（分析化学专业论文）压电生物传感器及其采集分析系统的研究.pdf

重庆大学硕士学位论文 中文摘要 摘要 本论文主要包括两大部分：第一部分构建了压电生物传感器及压电生物传感 实时分析仪，并考察了压电生物传感器及压电生物传感实时分析仪的稳定性能； 第二部分进行了压电生物传感实时分析仪在核酸分析以及抗原抗体分析中的初步 应用，并根据实验数据建立了压电生物传感实时分析仪数据分析数学模型。 第一部分，在实验室研究基础上，根据压电石英晶体微天平的原理，以及压 电生物传感器的基本原理，设计了新一代的传感器及传感器振荡电路，大大提高 了传感器的稳定性，灵敏度和检测范围；构建了基于复杂可编程逻辑器件( c p l d ) 和r s 2 3 2 串行通信的压电生物传感实时分析仪。压电生物传感实时分析仪的硬件 整体设计小巧轻便，可插件少，焊点少，大大提高了系统的稳定性，也降低了系 统的维护和维修费用：并在w i n 3 2 平台下由软件实现实时动态数据采集，显示所 采集数据曲线，并以文本或图形形式存储数据，之后使用集成的分析软件分析报 告检测结果；最后通过进行无水乙醇氯霉素溶液的挥发实验，对压电生物传感实 时分析仪的性能做了考察，简单验证了s a u e r b r e y 方程式，传感器的实测响应与通 过方程式所计算得到的理论值基本吻合。 第二部分，在核酸分析的初步应用中，根据基因杂交反应的特点，提出了动 力学初始速率法模型和平衡法模型。在抗原抗体检测的初步应用中，根据复杂溶 液体系中压电生物传感器响应信号，讨论了质量、粘度与频率响应之间的近似关 系式。在固定抗体检测抗血清实验中，抗原抗体的结合过程可以真实的被压电生 物传感实时分析仪动态实时监测，其真实反应信号与背景缓冲溶液有显著差异。 通过后期的大量实验验证，仪器性能的进一步完善，对压电生物传感实时分 析仪进一步改进，增加进样系统，恒温系统，校正系统等，并将c p l d 升级为大 容量f p g a ，升级为多通道生物分析系统后，压电生物传感实时分析平台可应用于 生物分析检测各个领域，并满足应用科研研究和l i 盎床研究的要求。 关键词：压电，生物传感器，c p l d ，串行通信，核酸，抗原抗体 重庆大学硕士学位论文英文摘要 a b s t r a c t t h i st h e s i sm a i n l yc o n s i s t so ft w op a r t s i nt h ef i r s tp a r t ，t h ep i e z o e l e c t r i c b i o s e n s o r sa n dt h em i n ip i e z o e l e c t r i cb i o l o g i c a la n a l y z ep l a t f o r mw e r em a d eu p a n dt h e p e r f o r m a n c eo ft h es y s t e mw a si n v e s t i g a t e d ；i nt h es e c o n dp a r t , t h es y s t e mw a sa p p l i e d i nd n aa n a l y s i sa n da n t i g e n a n t i b o d ya n a l y s i sp r i m a r i l y a n dt h em a t h e m a t i cm o d e lo f t h es y s t e mw a se s t a b l i s h e da c c o r d i n gt ot h ee x p e r i m e n td a t 乳 i nt h ef i r s tp a r t o nt h eb a s i so fo u rl a b o r a t o r y sr e s e a r c h an e wb i o s e n s o ra n di t s w o r kc i r c u i tw e r ed e s i g n e di nt h el i n eo ft h ep r i n c i p l eo fp i e z o e l e c t r i cq u a r t zc r y s t a l s m i c r o b a l a n c e ( p q c m ) a n dp i e z o e l e c t r i cb i o s e n s o r s ，w h i c hi m p r o v e dt h es t e a d y p e r f o r m a n c eo ft h eb i o s e n s o rg r e a t l y am i n ip i e z o e l e c t r i cb i o l o g i c a la n a l y z ep l a t f o r m b a s e do nc p l da n dr s 2 3 2s e r i a lc o m m u n i c a t i o nw e r em a d eu p 。w h i c hw a ss m a l l e r , m o r ec o n v e n i e n ta n dm o r er e l i a b l e i no r d e rt om a k eu s eo fc o m p u t e rt od e a lw i t l lt h e d a t u mf r o mt h ep i e z o e l e c t r i cb i o l o g i c a la n a l y z ep l a t f o r m ，as o f tw a sd e s i g n e di nw i n 3 2 ， w h i c hc o u l dd i s p l a yt h es a m p l i n gc u r v er e a l t i m ea n do n l i n e n ed a t ac o u l db es t o r e d i nt h ef o r mo ft e x to rp i c t u r e a n dt h ea n a l y s i sr e s u l tc o u l db er e p o s e do rp r i n t e d f i n a l l y t h en e wp l a t f o r m sp e r f o r m a n c ei sr e v i e w e db ym e a n so fa b s o l u t ee t h y la l c o h o l v o l a t i l i t ye x p e r i m e n t t h er e s p o n s eo f b i o s e n s o ro n t h e s p o ts u r v e yw a sa c c o r dw i t ht h e v a l h ec a l c u l a t e db yt h es a n e r b r e ye q u a t i o n i nt h es e c o n dp a r t , i nt h ep r e l i m i n a r ya p p l i c a t i o no fd n aa n a l y s i s d y n a m i c s m o d e la n db a l a n c em o d e lw e r ed u tf o r w a r dt oe x p l a i na n da n a l y z et h ed a t aa c c o r d i n gt o t h ec h a r a c t e ro fd n ah y b r i d i z er e a c t i o n i nt h e p r e l i m i n a r ya p p l i c a t i o n o f a n t i g e n a n t i b o d ya n a l y s i s ，t h er e l a t i o n s h i p o fn l a s s ，v i s c o s i t ya n df r e q u e n c yw a s d i s c u s s e da c c o r d i n gt ot h eb i o s e n s o rr e s p o n s es i g ni nc o m p l e xl i q u i d i ni m m o b i l i z e d a n t i b o d yt od e t e c ta n t i s e r u me x p e r i m e n t t h ep r o c e s so fa n t i b o d yb i n d i n gw i t l la n t i g e n e o u l db em o n i t o r e dr e a l t i m e t h e r ew a so b v i o u s l yd i f f e r e n tb e t w e e nt h er e a c t i o ns i g n a n db l a n ks i g n s ob ym e a n so fd o i n ga b t m d a n c eo fe x p e r i m e n t ，i m p r o v i n gt h ep e r f o r m a n c eo ft h e s 3 s t e mf u r l h e r r a i n ip i e z o e l e c t r i cb i o l o g a c a la n a l y z ep l a t f 0 1 t nc o u l db ew i d e l yu s e di n s c i e n t i f i cr e s e a r c h ，f o o ds a f e ，e n v i r o n m e n t a lm o n i t o r i n g a n dc l i n i c a lm e d i c i n ee ta 1 k e y w o r d s ：p i e z o e l e c t r i c ，b i o s e n s o r , c p l d ，s e r i a lc o m m u n i c a t i o n ，n u c l e i ca c i d ， a n t i b o d y a n t i g e n 重庆大学硕士学位论文1 绪论 l 绪论 生物传感器概述 传感器有时也称为换能器、变换器、变送器或探测器。根据我国指定的国家 标准( g b 7 6 6 5 8 7 ) ，传感器是指：“能接受( 或响应) 规定的被测量，并按照一定 规律转换成可用信号输出的器件或装置”。所谓传感器，是指那些能够取代甚至超 出人的“五官”，具有视觉、听觉、触觉、嗅觉和味觉等功能的元器件或装置。它通 常由敏感元件、转换元件及相应的机械结构和电子线路所组成。 以生物活性物质为敏感材料做成的传感器叫生物传感器。它以生物分子去识 别被测目标，然后将生物分子所发生的物理或化学变化转化为相应的电信号，予 以放大输出，从而得到检测结果。生物体内存在彼此间有特殊亲和力的物质对， 如酶与底物、抗原与抗体、激素与受体等，若将这些物质对的一方用固定化技术 固定在载体膜上作为分子识别元件( 敏感元件) ，则能有选择性地检测另一方。生 物传感器就是通过这种原理做成的。 生物传感器的选择性与分子识别元件有关，取决于与载体相结合的生物活性物 质。为了提高生物传感器的灵敏度，可利用化学放大功能。所谓化学放大功能， 就是使一种物质通过催化、循环或倍增的机理同一种试剂作用产生出相对大量的 产物。传感器的信号转换能力取决于所采用的转换器。根据器件信号转换的方式 可分为：( 1 ) 直接产生电信号；( 2 ) 化学变化转换为电信号；( 3 ) 热变化转换为电信号； ( 4 ) 光变化转换为电信号：( 5 ) 界面光学参数变化转换为电信号。 通常，根据分子识别元件划分生物传感器的类别。生物传感器分为酶传感器 ( 固定化酶) 、免疫传感器( 固定化抗体) 、基因传感器( 固定化单链核酸) 、微生 物传感器( 固定化微生物) 、细胞传感器( 固定化细胞器) 和组织传感器( 固定化 生物体组织) 。 生物传感器从上世纪六十年代初期开始发展起来，最先主要研究各种酶电极。 上世纪进入八十年代后，商品化的传感器相继问世。目前，这类传感器用于血糖、 鱼鲜度、b o d 、a t p 酶等的监测多达上百种，其中酶传感器占很大比例。而且应 用表面等离子体( s p r 技术) 【1 2 j 、生物发光、图形识别等技术的生物传感器层出 不穷。每年生物传感器销售额达数亿美元。由于生物传感器具有灵敏度高、选择 性好、响应快、测定简便迅速及微型化( 能直接插入生物体内进行检测) 等特点， 已广泛应用于医疗、环保、食品、化工、农林牧、发酵以及人口控制等领域，前 景十分广阔。 重庆人学硕士学位论文1 绪论 1 2 压电生物传感器的研究状况及应用 压电石英晶体最初被用来制作微天平，它可以测出很微小的质量变化，理论 上可以达到p g 级口1 。利用压电石英晶体微天平原理制作的压电生物传感器最先应 用于免疫学领域。压电免疫传感器的基本原理就是将抗体或抗原固定于石英晶体 电极表面，利用抗原与抗体的特异亲合反应，当待测的抗原或抗体与所固定的识 别物相互作用而产生特异性吸附时，就会导致晶体表面质量负载的增加，所吸附 的抗体或抗原的量可以通过传感器的频率变化加以监测。因为压电传感器测定的 是质量变化，无需经典的免疫分析方法如放射性同位素标记法及酶联耦合方法中 的标记和分离步骤，可以简化分析操作程序，提高分析检测速度。 早在1 9 7 2 年，s h o n s 等【4 1 便以抗原( 牛血清蛋白，马p 球蛋白) 作为晶体涂层， 用于检测溶液中的抗体活性。由于当时压电传感器只能在气相中振荡，因此需抗 体吸附于晶体表面并干燥后才能进行质量测定。 r o e d e r e r 等【5 】人直接在溶液中进行测定工作，他们以硅烷修饰晶体表面以获得 对蛋白质高度亲和的表面后，再将a n t i i g g 固定于晶体表面以测定溶液中的i g g 。 和其它免疫化学传感器一样，抗原或抗体的固定化技术是制各免疫传感器的关键。 固定化过程既要把目标蛋白质固定于载体表面，又需要保留蛋白质的活性。在压 电晶体表面直接固定蛋白质易导致蛋白质的失活，因此一般需要对晶体表面先进 行修饰，然后再在修饰层上固定抗体或抗原 6 1 。 目前，压电免疫传感器的研究工作主要集中在试验新的固定化方法方面。固 定化蛋白质的方法可分为三类： ( 1 ) 包埋法。这种固定方法采用的是将蛋白质直接包埋入密闭性或多孔性聚合 物中的方法进行固定。根据聚合物的不同又分为格子型和为微胶囊型。格子型是 利用一种具有网目构造的的高分子胶体格子，或具有直锁状的高分子，将酵素、 菌体、或蛋白质分子包覆的方法。微胶囊型是将酵素、蛋白质包覆于小胶囊或小 珠粒中。制造微胶囊的的方法有界面聚合法、乳化法、界面沉淀法等。m i c h i a k i 等【7 1 研究了用- - - k , 烯基苯( d v b ) ，乳化剂s p a n 8 0 和2 ，2 偶氮基- 2 ，4 二甲基 戊氰制备了d v b 均聚物微囊，用聚丙烯制备了有机聚合物微囊，并用硅酸钠制各 了无机胶囊，并对这些有机和无机微囊固定化酶催化三奶油酯的水解进行了探讨。 ( 2 ) 载体结合法。将蛋白质固定在不溶性载体上的固定方法叫载体结合法。根 据成键特性不同，又分为共价键和离子键法。共价键法是将不溶性载体与蛋白质 分子以共价键结合形式结合成固定化蛋白质的方法。共价键法是固定化蛋白质过 程中最活跃的一类方法。y o s h i h a r u 等【8 1 报道了通过碳二亚胺或戊二醛将脂肪酶固 定在多孔无机支持物、- 叮控孔玻璃或球状硅石的烷基胺衍生物上，结果表明，使 用碳二亚胺固定化脂肪酶取得较高的固定化酶活力和较好的稳定性。a l e x a n d e r 等 重庆大学硕士学位论文1 绪论 1 9 研究了聚砜膜被缩水甘油一4 一氧庚醚转化成环氧化物，然后与亚胺二乙酸( i d a ) 反应生成带有双配基的膜，再与c u ”、n i 2 + 或z n ”形成螯合物，这种螯合物对氨基 酸有亲和作用，可用于酶的固定化。刘新喜1 1o j 研究了高碘酸法在石棉纤维膜上固 定脂肪酶的方法，以n a l 0 4 断裂棉纤维的连二醇产生的醛基与酶以化学键结合， 其方法简单、固定化脂肪酶的牢固性较强，得到的固定化酶活力活力较高。离子 键法是利用蛋白质离子化的性质，将蛋白质以离子化的形式结合于离子交换体的 方法。在蛋白质的反应中，缓冲溶液的种类、酸碱值、离子强度、温度等等都会 对固定化的效率和脱离产生很大的影响。 ( 3 ) 交联法。交联法是将蛋白质互相连接具有反应性多官能团的交联剂，使之 间发生交联结构的固定的方法。常采用的交联剂有戊二醛、六甲撑异氰酸盐等。 其中以戊二醛应用最广。戊二醛常用来固定蛋白酶、羧肽酶、磷酸酶、葡萄糖氧 化酶。六甲撑异氰酸盐用来固定胰蛋白酶、淀粉酶和核糖核酸酶和淀粉酶。 a l e x a n d e r 等一j 用2 5 的戊二醛和0 1m 的p b s 溶液混合，浸泡y 一氨基丙烯硅制戊 二醛活化硅，然后固定化脂肪酶，得到最大固定化酶，其操作稳定性良好。 c a m e i r o d a c u n d a 等【l l j 报道了用尼龙、聚氨基甲酸乙酯及壳聚糖作载体，戊二醛作 多功能试剂固定化脂肪酶。杨帆等f 12 】用氨基偶联法在c m 5 传感片上固定肿瘤坏死 因子单克隆抗体。h b s f p 作为流动缓冲液以恒定流速流过传感片，传感片先用 n h s 、e d c 溶液活化，单抗用缓冲溶液稀释成效价为l ：1 0 ，注射与活化的传感片 的表面进行固定，最后用乙醇氨封闭未反应的n h s 酯。这类方法的优点是蛋白质 与载体结合牢固，不易脱落，稳定性较高，试剂价格低廉，固定化成本低；此类 方法是固定化蛋白质分子研究中最有潜力的方法。缺点是有的方法固定化操作较 复杂，进行化学修饰时，易造成酵素失活。 ( 4 ) 物理吸附法。它是采用不溶性载体如活性碳，多孔玻璃、氧化铝、硅胶等 将蛋白吸附而固定化的一种方法。这种方法依靠分子问的范德华力、静电力和亲 和性的物理性质吸附蛋白质。m a r t i n 等l ”j 用亲水性载体玻璃羊绒、多孔玻璃和漂 白土以及疏水性载体c 1 8 漂白和l i c h r o s o b r p 1 8 吸附法固定脂肪酶。t s u n e o 等【1 4 】 研究了两亲型固定化凝胶( o c t y l s e p h a r o s e c l 4 b 和p h e n y l s e p h a r o s e c l 一4 b ) 吸附法 固定化脂肪酶其固定化效率为9 6 8 9 9 6 。张军等1 15 j 对无机和有机的1 8 种载体吸附 法固定化脂肪酶进行了研究，其中，无机载体包括硅藻土、石英砂、硅胶g 、活 性氧化钙、皂土：有机载体包括琼脂粉、明胶、大豆蛋白和酸型、碱型及吸附型 离子交换树脂等，研究结果表明：硅藻土是较好的载体，固定后的脂肪酶酯化反 应速度快，酯化率较高；在同等条件下，吸附型树脂d x 一1 和皂土的相对酯化速度 为硅藻jj 二的5 8 5 f n1 2 6 。由于要依靠蛋白质和载体间的结合力连接，作用力较弱， 易脱落，因此，只能适用于活力很高的蛋白质，如淀粉酶、胃蛋白酶、溶菌酶。 重庆大学硕十学位论文 1 绪论 并且容易因外界环境温度、酸碱值、溶液中的离子强度的影响而导致蛋白质的脱 落。但载体的选择范围广，固定化操作简单，吸附法是经济上最具有吸引力的固 定化方法。 近年来发展了许多新得酶及蛋白质固定的方法，自2 0 世纪7 0 年代引入免疫 化学后，生物素一亲和和素体系( b a s ) 形成了具有发展前途的体系i l “。由于生物 素和亲和素结合速度快、结合物稳定性高、生物素分子易于活化；而且此体系运 用方法灵活多变，适合不同的设计要求。近来b a s 在传感器中的应用很多，主要 是本身的固定化和应用b a s 固定生物物质的研究。这种方法通过生物素一抗生素- 生物素的分子夹心进行固定。具体来说，就是在电极表面连接一个亲水性基团， 并在另一端的术端自由氨基用磺基- n h s 生物素进行生物素化，然后抗生素连接到 相应的空间位置上，生物素化的氰水解酶通过抗生素生物素反应固定上去。这种 固定方法可靠，操作可以控制，其他的酶也可以通过这种方法固定。高志贤等m 1 人则采用3 ，3 一二巯基硫代丙酸的金电极自组装技术，用e d c 和n h s 偶联剂将 亲和索固定于电极上。生物素方法是现在应用比较普遍的固定方法，并且生物素 化的操作简单，不需要复杂和昂贵的仪器。很多情况下，可以直接把生物素加入 溶液中，生物素化一定时间后，可以用氨基乙酸与过量的生物素反应，或用凝胶 过滤或透析的方法移去未反应的生物素。常用的生物素是n h s l c b i o t i n 。金表面 自组装技术固定生物分子既可用电化学检测、也可用光学检测和质量检测，因而 进年来用金表面自组装技术固定生物分子的研究越来越多。其原理是利用紧硫键 固定含硫基的化合物，然后用偶联剂将生物分子固定在金表面，或者直接将有巯 基的生物分子固定在金表面。姜雄平等【1 8 l 报道了在会表面自组装成n 乙酰半胱胺 酸单分子层在金表面进行抗原、抗体的固定。在饱和湿度下，将n - 乙酰半胱胺酸 水溶液滴加于洁净石英金膜表面，室温放置，使其在金表面自组装成n 乙酰半胱 胺酸单分子层，用水洗去未组装的n 乙酰半胱胺酸，立即滴加e d c 和n h s 溶液 ( 均以1 0 m m 的p b s 配制) 使单分子中的羧基与e d c 和n h s 反应生成活泼的酯， 过量的e d c 和n h s 滴加兔i g g 或山羊抗兔i g g 溶液，于4 。c 及饱和湿度下放置过 夜，使单分子层中的活泼酯与兔i g g 或山羊抗兔 9 6 的氨基生成酰胺键，以固定 兔i g g 或山羊抗兔i g g ，用水洗去未固定的i g g 或山羊抗兔i g g ，滴加封闭液，以 封闭未反应的活泼酯基团。陈泽忠等【1 9 】采用用自组装单分子膜技术，在压电石英 晶体表面形成半胱胺膜，通过戊二醛共价交联，将乙肝表面抗原单克隆抗体分子 固定在电极表面，研制成h b s a g 压电免疫传感器。在金电极表面先用p i r a n h a 溶液 和水清洗后，用胱胺溶液浸泡2 小时，洗涤后转入5 的戊二醛溶液中浸泡1 小时， 清洗晾干后，滴加乙肝表面抗原单克隆抗体溶液，放置l 小时后，洗涤，至于o 2 m 的赖氨酸溶液中浸泡3 0 分钟，封闭残余醛基，这样石英晶体就修饰有抗体。 4 重庆人学硕士学位论文 1 绪论 近年来，含有生物分子的特定超薄膜的组装以成为一个新的研究热点，其研 究会极大地促进生物传感器、生物电子、生物膜等领域的研究。通过链亲和素一生 物素层层组装的技术可实现对酶固定的精确控制以及生物分子超薄膜的制备。裴 仁军等【2 0 1 研究了使用生物分子相互作用分析技术实时检测了在链霉亲和素表面层 层组装亲和素生物素抗体的多层膜的过程，并用实时b i a 技术求得每层蛋白质的 表面浓度。 等离子体聚合膜是近年来出现的一种新的应用于传感器的蛋白质固定的技 术。等离子聚合膜( p l a s m a p o l y m e d z e df i l m ) 是由有机蒸气在辉光放电下聚合而 成的，这种高度交联的膜具有均匀、超薄、附着力强、化学稳定性好、机械性能 良好、基质类型多样以及成膜有机物品多样等优点。许多有机物，特别是那些带 有生物生物活性的基团( 如_ n h 2 、o h 、c o o h 和s h 等) 。目前，所研制的传感 器己用于有机气体的测定，k a r u b e 小组报道了乙烯二胺等离子体共聚体聚合膜在 免疫传感器方面的应用1 2 ”，但这种方法由于抗体直接共价键结合到等离子体聚合 膜上，无法洗脱，等离子体聚合修饰膜的传感器不能再生，而不同批次沉积的等 离子体聚合膜其交联毒、活性基团等又不一致，影响了传感器的响应特性。王桦 等1 2 2 1 人则采用在石英晶体上沉积一层正丁胺聚合膜，再在膜上自组装一层易再生 的、带负电的聚电解质，调节抗体溶液的p h 值使其带正电，经静电吸附包被抗体 后用以测定抗原。用这种方法在压电传感器的的石英晶体表面固定了转铁蛋白抗 血清，用于转铁蛋白血清( 抗原) 。 为了平，衡传统单一固定化方法使用中的优缺点，联合固定化的应用现在也有 了较多的报道。包埋一交联法应用较早，含青霉素酰化酶的大肠杆菌及含天冬门酸 的大肠杆菌等分别先用明胶包埋，再用戊二醛交联有很好的效果田j 。吸附一交联法、 凝聚交联法、包埋共价结合法均有取得良好效果的报道。而磁、光、辐射、声等 物理新手段为固定新方法的应用及传统方法的改进提供了良好的条件。超声波固 定化方法在克服加热或反应防热可能导致酶的活性下降方面有良好的效果，固定 化反应不仅可在温和的条件下进行而可在随反应温度的降低加速反应。另外，辐 射技术应用于蛋白质的固定化都有了报道。 另外，有关压电免疫传感器的响应理论也有不少研究。由于生物大分子具有 一定的粘弹性，很难满足s a u e r b r e y 方程所要求的刚性条件，同时免疫反应除在晶 体电极上增加质量外，还会引起电极溶液界面粘度的变化，因此结合到传感器表 面的抗原或抗体的质量与传感器的频率下降值不再是简单的线性关系。在涂层较 厚的情况卜，甚至出现抗体抗原反应后频率反而卜升的现象。r i c k e r t 等1 2 4j 在石英 晶体表面构造抗原抗体多层蛋白质( 最多达2 0 层) ，结果发现传感器对蛋白质的质 量响应的灵敏度随蛋白质离晶体表面的距离增加而线性衰减。 重庆大学硕十学位论文 1 绪论 压电生物传感器也是较早被尝试用于d n a 分子杂交检测的。早在1 9 8 8 年， f a w c e r 等【2 5 1 就报道了d n a 压电生物传感器的初步研究结果。他们利用压电生物 传感器发现固定在石英晶体表面的基因杂交后会引起共振频率的明显变化，并利 用晶体振荡频率的变化测定靶核酸量。先将单链寡核苷酸固定在压电晶体表面， 然后暴露在单链互补序列中，经过一段充裕时间的杂交后检测其共振频率，通过 振荡频率变化说明杂交的程度。他们研究当用9m h z 的a t 切割石英晶体表面结 合的p o l y ( u ) 与溶液中互补的p o l y ( a ) 互补杂交时，共振频率降低了5 0 0 h z 。 过去d n a 压电生物传感器多是比较杂交前后传感器干燥表面的质量变化进行 检测。随着液相压电传感技术的成熟，通过现场监测杂交过程，使d n a 压电生物 传感器更为简便和快捷：同时也可进行表面杂交过程动力学的研究，为d n a 压电 生物传感器的优化提供依据，这方面率先展开研究的是o k a h a t a 实验室。在f a w c e r 的基础上，日本o k a h a t a 等【2 6 j 人采用a t 切割9 m h z 镀金的石英晶体，利用含有1 0 个碱基能与单链m 1 3 噬菌体d n a 的e c o ri 结合位点互补的脱氧核糖核苷酸作为 探针，研究了杂交引起的频率随时间的变化情况，获得了满意的结果。同时，他 们还研究了不完全互补靶d n a 的杂交情况。结果表明，当有几个连续的互补碱基 存在时，也可以进行杂交，但随着互补碱基的数量下降杂交也变得越来越不稳定， 他们测定了1 0 m e r 到3 0 一m e r 寡核苷酸双链互补结合的平衡常数、结合及离解的速 率常数等动力学参数以及表面的杂交结合量；并通过改变探针的固定方法、探针 和靶基因的长度、错配的碱基数、杂交温度、杂交液离子强度等因素，详细研究 了传感器表面杂交过程动力学特性【2 ”。 i t o 等【2 8 】观察了溶液酸碱度对d n a 连接的影响，发现在酸性或碱性条件下， d n a 探针连在电极上的量最多，而在中性溶液中，d n a 杂交效果最好。还发现将 双链d n a 连在电极上之后加热变性成单链，比单链d n a 直接连在电极上杂交的 d n a 量多。他们认为出现这种差异可能是由于连在电极上的单链d n a 所产生的 杂交空间位阻比双链d n a 大所致。 e b e m o l e 等 2 9 1 采用亲和素和链亲和素固定生物涂层的方法测定了单纯疱疹病 毒的核酸目标段。s u 等【3 0 i 在石英晶体表面固定d n a ，用于检测抗癌铂药物的含量， 检测限为1 0 7 m o l l ，并检测了顺铂和反铂药物与d n a 的不同作用过程。 y a m a g u c h i i3 1 l 用阻抗分析和等效电路技术研究了d n a 在电极上的吸附、固定化及 杂交过程，所得结果满意。n i c o l i l i 等1 3 2 j 用l b 膜技术在石英谐振器上沉积得到与 脂肪胺混合的单链d n a 的单分子层，有很好的杂交反应活性。n i i k u r a l 3 3 1 用生物素 一亲合素的固定化方法，将模板和引物固定在2 7m h z 镀金的压电石英晶体电极上， 然后在电极上直接进行p c r 反应，直接在液相定量检测p c r 的每一步反应。首先 将扩增时所需的引物d n a 单链固定在压电石英晶体的电极上，此时质量增加，频 6 重庆大学硕十学位论文 绪论 率变小。延伸时沿着模板d n a 的单链进行碱基互补，质量继续增加，频率继续变 小。接着从聚合的d n a 中将酶释放出来，质量减小，频率增加。这样通过压电 d n a 生物传感器频率的变化可以对p c r 的整个反应过程的每一步反应进行动态 监测，如结合的酶量、延伸率以及从完全聚合的d n a 中释放的酶量等。 压电生物传感器在微生物方面检测主要利用其非质量型效应。在液相，压电 石英晶体传感器可以对液体的粘度、密度、电导率和介电常数的变化给出相当灵 敏的响应，而这些是用质量型压电生物传感器无法实现类似目标的。根据细胞在 培养液中的状态可以把细胞分为悬浮细胞和贴壁细胞。贴壁细胞顾名思义就是在 培养器皿的壁上生长，细胞的分裂生长过程对应于器壁的质量增加过程，故可以 利用压电传感器的质量特性对细胞生长过程进行监测。r e d e p e n n i n g 等i j 4 j 用压电传 感器对成骨细胞o s t e o b l a s t s 的贴壁速率进行了监测，并用扫描电子显微镜测定细胞 的表面覆盖率，结果发现晶体的频率下降值与晶体表面细胞的覆盖率有线性关系， 但信号主要来自细胞贴壁所导致的表面粘度变化，因此s a u e r b r e y 方程不成立。这 一结果也在预料之中，因为细胞的典型直径约为l o p m ，比压电晶体表面声波的作 用距离大得多，细胞中只有贴壁的一小部分参与晶体的振荡；另外，细胞在表面 不是均匀刚性膜，而且细胞含大量的细胞浆，在溶液中细胞还受溶液的浮力作用。 由于在细胞与晶体的作用中，粘弹性的作用大于质量作用，所以在压电传感 器的检测方式上，除采用频率外还以阻抗分析法测量与能量损耗有关的参数【3 。3 6 1o 此外，细菌生长过程中的新陈代谢作用也会改变培养基的物理活性参数如粘 度等，这一现象也可用压电传感器加以监测i j7 ，”j 。 在临床医学中，血液流变检测是一个重要的检验项目，对于一些疾病的诊 断它可提供重要的参考依据。目前已建立几种新型的血液流变压电检测方法。 它们都是根据传感器对血液粘弹性或粘密度变化的响应所作出的。这些方法已被 用于下列方面：血流粘性或粘弹流变性质的测定【3 9 】、血液凝固过程和血浆凝胶纤 湾流变过程的监测【40 、血液凝血因子活性的测定、红细胞低渗溶血过程和血液红 细胞聚集沉降行为的监测等。此外还用于红细胞细胞质电导率及红细胞形状因子， 以及红血球比积的测定【4 “3 1 。 压电生物传感器不需使用如荧光剂、放射性物质等的标定物质，即可达到检 测的目的，适用的生物分子，包括了蛋白质蛋白质、抗原抗体、酶受体、药物 受体、核酸核酸、核酸蛋白质等具有相互作用力反应的分子，因此越来越受到科 研工作者的关注。 1 3 压电生物传感器的分析系统研究现况 何锡文等1 4 4 , 4 5 1 用7 个压电晶体组成传感器阵列，实验室自行设计研制频率测量 重庆人学硕士学位论文 1 绪论 用振荡电路和数据采集系统，并研究了一种利用微机控制测量和采集压电晶体传 感器阵列振荡频率的智能型仪器1 4 州。介绍了其硬件及数据采集系统软件的功能、 结构等。仪器精度高，稳定性好，阵列中晶体个数可在1 1 2 问改变，可实现在线 观察频率变化，且数据可存储，为应用传感器阵列进行混合物测定、复杂物质分 类及观察响应信号的动力学变化提供了有力的测定手段。 吴晓娟等【4 7 】利用利用石英晶体的共振频率随晶片附着物质量的变化而变化的 原理，采用频差检测方法。将压电石英晶体作为质量传感器，设计出了测定物质 质量微变化的检测系统，并成功地应用于金溶胶在石英晶体电极上沉积过程的在 线测量中。该系统频率测量电路是以8 9 c 5 1 为核心用以检测频率差值，并将检测到 的数据送入p c 机的r s _ _ 2 3 2 接口，传送波特率为9 6 0 0 比特，具有全双工异步通讯 功能。p c 机实时数据监控系统采用w i n d o w s 界面下的图形工作方式，人机界面友 好，便于操作，并具有实时数据及测量图线打印功能。 胡继明等【4 8 j 自行设计并组装了使多道石英晶体传感器同时起振的高稳定度的 振荡电路及其智能分析仪，同时采用准确、简单的计数方式，用单片机系统进行 控制，实现了对多道反应的同步监测和显示。该分析仪弥补了单道检测的缺点， 操作简单、性能稳定、成本轻低，具有广泛的应用前景。 瑞典b e n g tk a s e m o 等【4 9 】成立的q s e n s ea b 公司研开发了q c m d 系统，采用 压电石英晶体微天平原理，来研究不同表面的分子相互作用以及分子吸收。其产 品q s e n s ed 3 0 0 已经应用于聚电化合物、蛋白质、血液凝聚等分析研究。 日本y o s h i oo k a h a t a 等删成立的同烟- 森研究室同s o g op h a r m a c e u t i c a lc o ， l t d ( 相互蕖工株式会社) 【5 l j 联合研制了生体分子问相互作用定量单通道q c m 装置 a f f m i x q 以及四通道q c m 装置a f f i n i x q 4 ，并应用于抗原，抗体反应，d n a 核酸检 测，膜表面分子结合以及细胞巨大分子的结合的分析研究。 台湾a n tt e c h n o l o g y 公司【52 j 研制了p s e n s o r2 0 0 0 系统，它是结合微电子高频 技术与生物辨视技术的一种高灵敏度生物感测器，应用于实时( r e a lt i m e ) 检测生物 分子间的作用力与生物分子的浓度，其包含了精密设计的注流系统( f i a ) ，方便的 操作软件，及可重复使用的检测芯片。 美国m a x t e k ，i n c 公司1 5 3 i 为压电传感器设计了传感器支架c h c c h 到c h t _ l o o ， 专门进样装置f c 一5 5 0f l o wc e l l 及其采集系统l i q u i dp l a t i n ga n de t c h i n gp r o d u c t s ： p m 7 0 0m o n i t o r ，其配置r s 2 3 2 计算机接口和数据分析软件。 德国i m o s ( i n s t i t u t ef o rm i c r o a n ds e n s o rs y s t e m s ) 研究组研制了单道及阵列式 压电传感器，用i m p e d a n z 分析卡来收集单道压电传感器信号，并应用于海洋水体 污染，废水污染物监测【5 ”。 压电生物传感器的以其响应的高灵敏性及其检测仪器数字化，自动化程度高 8 重庆大学硕十学位论文 1 绪论 的特点，受到全世界科研工作者的极其重视，渗透在医疗卫生，食品安全，环境 监测等与人和自然密切相关的各个领域内。 1 4 课题构思 本文主要研究开发以压电石英晶体为换能器件的生物传感器，以及为压电生 物传感器配套的压电生物传感实时分析仪，并进行该生物传感器在核酸分析和抗 原抗体分析上的初步应用研究，并根据实验数据提出数据处理的数学模型。 压电生物传感器的研究是在本实验室长期探索的基础上，对现有传感器的改 进，使其更适应于大规模现代电子产品生产，而且不降低其分析生物样品的灵敏 度和检测限。 根据科研需要，构建基于复杂可编程逻辑器件( c p l d ) 的生物分析平台。所 研制的生物分析平台便携式、微型化并保留了和w i n d o w s 平台的接口，可借助软 件系统的强大功能进行亲合反应的动力学和热力学研究。 最后对压电传感器及其采集分析系统性能进行评价，并进行压电生物传感器 在核酸分析和抗原抗体分析上的初步应用。在核酸分析中，提出解决核酸杂交反 应的两种数学模型动力学模型和平衡法模型。在抗原抗体分析中，由于压电 非质量效应增大，不能直接套用s a u e r b r e y 方程，因此提出解决抗原抗体结合分析 的修f 的方程。 本文在此领域的研究是在本试验室的已有研究基础上进行的。 重庆人学硕士学位论文2 压电生物传感器的原理及设计 2 压电生物传感器的原理及设计 2 1 引言 晶体受外界机械压力的作用，在其表面上产生电荷，当外力去掉后又回到不 带电的状态，这种现象被称为压电效应( p i e z o e l e c t r i ce f f e c t ，p i e z o 源自希腊文， 意为加压) 。1 8 8 0 年，p i e r r e 和j a c q u e sc u r i e s 首先发现石英等一些晶体的压电现象。 他们指出，晶体表面所形成的电荷和外加压力成正比。第二年末，他们证实了逆 压电效应，即晶体受电场作用时，可发生正比与电场强度的机械变形，而且正、 逆压电效应的压电系数相等。逆压电效应也称电致伸缩效应。 具有压电效应的电介质物质称为压电材料。在自然界中，大多数晶体都具有 压电效应。但多数晶体的压电效应过于微弱，没有实用价值。比较常见的压电材 料有四类：压电晶体、压电陶瓷、高分子压电材料和半导体材料。其中压电晶体 中石英晶体因其良好的机械、电化学和温度等综合性能，已成为压电传感器，特 别是压电化学生物传感器主要元件。 2 2 压电石英晶体微天平原理 石英晶体是机电耦合元件，是一个振动体，存在多个振动模式，最通常的振动 模式有：a 弯曲；b 伸缩；c 面切变：d 厚度切变。晶体振动时，晶体侧面的两个对 角线之一伸长，另一缩短，波节面经过晶片中央，并与主平面平行，此种剪切与 厚度有关，故叫厚度剪切。石英晶片可磨至很薄，因而厚度剪切模式的振荡频率 很高。化学与生物传感器常用石英晶体的厚度切变。 x x x 一电轴；y 一光轴；x 卜晶片平面；y 一晶片法线；e 一由x z 平面绕x 轴旋转的期 图2 1 石英晶体的厚度剪切振荡 f i g2ls h e a r i n gv i b r a t i o no fq u a r t zc r y s t a l 一石英晶体属于三方晶系3 2 ( d 2 ) 点群、结晶的各向异性体。它的各种性质： 电学、热学、弹性和压电等性质都与晶体的方向有关。压电性质取决于晶体的方 重庆人学硕士学位论文2 压电生物传感器的原理及设计 位，如晶体在z 方向就不具有压电性质；压电性能是x 方向大于y 方向，逆压电 性能则相反，是y 方向大于x 方向。在晶体坐标系中，按一定的方位切割，取得 一定尺寸的切型，石英晶体的切型如图2 _ 2 所示。石英晶体频率随温度变化的特性 与其切型有关，以a t 切型石英晶体为佳。在( - - 5 0 8 0 ) 范围内频率变化较小， 尤以两个拐点附近为优( 图2 3 ) 。压电化学或生物传感器中常用a t 切型石英晶体， 常用a t 切型晶体的频率为o 8 3 5 0 m h z 图2 2 压电石英的切型 f i g2 2c u t t i n go f q u a r t zc r y s t a l 群 | = h ：= ! = 斗十 5 t 、 i _ 上一 ，、 时 一 、n 【i ， 荸i 7 - 矿珏月一r 1tn hi j | 、j + 川一 t i li i 玉 d tz 一? ： i “_ z | 1 ? l ， + i- f l | ， l 孙 2 3 不同切型石英晶体的频温特性曲线 f i g2 3c u r v eo f f f e q u e n c yv s t e m p e r a t u r ea b o u td i f f e r e n tc u t t i n gc r y s t a l a t 切厚度切变模式压电石英晶体大多数采用垂直场激励方法。其振动频率与 重庆大学硕十学位论文2 压电生物传感器的原理及设计 晶片厚度有关，频率方程为： 驴笔再 式中t l 晶片厚度；n ：泛音次数；氏： 一旦厚度确定，晶体频率也就确定， 这一固有特性如图2 4 所示 n = 1 ，3 ，5 ( 2 1 ) 弹性常数；p ：晶体材料密度。 但同时也存在1 、3 、5 等多次泛音频率 畿基频群寄生瓣 ，z 二 f 图2 4 晶体的频率特性 f i g 2 4c h a r a c t e r i z a t i o no f c r y s t a lf r e q u e n c y 人们发现，当交变激励电压施加于压电晶体两侧的电极时，晶体会产生机械