进健康的保健食品 应运而生并迅速发展起来。有关专家认为：预防心、脑血管疾病、癌症、动脉硬 化、延缓衰老等的保健食品将有着广阔的市场。 而白藜芦醇难是这种心、脑血管疾病及癌症的天然化学预防剂”，它具有重要 的生理活性：包括：抑制血小板凝集。”；调节脂蛋白的代谢“；抗氧化活性”1 ；白 藜芦醇对铜离子具有强的螫合能力，因此可抑制出铜离子所催化的低密度脂蛋白 的过氧化3 ；可清除过氧化离子，抑制细胞膜的脂质过氧化；另外，由于白藜芦醇 可以自由进入脂质环境，因此在活体内存在明显的抗氧化活性。综上所述，白藜 芦醇对心血管疾病和动脉硬化的抑制效果扮有重要角色”1 ，亦可藉此促进人类肿瘤 细胞的凋亡，或是透过肿瘤抑制因子p 5 3 的表现来达到抗肿瘤活性”1 。其抑制癌细 胞、降低血脂、防治心血管疾病、抗氧化、延缓衰老等作用比较明显，被喻为继 紫杉醇之后又一新的绿色抗癌药物。j 下是由于自藜芦醇具有这些重要的生理活性 作用，它被美国专著抗衰老圣典一书列为“1 0 0 种壤热门有效抗衰老物质之一”。 因此，人们对其关注、研究程度r 益加深，使得它在食品、医药等工业上的应用 也越来越广，市场价值极高。迄今美国宇航局已将花生定为航天食品，花生油、 花生酱等富含白攀芦醇的食品将会成为2 l _ 【i 纪营养健康的新时尚”；在同本，已 将含白藜芦醇的植物提取物作为食品添加剂使用；在我国，也有将白藜芦醇的植 物提取物制成降脂、美容、减肥和抗癌的天然保健食品及胶囊“3 。另外，还可以 将其添加到各种酒中，以增加酒的品质。 原花色素也是一种多酚类物质，低聚原花色素具有很强的抗氧化能力，其抗 氧化能力是v 。的5 0 倍v c 的2 0 倍“。另外，它还具有强有力的清除自由基和对 人体微循环特殊改善的双重功效，以高效、低毒、高生物利用率而著称。f 是山 于原花色素具有较强的抗氧化能力”“、清除自由基的能力“3 1 和较好的药理活性， 如抗癌、抗诱变、抗炎症、抗h i v 病毒等8 0 多种出自山基引起的疾病，1 9 9 5 年 湖北工业大学硕士学位论文 在事先未指定候选药物的情况下，美国公众无记名投票推选它为最受欢迎的1 0 大 植物药之“”，近十年来，它已在北美保健食品业和化妆品业得到广泛应用；另 外，在欧洲已将原花色素用作治疗血液循环疾病、减轻浮肿与静脉曲张用药“。 由于白攀芦醇、原花色素具有这些重要的天然活性保健作用，利用我国丰富 的原料资源( 如葡萄、虎杖、花生及种皮、高粱等) ，大力开发相关的保健产品能 够充分、合理、有效地利用资源并具有广阔的市场前景及良好的经济效益。 花生是我国重要的油料作物和经济作物之一，也是世界最为重要的四大油料 作物之，花生产业是我国和世界上有着巨大发展潜力的产业。我国花生收获面 积占世界第2 位，而总产量居世界第1 位，2 0 0 2 年我国花生收获面积占世界的 2 0 3 6 “”。我国花生约有5 0 用于榨油，2 9 用于食用，鳓用于出口1 5 用于留种 和其它用途“。而花生制品生产厂的副产品资源花生红衣并没有得到有效、 充分的利用，因而利用花生红衣资源提取其中的天然活性成分，具有良好的经济 效益及深远的意义。花生的营养价值、保健功能，决定了它是继大豆开发后国际 植物资源研究利用的新热点，中国农科院花生研究所禹山林研究员和国家著名医 药专家毛文岳教授说，有关花生中自藜芦醇的研究开发将是2 l 世纪最重要的营养 课题之一渊。 1 2 国内外对白藜芦醇的研究现状 1 2 1 白藜芦醇的结构、性质 自藜芦醇( r e s v e r a t r o l ，简称r e s ) ，又称芪三酚，化学名称为3 ，4 ，5 三羟 基二苯乙烯，起初在葡萄中发现，被认为是：它的产生与葡萄植株对真菌的感染 或非生物刺激( 如紫外辐射) 有关“。它是含有芪类结构的非黄酮类多酚化合物， 其分子式为c 。0 。相对分子质量为2 2 8 2 5 ，具有顺式和反式两种结构，为白色针 状晶体( 工业上白藜芦醇产品一般为淡黄色粉未) ，熔点为2 5 6 2 5 7 ，升华点为 2 6 1 ，易溶于乙醚、氯仿、甲醇、乙酵、丙酮、乙酸乙酯等有机溶剂。白藜芦醇 的热稳定性较差：7 0 8 0 。c 下加热3 0 m i n ，有部分分解；有很强的光敏性，见光极 易分解、转化，完全避光时，反式体可在乙醇中稳定数月，但在p h 1 0 时稳定性 略差，顺式体只在中性条件下稳定。g o l d b e r g 等报道将反式自藜芦醇的标准溶 液置于2 5 4 n m 、强度9 9 0 t lw c m 2 的紫外光条件下l o m i n ，可以使大约7 0 的反式白藜 芦醇转化为其同分异构体”“。在自然界中，白藜芦醇主要存在于葡萄、虎杖、花 生、桑椹、买麻藤、朝鲜槐等植物中，尤其在种皮中含量较高。其存在形式主要 2 湖北工业大学硕士学位论文 有四种：反式白藜芦醇、顺式白藜芦醇以及反式白藜芦醇糖苷( p i c e i d ) 、顺式白 藜芦醇糖苷，主要以反式形式存在，其糖苷体能够在人体肠道中糖苷酶的作用下 释放出自藜芦醇。其反式异构体的生理活性强于顺式异构体，单体强于糖苷。白 藜芦醇苷为白色针状晶体，难溶于水，微溶于乙醚，能溶于乙醇、丙酮、乙酸乙 酯等，遇氨水反应显红色，遇醋酸镁的甲醇溶液反应显粉红色。白藜芦醇及其糖 苷体的结构式为： ( 、1 1 r - h内营严醇 r = 髓毒辕 ! ；! 曩芦辨髓萄营 图1 1 反式白藜芦醇及其糖苷的结构式 r i g 1 1c h e m i c a ls t r u c t u r eo f t r a n s - r e s v e r a t r o la n dt r a n s p i c e i d 1 2 2 白藜芦醇的生理功能” 1 2 2 1 影响脂类及花生四烯酸代谢、抗血小板凝集和抗炎、抗过敏作用 1 2 2 2 抗血栓作用 1 2 2 3 抗动脉粥样硬化和冠心病、缺血性心脏病、高血脂症的防治作用 1 2 2 ，4 抗氧化、清除自出基的作用 1 2 2 5 抑制肿瘤的作用“3 1 。2 3 白藜芦醇的提取方法 1 ，2 3 1 从天然植物中提取 1 2 3 ，1 1 有机溶剂提取自攀芦醇 由于白藜芦醇属于中等极性化合物，故常采用乙醇、甲醇、乙酸乙酯的水溶 液进行提取。姚宝书“1 等以葡萄皮渣为原料，筛选出乙酸乙酯为提取剂，所得粗 提取液是以白藜芦醇为主成分的多羟基芪类物质，经硅胶柱富集纯化，得到顺、 反白黎芦醇及顺、反自藜芦醇苷。张敏”等以虎杖为原料，乙醇的水溶液为提取 剂，并以超声波振荡、微波处理等方法辅助提取确定了白黎芦醇的最佳提取条 件。t i m o t h y “”等用8 0 的乙醇提取去皮花生中静自婺芦醇，并通过气楣色谱一质谱 湖北工业大学硕士学位论文 ( g c m s ) 对提取物进行定性分析，高效液相色谱( h p l c ) 对不同花生品种中白藜 芦醇的含量进行定量分析。 1 2 3 1 2 碱溶酸沉法提取白藜芦醇 由于白婪芦醇的酚羟基较少，在水中的溶解度较小，而在定条件下它可以 和某些无机碱、碱性赫形成酚盐而增加其在体系中的溶解度，通过调节体系的p h 值，白藜芦醇将重新沉淀出来，故可通过碱溶酸沉的方法来富集提取白藜芦醇。 苏文强1 等采用碱性水溶液提取、调节溶液p h 沉降的方法，从虎杖中提耿自藜芦 醇，并考察了碱的种类、用量以及酸的种类、用量对提取效果的影响，确立了白 藜芦醇的碱溶酸沉最佳提取条件。 1 2 3 1 3 超临界萃取法提取自藜芦醇 曹庸”7 1 等采用超临界c o ：流体技术对虎杖中的白藜芦醇进行萃取，获得了初步 萃取条件：萃耿釜压力2 5 m p a ，温度5 0 ；解析釜蕊力5 7 m p a ，温度4 6 。c ，用h p l c 对萃取物进行白藜芦醇的含量测定。 1 2 3 2 化学合成 化学合成白藜芦醇十分困难，步骤复杂且需要较高的成本，而得率不高。目 前，国内对这一方法的研究还比较少。李晓光等”以3 ，5 - z 甲氧基苯甲醛和对甲 氧基苄基溴( 可由对甲氧基苯甲醛为原料制得) 进行w i t l i n g 反应、顺反异构化 和去保护基三步反应，分离提纯，制得9 8 的自藜芦醇。 1 2 3 3 利用细胞培养技术 西北大学生命科学院论证了植物组织培养生产自藜芦醇的方法在理论上的可 行性：白藜芦醇的生产不受季节的限制，可以人为地影响或控制植物组织的生长 周期。在此基础上，郭斌等1 利用h e n e 激光辐照用根癌农杆菌株感染过的葡萄皮 脱皮化组织，进行诱变处理，通过继代选育得到了遗传性状稳定、生长迅速、生 长周期短、高产白藜芦醇的优良细胞系。利用大规模的植物细胞悬浮培养技术生 产自藜芦醇，不但可以大大降低生产成本、提高产品品质，同时也为白藜芦醇产 业化提供了新途径。 1 2 4 白藜芦醇的检测方法 1 2 4 ，1 定性检测 通常采用红外光谱对自藜芦醇进行定性检测，所得到的白藜芦醇红外图谱在 3 3 5 0 c m - 。处有酚羟基吸收峰，在1 6 2 0 c r n 、1 5 4 0 c r 】。、1 5 0 0 c m “处有苯环吸收峰，在 4 湖北工业大学硕士学位论文 9 6 5 c m l 处有反式一c = c 一特征吸收峰，7 0 0 c m “处为顺式- c = c 一的特征吸收。出此可判 断白藜芦醇的结构。“”。 也可将样品的测定和标准样混合液交叉进行，和标准样的出峰时问进行比较 来加以定性。 同时白藜芦醇具有一些特征颜色反应。，可以定性检测样品中是否含有白藜 芦醇。将适量反式白藜芦醇的甲醇溶液加入不同试剂或者进行光照实验，其颜色 反应如表1 一l ： 表1 1 特征颜色反应结果 t a b l e1 - 1c h a r a c t e r i s t i cr e a c t i o n so fr e s v e r a t r o lo nc o l o r s 1 2 4 ，2 定量检测 定量检测的方法主要有：高效液相色谱、气相色谱、色谱质谱法、二次微分 简易示波伏安法等。在色谱法中常用荧光检测器或紫外一可见光检测器对物质进行 定量分析。 1 ，2 4 2 1 高效液相色谱法 高效液相色谱法是目前对白藜芦醇进行定量分析所使用的最广泛的方法，具 有灵敏度高、重现性好、结果可靠等优点。不仅可以用于葡萄中自藜芦醇的定量 检测，而且可以用于葡萄酒中自藜芦醇的定量检测。而由于白藜芦醇的顺、反异 构体具有不同的吸收光谱，所以其顺、反异构体具有不同的线性，故在用高效液 相色谱进行定量时，需要顺、反异构体豹两个标准样品”。韩雅珊。“1 等采用p b o n d a p a kc 。色谱柱测定1 1 种圈产葡萄酒中自婪芦醇的含量，以体积分数为4 0 的乙腈为流动相，紫外3 0 6 r i m 检测，反式白藜芦醇和顺式自藜芦醇的保留时间分 别为7 7 m i n 和8 9 m i i 1 ，回收率9 0 0 9 7 8 ，最小检出限1 0 0 ug l ，白藜芦醇 的质量浓度从i 0 0ug l 。到9 2 0 0pg l 不等。周建军。”1 等采用h p l c 法直接测定 汉中地区虎杖中白藜芦醇苷及苷元的含量，色谱柱为e c l i p s e x d b 巴柱，流动捆为 乙腈一水，流速l m l m i n ，检测波长为3 0 3 n m ，测得虎杖中白藜芦醇苷的含量为2 5 ， 自藜芦醇的含量为0 4 3 。 湖北工业大学硕士学位论文 1 2 4 2 2 色谱质谱法 气相色谱是很好的分离装置，但不能对化合物定性，且只能对葡萄等植物中 的白藜芦醇进行分析，而不适合于葡萄酒中自藜芦醇的定量分析。”；质谱仪是很 好的定性分析仪器，但要求纯样品，而将气相色谱、质谱联用就可分离、鉴定同 时进行。故气相色谱质谱法对混合物的分析是很理想的方法，它能同时定量检测 葡萄酒中的顺、反式白藜芦醇。马亭。”1 等用反向c 。固相萃取小柱对葡萄酒进行预 处理，然后用b s t f a 硅烷化试剂对萃取物进行了衍生化处理，用气相色谱质谱对 葡萄酒中顺式、反式白藜芦醇同时进行测定，并建立了定量分析方法。曾早。”1 等 从中药虎杖中提取白藜芦醇，并用液相色谱质谱分析提取物并比较其化学成分： 1 2 4 2 3 高效液褶色谱一电化学法( r p - h p l c e c d ) 陈新。州等用反相高效液相色谱一电化学检测方法，测定红葡萄酒中的顺式和反 式白藜芦醇。用c 。柱( 2 5 0 4 6 m m ，5 pm ) 作为分析柱，流动相为2 0 m m 0 1 l 柠檬酸 钠( p h 4 0 ) ；甲醇( 5 0 ：5 0 ) ，柱温3 5 。c ，流速l m l m i n ，电化学检测器工作电压0 7 5 v ， 最低检测限为5 n g m l ，线性范围为l o 5 0 0 0 n g m l ，顺式和反式白黎芦醇重复5 次进样的相对标准差( r s d ) 分别为3 5 2 和3 1 6 。该方法简便、快速、重复性好， 适用于食品及生物样品中自藜芦醇含量的分析。 i 2 4 2 4 二次微分简易示波伏安法 张宏芳”等在0 2 m o l lk o h 介质中，用二次微分简易示波伏安法测定了葡萄 酒中自藜芦醇的含量。校正曲线的线性范围为2 1 0 5 1 0 。；m o l 。，检出限为 l l o 。6 m o l l ，对2 ，5 x1 0 一m 0 1 l 白藜芦醇的相对标准偏差为1 9 ( n = 6 ) 。该法 具有仪器装置简单、操作简便、分析速度快等优点。而且由于白藜芦醇的顺、反 异构体示波特性相同，所以利用此法测定白藜芦醇的总量时，只需反式( 或顺式) 的标准样即可。 1 3 原花色素的研究进展 1 3 1 原花色素的结构、性质 原花色素( p r o c y a n i d i n s 简称p c ，又称原花青素，其使用过的英文名称有 p r o a n t h o c y a n i d i n 、p y c n o g e n o l 等) 是植物界中广泛存在的一大类多酚类化合物， 是黄烷一3 一醇衍生物的总称，广泛存在于各种水果的皮、核、梗以及草柑、可乐果 树、黑荆树等植物中”。它是由儿茶素、表儿茶素( 分子量为2 9 0 ) 聚合而成，包括 一聚体、三聚体、四聚体、赢至十聚体。其中二到四聚体称为低聚体，五聚体以 6 湖北工业大学硕士学位论文 上的称为高聚体，其低聚体的活性要高于高聚体。低聚原花色素为红棕色无定 形粉术，能很好地溶于丙酮、乙酸乙酯、乙醇、冰醋酸，不溶于苯、氯仿、石油 醚等。其结构中引入的羟基越多，在水中的溶解度越大，而羟基甲基化后，则增 加其在有机溶剂中的溶解度”。原花色素具有较强的热敏性，它的热稳定性略好 于白藜芦醇；原花色素二聚体结构式为： 。磷擘： 蛰 1 图卜2 原花色素二聚体结构式 f i g 1 - 2c h e m i c a l s t r u c t u r eo fp r o c y a n i d o l i cd i m e r 1 3 2 原花色素的生理功能”1 1 3 2 1 抗氧化活性和清除自由基的作用” 1 3 2 2 保护心血管和预防高血压“1 1 3 2 3 抗突变作用“” 1 3 2 4 抗肿瘤作用“” 1 3 2 5 抗炎、抗过敏作用 1 3 2 6 抗辐射作用” 1 3 2 7 皮肤保健和美容作用 1 3 2 8 改善视力作用 1 3 3 原花色素的提取方法 1 。3 3 ，1 有机溶剂萃取法 这是最常用的一种提取原花色素的方法，主要用有机溶剂( 如乙醇、甲醇、 丙酮等) 提取植物原料中的原花色素，然后通过大孔吸附树脂层析进行精制纯化。 如赵文恩m 1 等用6 0 的甲醇从葡萄皮渣中提取原花色素，并用大孔吸附树脂进行纯 化。 1 3 3 2 沉淀法 吕丽爽。”1 等采用石油醚脱脂的干葡萄籽为原料以乙酵为溶剂热提取后，通 过调节溶液p h 除去蛋自质，再用乙酸乙酯萃取粗提物中的原花色素等物质，最后 湖北工业大学硕士学位论文 用石油醚沉淀乙酸乙酯相中的原花色素，使产品得以纯化。 1 3 3 3 超临界萃取法 孙传经“”等采用超临界二氧化碳萃取法从葡萄籽中提取葡萄籽油和原花色素 低聚物。此方法的优点是无溶剂残留，且提取过程在低温下进行，活性物质的损 失很小，但成本较高。 1 3 4 原花色素的检测方法 1 3 4 1b a t e s m i t h 法“ 其原理是，原花色素在稀酸的作用f ，单体与单体之间的c e 键首先断裂，。 形成中间产物i 、i i ，然后脱去产物i i 中c ：位上的h ，从而形成花青素，花青素在 5 5 0 n m 处有最大吸收峰，利用比色法测定反应液5 5 0 h m 处的吸光值，通过计算公式 或和标准品进行对照得出原花色素的含量。通过计算公式得出的含量是用原花色 素指数来表示的，该法测定的只是原花色素的相对值。具体方法是：取适量提取 物，用甲醇溶解，定容于l o o m l ，取l m l 加入l o m l 的比色管中，加6 m l 盐酸一币丁 醇( v v ，5 9 5 ) ，在9 7 1 下反应4 0 分钟后，驳出迅速冷却，在5 5 0 n m 处测定其 吸光度，以甲醇代替提取液做空白。绘制原花色素标准品的标准曲线，通过对照 标准曲线，能够得出原花色素的准确含量。原花色素指数的计算公式为( a 为吸光 度。w 为样品的质量( g ) ) ： 原花色素指数= a 7 0 w l4 i 2 基l m 话0 8 0 6 釜o o z 0 珊瑚6 0 d 瓷k 【) 图l 一3 花青素的紫外吸收图谱 f i g 1 3u vs p e c t r u m o fc y a n i d i n s 1 3 4 2p o r t e r 法 其原理$ 口b a t e s m i t h 法相同，原花色素在稀酸的作用下形成花青素，花青素 在5 4 6 n m 处有最大吸收峰，利用比色法测定反应液5 4 6 n m 处的吸光值，通过p o r t e r 法计算公式或和标准品进行对照得出原花色素的含量。定量的过渡余属离子， 湖北y - 业大学硕士学位论文 如c u 、m n ”、f e ”、f e3 + 等离子或醌类如对一苯醌、o 一萘醌、9 ，1 0 - 葸醌等氧化荆 的存在能够促进反应的进行，但过量的醌类及m n “、c u ”会降低吸光值，采用铁盐 较为适合，尤其是三价铁盐，如硫酸高铁铵，此方法是b a t e s m i t h 法的改进，是 在b a t e s m i t h 法的基础上，添加o ，2 m l 2 ，o 的硫酸铁铵( 用2 m o l 的盐酸溶解) ， 以增加反应程度及颜色的稳定性。p o r t e r 法不能区分测出的是何种原花青素，所 以若测出的值较大，则该产品可能是低聚体原花色素含量较多，也可能是单体和 高聚体原花色素含量较多。按下式计算原花色素的含量( a # b 吸光度，w 为样品的质 量( g ) ) ： 原诧色素含量( ) = ( a 2 5 x7 2 ) ( w 0 3 6 6 ) 1 0 0 13 4 3 紫外分光光度法 由于原花色素在2 8 0 n m 处有最大吸收峰，故傅武胜。”等用紫外分光光度法， 通过制作标准曲线来测定原花色素的含量。由于很多物质在2 8 0 n m 处有吸收，此 方法所测得的结果和实际值相比将会有所偏高，故此方法只适合于测定较纯提取 物中原花色素的含量。但由于此法简便、易操作，故工业上常采用此方法测定原 花色素的纯度。 瓤0 撷 姗 2 8 0 2 6 0 2 4 0 i n 曲v 口h n ( o 图1 4 原花色素的紫外吸收图谱 f i g 1 - 4u vs p e c t r u m o fp r o c y a n i d i n s 1 3 4 ，4 香草醛法” 将待测样品配制成0 1 9 l l 的甲醇溶液，取其i m l 移入2 5 m l 的比色管中，依 次加入6 m l 浓度为4 o g l o o m l 的香草醛甲醇溶液和3 m l 浓盐酸( 另外，也可用 6 m 0 1 l 的硫酸代替浓盐酸，缓缓加入到反应体系中) ，加塞摇匀，在2 0 1 避 光条件下反应1 5 h 后，于5 0 0 n m 处测其吸光度。”，以甲醇代替样品溶液作为空白 对照，用儿茶素标准他线计算样品中原花色素的含量。 1 4 研究的目的及意义 湖北工业大学硕士学位论文 1 4 1 采用有机溶剂，在超声波条件下提取白藜芦醇、原花色素，并通过柱层析 精制、纯化，获得纯度较高的白藜芦醇及原花色素。以期用于保健食品、药品、 化妆品等的添加剂或主要成分。 1 4 2 白藜芦醇、原花色素具有很多重要的生理功能，最主要表现在抗癌作用和 抗心血管疾病等方面，因此国内外有多家科研机构在对其进行研究，其功能只要 体现在保健食品、药品、化妆品等方面。据有关资料报道，美国农业部专家证实， 白藜芦醇在花生红衣中含量丰富，含量为2 5 7 m g l o o g ，而多酚类物质总的含量达 到1 5 ，可见，花生是提取这些物质的极好材料。而花生资源在我国极其丰富，因 此我们选择花生红衣作为原料，从中提取白藜芦醇，并优化提取工艺。由于在花 生蛋白粉、蛋白酱生产厂中有大量的废弃红衣有待开发利用，另外，花生红衣中 含有大量的原花色素和止血特效成分( 维生素k ) ，可提高产品的附加值，因而研究 从花生及红衣中提取自藜芦醇、原花色素的可能性，合理、有效地利用花生资源 及花生制品厂的副产品资源将具有深远的意义及良好的经济效益，对今后，1 ：发相 关的保健产品具有现实意义。 1 4 3 天然活性物质的提取，其关键在于先进的提取工艺的采用和产物质量的控 制，这就需要有简单、快速、准确的提取检测方法。因此，我们在实验中采用紫 外、可见分光光度法、高效液相色谱等检测方法及超声波辅助萃取的技术，对提 取工艺进行了优化选择。 1 5 本课题研究的主要内容 1 5 ，1 花生红衣中白藜芦醇、原花色素提取工艺研究 1 5 2 花生红衣提取物中白藜芦醇、原花色素分离纯化工艺研究 1 5 3 白藜芦醇、原花色素抗氧化、清除自由蒸性能的研究 1 0 湖北工业大学硕士学位论文 i i 第2 章花生红衣中自藜芦醇、原花色素提取工艺研究 日前，国内外提敬白藜芦醇的工艺大多以葡萄皮渣、虎杖等植物为原料，先 将原料进行预处理( 清理、干燥、粉碎、过筛) ，用有机溶剂( 如甲醇、乙醇、乙 酸乙酯等) 进行浸提或回流萃取，经过滤后将滤液浓缩干燥，即得白黎芦醇粗品， 经层析分离、提纯可得纯度较高的白藜芦醇产品。产品经制备型h p l c 提纯可获得 纯度达9 9 的白藜芦醇。 2 0 世纪8 0 年代以前，提取原花色素的原料主要是法国海岸松树皮。此后，人 们主要从含量更丰富的葡萄籽中提取。目前，提取原花色素较常见的原料是葡萄 “、高粱”3 1 、菜籽“”等植物。较常用的提取方法是有机溶剂提取法，提取液经柱 色谱层析分离得以纯化。t 从天然植物中提取白藜芦醇、原花色素的传统方法中，浸提所需的时问较长， 溶剂用量大，提取效率不高；而回流所需的温度较商，易造成活性成分的分解或 挥发，对热稳定性较差的白藜芦醇、原花色素的提取工艺不利。相对于这些传统 的提取方法，用超声波技术辅助提取具有较多的优点，超声波因其频率高、方向 性强、穿透力大，近年来，人们常采用超声波技术提取植物中的生物碱、黄酮、 多糖、皂甙、蒽醌、香豆索等生物活性物质“”“，结果都表明超声波强化提取比 常规提取法费时少、得率高，丽化学成分与常规法相比并没有变化。超声提取原 理是利用超声波产生的强烈振动、空化效应、粉碎等作用”7 。”，将植物药材中所 含成分提取到溶剂之中。超声波是一种强的弹性波“，其振动能产生强大的能量， 给媒质质点以很大的速度和加速度，将植物体快速穿透8 ”，使溶剂能和植物中的 有效成分充分接触，有利于有效成分向提取溶剂转移，提高提取效率。同时，花 生资源在我国极其丰富，利用花生制品厂的副产品资源花生红衣柬提取其中 的天然活性成分，具有良好的经济效益及深远的意义。 本实验采用超声波辅助有机溶剂提取花生红衣中的活性物质白藜芦醇和原花 色素，对提取条件进行了系统、全面的研究：对溶剂种类、固液比、提取温度、 溶剂浓度、提取时间、提取次数、溶液p f 进行了考察。在单因素实验的基础上， 通过难交实验优化提取条件。通过寻找最佳提取参数，不仅可以更有效更经济地 提取出有效成分，还将为以后进一步富集纯化有效成分、制备高质量的精制产品 奠定基础。 湖北工业大学硕士学位论文 2 1 材料与方法 2 1 1 材料与仪器 原料：花生红衣一山东鲁花4 号( 山东青岛淳会植物油有限公司) 花生红衣中白藜芦醇的含量为2 7 9 m g 1 0 0 9 ，h p l c 检测 花生红衣中原花色素的含量为4 9 5 ，p o r t e r 法检测 试剂：无水乙醇、无水甲醇、石油醚、乙酸乙酯( 均为分析纯) 仪器：s b 一5 2 0 0 d 型超声波清洗器( 宁波新芝生物科技股份有限公司) r e 5 2 c s 型旋转蒸发器( 上海亚荣生化仪器厂) w f g 7 2 0 0 型可见分光光度计( 尤尼柯上海仪器有限公司) c a r y5 0 型紫外分光光度计( 美国v a r i a n 仪器公司) p r o s t a r 高效液相色谱仪( 美国v a r i a n 仪器公司) 2 1 2 提取、分离工艺路线 l 有机溶剂l 回收溶剂i 土 工 i 堡型匦丝堡，i 竺墨望皇鲨查塑堡坠l 茔塑驾 菰主；i 磊 工 区磊圈奎兰坚堕望塑堡竺叵高丽习 图2 1 提取分离工艺路线 f i g 2 1t e c h n o l o g y m e t h o do fe x t r a c t i o na n ds e p a r a t i o n 花生红衣白藜芦醇、原花色素提取、分离纯化工艺路线如图2 1 ：将花尘红衣 进行选择、清理后，低温干燥，用万能快速粉碎机粉砰后，过5 0 目筛，得到实验 原料。称取一定量的原料，用石油醚脱脂，除去石油醚相后，以一定的固液比加 湖北工业大学硕士学位论文 入有机溶剂进行超声波水浴提取，经过滤后，低温减压浓缩提取液并回收溶剂， 浓缩液用乙酸乙酯进行萃取，乙酸乙醅层经真空浓缩( 4 0 以下) 至二f 后，用甲 醇溶解并定容。测定甲醇液在3 0 5 n m 处吸光值，以a ：。表示白藜芦醇的相对含量； 用p o r t e r 法测定原花色素的含量，含量以。表示。通过比较，确定最佳实验条 件。分离纯化工序采用柱层析法，眺大孔吸附树脂为填料，实验方法将在下一章 进行介绍。 2 1 ，3 测定方法 2 1 3 1 白藜芦醇含量的测定 由于白藜芦醇在紫外3 0 5 n m 处有最大吸收峰1 ，且吸光度和浓度成正比的关 系，故选择紫外分光光度法来测定自藜芦醇粗产品的相对量。用高效液相色谱测 定白藜芦醇的精确含量“，测定条件：固定相：c 。柱( 2 0 0 5 ) ；流动相：乙 腈水( 2 5 ：7 5 ) ；流速：0 8 m l m i n ；检测波长：3 0 5 n m 。 提取得率( ) = 提取的白藜芦醇产品质量( g ) 原料质量( g ) x 1 0 0 2 1 3 2 原花色素含量的测定 采用p o r t e r 法“”测定原花色素的含量。 提取得率( ) = 提取的原花色素产品质量( g ) 原料质量( g ) x 1 0 0 2 1 4 影响提职效果单因素的探讨 2 1 4 1 提取剂的选择 以水、乙醇、甲醇、乙酸乙酯、丙酮等5 种溶剂做提取剂，相同条件下对花 生红衣进行提取、过滤、浓缩定容，测定吸光值，进行比较，确定适宜提取剂。 2 1 4 2 料液比对提取效果的影响 准确称取2 0 0 9 花生红衣粉末5 份，经石油醚脱脂后，弃去石油醚，分别加 入8 0 m l ，l o o m l ，1 2 0 m l ，1 4 0 m l ，1 6 0 m l 浓度8 0 的乙醇溶液，在6 0 c 、频率为2 5 k h z 的超声波水浴中，以一定的转速搅拌提取3 0 m i n 。提取液经浓缩回收乙醇后，用乙 酸乙酯萃取，取乙酸乙酯层，于4 0 。c 下减压蒸馏至于，用甲醇溶解残留物，并定 容至2 5 m l 。测定其中白藜芦醇及原花色素的吸光值，比较料液比对提取效果的影 响。 2 1 4 3 乙醇浓度对提取效果的影响 准确称取2 0 o g 花生红衣粉术5 份经石油醚脱脂后，弃去石油醚，分别加 湖北工业大学硕士学位论文 入浓度5 0 ，6 0 ，7 0 ，8 0 ，9 5 的乙醇溶液1 0 0 m l ，在6 0 、频率为2 5 k h z 的超 声波水浴中，以一定的转速搅拌提取3 0 m i n 。提取液经浓缩回收乙醇后，用乙酸乙 酯萃取，取乙酸乙酯层，于4 04 c 下减压蒸馏至干，用甲醇溶解残留物，并定容至 2 5 m l 。测定其中白藜芦醇及原花色素的吸光值，比较浓度对提取效果的影响。 2 1 4 4 温度对提取效果的影晌 准确称取2 0 o g 花生红衣粉术5 份，经石油醚脱脂后，弃去石油醚，加入浓 度6 0 的乙醇溶液l o o m l ，分别在4 0 ，5 0 ，6 0 ，7 0 ，8 0 、频率为2 5 k h z 的超声波水浴中，