（外科学专业论文）胆管癌组织中pten、her2neu和pkb的表达及其意义.pdf

目录 一、摘要 中文论著摘要1 英文论著摘要2 二、英文缩略语4 三、论文 1 一j 。 刚舌5 材料与方法5 实验结果7 讨论8 结论1 0 四、本研究创新性的自我评价11 五、参考文献1 2 六、附录 综j 苤。1 4 致谢2 5 个人简介2 6 中文论著摘要 胆管癌组织中p t e n 、h e r 2 n e u 和p l 的 表达及其意义 目的 观察p t e n 、h e r 2 n e u 和p k b 在胆管癌组织中的表达，并探讨其与胆管癌发 生、发展的关系及其意义。 方法 应用免疫组织化学s p 法检测8 0 例胆管癌组织和2 4 例正常胆管组织( 取自其他 良性疾病行胆管切除者) 中p t e n 、h e r 2 n e u 和p k b 的表达。 结果 当日7 尺 胆管癌组织中p t e n 表达显著低于正常胆管组织( x 2 = 11 3 3 ，p = 0 0 0 1 ) ， h e r 2 n e u 的表达显著高于正常胆管组织( x 2 = 1 3 1 6 ，p = - 0 0 0 0 ) ，p k b 的表达显著 高于正常胆管组织( x 2 = 6 4 1 ，p = 0 0 1 ) 。p t e n 和h e r 2 n e u 蛋白表达呈明显负相 关( f 0 4 5 6 ，p - - 0 0 0 0 ) ；p t e n 与p k b 蛋白表达呈明显负相关( 产0 3 5 5 ，p = - 0 0 0 1 ) ； h e r 2 n e u 与p k b 蛋白表达呈明显正相关( r = o 3 7 4 ，p = 0 0 0 1 ) 。 结论 p t e n 表达的缺失和h e r 一2 n e u 过表达可能导致细胞增殖失控，与胆管癌的发生、 发展密切相关，二者均与p k b 呈相关性，提示二者均可能通过p 1 3 k - p k b 信号转导参 与胆管癌的发生发展。 关键词 胆管癌；p t e n ；h e r 2 n e u ；p k b ；免疫组织化学； 英文论著摘要 e x p r e s s i o no f p t e n 、h e r - 2 n e ua n dp k bi n c n o l a n g l o c a r c l n o m aa n dl t ss l l l n i l i c a n c e 1 o b j e c t i v e t oe x p l o r et h ee x p r e s s i o no fp t e n 、h e r - 2a n dp k bi nc h o l a n g i o c a l c i n o m aa n dt o i n v e s t i g a t e t h er o l eo ft h e i ra l t e r a t i o ni n t u m o r i g e n e s i s a n d p r o g r e s s i o n o f c h o l a n g i o c a l c i n o m a m e t h o d s w ed e t e c t e dt h ep t e n 、h e r - 2a n dp k bi n8 0c h o l a n g i o c a l c i n o m aa n d2 4n o r m a lb i l e d u c tt i s s u e sb yt h ei m m u n o h i s t o c h e m i s t r ys pm e t h o d r e s u l t s p t e ne x p r e s s i o ni nc h o l a n g i o c a r c i n o m aw a ss i g n i f i c a n t l yl o w e rt h a nn o r m a lb i l e d u e tt i s s u e s ( 搿= 11 3 3 ，p = 0 o o1 ) ，h e r - 2 n e ue x p r e s s i o nw a ss i g n i f i c a n t l yh i g h e rt h a n t h a ti nn o r m a lb i l ed u c tt i s s u e s ( x z = 13 16 ，p = 0 o o o ) ，a n dp k be x p r e s s i o nw a s s i g n i f i c a n t l yh i g h e rt h a nt h a ti nn o r m a lb i l ed u c tt i s s u e s ( x 2 = 6 4 1 ，p = 0 01 ) p t e na n d h e r - 2 n e up r o t e i ne x p r e s s i o nw a sn e g a t i v e l yc o r r e l a t e d ( r 一0 4 5 6 ，p = o 0 0 0 ) ；p t e na n d p k b p r o t e i ne x p r e s s i o nw a sn e g a t i v e l yc o r r e l a t e d ( r = - 0 3 5 5 ，p = 0 0 0 1 ) ；h e r - 2 n e ua n d p k bp r o t e i ne x p r e s s i o nw a sp o s i t i v e l yc o r r e l a t e d ( r20 3 7 4 ，p = o o o1 ) c o n c l u s i o n s l o s so fp t e ne x p r e s s i o na n dh e r - 2 n e uo v e r - e x p r e s s i o nm a yl e a dt ol o s so fc o n t r o l o fc e l l p r o l i f e r a t i o n ，a n d a l ec l o s e l yr e l a t e dw i t ht h eo c c u r r e n c e 、d e v e l o p m e n to f c h o l a n g i o c a r c i n o m a , b o t hw e r ea s s o c i a t e dw i t ht h ep k b ，s u g g e s t i n g t h a tt h e ym a yp a s st h e p 1 3 k p k bs i g n a lt r a n s d u c t i o np a t h w a yi n v o l v e di nt h eo c c u r r e n c ea n dd e v e l o p m e n to f c h o l a n g i o c a r c i n o m a 2 k e y w o r d s c h o l a n g i o c a r c i n o m a ；p t e n ；h e r - 2 n e u ；p k b ；i m m u n o h i s t o c h e m i s t r y ； 3 英文缩略语 4 论文 胆管癌组织中p t e n 、h e r 2 n e u 和p k b 的 表达及其意义 刖昌 胆管癌是起源于胆管上皮细胞的恶性肿瘤，近年来其发病率呈上升趋势【1 1 。胆管 癌恶性程度高、发展迅速，临床上难于早期发现；另外由于胆管癌所在解剖部位复杂 使得手术切除率很低；加上一般的放、化疗疗效不满意；所以胆管癌预后非常差。鉴 于胆管癌的上述特性，有必要对其发生、发展机制进行更深入的研究。 研究证实，p t e n ( p h o s p h a t a s ea n dt e n s i nh o m o l o gd e l e t e di nc h r o m o s o m e l o ，) 、 人表皮生长因子受体2 ( h u m a ne p i d e r m a lg r o w t hf a c t o rr e c e p t o r 2 ，h e r 一2 ) 和蛋 白激酶b ( p r o t e i nk i n a s eb ，p k b ) 在人类多种肿瘤，如神经胶质瘤、前列腺癌、子宫 内膜癌、黑色素瘤及胃肠道肿瘤、肝癌、胰腺癌、上皮性卵巢癌等【2 4 1 均存在表达的 异常，提示p t e n 、h e r 一2 n e u 和p k b 的改变与肿瘤的发生、发展有关。本研究旨在探讨 p t e n 、h e r - 2 n e u 和p k b 在胆管癌组织中的表达和三者在胆管癌发生发展中的关系及意 义。 资料和方法 一、资料 ( 一) 标本 收集中国医科大学附属盛京医院普通外科2 0 0 5 年1 月一2 0 0 8 年1 0 月住院并行 手术治疗的胆管癌患者资料，选择其中临床资料完整的胆管癌病例8 0 6 0 ，均经病理检 查确诊，术前均未放化疗。另收集同期2 4 例经病理证实的正常胆管组织标本( 取自 其他良性疾病行胆管切除者) 作为正常对照。标本均用1 0 甲醛溶液固定，石蜡包埋，4 um 连续切片。 ( 二) 主要仪器及试剂 兔抗人h e r 一2 n e u 多克隆抗体( d a k o u s a ) 、鼠抗人p t e n 单克隆抗体、s p 和d a b ( 购 自北京中杉金桥生物技术有限公司) ，鼠抗人p k b 多克隆抗体为s a n t ac r u z 公司产 品。 二、方法 ( 一) 所有标本均经石蜡包埋、切片，常规脱蜡，水化后经3 过氧化氢处理， 微波抗原修复，其余染色步骤按各试剂说明书分别进行p t e n 、h e r - 2 n e u 和p k b 免疫 组化s p 法检测。阴性对照以p b s 代替一抗作空白对照，阳性对照用己知阳性片为阳性对 照。 ( 二) 阳性结果判断 1 、p t e n 与p k b 蛋白结果判定：p t e n 蛋白多表达于胞浆少数表达于细胞核( 见图 1 ，3 ) ，阳性结果以细胞浆出现明显棕黄色颗粒为准，在放大4 0 0 倍的显微镜下观察， 随机计数1 0 个高倍视野，无阳性或阳性细胞 7 5 为( + + + ) ，+ 或+ + 视为p t e n 、p k b 过表达 阳性，+ + + 视为p t e n 、p k b 过表达强阳性。不以染色深浅作为判断阳性程度指标，以排 除一抗浓度、d a b 染色时间、标本保存时间等因素的干扰【5 1 。 2 、h e r - 2 n e u 结果判定：以细胞膜和细胞浆( 少数) 出现棕黄色颗粒( 见图2 ) 作为h e r 一2 n e u 阳性染色的判断标准，按照d a k o 3 标准进行染色强度分级：在放大4 0 0 倍的显微镜下观察，随机计数1 0 个高倍视野，阴性( 一) ：未着色或 1 0 9 6 的肿瘤细胞膜呈微弱的着色且仅为细胞膜的不完全着色：( + + ) ： 1 0 的肿 瘤细胞呈弱到中等强度的细胞膜完全着色：强阳性( + + + ) ： 1 0 的肿瘤细胞呈强的细胞 膜着色，+ 或+ + 视为h e r - 2 n e 过表达阳性，+ + + 视为h e r - 2 n e u 过表达强阳性： 三、统计学方法 采用s p s s l 3 0 软件包进行统计学分析，计数资料以x 2 检验和f i s h e r 精确概率 法进行统计分析，p t e n 、h e r - 2 n e u 和p k b 之间的相关性采s p e a r m a n 等级相关分析， 6 均以p 0 0 5 认定为有统计学意义。 实验结果 一、p t e n 、h e r - 2 n e u 和p k b 蛋白在胆管癌和正常胆管组织中的表达 p t e n 蛋白在胆管癌组织阳性表达率为4 0 0 0 ，正常组织阳性表达率为7 9 1 7 ， 两者存在显著性差异( x 2 = i i 3 3 ，p = 0 0 0 1 ) ；h e r 一2 n e u 蛋白在胆管癌组织阳性表 达率为7 3 7 5 ，正常组织阳性表达率为3 3 3 3 ，两者存在显著性差异( x 2 = 1 3 1 6 ， p = 0 0 0 0 ) ；p k b 蛋白在胆管癌组织阳性表达牢为8 0 0 0 ，正常组织阳性表达率为 5 4 1 7 ，两者存在显著性差异( x 2 ：6 4 1 ，p = 0 0 1 ) 。( 见表1 ) 二、p t e n 、h e r - 2 n e u 和p k b 蛋白在胆管癌组织中表达的相关性 p t e n 和h e r 一2 n e u 表达存在显著的负相关( r 一0 4 5 6 * * ，p = 0 0 0 0 ) ；p t e n 和p k b 表达亦存在显著的负相关( r 一0 3 5 5 * * ，p = 0 0 0 1 ) ；h e r - 2 n e u 和p k b 表达则存在显 著的正相关( r = 0 3 7 4 * * ，p = 0 0 0 1 ) 。( 详见表2 ) 图1 ，p t e n 在胆管癌组织中表达( 4 0 0 倍)图2 ，胆管癌组织中h e r - 2 表达( 4 0 0 倍) 7 图3 ，胆管瘸组织中p k b 表达( 4 0 0 倍) 表1 1 日、；：e - 2 n e 帅p l 【b 蛋白在胆管癌组织及正常组织的表达率 p i e n l 矩r - 2 n e u嘞 组型n 阴性阳性x 2p 阴性阳性x 1 2p 阴性阳性xx 2p - i - 卫上 j t 止鬲强2 451 97 9 1 71 1 。3 3 0 叩l1 683 3 3 3 1 3 。1 60 。0 0 01 l1 35 4 1 76 。4 l0 0 1 病例组8 04 8 3 24 0 0 02 15 97 3 51 66 48 0 0 0 ! 堕堡坠2 纽盟旦 l 碌- 7 n e u 阴性田性强阳性台计 珊 阴性阳性强阳性合计p t 日阴性阳性强阳性合计 阴性4 t1 02 1 阴性5651 6 阴性71 03 14 8 掰性 2 0352 8 阳性 1 5452 4 阳性2851 5 强阳性 2 452 3 1强隈性11 82 14 0 强阳性t641 7 合计 4 81 5 l t8 0合计 2 12 83 18 0 合计 1 6 2 4 4 08 0 r = - - 0 4 5 6 * * p - 0 。0 0 0r = - 0 。3 t 4 l lp = 0 叩1r ：- 0 3 5 5 * * p = - 0 。0 0 1 讨论 癌基因和抑癌基因的表达失常或失衡所导致的细胞信号转导紊乱、细胞无控增殖 在肿瘤的发生、发展和转归上具有关键性作用。如前所述，大量研究表明，抑癌基因 p t e n 、癌基因h e r - 2 n e u 在多种肿瘤中均有异常表达，并且在调节肿瘤细胞生长、分 化、侵袭转移和肿瘤血管新生等各方面均有重要作用【7 ，引。另一方面，细胞信号转 8 导通路紊乱是肿瘤细胞的重要牛物学特性之一，其中三磷酸肌醇激酶蛋白激酶b ( p 1 3 k p k b ) 信号转导通路在维持细胞恶性生物学特性中起着重要作用【9 】。 p t e n 是迄今为止发现的第一个具有磷酸酶活性的抑癌基因，定位于人染色体 1 0 q 2 3 1 0 】，其表达产物是p1 3 k p k b 信号转导通路上的关键蛋白。f u m a r i 等在对脑胶 质瘤细胞系的研究中也发现外源性野生型p t e n 能显著抑制脑胶质瘤细胞系的生长 【1 。p t e n 基因缺失和突变率非常高，在人类多种肿瘤中均有p t e n 杂合性丢失或突变 致畸失活，如在神经胶质瘤、子宫内膜癌、前列腺癌、在乳腺癌、卵巢癌、肾细胞癌、 甲状腺癌、淋巴瘤、肝细胞癌，肺癌等多种恶性组织中均有p t e n 表达的不同程度下降 【1 2 1 。本研究结果显示，p t e n 蛋白在胆管癌组织中表达显著低于在正常胆管组织，提 示胆管癌的发生发展过程中同样可能存在p t e n 基因的突变或杂和性缺失。 h e r 2 n e u 基因则位于人染色体1 7 q 1 2 2 1 3 的一种细胞癌基因，主要参与细胞 的分裂和生长，于胚胎发育时期开始表达，成年后正常组织中仅可检测到少量的 h e r 2 n e u 基因。在正常情况下该基因处于非激活状态，其编码产物是具有酪氨酸酶 活性的细胞跨膜糖蛋白( p 1 8 5 ) ，其在某些肿瘤的细胞信号转导中起着重要作用，是 肿瘤细胞生长、分化的重要调节因子【1 3 l 。目前认为h e r 2 n e u 主要通过对细胞转导 通路的影响来参与细胞的增殖、分化、迁移、粘附、转化与凋亡，使细胞增殖加快， 周期加速，使细胞呈现恶性表现。一些究研认为h e r 2 的过表达与临床进展相关系， 认为它是决定患者牛存期的独立因素，并且有人认为血清h e r 2 蛋白水平是复发后 预期存活的最强因素【8 ，1 4 1 。本实验研究结果显示，h e r - 2 n e u 蛋白在胆管癌组织表达 名显高于正常胆管组织；表明h e r 2 蛋白过表达同样与胆管癌发生、发展密切相关。 p k b 是一个分子量约6 0 k d 的蛋白，是一类调解细胞凋亡存活的胞浆信号转导 蛋白【1 5 】，其在多种细胞中充当抗凋亡信号激酶的作用，参与调控细胞内若干程序信 号转导，介导肿瘤发生发剧1 6 】，因此p k b 被认为是一个潜在的癌基因。细胞外生长 信号通过p 1 3 k 作用产生p i p 3 ( 磷脂酰肌醇3 ，4 ，5 三磷酸) ，后者激活p k b 从而启动一 系列与细胞凋亡、细胞周期调控、端粒酶活性、血管生成、细胞亲信迁移相关的程序 1 7 - 1 9 ，此信号转导通路即为p 1 3 k p k b 信号转导通路。本实验研究结果显示胆管癌组 9 织中p k b 蛋白明显高表达并与p t e n 、h e r 一2 表达均显著相关，表明p t e n 、h e r 一2 亦可 能通过p 1 3 k p k b 信号转导通路参与胆管癌的发牛、发展。有研究表明，p t e n 可催 化p i p 3 和p l p 2 去磷酸化，进而抑制p k b 的活性，p t e n 突变则可引起p k b 活性增 强口0 1 。h e r 2 n e u 的激活多表现为野生型基因的扩增和过表达，其激活后则可引起下 游蛋白磷酸化而激活多条通路，主要有r a s r a f m a p k 、p 1 3 k p k b 和c a m p 等。 h e r - 2 n e u 的激活可以活化p 1 3 k ，在细胞膜内生成p i p 3 与p i p 2 ，进而与p k b 相互 作用介导细胞分化、迁移、存活、凋亡。 结论 本研究结果表明p t e n 、h e r 一2 n e u 和p k b 与胆管癌的发生、发展密切相关，并 提示肿瘤的发生是多种癌基因活化与抑癌基因失活共同作用的结果。检测胆管癌中不 同基因的表达，对判定胆管癌的恶性程度、侵袭性以及评价预后具有重要意义，同时 或可为胆管癌的靶向药物治疗提供新的靶点。 1 0 本研究创新性的自我评价 虽然国内已有p t e n 、h e l 0 2 n e u 和p k b 与胆管癌的相关研究，但本实验首 次将三个因子结合，探讨它们的关系。 参考文献 lk h a ns a ，t h o m a sh c ，d a v i d s o nb r ，t a y l o rr o b i n s o ns d ( 2 0 0 5 ) c h o l a n g i o c a r c i n o m a l a n c e t 3 6 6 ( 9 4 9 3 ) ：1 3 0 3 - 1 31 4 2x ug ，z h a n gw ，b e r t r a mp ，e ta1 p h a r m a c o g e n o m i cp r o f i l i n go ft h ep 1 3 k p l t 日、l - a k t - m t o r p a t h w a yi nc o m m o nh u m a nt u m o r j i n tjo n c o l ，2 0 0 4 ，2 4 ( 4 ) ：9 0 1 - 9 0 8 3k a n a m o ny ，k i g a w aj c o r r e l a t i o nb e t w e e nl o s so fp t e n e x p r e s s i o na n da k tp h o s p h o r y l a t i o ni n e n d o m e t r i a lc a r c i n o m a c l i n , c a n c e rr e s ，2 0 01 ，7 ( 4 ) ：8 9 2 4 c h a n gf ，l e ej t ，n a v o l a r f i cp m ，e t a 1 i n v o l v e m e n to fp 1 3 k a k t p a t h w a y i nc e l l c y c l e p r o g r e s s i o n , a p o t o s i s ，a n dn e o p l a s t i ct r a n s f o r m a t i o n ：at a r g e tf o rc a n c e rc h e m o t h e r a p yl e u k e m i a , 2 0 0 3 ，1 7 ：5 9 0 5 庞宗国，步宏c e r b b 2 基因在乳腺癌中研究进展阴中华病理学杂志，2 0 0 0 ，2 9 ( 4 ) ：3 1 3 6s u nl i t h ee x p r e s s i o na n dr e l a t i o n s h i po fp t e na n dh e r - 2 n e ui nt h et i s s u eo fo v a r i a nc a n c e r 【j 】 j o u r n a lo fp r a c t i c a lo n c o l o g y ，2 0 0 8 ，2 2( 3 ) ：2 2 9 2 3 2 7m u r e rg l ，l i nm c ，f i t z g e r a l dj t ，e ta 1 2 0 0 0 ) a l t e r e dp t e ne x p r e s s i o na sad i a g n o s t i cm a r k e rf o r t h ee a r l i e s te n d o m e t r i a lp r e c a n c e r s jn a t lc a n c e rl n s t9 2 ：9 2 4 - 9 3 0 8 k r u g e rs ，w e i t s c hg , b u t t n e rh ，e t a i h e r - 2o v e r e x p r e s s i o ni nm u s c l e - i n v a s s i v ec a r c i n o m ao ft h e b l a d d e r i n tjc a n c e r , 2 0 0 2 ，10 2 ：51 4 9b i a n c or k e yc a n c e rc e l ls i g n a lt r a n s d u c t i o np a t h w a y s 鹊t h e r a p e u t i ct a r g e t s 【j 】e u rjc a n c e r , 2 0 0 6 ，4 2 ( 3 ) ：2 9 0 2 9 4 10n i e l s e n - p r e i s ss m ，s rs i l v a , j mg i l l e t t e r o l eo fp t e na n da k ti nt h er e g u l a t i o no fg r o w t ha n d a p o pt o s i si nh u m a no s t e o b l a s t i cc e l l s j 】jc e l lb i o c h e m ，2 0 0 3 ，9 0 ( 5 ) ：9 6 4 9 7 5 1 1f u r n a r if b ，l i nh ，h u a n gh s ，e ta 1 g r o w t hs u p p r e s s i o no fg l i o m a c e l l sb yp t e nr e q u i r e sa f u n c t i o n a lp h o s p h a t a s ec a t a l y t i cd o m a i n j p r o c n a t l a c a ds c ，i1 9 9 7 ，9 4 ( 2 3 ) ：1 2 4 7 9 - 1 2 4 8 4 1 2c r i s t o f a n oa d ，p e s c eb ，c o r d o n - c a r d oc ，e t a l p t e ni se s s e n t i a lf o re m b r y o n i cd e v e l o p m e n ta n d t u l l l o u rs u p p r e s s i o n j n a t g e n e t ，19 9 8 ，19 ( 4 ) ：3 4 8 - 5 5 1 3s l a m o nd j ，c l a r kg m ，w o n gs g , e ta lh u m a nb r e a s tc a n c e r c o r r e l a t i o no f r e l a p s ea n ds u r v i v a lw i t h a m p l i f i c a t i o no f t h eh e r - 2 n e uo n c o g e n e j s c i e n c e 1 9 8 7 , 2 3 5 ( 4 7 8 5 ) ：1 7 7 - l8 2 1 4f e h mj ae ta 1 o n t o l o g y , 1 9 9 8 ，5 5 ( 1 ) ：3 3 - 3 8 15m a r t eb m ，d o w nw a r dj p k b a k t ：c o r m e c t i n g p h o s p h o i n o s i t i d e3 - k i n a s et oc e l ls u r v i v a la n d b e y o n d j 】t r e n d sb i o c h e ms c i 19 9 7 ，2 2 ：3 5 5 - 3 5 8 1 6v i v a n c ois a w y e r sc l t h ep h o s p h a t i d y l i n o s i t o l 3 k i n a s ea k tp a t h w a yi nh u m a nc a n c e r j n a t r e vc a n c e r , 2 0 0 2 ，2 ；4 8 9 - 5 01 1 7d a t t as r , b r u n e ta ，g r e e n b e r gm e ，e ta 1 ap l a yi nt h r e ea k t s g e n e sd e v , 1 9 9 9 ，1 3 ( 2 2 ) ： 1 2 2 9 0 5 - 2 9 2 7 18k i md ，k l ms ，k oh ，e ta 1 a k t p k bp r o m o t e sc a n c e rc e l li n v a s i o nv i ai n c r e a s e dm o t i l i t ya n d m e t a l l o p r o t e i - n a s ep r o d u c t i o n f a s e b ，2 0 01 ，15 ( 11 ) ：19 5 3 - 19 6 2 19 z h o n gh ，c h i l e sk ，f e l d s e rd ，e ta 1 m o d u l a t i o no fh y p o x i a - i n - d u c i b l ef a c t o r1a l p h ae x p r e s s i o n b yt h ee p i d e r m a lg r o w t hf a c t o r p h o s p h a t i d y l i n o s i t o l3 - k i n a s e p t e n a k t f r a pp a t h w a yi n h u m a np r o s t a t ec a n c e rc e l l s ：i m p l i c a t i o n sf o rt u m o ra n g i o g e n e s i sa n dt h e r a p e u t i c s c a n c e rr e s ， 2 0 0 0 ，6 0 ( 6 ) ：1 5 4 1 1 5 4 5 2 0p o r en ，l i us ，e ta 1 p t e nm u t a t i o na n de p i d e r m a lg r o w t hf a c t o rr e c e p t o ra c t i v a t i o nr e g u l a t e v a s c u l a re n d o t h e l i a lg r o w t hf a c t o r ( v e g f ) m r n ae x p r e s s i o ni nh u m a ng l i o b l a s t o m ac e l l sb y t r a n s a c t i v a t i n gt h ep r o x i m a lv e g fp r o m o t e r j 】c a n c e rr e s ，2 0 0 3 ，6 3 ( 1 ) ：2 3 6 - 2 41 1 3 综述 a k t 、p t e n 在肿瘤中的研究进展 摘要细胞胞凋亡是正常的生理过程，具有维持机体内环境稳定，确保机体正 常生长、发育，及发挥积极的防御功能等，但是凋亡过多或过少都可引起疾病发生。 细胞凋亡受细胞癌基因、抑癌基因的控制和调节，与肿瘤的发生、发展和转归密切相 关。a k t 作为一个潜在的癌基因，又被称为蛋白激酶b ( p k b ) 属于蛋白激酶超家族中 的a g c 亚家族，具有丝氨酸苏氨酸激酶活性，是一类调解细胞凋亡存活的胞浆信 号转导蛋白，在介导肿瘤发生、发展中起重要作用。p t e n ( ( p h o s p h a t a s ea n dt e n s i n h o m o l o g yd e l e t e do nc h r o m o s o m e1 0 ) 基因是继p 5 3 之后发现的一种新型抑癌基因， 具有磷酸酯酶活性，是在人类肿瘤中缺失和突变率最高的抑癌基因【2 】，与人类恶性肿瘤 的发生、发展关系密切，自发现以来已经成为肿瘤研究的热点。在肿瘤的发生、发展 和转归过程中，生物信号分子的转导起到了重要作用。a k t 、p t e n 都是细胞信号转 导通路上的重要生物信号分子，并与磷脂酰肌醇3 ( 羟基) 激酶( p 1 3 k ) 构成 p 1 3 k p t e n a k t 重要信号转导通路，共同参与多种牛长因子的信号转导，且具有广泛 的生物学效应，被认为参与了多种肿瘤的发生、发展及侵袭转移【3 “】。近年来逐渐成 为肿瘤发生机制及治疗的研究热点，本文就a k t 、p t e n 在肿瘤的研究进展作一综述。 关键词胆管癌；p t e n ；a k t ；免疫组织化学； 一、a k t 与肿瘤 ( 一) a k t 的生物学特性 1 、a k t 的发现与结构特征 19 7 7 年s t a a l 5 】等从a k r 小鼠自发性胸腺瘤中分离逆转录病毒a k t 8 ，随后在病 毒基因组中发现具有恶性转化作用的细胞源性序列，被称为病毒癌基因v a k t 。1 0 年 后s t a a l 在人的基因库中克隆出a k t l 和a k t 2 两个片段，并且与肿瘤密切相关【6 】。 a k t 结构与p k a 、p k c 具有高度同源性，因此又被称为蛋白激酶( p k b ) 。p k b 属于蛋 1 4 白激酶超家族中的a g c 亚家族，具丝氨酸苏氨酸激酶活性。哺乳动物的a k t 由3 个亚型组成，分别是a k t l 、a k t 2 和a k t 3 。三者来自不同的基因，但在氨基酸序列上 有8 0 的同源性，而且他们在结构方面很相似，共同携带含有3 个不同功能结构域的 保守结构吲。这三个功能域包括了： ( 1 ) n 末端p h 结构域，可与p i p 3 结合，从而介导膜上整合素受体的效应，调 节蛋白质蛋白质和蛋白质一脂质的相互作用。 ( 2 ) 中间的激酶催化区，与p k a 、p k c 有高度相似性，包含有a k t 部分活化所 必需的苏氨酸； ( 3 ) c 端携有疏水性磷酸化位点调节区，该区域中的丝苏氨酸残基的磷酸化是 a k t 完全活化所必需的。其中激酶催化区和c 端疏水模序( h m ) 在a g c 族成员间具有 高度保守性。 2 、a k t 的激活 生理状态下a k t 以低活性或失活状态存在于细胞浆，当其暴露各种刺激因素如： 牛长因子缺乏、紫外线照射或d n a 损伤时，a k t 在p 1 3 k 调节下发生磷酸化而激活， 且t 3 0 8 位点及$ 4 7 3 位点的同时磷酸化为a k t 活化所必需【8 1 。 ( 1 ) p 1 3 k 依赖性活化p 1 3 k 聚集到细胞膜上的受体旁时，他们被活化，并在3 - o h 位磷酸化p i p 2 ( - - 磷酸磷脂酰肌醇) 牛成p i p 3 ( 三磷酸磷脂酰肌醇) ，p i p 3 结合a k t 的 p h 结构域使其转位于胞膜，使得a k t 的构象发生变化，s e r 4 7 3 和t h r 3 0 8 相继磷酸化， a k t 呈现活性形式并转至胞质或胞核内发挥丝氨酸苏氨酸激酶的作用。 ( 2 ) 自身磷酸化a k t 一旦被激活，就会发生自身磷酸化，机制与其磷酸化作用使 脂质聚集到a k t 的p h 域密切相关，从而调节a k t 的活性。 3 、艋的作用机制和功能 ( 1 ) 直接磷酸化的抗细胞凋亡作用 一a c t 是强有力的b a d 激酶，活化的a k t 可以使b a d 的s e r l 3 6 位点，而b a d 可与b c l 2 形成复合体而表现促凋亡作用，b a d 一旦被磷酸化，便难与b c l 2 形成复 合体，使其难以发挥促进细胞凋亡作用【9 1 。 a k t 磷酸化b e l - 2 家族成员b a x 的s e r l8 4 位点，负调控促凋亡功能【1 0 】。 a k t 能磷酸化促凋亡蛋白p a r - 4 ，从而灭活p a r - 4 的促凋亡作用【1 1 】。 活化的a k t 可以使细胞凋亡的启动者效应者半光天冬酶9 的s e r l 9 6 位点磷酸 化，使其失活从而抑制细胞凋亡【9 】o ( 2 ) 调节细胞周期进而影响细胞繁殖a k t 作用于其下游靶点哺乳动物类帕霉素 ( m t o r ) ，调控特定亚组分m r n a 的翻译，进而调节蛋白质的合成，影响细胞的增 殖，从而影响细胞凋亡【12 1 。 ( 3 ) 防止线粒体释放凋亡因子线粒体可以释放细胞色素c 及凋亡诱导因子，且 其释放受a k t 聚集的影响，当a k t 聚集到细胞膜时可阻止线粒体释放细胞色素c 及 凋亡诱导因子，进而抑制细胞凋亡【13 1 。 ( 4 ) 对糖代谢的影响a k t 对糖代谢的影响较为肯定，自发活化的a k t 表达后可 使糖原摄取、合成和蛋白合成均增加，糖原合酶激酶3 被a k t 磷酸化失活，不能磷酸 化糖原合酶，从而使糖原合成增加。 ( 二) a k t 与肿瘤的发生 虽然a k t 基因的过度表达在肿瘤发生中的具体作用尚有争议，但其在肿瘤发生中 具有重要意义已为大量的研究所证实。最早只在胃癌中得到检测，后相继在对卵巢癌、 乳腺癌、结肠癌、肝癌、滤泡状甲状腺癌和肺癌等研究中发现活化的a k t 呈现高表达 【1 4 】。而且a k t 的表达异常与肿瘤的发生、发展以及预后密切相关。s u n 等将具有持 续活性的m y r - a k t l 基因转导入n i h 3 t 3 细胞中，导致了细胞的恶性转化，表明a k t 的 异常活化对肿瘤的发生起重要作用。在未转化的肠上皮细胞和结肠肿瘤细胞中，a k t 信号通路已经证实能够转导来自生长因子受体的促有丝分裂信号。这些暗示着肿瘤的 发生很可能和a k t 激酶活性的激活有关【16 1 。并且在对结肠癌的研究中发现，结肠癌 组织中存在a k t 表达增多，活化的a k t 通过促进细胞增殖并抑制其凋亡从而促进肿瘤 的发生发展，且a k t 的活化程度与肿瘤的临床特征密切相关。有研究表明非小细胞肺 癌癌组织中磷酸化a k t 蛋白表达与肺癌发生、发展有关，可作为预测患者不良预后的 独立危险因素17 1 。蒋虹等发现，i i i l i a 期无淋巴结转移的高分化食管癌组织中a k t 1 6 蛋白表达低于l l l b i v 期有淋巴结转移的低分化食管癌，进一步证明了a k t 促进癌细 胞侵袭转移的作用。a r b o l e d a 等【1 9 】发现，人类上皮牛长因子受体2 ( h e r - ) 通过p 1 3 k a k t 途径引起a k t 2 过度活化，促使卵巢癌细胞黏附运动增强，侵袭力增加。用p 1 3 k 抑制剂 l y 2 9 4 0 0 2 或渥曼青霉素抑制a k t 活性，在体外能减少卵巢癌细胞的侵袭性。 ( 三) a k t 与肿瘤的治疗 a k t 过表达在肿瘤发牛发展中的重要作用，使a k t 成为肿瘤治疗研究的理想靶点， a k t 抑制剂是当前研发的热点，它能拮抗a k t 的抗凋亡作用，破坏癌细胞耐药性，诱 导癌细胞凋亡。较早发现的a l g 抑制剂有抗炎药物塞莱考昔( c e l e c o x i b ) 、及其衍生 物o s u 0 3 0 1 2 和o s u 0 3 0 1 3 ，其中o s u 0 3 0 1 2 在抑制a k t 方面更具专一性，且具有 高活性、低毒副作用的优点。现在，研究进一步证实c e l e c o x i b 能够通过使a k t 失活 而抑制乳腺癌细胞的生长【2 0 1 。p e r i f o s i n e 是一种基于脂的a k t 抑制剂，通过抑制a k t 的膜转位，降低a k t 活性，抑制多种肿瘤细胞的生长【2 1 1 。最近z h a n g 2 2 】等研究发现了 一种新的a k t 抑制剂c m e p ，其通过抑制$ 4 7 3 和t 3 0 8 的磷酸化下调a k t 活性，而 对p 1 3 k 、p d k l 、或m a p k 的活性则没有影响。研究证明c m e p 对多种a k t 高活化 的前列腺癌细胞具有抗增殖和诱导凋亡的效应，而对于没有激活的癌细胞的抑制作用 极微。另外一些小分子抑制剂通过间接作用于p 1 3 k a k t 信号通路，促进肿瘤细胞凋 亡，抑制肿瘤的生长，如表皮生长因子抑制剂z d l 8 3 9 等。因此，如果对a k t 基因在 其它肿瘤发病中的作用及其产物的表达得出肯定的结果，则a k t 的抑制剂可应用于多 种肿瘤的分子生物学靶向治疗，成为肿瘤的综合治理的一个重要组成部分，从而明显 提高治疗效果。 二、p t e n 与肿瘤 ( 一) p t e n 的生物学特性 1 、p t e n 的发现和结构特征 p t e n 是1 9 9 7 年由美国的3 个研究小组分别发现的一种抑癌基因，又称作 m m ac 1 ( m u t a t e di n m u l t i p l e a d v a n c e dc a n c e r s1 ) 和t e p 1 ( t g f - - b r e g u l a t e da n d e p i t h i l i a lc e li e n r i c h