（材料学专业论文）聚合物表面拓扑结构对蛋白质吸附、细胞黏附的影响.pdf

中文摘要 蛋白质在生物材料表面的吸附是材料接触生物体内环境后发生的首要反应， 是衡量材料生物相容性的一个重要指标。材料表面的化学组成和拓扑结构都会影 响蛋白质吸附以及后续的细胞黏附。因此，研究材料表面的化学组成、拓扑结构 及其两者的协同作用对蛋白质吸附、细胞黏附的影响，对于合理设计材料的表面、 提高材料的生物相容性具有重要意义。 本课题首先选取常用的生物材料，一方面采用软刻蚀和紫外光刻技术，构筑 化学组成均质和异质的聚合物表面拓扑结构图案，另一方面从仿生的角度出发， 制备具有仿荷叶表面拓扑结构的生物医用材料；进而考察以上所得的拓扑结构表 面对蛋白质吸附、细胞黏附的影响。具体内容如下： 1 采用制备软刻蚀弹性印章的方法得到了聚二甲基硅氧烷 ( p o l y ( d i m e t h y l s i l o x a n e ) p d m s ) 图案表面，所得表面化学组成均一；以p d m s 图案为模板，采用浇注成膜的方法制备聚氨酯( p o l y u r e t h a n e p u ) 图案表面。以 p d m s 表面微米拓扑结构为基材，研究单纯的拓扑结构对于纤维蛋白原 ( f i b r i n o g e n ，f g ) 吸附和血小板黏附的影响。当拓扑结构被引入p d m s 表面后， 材料的表面积增加了8 3 而f g 的吸附量却增加了3 4 6 。激光共聚焦显微镜结 果显示，在平整表面，吸附的f g 呈现无规分布，而在图案表面，吸附的f g 呈 现图案化分布且多数吸附在凸起的边缘和底部。这些结果表明微米级拓扑结构同 样会影响纳米级f g 的吸附和分布。富含血小板血浆( p l a t e l e tr i c hp l a s m a , p i 冲) 和流动全血( f l o w i n gw h o l eb l o o d ，f w b ) 的血小板黏附实验结果显示，在不同 的实验条件下，黏附在材料表面的血小板呈现的形态和激活程度不同，但是多数 血小板的黏附位置与f g 的分布相对应。表面微米拓扑结构很可能首先影响血浆 蛋白质中f g 的吸附，然后通过吸附的f g 影响后续血小板的黏附。 2 通过硅氢加成反应，在p d m s 表面接枝了烯丙基聚乙二醇 ( m o n o a l l y l p o l y e t h y l e n eg l y c o l ，a p e g ) ，红外光谱、x 射线光电子能谱和水接触 角的测试结果证实了p d m s a p e g 表面的成功制备。通过1 7 2 n m 紫外光刻在 p d m s a p e g 膜片表面制备了化学组成异质的拓扑结构图案：受到紫外光照的 a p e g 被刻蚀，未受到紫外光照的a p e g 保存完好。激光共聚焦显微镜测试结果 表明，f g 只能吸附在a p e g 被刻蚀的区域，a p e g 保存完好的区域能够有效地 排斥f g 吸附，从而形成了规整的蛋白质图案表面。 3 以天然的荷叶表面为模板，通过两次浇注成膜，在p u 、聚碳酸亚丙酯 ( p o l y ( p r o p y l e n ec a r b o n a t e ) ，p p c ) 和p u 共混p l u r o n i c f 1 2 7 ( p u f ) 表面制得 了仿荷叶的拓扑结构。扫描电子显微镜测试结果表明聚合物仿荷叶表面存在大量 微乳突结构，这使得p u 、p p c 仿荷叶表面的疏水性增强；而拓扑结构和化学组 成的协同效应，使得p u f 表面显示出独特的浸润性，静态水滴和捕捉气泡法水 接触角在平整表面变化不大，而在仿荷叶表面，静态水滴接触角显示其较为疏水， 捕捉气泡法水接触角则显示其较为亲水，p l u r o n i e f 1 2 7 含量为2 0 的p u f ( p u f 2 0 ) 仿荷叶表面达到了超亲水性。f g 的吸附结果表明，p u f 表面的排斥 非特异性蛋白质吸附的效果与预先浸泡过程有关，没有预先浸泡而直接进行蛋白 质吸附的膜片具有较好的排斥非特异性蛋白质吸附的能力。p u f 2 0 仿荷叶表面排 斥f g 吸附的效果最佳( 0 0 1 6 _ t g ) ，相比于未改性的平整表面( 0 2 8 9 9 9 ) 下降了 9 4 。 本课题通过考察拓扑结构图案表面和仿荷叶拓扑结构表面对蛋白质吸附、细 胞黏附的影响，深化认识了材料表面性质与蛋白质吸附、细胞黏附的相互作用， 为生物医用材料的表面设计、修饰提供了理论基础。 关键词：拓扑结构图案，仿荷叶表面拓扑结构，蛋白质吸附，细胞黏附 h a b s t r a c t p r o t e i na d s o r p t i o n ，t h ef i r s tr e s p o n s ea f t e rb i o m a t e r i a l sc o n t a c t i n gt h eb i o l o g i c a l e n v i r o n m e n t ，p l a y sac r u c i a lr o l e i nm e d i a t i n gt h es u b s e q u e n tr e a c t i o n ss u c h a s p l a t e l e t c e l la d h e s i o na n di nd e t e r m i n i n gt h ef i n a lb i o c o m p a t i b i l i t yo fb i o m a t e r i a l s b o t hs u r f a c ec h e m i s t r ya n dt o p o g r a p h yh a v ee v i d e n te f f e c t so np r o t e i na d s o r p t i o n t h e r e f o r e ，t h es i n g l ee f f e c to fe i t h e rs u r f a c ec h e m i s t r yo rt o p o g r a p h ya n d t h es y n e r g i c e f f e c to ft h e i rc o m b i n a t i o no np r o t e i na d s o r p t i o na n dc e l la d h e s i o nn e e dt ob e i n v e s t i g a t e d i no r d e rt o r a t i o n a l l yd e s i g nb i o m a t e r i a l s s u r f a c ep r o p e r t i e sa n d e f f e c t i v e l yi m p r o v eb i o m a t e r i a l sb i o c o m p a t i b i l i t y c h e m i c a lh o m o g e n e o u sa n dh e t e r o g e n e o u st o p o g r a p h i cp a t t e r n sw e r ef a b r i c a t e do n p o l y m e r i cb i o m a t e r i a l ss u r f a c e su s i n gs o f tl i t h o g r a p h ya n du l t r a v i o l e tl i t h o g r a p h y , r e s p e c t i v e l y i n s p i r e df r o mb i o n i cc o n c e p t ，b i o m a t e r i a lw i t hl o t u s - l e a f - l i k es u r f a c e t o p o g r a p h yw a sa l s op r e p a r e d t h ee f f e c t so fp r e p a r e dt o p o g r a p h i e so np r o t e i n a d s o r p t i o na n dc e l la d h e s i o nw e r es t u d i e da sf o l l o w s ： 1 c h e m i c a lh o m o g e n e o u sm i c r o t o p o g r a p h yo np o l y ( d i m e t h y l s i l o x a n e ) ( p d m s ) w a sf a b r i c a t e du s i n gs o f tl i t h o g r a p h yt e c h n i q u e p a t t e r n e dp o l y u r e t h a n e ( p u ) w a s t h e np r e p a r e du s i n gt h eo b t a i n e dp d m sa st e m p l a t e t h ei n d i v i d u a le f f e c t so fp d m s s u r f a c em i e r o t o p o g r a p h yo nf i b r i n o g e n ( f g ) a d s o r p t i o na n dp l a t e l e ta d h e s i o nw e r e s t u d i e d a f t e rm i c r o t o p o g r a p h yb e i n gi n t r o d u c e do np d m ss u r f a c e ，t h es u r f a c ea r e a o n l yi n c r e a s e db y8 3 w h e r e a s t h ef ga d s o r p t i o ni n c r e a s e db y3 4 6 l a s e r s c a n n i n gc o n f o c a lm i c r o s c o p e ( l s c m ) r e s u l ts h o w e dt h a tf gr a n d o m l ya d s o r b e do n f l a ts u r f a c ew h e r e a sr e g u l a r l yd i s t r i b u t e do np a t t e r n e ds u r f a c e a d d i t i o n a l l y , f l u o r e s c e n ti m a g e ss h o w e dt h a tv e r yc o n s i d e r a b l ea m o u n to ff ga d s o r b e do nt h e f l a n k sa n dv a l l e y so fp r o t r u s i o n s t h e s er e s u l t ss u g g e s tt h a ts u r f a c em i c r o t o p o g r a p h y c a na f f e c tt h ea m o u n ta n dd i s t r i b u t i o no fa d s o r b e df g f u r t h e r m o r e ，t h er e s u l t so f p l a t e l e ta d h e s i o nf r o mp l a t e l e tr i c hp l a s m a ( p i 冲) a n df l o w i n gw h o l eb l o o d ( f w b ) s h o w e dt h a tt h em o r p h o l o g i e sa n da c t i v a t i o ns t a t e so fa d h e r e dp l a t e l e t sw e r ed i f f e r e n t u n d e rp r pa n df w bs i t u a t i o n s h o w e v e r , t h ed i s t r i b u t i o no fm o s ta d h e r e dp l a t e l e t s r e s e m b l e dt h a to fa d s o r b e df gu n d e rb o t hc o n d i t i o n s ，i n d i c a t i n gt h a tp a t t e r n e ds u r f a c e i n d i r e c t l yi n f l u e n c e dt h el o c a t i o no fp l a t e l e t sv i aa f f e c t i n gp l a s m ap r o t e i n sa d s o r p t i o n ， e s p e c i a l l yf g 2 m o n o a l l y l p o l y e t h y l e n eg l y c o l ( a p e g ) w a sg r a f t e d t op d m ss u r f a c e i i i ( p d m s - a p e g ) u s i n gh y d r o s i l y l a t i o n i n f r a r e ds p e c t r u m ，x r a yp h o t o e l e c t r o n s p e c t r o s c o p y ( x p s ) a n d w a t e rc o n t a c t a n g l e c h a r a c t e r i z a t i o n sc o n f i r m e dt h e m o d i f i c a t i o n c h e m i c a l h e t e r o g e n e o u st o p o g r a p h i cp a t t e r nw a sf a b r i c a t e d o n p d m s a p e gs u r f a c eu s i n gu l t r a v i o l e tl i t h o g r a p h ya t17 2 n m t h ea p e gr e g i o nw i t h i r r a d i a t i o nw a se t c h e dw h i l ew i t h o u ti r r a d i a t i o nw a sk e p t l s c mr e s u l ts h o w e dt h a t f go n l ya d s o r b e dt ot h ei r r a d i a t i o nr e g i o nw i t h o u ta p e g w h e r e a st h er e s e r v e da p e g r e g i o ne f f e c t i v e l yr e s i s t e df ga d s o r p t i o n f o r m i n gar e g u l a r p r o t e i np a t t e r n 3 l o t u s - l e a f - l i k et o p o g r a p h yw a sf a b r i c a t e do np u ，p o l y ( p r o p y l e n ec a r b o n a t e ) ( p p c ) a n dp ub l e n dp l u r o n i c f 12 7 ( p u f ) s u r f a c e su s i n gn a t u r a ll o t u sl e a fa s t e m p l a t e s c a n n i n ge l e c t r o nm i c r o s c o p e ( s e m ) r e s u l ts h o w e d t h a ta 。m a s so f m i c r o - p a p i l l af o r m e d o nt h e s e p o l y m e rs u r f a c e s ，c a u s i n g t h ee n h a n c e m e n to f h y d r o p h o b i c i t yo np ua n dp p cs u r f a c e s t h es y n e r g i ce f f e c to fs u r f a c ec h e m i s t r ya n d t o p o g r a p h ye n d o w e dp u fs u r f a c e sw i t hs p e c i f i cw e t t a b i l i t y s e s s i l ed r o p l e ta n d c a p t i v eb u b b l ew a t e rc o n t a c ta n g l e sw e r es i m i l a ro nf l a tp u fs u r f a c e s i nc o n t r a s t c a p t i v eb u b b l ew a t e rc o n t a c ta n g l e sw e r es i g n i f i c a n t l yl o w e rt h a ns e s s i l ed r o p l e to n l o t u s 1 e a f - l i k ep u fs u r f a c e s ( p u f l ) a n dp u f l 2 0 ( b l e n d2 0 p l u r o n i c 吲f - 12 7 ) s u r f a c ea c h i e v e ds u p e r - h y d r o p h i l i c i t y t h ep r o t e i na d s o r p t i o nr e s i s t a n tc a p a c i t yo f p u fs u r f a c ew a si n f l u e n c e db yt h ep r e e q u i l i b r i u mi nb u f f e rs o l u t i o n p u fs u r f a c e s w i t h o u tp r e e q u i l i b r i u mh a db e t t e ra b i l i t yt or e s i s tn o n s p e c i f i cp r o t e i na d s o r p t i o n t h ea m o u n to fa d s o r b e df gr e d u c e df r o m0 2 8 9 肛go np uf i a ts u r f a c et o0 016 p go n p u f l 2 0s u r f a c e ( 9 4 d e c r e a s e ) i nc o n c l u s i o n t h ec o r r e l a t i o nb e t w e e ns u r f a c ep r o p e r t i e sa n dp r o t e i na d s o r p t i o n 嬲 w e l la sc e l la d h e s i o nw a sf u r t h e ru n d e r s t o o db yt h ei n v e s t i g a t i o no nt o p o g r a p h i c p a a e r n sa n dl o t u s l e a f - l i k es u r f a c et o p o g r a p h y t h i sr e s e a r c hm a yb eh e l p f u lt ot h e r a t i o n a ld e v i s ea n dm o d i f i c a t i o no fb i o m a t e r i a ls u r f a c ep r o p e r t i e s k e yw o r d s ：t o p o g r a p h i cp a t t e r n ；l o t u s l e a f - l i k e s u r f a c e t o p o g r a p h y ；p r o t e i n a d s o r p t i o n ；c e l la d h e s i o n i v 武汉理工大学学位论文独割性声明及使用授权书 独创性声瞬 零入声鳞，掰鏊交的逢文怒我个久往黪黪揩蟹f 遴行豹蟒窥t 份及墩褥豹獗究 袋聚。瑟我所翔，除了文r 弘锈掰蠢i 敖杯演鹈毁镢鞠勉方辨，论文巾誉篷禽葵饿天翌 缆鬏袭凌撰霉i 霪豹磁跷戏繁，缆夺纽螽为获键跌汊瑷l ：天掌藏j 它教豁税掏豹警缎 或醚书殛缆翔进约耪耪。易我一麓“l ：佑豹鹾忐凳 零矮究掰徽豹缓秘蠢鼷均0 在途文 孛露了明磁麴浚唆磬鲞蠢：了澍恣。 研究生签名 ： 蠢垄 l ；鲻纠堕ii 学位论文使用授权书 零夫宠垒了辫武汉理t 火譬彳f 裳缳貉、经j ；j 譬缎沦文雅胤宠。湖：掌梭钉牧探 塑磐廊翻家存燕辫门竣梳鞠送交浚冀懿爱荽器箨承l 魄孑磁，宠珞论交拨森阑和偌缁。 番入援辍武汉瑷工太攀辨f 戮褥零学镌浚嶷豹仝繇内窭缓入钉荑数缀黪进i 援索，砑 泼象粥影印、绦印或簸缝簸渤誓羧辍孬或汇编零掌经谂爻，酾雪授较经武汉理j ；：丈 攀谈| l l 鹩瀚豢钉荑甥 搦线泛文数糍终霞掰或牧麓求孝後逾交，势秘社会公众挺缀翁 患旅务。 ( 保密的论文在解密蠡旋遵守此规定) 磺究生 ：塞氛器势( 筝彩) ： 泣：垂袁经砺巍生放话繇签筋j 磊。滚致秘+ 凌擎貔沦文捅甏翁受。 武汉理工大学硕士学位论文 第1 章绪论 1 1 蛋白质吸附与生物相容性 1 1 1 生物医用材料的生物相容性 生物医用材料( b i o m e d i c a lm a t e r i a l s ) 也称生物材料( b i o m a t e r i a l s ) 是与人 体组织、体液、血液接触及相互作用而对人体无毒副作用、不造成凝血和溶血、 不诱发细胞突变、畸变和癌变、不引起免疫排异和过敏反应的特殊功能材料； 可用于对生物体进行诊断、治疗、修复和替换病损组织、器官或增进其功能的 新型高技术材料【l 】。 生物医用材料是研究人工器官和医疗器械的基础，目前已被广泛用于人工 器官、外科修复、理疗康复、诊断治疗疾患等医疗保健领域。近年来，随着生 物技术的蓬勃发展和重大突破，生物医用材料己成为各国科学家竞相研究和开 发的热点领域之一。 但是，这些材料在实现其基本的临床功能的同时，也带来了一系列不良的 生物反应，例如术后的感染、炎症反应、血栓栓塞、组织增生等，这些不良反 应都是由生物医用材料和生命环境之间的非生物相容性作用造成的【2 】。因此，提 高生物医用材料的生物相容性是最终解决这些问题的根本途径。 生物医用材料的生物相容性是指材料在生理环境中，生物体对植入材料的 反应和产生有效作用的能力，用以表征材料在特定应用中与生物机体相互作用 的生物学行为。生物相容性取决于材料和生物系统两个方面。在材料方面，影 响生物相容性的因素有材料的类型、制品的形态、表面组成、物理化学性质、 力学性质、使用环境等；在生物系统方面，影响因素有生物机体的种类、植入 部位、生理环境、材料存留的时间、材料对生物机体免疫系统的作用等。生物 相容性是生物医用材料极其重要的性能，是区别于其他材料的标志，是生物医 用材料能否安全使用的关键性能【3 j 。 1 1 2 蛋白质吸附对生物相容性的影响 蛋白质广泛而大量地存在于生物体体液之中，是构成生物体的主要物质， 同时也是生物识别机制的主要信息载体之一，因此蛋白质在生物医用材料表面 的吸附行为对材料的生物相容性至关重要。 生物医用材料和机体内环境接触后，首先发生的现象就是体液或血液中两 武汉理t 大学硕七学位论文 百多种蛋白质的非特异性吸附，不同蛋白质之间相互竞争形成多种蛋白质共存 的吸附层，其中的每种蛋白质可以有各种不同的非特异性变性结构，吸附的蛋 白质还可以进一步诱导细胞等其他生物分子的行为。 尽管生物医用材料表面从相同的生物体内环境吸附蛋白质，但是不同的材 料却可以诱导产生不同的表面蛋白质吸附层，进而引发不同的生物化学反应。 因此，材料表面的蛋白质吸附层由材料的表面性质决定，而蛋白质吸附层的成 分和构象反过来又影响生物医用材料的生物相容性。 例如和血液接触的生物医用材料，在材料表面吸附的血浆蛋白质主要为纤 维蛋白原、球蛋白、纤维结合蛋白和白蛋白。当材料表面吸附纤维蛋白原、球 蛋白和纤维结合蛋白时，这些蛋白质会与血小板形成复合体并黏附在材料表面， 加速凝血过程，使纤维蛋白原转化为纤维蛋白并包裹血液中的其它有形成分， 在材料表面形成血栓。如果材料表面吸附白蛋白时，白蛋白与血小板形成复合 体的几率就很小，但是当吸附的白蛋白变性时，也会使纤维蛋白原吸附在变性 的白蛋白上，导致凝血的产生。而且，纤维蛋白原在血浆中浓度较高，对表面 具有较高的亲合力，因此它在材料表面的蛋白质吸附和血栓形成方面起着非常 重要的作用。 1 2 材料表面性质与蛋白质吸附 1 2 1 蛋白质的吸附过程 蛋白质自身的结构复杂，有肽链中的氨基酸序列( 一级结构) ，多肽链中规 则重复的构象( 二级结构) ，以及与其生理功能关系十分密切的三维空间结构( 三 级、四级结构) 。蛋白质紧密有序的空间结构会由于周围环境因素的干扰( 化学、 物理等) 而转变成杂乱、松散、无序的空间结构。在疏水作用下，蛋白质分子 内部的疏水基团可能翻转暴露于表面，导致其生物活性的丧失。 蛋白质在生物医用材料表面的吸附是一个动态的过程，它包含着蛋白质的 吸附、重排和解吸附，也是一个复杂的过程，与范德华力、疏水相互作用、静 电和氢键作用有关。正是由于蛋白质特殊的结构以及和材料表面之间大量复杂 的、相互依赖的、动态的相互作用，蛋白质与材料表面的相互作用机理及材料 表面性质对蛋白质吸附行为的影响至今仍未完全阐明，但其重要性已经受到研 究者的广泛重视。 一般认为，决定蛋白质在材料表面吸附和解吸附行为的物理化学因素通常 有八种，如图1 1 所示【4 】。 从蛋白质靠近生物医用材料表面，到在材料表面吸附，再到从材料表面解 2 武汉理工大学硕士学位论文 吸附，其中的每一个过程都有其特征。在靠近过程中，蛋白质的运输性质、蛋 白质与材料表面的本征相互作用共同决定蛋白质靠近材料表面的程度，此过程 同时受溶剂分子运动和蛋白质自身分子运动性质的影响。 研究认为，蛋白质吸附过程中的相互作用包括氢键、静电和疏水等非共价 的相互作用【5 】。其中氢键的形成是由于电负性原子与氢原子形成的基团中，氢原 子周围分布的电子少，正电荷氢核与另一电负性强的原子之间产生静电吸引， 从而形成氢键。疏水相互作用又称为非极性相互作用，发生于非极性基团之间， 蛋白质同时含极性和非极性的基团，当蛋白质处于水溶液中时，极性基团之间 以及极性基团与水分子之间易发生静电吸引而排开非极性基团，因此疏水相互 作用并非是疏水基团之间有吸引力的缘故，而是由于非极性基团避开水的需要 而被迫接近【6 】。这些相互作用本质上与小分子的吸附没有差别，而蛋白质吸附的 独特性在于吸附的是具有生物活性的大分子，以及在吸附过程中，蛋白质可以 发生各种物理( 如构象变化) 和化学的变化，从而导致生物活性的变化。此外， 蛋白质的空间结构和表面酸性氨基酸、碱性氨基酸基团的密度会影响其吸附， 同时材料的表界面性质对蛋白质的吸附速率、吸附量和吸附机理有重要影响。 蠢近 图1 1 蛋白质在生物医用材料表面的吸附和脱附过程 1 运输性质；2 溶剂介导的蛋白质和材料之间的相互作用；3 蛋白质和材料之间 的短程相互作用；4 释放结合水和抗衡离子作用引起的熵增；5 蛋白质变性引起 的熵增；6 溶剂热扰动；7 溶剂剪切流动；8 其他吸附质取代 1 2 2 材料表面性质对蛋白质吸附的影响 生物医用材料影响蛋白质吸附的主要因素包括材料表面的化学组成【7 1 和拓 扑结构。 坚 半 垂 锈一 ， 武汉理工大学硕士学位论文 几十年来，研究者就材料表面的化学组分对蛋白质吸附的影响开展了广泛、 深入的研究。化学组成的变化会影响材料表面的亲疏水性、电荷分布、表面能 等，进而影响蛋白质的吸附。例如，聚乙二醇( p o l y e t h y l e n eg l y c o l ，p e g ) 或聚 氧化乙烯( p o l y e t h y l e l l eo x i d e ，p e o ) 能够有效地排斥非特异性蛋白质吸附文引， 其经过改性得到的衍生物在保持排斥非特异性蛋白质吸附能力的同时，能够特 异地结合目标蛋白质等生物分子，诱导特定的生物化学反应【l0 1 。因此，利用p e g 或p e o 及其衍生物对生物医用材料表面进行改性是提高其生物相容性的有效途 径。此外，聚2 甲基丙烯酰羟乙基磷酰胆碱( p o l y ( 2 m e t h a c r y l o y l o x y e t h y l p h o s p h o r y l c h o l i n e ) ) 【l l 】、两性聚合物1 引、聚磺基甜菜碱( p o l y ( s u l f o b e t a i n e ) ) 【1 4 】 和聚羧基甜菜碱( p o l y ( c a r b o x y b e t a i n e ) ) 1 s 】都能够有效地排斥非特异性蛋白质吸 附。 材料表面的拓扑结构可以认为是一种阶层结构，即从原子、分子结构到纳 米、微米结构，再到宏观结构。蛋白质的尺寸属于纳米尺度范畴，而细胞的尺 寸属于微米尺寸范畴。拓扑结构对蛋白质吸附的影响近年来才受到关注。关于 拓扑结构对生物相容性影响的研究多集中在材料表面拓扑结构对细胞行为的影 响。早在1 9 6 4 年，人们就发现细胞所处环境的拓扑结构对其行为能产生一定影 响【1 6 】。组织工程学研究的发展更进一步引起了人们对表面拓扑结构与细胞之间 相互作用的关注 1 7 , 1 8 】。但是，它们之间的内在机理有待更深入地阐明。而进一步 的研究必然会涉及到蛋白质吸附与表面拓扑结构的关联，这是由于一方面，当 生物医用材料进入生物体内环境后，蛋白质的吸附过程早于细胞的黏附过程； 另一方面，细胞膜和细胞外基质中分布有多种蛋白质，这些蛋白质( 如调节细 胞黏附的整联蛋白) 功能的表达直接影响到细胞的行为。因此，研究拓扑结构 和蛋白质之间的相互关系，将有助于最终阐明拓扑结构对细胞形貌、黏附、增 殖、分化和生长等行为的影响。此外，生物体内( 如血管内壁等) 许多与蛋白 质直接接触表面的特殊微纳拓扑结构与其生物相容性的关系也有待于进一步认 识；生物传感器【1 9 】、微流动装置等的表面微结构对非特异性蛋白质吸附的排斥 能力直接影响到生物医学检测的灵敏度；纳米材料的生物安全性也涉及到蛋白 质吸附与材料表面微纳拓扑结构的关系。总之，蛋白质在具有拓扑结构表面的 吸附行为值得深入考察和研究。 需要指出的是，本质上化学组成和拓扑结构是紧密联系、相辅相成的，因 为特定化学物质的集合体以拓扑结构的形式呈现出来，而特定的拓扑结构由化 学物质所组成，所以不能简单、机械的将两者割离开来，而应该将两者看成一 个有机的整体，换句话说，材料表面拓扑结构和化学组成是同一问题的两个方 面，两者既相对独立各自影响着蛋白质、细胞等的行为，又相辅相成 4 武汉理工大学硕士学位论文 共同决定着材料的生物相容性。因此，很多时候，需要在优化的拓扑结构表面 进行化学改性，或在特定化学组分表面构筑拓扑结构，通过两者的协同效应以 得到最理想的材料表面【2 0 ，2 1 1 。 1 3 材料表面拓扑结构的分类和常用制备方法 1 3 1 材料表面拓扑结构的分类 材料表面的拓扑结构图案通常可以分为两大类：一类为化学组成均质的拓 扑结构；另一类为化学组成异质的拓扑结构。 很多常用的生物医用材料表面具有化学组成均质的拓扑结构，这些拓扑结 构有些是在材料成型加工过程中无意引入的，有些是为了满足特定需要而有目 的地引入的，前者如材料表面广泛存在的粗糙度，后者如组织工程所用的多孔 支架材料【2 2 1 。 在化学组成异质的拓扑结构表面，不同的区域具有各自不同的化学成分。 在多数情况下，研究者在材料表面特定的区域引入特定的化学基团、生物分子， 赋予各个区域各自独特的功能，进而将多重功能集成在一个材料表面上，从而 构成化学组成异质的表面拓扑结构。例如，在材料表面的一个区域上的化学基 团可以有效地排斥非特异性蛋白质吸附，而在另一个区域上的生物分子可以识 别结合特异的蛋白质【l 纠，用于医疗诊断的生物芯片为了提高信噪比常具有这一 特点。又例如，在材料表面的一个区域上的化学组成不利于细胞的黏附，而在 另一个区域上的化学组成则促进细胞的黏附2 3 1 。 1 3 2 材料表面拓扑结构的常用制备方法 1 3 2 1 软刻蚀( s o f tl i t h o g r a p h y ) 软刻蚀是上世纪9 0 年代初期，由美国h a r v a r d 大学w h i t e s i d e s 教授的研究 小组【2 4 】率先研究开发出来的，这类技术所有操作方法的一个共同特征就是使用 一个弹性印章来进行图形的复制与转移或采用印章当作掩模，“软刻蚀也应因 此得名。 软刻蚀技术除了制作母板需要使用比较昂贵的电子束刻蚀或其他先进技术 外，在后续的操作过程诸如浇注、复制、转移图案等都是非常简便的操作，因 而与传统光刻技术相比，软刻蚀技术可以有效地克服光刻技术的一些缺陷，为 化学家、生物学家和材料学家提供了方便、廉价的微图案转移方法，具有明显 的优势。软刻蚀操作过程简单，方便快捷，不需要复杂昂贵的大型设备；弹性 印章一次模塑成型，可重复使用，有效地降低成本；可一次在大面积上制作图 武汉理工大学硕士学位论文 形，适宜大面积、成批量生产；可以方便地在平面或曲面表面制作微细结构； 既可以制造二维图案，也可以制造三维的微结构；可以对图案表面的化学性质 加以控制，方便地形成带特定官能团的图形表面等等。 迄今为止，软刻蚀已经发展壮大成一系列的相关操作，现在的软刻蚀特指 这些操作的统称，它们具体包括微接触印刷( m i c r o c o n t a c tp r i n t i n g ，“c p ) 2 5 】、 复制模塑( r e p l i c am o l d i n g ，r e m ) 2 6 】、毛细微模塑( m i c r o m o l d i n g i nc a p i l l a r i e s ， m i m i c ) 2 7 】、溶剂辅助微模塑( s o l v e n t a s s i s t e dm i c r o m o l d i n g ，s a m i m ) 1 2 8 、转 移微模塑( m i c r o t r a n s f e rm o l d i n g ，i t t m ) 【2 9 】等多项内容。 制作表面带有凸凹微结构的高精度弹性印章是软刻蚀技术的成败关键。弹 性印章的材料一般选用聚二甲基硅氧烷( p o l y d i m e t h y l s i l o x a n e ，p d m s ) ，也可以 用聚氨酯( p o l y u r e t h a n e s ，p u ) 、聚酰亚胺( p o l y i m i d e s ，p i ) 、交联酚醛清漆树脂 ( c r o s s 1 i n k e dn o v o l a cr e i n s ) 等 3 0 】。制作弹性模印章的硬母板可以用光刻、微机 械、电子束刻蚀等方法制造或用现有的带有微图案的衍射光栅、t e m 格子等， 或用计算机辅助设计的方法快速设计打印模板，获得硬母板后，就可以制作弹 性印章。现在研究者普遍使用的是以d o wc o m i n g 公司生产的牌号为s y l g a r d 1 8 4 为代表的p d m s 作为弹性印章的材料。p d m s 弹性印章制作过程如图1 2 所 示，首先将室温为流体的p d m s 加入交联剂，均匀混合后浇铸在硬母板上，用 u v 光照或热处理数小时，使其交联，将固化的p d m s 轻轻剥下，就得到了弹 性印章。之所以选用p d m s 作弹性印章，是因为p d m s 具有很低的玻璃化转变 温度，在室温下为流体，通过交联，流体很容易转变为具有弹性的固体。其次， p d m s 还有其它一些特点，例如与非平面的基板形成良好的接触，有很强的化 学稳定性和图形稳定性，可以在几个月内使用多次而不发生明显性能下降等。 软刻蚀技术在生物医用领域有着广泛的应用，通过此方法，研究者在多种 材料表面形成了各种各样的化学、生物分子拓扑图案结构。例如，a m e r i n g e r 等 【3 l 】将星状p e g 涂覆在玻璃基材表面，所用涂层为带有异氰酸根基团的六臂星状 预聚物，通过“c p 固定末端为氨基的寡聚核苷酸，荧光显微镜观察发现，荧光 标记的d n a 实现了持久的固定。h y u n 等【3 2 峙艮道以乙二醇齐聚物为侧链的两亲 性梳状聚合物能够在不同的聚合物材料表面( 例如聚苯乙烯、聚甲基丙烯酸甲 酯、聚对苯二甲酸乙二酯) 形成薄膜，该梳状聚合物在水环境中保持稳定，侧 链末端为c o o h ，在将c o o h 转化为n h s 后，用p d m s 弹性印章将- n h 2 修饰 的生物素印刷在薄膜表面，从而在梳状聚合物表面形成了图案化的生物素，进 而控制成纤维细胞在图案区域的黏附与生长。m a 等【”】通过l x c p 在金基底表面制 得微米或纳米级的可引发原子转移自由基聚合的引发剂图案，进而得到聚( 甲 基丙烯酸( 齐聚乙二醇) 酯) ( p o l y ( o e s m a ) ) 图案化表面。蛋白质吸附实验表 6 武汉理工大学硕十学位论文 明，蛋白质只吸附在p o l y ( o e s m a ) 医 案的间隙，形成蛋白质图案，在纤连蛋白 图案表面进行细胞培养则可以形成细胞图案。 l 制作刚性硬模板 匿夔蓥圈s 删i 0 2 , 胶s i 訾属 图1 2p d m s 弹性印章加工过程示意图 1 3 2 2 紫外光刻( u l t r a v i o l e tl i t h o g r a p h y ) 紫外光刻与传统光刻的原理类似，是把掩模上的图案转移至基材表面的过 程。以采用光刻胶的体系为例，光刻涉及的设备与材料主要包括紫外光源、光 刻胶、掩模和基材。光刻过程如图1 3 所示，首先在基材表面涂覆一层光刻胶， 然后在其上放置带有图案结构的掩模，暴露出来的光刻胶将会受到紫外光的照 射。对于正性光刻胶，受到光照的区域相对于未受到光照的区域在显影剂溶液 中更易于溶解；而对于负性光刻胶，受到光照的区域不溶解于显影剂溶液。所 得到的光刻胶图案将作为掩模来图案化目标物质，常用的目标物质是硅烷类， 当硅烷结合在暴露出的基材表面后，通过在丙酮中超声清洗将作为掩模的光刻 胶去除，这些原先被光刻胶覆盖的区域可以结合另一种所需的物质，例如排斥 或促进蛋白质吸附、细胞黏附的物质。 s t e n g e r 等【3 4 】用紫外光照射n h 2 ( c h 2 ) 2 n h ( c h a ) 3 s i ( o c h 3 ) 3 ( e d a ) 单分子 层，通过与全氟化烷基硅烷的反应，在紫外光照的区域形成疏水表面以抑制细 胞在该区域的黏附，进而控制细胞黏附的位置，引导大鼠海马神经元和猪主动 脉内皮细胞的生长。m a t s u z a w a 等【3 5 1 采用类似的方法，紫外光照涂覆有十八烷基 三氯硅烷( o t s ) 的玻璃基材，通过与e d a 的反应回填紫外光照的区域，由此 形成的图案表面用于人神经母细胞瘤细胞的培养，该方法为在体外构筑具有可 控几何形状的神经网络提供了可能。p o t e m b e r 等【3 6 】使用紫外光照射o t s 自组 装单分子层，受到光照的区域用三氨基丙基三乙氧基硅烷修饰，通过合成的多 7 武汉理工大学硕士学位论文 肽与氨基间的化学反应得到图案化生物分子的表面，这种表面促进了胚胎大鼠 海马神经元的增殖。 产物豳磁弦嬲嬲翱翱翔物蕊翻嬲鼍覆盖光刻胶的基材 紫外光照 豳翟圈弦物弦物弦豳 il 图案化的光刻驳 沉积目标物质 鏊彗遨i滋i 。 |l 除去光刻胶 图1 3 紫外光刻过程示意图 紫外光刻是在材料表面引入拓扑图案结构的主要手段，采用该方法可以获 得亚微米尺度的精确图案。但是，紫外光刻需要贵重的仪器设备，不适合在普 通实验室中推广。此外，在光刻过程中所使用的化学物质，有些对细胞产生毒 副作用，有些会使生物分子变性。这些缺陷限制了紫外光刻在生物医用领域的 应用。 1 3 2 3 其他方法 亚微米级单分散的胶体微球在重力p 7 】、静电力网和毛细力p 9 1 的作用下可以 通过静态自组装形成二维或三维有序排列图案，这些有序排列的微球聚集体通 常称为胶体晶体( c o l l o i d a lc r y s t a l s ) 。胶体晶体是一类在很多领域都非常有用的 先进材料，例如作为构造有序大孔材料的模板【4 0 】、生物和化学传感器的基材】 等。在生物医用领域，y a p 4 2 】等人