（食品科学专业论文）陈皮提取物抗氧化活性的研究.pdf

摘要 本论文对陈皮提取物的抗氧化活性进行了系统全面的研究。 实验研究了通过最佳提取工艺条件制备的陈皮提取物中总黄酮 地含量，达2 4 4 3 ，并通过h p l c 分析测定了陈皮提取物中的一种主要 的抗氧化组分多甲氧基黄酮川陈皮素，其含量达0 13 4 。 通过实验研究了陈皮提取物的总抗氧化能力，其总抗氧化能力 与提取物浓度有很强的量效关系，线性关系显著，表明陈皮提取物 具有较强的抗氧化能力。 进一步研究了陈皮提取物对几种自由基的抑制作用，制备的陈 皮黄酮提取物对有机自由基( d p p h ) 、超氧阴离子自由基( 0 2 ) 、 羟自由基( o h ) 、h 2 0 2 及脂质过氧化都具有较强的抑制作用，有一 定的量效关系。 通过大鼠体外实验，研究了陈皮提取物对大鼠肝、肾自发性丙 二醛( m d a ) 的影响及h 2 0 2 诱导大鼠肝脂质过氧化的影响，结果显 示陈皮黄酮提取物对大鼠肝、肾自发性丙二醛( m d a ) 的影响及h 2 0 2 诱导大鼠肝脂质过氧化都具有显著作用。显著抑制丙二醛( m d a ) 的产生。 通过在t f 常小鼠体内抗氧化作用的实验，研究了陈皮提取物对 小鼠体重、血浆、组织的脂质过氧化、超氧化物歧化酶( s o d ) 、过 氧化氢酶( c a t ) 的影响，结果显示：与对照组比较，陈皮黄酮提取物对 小鼠体重无影响，而对小鼠体内丙二醛( m d a ) 的产生有显著抑制， 同时显著提高小鼠血浆、组织中超氧化物歧化酶( s o d ) 干i i 过氧化氢酶 ( c a t ) 的活性。 关键词：陈皮黄酮抗氧化活性 a b s t r a c t t h ea n t i o x i d a n ta c t i v i t yo fo r a n g ep e e le x t r a c t i o n sw a ss t u d i e da n da p p r m s e d s y s t e m a t i c a l l yi nt h i sp a p e r f i r s to fa l l - j u s tb a s e do nt h et o pa n t i o x i d a n t sa b s t r a c t i n gt e c h n o l o g y ，t h e f l a v o n o i d sw i t ht h et o t i ea m o u n to f 2 4 4 3 w e r ee x t r a c t e d 丘o mt h eo r a n g ep e e l t h e n p o l y m e t h o x y l a t e df l a v o n e s n o b i l e t i n ，t h em a i na m i o x i d a n t si nt h eo r a n g ep e e l e x t r a c t i o n sw a ga n a l y s e dt h r o u g hh p l ct o 也ea m o u n to f 0 1 3 4 b e s i d e s ，t h ee x p e r i m e n t so i lt h ea n t i o x i d a t i o no f o r a n g ep e e le x t r a c t i o n sp r o v e dt h a t i t st o t l ea n t i o x i d a t i o na c t i v i t yw a s m u c hr e l a t e dw i t hi t sc o n s i s t e n c y , a n dt h el i n e a r r e l a t i o nw a ss i g n i f i c a n t 订，er e s u l to f t h et e s t ss h o w e dt h a tt h eo r a n g ep e e le x t r a c t i o n s h a ds t r o n ga n t i o x i d a n ta c t i v i t y a n df u r t h e rs t u d i e sw e r ee x p l o r e dt ot h ei n h i b i t i o n so fo r a n g ep e e le x t r a c t i o n so n t h ed i f f e r e n tt y p e so ff r e er a d i c a l s i m i l a r l yr e l a t e d 、i mt h ec o n s i s t e n c y , t h eh i g h l y i n h i b i t o r ye f f e c t so f o r a n g ep e e le x t r a c t i o n so p d p p h ，s u p e r o x i d en e g i o n ( 0 2 ) a n d h y d r o x y lf r e er a d i c a l s ( o h ) ，h 2 0 2a n dl i p i d sp e r o x i d a t i o nw e r ec o n c l u d e d t h r o u g ht e s t so fo r a n g ep e e le x t r a c t i o n si nv i t r oo nt h er a t s ，g r e a ti n h i b i t o r y i n f l u e n c e s o fs p o n t a n e o u sm d ao nl i v e r sa n dk i d n e y s ，a n dh 2 0 2i n d u c e dl i p i d s p e r o x i d a t i o no fr a tl i v e r sw e r ep r o v e d ，a n dt h ep r o d u c t i o no fm d aw a si n h i b i t e d s i g n i f i c a n t l y f u r t h e r m o r e ，t h ee x p e r i m e n t so fa n t i o x i d a n ta c t i v i t yo nn o r m a lr a t sw e r ef u l f i l e d t os t u d yt h ee f f e c t so fo r a n g ep e e le x t r a c t i o n so nt h ew e i g h to fr a t , a n dl i p i d s p e r o x i d a t i o n ，s o d c a ti nt h es e r u ma n dt i s s u e sa sw e l l c o m p a r e d w i t ht h e c o n t r o l l e dg r o u p ，o r a n g ep e e le x t r a c t i o n sh a dn oi n f l u e n c e so i lt h ew e i g h to fr a t ，b u t g r e a t l yi n h i b i t e dt h ef o r m a t i o no fm d a i n s i d et 1 1 er a t s ，a n da t 血es a m et i m e ，e x c i t e d t h ea c t i v e so fs u p e r o x i d ed i s m u t a s e ( s o d ) a n dc a t a l a s e ( c a t li nt h es e r l l r na n d t i s s u e so f r a t s k e y w o r d s ：o r a n g ep e e l ；f l a v o n o i d s ；a n t i o x i d a n ta c t i v i t y 儿 独创性声明 本人声明所呈交的论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及 取得的研究成果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外， 论文中不包括其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得河 南工业大学或其他教育机构的学位或证书而使用过的材料。与我同工 作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表 示了谢意。 论文作者签名：丕鱼丞日期：弘叼0 r 关于论文使用授权的说明 本人完全了解河南工业大学有关保留、使用学位论文的规定， 即：学校有权保留送交论文的复印件，允许论文被查阅和借阅；本 人授权河南工业大学可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数 据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编 学位论文。( 保密的论文在解密后应遵守此规定) 论文作者签名：圣至 日期：圣翌： 导师签名： 日期： 陈皮提取物抗氧化活性的研究 1 1 研究目的和意义 第一章前言 近年来，随着我国的经济的不断发展，人们自匀l 生活水平逐渐地提高，我国的膳 食结构正由温饱型向小康型过渡。人们意识到健康与膳食结构有着密切相关的重要 性，再加上中国传统饮食文化和中医药理念就有药补不如食补，药食同源之说。保 健食品近年得到迅猛发展，保健食品已是2 1 世纪食品发展的潮流。 目前，对于保健食品的概念国际上还没有一个统一的定义，我国卫生部在1 9 9 6 年颁靠的保健食品管理办法中对保健食品的定义是：保健食品系指表明具有特 定保健功能的食品，适用于特定人群食用，具有调节作用，不以治疗疾病为目的的 食品。保健食品随着科学技术的发展，经历几个发展阶段：第一代是各种强化食 品；第二代保健食品是经动物和人体试验，证明有某种保健功能，但往往不知其功 效成分、化学结构、有效成分的含量；第三代保健食品是从天然原料中提取出功能 因子或有效成分后加到产品中去，其化学结构和含量均已明确。即它是在第二代保 健食品具有的经人或动物实验验证具有生理调节功能，且明确功效因予及该因子的 结构，含量、作用机理的保健食品。它更有利于进行有效的监督和管理。目前我国 的保健食品还多处于第二代保健食品，第三代保健食品是当今保健食品发展的趋 势，开发含有明确功效因子的保健食品是是保健食品进一步发展的关键。 现代营养学的一项重要发现，就是揭示了膳食中一些早期为人们所忽视的一些 微量成分对于人类健康的重要性。植物中所含有的这些微量成分，被称之为植物生 物活性成分，它们在维持并促进人体健康，预防多种慢性疾病方面的显著效果，使 之在功能保健食品中大有作为。 我国植物资源较为丰富，中医药有着悠久的历史，从我国的植物资源中提取富 集保健功效因子是我国保健食品发展的方向。植物食品包括水果和蔬菜，是人们生 河南工业大学硕士学位论文 活中必不可少的膳食组成部分，果蔬的加工处理都产生大量的副产物，例如果蔬的 皮、渣等。这些副产物极易腐烂从而造成环境污染，然而这些副产物中往往富含多 种生物活性物质，是提取制备食品功能因子的极好原料。植物中的生物活性物质多 种多样，黄酮类化合物就是分布广泛的一种具有生物活性多酚类化合物，在许多生 物体中以抗氧化剂的形式发挥其抗氧化作用。它们存在于多种植物中，柑桔属植物 就是代表之一。柑桔属中的类黄酮类化合物含量丰富，易于分离，具有独特的芳香 性和显著的药理学作用。在成熟的柑桔果实中，类黄酮在果皮、果肉、果核中含量 较高，而在果汁中含量较低，仅为1 5 ，这样柑桔经过榨汁后，剩余的下脚料 可被综合利用，其综合利用方式之一是用于提取类黄酮等天然活性物质。 2 】【3 l 【4 】在 我国，这方面研究还不多，许多加工下脚料未得到综合利用，因此深度开发柑桔中 极其丰富的类黄酮类化合物资源，研究其生理及药理学作用，对于柑桔的深加工及 其在医药、保健食品领域的应用，具有重大的经济效益和社会效益。 我国是柑桔生产大国，柑桔皮的进一步研究开发利用是有着积极意义的。陈皮， 又名橘皮，芸香科植物及其栽培变种的成熟果实的果皮，也即柑桔类果实的干燥成 熟果皮。是我国的传统中药，在我国有着悠久的历史，具有行气健脾，和胃止呕， 燥湿化痰的功效。是一种常用的中药材，应用于许多中药复方制剂中，它还是卫生 部颁布的第一批既是食品又是药品的品种，深入了解其生物活性，提高资源的利用 率和附加值是很有现实意义及必要的。 1 2 植物黄酮研究概况 自然界存在着数以百万计的高等植物，生物黄酮与生物多糖、生物碱同为植物 来源的三大天然产品。但与后两者相比，生物黄酮的开发利用较晚。生物黄酮，主 要是指以2 一苯基色原酮为基核的化合物，具有c 6 c 3 一c 6 双芳环联结形式，即以 c 6 c 3 c 6 为骨架，具有不同取代酚羟基的一类化合物，图1 - 1 为黄酮类化合物的基 本结构。 2 陈皮提取物抗氧化活性的研究 7 6 ， t 图1 - 1 黄酮类化合物的基卒结构 1 分子中心的、1 3 不饱和吡喃使其表现出抗氧化活性。生物类黄酮类化合物的 抗氧化能力与其所含羟基的数量和位置有关，一般羟基数目多抗氧化能力强。生物 类黄酮在自然界广泛分布，属植物次级代谢产物，广泛存在于黄绿色蔬菜、水果、 花和豆类等植物中，因多呈黄色而称生物类黄酮。至今，己发现生物类黄酮物质有 4 0 0 0 多种。根据生物类黄酮化学结构进行分类，可分为八大类5 1 主要有：黄酮 ( f l a v o n e s ) 、黄酮醇( f l a v o n o l s ) 、黄烷酮( f l a v a n o e s ) 、异黄酮( i s o f l a v o n e s ) 、黄 烷醇( f l a n a n o l s ) 、黄烷酮醇( f l a v a n o n o l s ) 、查耳酮( e h a l c o n e ) 、花色甙( a n t h o c y a n i n s ) 。 ( 如图1 2 所示) 。 黄酮( f l a v o n e s )黄酮醇( f l a v o n o l s ) r 丫、 黄烷酮( f l a v a n o e s )异黄酮( i s o f l a v o n e s ) 河南工业人学硕十学位论文 黄烷醇( f l a n a n o l s ) 查耳酮( c h a l c o n e ) 花色甙( a n t h o c y a n i n s ) 黄烷酮醇( f l a v a n o n o l s ) 图1 2 黄酮类化合物的结构分类 多年来，研究发现生物类黄酮具有很强的抗氧化清除自由基的能力，使其表现 出了具有多种生物活性。目前，在生命科学中发展最快的是自由基生物学和自由基 医学。研究发现自由基与人类多种疾病有关，【6 】 7 1 9 8 4 年h u i l l i v e u 首次提出氧化 损伤是引起组织损伤的主要原因，而氧化主要由自由基引起。自由基系含有未成对 电子的原子、原子团或分子。生物体的生命活动会产生大量的自由基，它具有很强 的氧化作用，是维持正常生命的必需，但是如果自由基产生过多不能及时清除，就 会危害机体健康，产生疾病。生物体体内常见的自由基有超氧阴离子自由基( 0 2 一) 、 羟自由基( o h ) 、烷氧自由基( r o ) 。自由基性质活泼，有极强的氧化能力，其 中，超氧阴离子自由基( 0 2 - ) 形成最早，羟自由基( o h ) 作用最强，烷氧自由基( r o - ) 链锁反应循环最持久，对人体有很大的危害性。在体内自由基产生脂质过氧化作用， 使多种大分子成分：如核酸、蛋白质产生氧化变性，d n a 交联和变性，导致细胞 结构的改变和功能破坏，而引起衰老、癌症及心血管等褪变性疾病。许多天然产物 具有清除自由基的能力，其中黄酮类化合物是活性较强的一类，其作用机理在于它 阻止了自由基在体内产生三个阶段：【8 】 4 书 陈皮提取物抗氧化活性的研究 ( 1 ) 与超氧阴离子自由基( 0 2 ) 反应阻断自由基的引发连锁反应； ( 2 ) 与脂质过氧基( r o o - ) 反应阻断脂质过氧化过程； ( 3 ) 与金属离子螯和阻断自由基产生。 黄酮类化合物简称类黄酮，是一大类天然产物，广泛存在于植物界，是许多中 草药的有效成分。目前很多具有世界领先水平的抗氧化剂，降血脂、治疗心脑血管 疾病药物的功能因子都是类黄酮。临床试验证实：类黄酮既是药理因子，又是重要 的营养因子，人体自身不能合成类黄酮，主要依靠从蔬菜、水果等食物中摄取定 量的类黄酮，而且类黄酮在体内代谢很快，所以需要不断的补充。黄酮类化合物在 人体内不能直接合成，只能从食品中获得，而黄酮类化合物广泛存在于植物体中， 因此，近年来，从植物体中提取高纯度、活性强的天然黄酮成为人们关注的热点。 萨因为类黄酮对人体有如此重要的作用，加之近年来自由基生命科学的进展，研究 开发类黄酮这种天然活性物质便成为营养学和医学领域的重要课题，使具有强抗氧 化和清除自由基作用的类黄酮受到空前的重视。 人体内需氧的生理过程都会产生自由基，它具有很强的氧化作用，是维持正 常生命的必需，但是如果自由基产生过多不能及时清除，就会危害机体健康，产生 疾病。现代病理学研究已证明，生物氧化与许多疾病的发生有关，如衰老、癌症、 动脉粥样硬化、肝病、糖尿病等。 9 1 黄酮类化合物的抗氧化作用是指其对单线态氧 和含氧自由基的清除能力。抗氧化作用是类黄酮化合物最重要的生物活性，它包括： 清除自由基、淬灭单线态氧、清除超氧化物、清除羟自由基、抑制脂质过氧化。 类黄酮化合物可提供给自由基大量h 原子，阻断自由基的链式反应，清除羟自 由基( o h ) 和超氧自由基( 0 2 - ) 。胡春等1 0 1 用化学发光法研究黄酮类化合物对羟 自由基( o h ) 和超氧自由基( 0 2 ) 的作用，黄酮化合物的浓度的增加，对( 0 2 - ) 抑制率上升，其作用呈明显的剂量一效应关系。 黄酮类化合物作为抗氧化剂的作用，通过酚羟基与自由基反应生成较稳定的半 醌式自由基，从而终止自由基链式反应，是黄酮类化合物抗氧化的最主要机制。黄 酮类化合物缸环上羟基和b 环上的邻位羟基可大大增强清除( 0 2 ) 的能力。f i l l 生物黄酮作为保健产品首次引起国际医药界的注意是在2 0 世纪8 0 年代末。法 河南工业大学硕士学位论文 国一家保健食品厂商率先推出具有市场引导作用的生物黄酮“碧萝芷”( p y c n o g e n 0 1 ) 作为保健产品首次引起国际医药界的注意。这是一种从法国地中海沿岸地区生长的 一种主要树种“滨海松”树皮中提取的黄酮混合物。由于碧萝芷能预防和治疗冠心 病与心肌梗塞等心血管疾病，故上市后销售情况极为良好。在上市1 0 年以后，临 床医学研究人员不断发现碧萝芷有不少令人感兴趣的新用途，其中包括抗哮喘、防 止长期抽烟引起的脑动脉硬化、脑血栓形成以及降血压作用等。据科学家研究，法 国生产的碧萝芷含有极其复杂的生物黄酮成分，其中包括儿茶素、表倍儿茶素、紫 杉素、原花青素及其单体、二倍体、三倍体与多倍体混合物。正是这些复杂的生物 黄酮构成了碧萝芷多样化药理作用的基础。生物黄酮实际上是一个庞大的家族。现 已确认其化学结构的生物黄酮类物质至少有4 0 0 0 多种。生物黄酮是一涵盖面极广 的总名称。实际上生物黄酮物质的化学分类极为复杂。近几年来，科学家对植物黄 酮进行了广泛而深入的研究，并发现了黄酮不少令人感兴趣的新用途。黄酮具有多 种药理作用，其中包括：抗氧化作用、消炎作用、抗癌和抗基因诱变作用。大多数 黄酮类物质的化学结构以2 一苯基色原酮为基核的化合物，系由植物自身所合成的。 随着研究的深入，科学家逐渐认识到：蔬菜、水果中的植物黄酮对人体健康有无可 替代的重要作用。某些黄酮与黄烷酮已被证实有很强的抗心血管病作用。在上述新 发现的推动下，植物黄酮类保健药物的开发工作取得了令人瞩目的重要进展。如利 用低档绿茶为原料提取的茶多酚加工而成的胶囊剂在世界市场上的年销售额早已 超过1 亿美元。由于大豆异黄酮的一大作用是预防乳癌，近几年来成为国外开发的 另一重要黄酮类保健药物。大豆异黄酮又名“植物雌激素”( 因其化学结构与天然雌 激素十分相似) ，它在人体内同样能与雌激素受体结合，故能有效预防一系列与激 素有关的疾病( 其中包括乳癌、骨质疏松症和更年期综合征等) 。从葡萄皮和葡萄 籽中提耿所得的黄酮类物质“白藜芦醇”现已成为国际市场上的畅销天然药物。研究 证实：白藜芦醇可有效预防中风与冠心病。【l 2 】 总之，近年来，天然抗氧化剂的研究与开发取得了前所未有的进展，天然抗氧 化剂已从单纯做油脂或含油脂食品的抗氧化剂，发展到作为体内活性氧的清除剂， 从而起到保护人体细胞组织免受氧化损伤，保护心脑血管循环系统，预防癌症及延 6 陈皮提取物抗氧化活性的研究 缓衰老的效果，天然抗氧化剂在维持机体健康，预防诸多慢性疾病方面的特色，越 来越引起人们的极大关注，该领域的研究己成为生命及营养科学中最令人注目的热 点。 实际上，迄今为止真正开发上市的黄酮类保健药物只有区区几种，而已发现的 植物黄酮至少有几千种之多。可以相信，今后将会有更多的植物黄酮陆续被开发成 为新型药物及保健功能因子，其市场前景无限广阔。 1 2 1 陈皮黄酮研究概况 柑桔属中的黄酮类含量丰富，易于分离，具有独特的芳香性和显著的药理学作 用。柑桔皮综合利用方式之一是用于提取类黄酮等天然活性物质。而在我国，这方 面研究还不多。许多柑桔属加工下脚料未得到综合利用，因此深度开发柑桔中极其 丰富的类黄酮资源，研究其生理及药理学作用，对于柑桔的深加工及其在医药、食 品领域的应用，具有重大的经济效益和社会效益。 1 2 1 1 柑桔属中类黄酮的种类 柑桔类含有大量有益于人体健康的生物活性物质己人所共知，除维生素、矿物 质、膳食纤维等外，柑桔类中还含有类黄酮、胡萝h 素类、单萜类等生物活性成分。 黄酮类化合物是广泛分布于植物中的一大类多酚化合物，到目前为止，已从柑桔类 植物中分离到6 0 多种不同的类黄酮类化合物，大致可分为三类： t 1 1 1 1 2 1 一般类黄 酮化合物，如芦丁( 1 u t i n ) 等，柑桔特有的黄烷酮类，如橘皮甙等。其他果蔬中 几乎没有的多甲氧基类黄酮类( p o l y m e t h o x y l a t e df l a v o n e sp m f s ) ，如川陈皮素 ( n o b i l e t i n ) 、七甲氧基黄酮( h e p t a m e t h o x y f l a v o n e ) 等。a n a g n o s t o p o u l o nm a 等【1 3 】， 利用h p l c m s 分析了g r e e kn a v e l 柑桔皮，结果表明柑桔皮中主要的类黄酮类化 合物是：多甲氧基类黄酮类、c 糖基黄酮、o 糖基黄酮、0 糖基黄烷酮和酚酸及其 它们的衍生物等。o r t u n o 等1 4 1 采用h p l c m s 分析柑桔中的聚甲氧基类黄酮类化合 物( 如川陈皮素、七甲氧基黄酮) 中的含量水平，发现在果皮中含量高于其它部位。 由于像从柑桔等植物中提取的黄酮类化合物具有很强的生理功能活性，也常被人们 河南，j 业大学硕士学位论文 称之为生物类黄酮( b i o f l a v o n o i d s ) 。可见柑桔皮中的类黄酮化合物的开发与利用 是柑桔副产物综合利用的一个途径。 陈皮其含蛋白质、维生素c 、类胡萝h 素、矿物质都较高。i t s 陈皮也富含多 种生物活性物质，1 9 9 8 年，钱士辉等对陈皮的黄酮类化合物进行了研究，鉴定出4 种黄酮类化合物。【1 6 l 1 2 1 2 柑桔类黄酮类化合物的生物活性 柑桔类一直作为中药以及生药原料为人们所利用，柑桔皮中含有丰富的类黄 酮，尽管柑桔类黄酮化合物在柑桔中含量相对较低，但表现出很强的生物活性【】， 具有抗氧化作用、抗癌作用、防止心血管疾病、消炎抗过敏作用、抗菌和抗病毒作 用。在生物体中有大量的脂质，在自由基的作用下可生成脂质过氧化物，它们将严 重影响细胞功能，陈钰等1 8 1 对浙江的主要的柑桔品种的果皮提取物抗脂质过氧化进 行了研究，结果表明柑桔皮的甲醇浸膏对硫酸亚铁一半胱氨酸引发的体外脂质过氧 化有较强的抑制作用，对心、肝、脑组织过氧化脂质的生成也有明显的抑制作用。 秦得安等1 9 1 证实，橙皮提取物具有清除( 0 2 一) 和抑制( 0 2 一) 诱导的脂质过氧化 的作用，对( o h ) 也有明显得清除作用。 2 0 1 近年来，人们的注意力已转向对柑桔属中多甲氧基黄酮的研究，因为它有许多 特殊的作用。多甲氧基黄酮可作为柑桔分类的标识物；柑桔中的多甲氧基黄酮具有 重要的药理学作用。柑桔中的多甲氧基黄酮较常见的是川陈皮素、七甲氧基黄酮、 橙黄酮和橘黄酮。川陈皮素和七甲氧基黄酮具有溶解癌细胞的性质，并对冠心病病 人的血液循环起作用。另外，七甲氧基黄酮是一种强心剂，它对于小鼠心脏组织可 直接产生收缩作用。研究发现多甲氧基黄酮，具有明显的抑制肿瘤、抗肿瘤活性。 1 2 1 1 1 2 2 黄酮类化合物抗氧化机制 黄酮类化合物特殊的结构赋予它一系列独特的化学性质，黄酮类化合物的抗氧 化活性是其独特性质的一集中表现，黄酮类化合物发挥抗氧化作用的途经多种多 陈皮提取物抗氧化活性的研究 样，其作用机制可概括以下几种。1 2 2 1 2 3 】1 2 4 1 1 2 5 1 2 2 1 阻断自由基链的传递过程 黄酮类化合物抗氧化机理与酚类物质( 如b h a 、b h t ) 抗氧化枫理一致，它们均 将氢供给脂类化合物自由基，自身转变为酚基自由基，酚基自由基的稳定性降低了 自动氧化链反应的传递速度，从而抑制进一步被氧化。简而言之，就是作为自由基 吸收剂而起到抗氧化作用。其机理如下： 其断链反应为： r o + a h r o h + a r 0 0 + a h r o o h + a 其中：a h 抗氧化剂 a - - 抗氧化剂供氢后自身形成的自由基 这是天然抗氧化剂抑制氧化的重要作用机制，许多抗氧化剂，包括常用的b h a 、 b h t 、t b h q 以及茶多酚、黄酮、单宁等天然抗氧化剂都是有效的自由基终止剂， 它们作为氢的给予体与脂类自由基反应，使自由基转变为非活性的或较稳定的化合 物，从而干扰或延滞链反应中的链增长步骤，达到抑制氧化的目的。 另外，黄酮化合物可经单电子转移方式直接清除0 2 、o h 等。 1 2 2 2 作用于与自由基有关的酶 在有氧条件下，黄嘌呤氧化酶催化黄嘌呤生成尿酸，释放超氧阴离子等自由基。 槲皮素等大多数黄酮醇可抑制黄嘌呤氧化酶的活性，使s o d 、g s h p x 生成增加和 提高它们的活性，导致血浆过氧化脂质( p l p o ) 和红细胞过氧化脂质( e l p o ) 含量显 著降低抑制膜脂质过氧作用。 在生物体内各种自由基对脂类化合物起氧化作用。由黄质氧化酶和过氧化物 作用产生的超氧化物自由基0 2 一，可以被超氧化物歧化酶除去，其反应模式如下： 超氧化物岐化酶 20 2 + 2 h + - h z 0 2 + 3 0 2 过氧化氢酶 2 h 2 02 一一- 2 h 2 0 + 3 0 2 9 河南工业大学硕士学位论文 1 2 2 3 与诱导氧化的过渡金属离子络合 体内许多氧化过程是在过渡金属离子参与下进行的，黄酮化合物与诱导氧化的 过渡金属离子络合，抑制了氧化反应的进一步发生。 1 3 研究中存在的问题 尽管研究人员在利用植物资源研究黄酮类化合物做了许多工作，但是由于植 物类黄酮种类繁多，结构复杂，性质多样，因此，还存在着许多问题有待于迸一步 解决。 要研究开发一种保健功能因子，还需要解决以下几个问题： ( 1 ) 天然植物提取物的组分复杂，有效成分的单体很难分离提取，这将限制其 的功效作用以及使用量。 ( 2 ) 目前，虽然有多种生物的、化学的鉴别天然抗氧化剂抗氧化活性的方法， 但对天然抗氧化剂的抗氧化机理还不是十分明确，而抗氧化作用可能涉及到多种作 用机理，使不同的抗氧化物在不同的体系中显效程度不一，因此，有必要对天然植 物提取物抗氧化活性进行研究评价，使其发挥最大的生物活性。 1 4 主要研究内容 虽然，对陈皮提取物进行的研究有很多，得到了多种多样的结果，但分析其主 要抗氧化物质、全面研究其抗氧化活性还未见到报道。因此，有必要对通过最佳提 取工艺制备的陈皮提取物抗氧化活性进行研究。 本研究的主旨就是对通过最佳提取工艺制备的陈皮提取物抗氧化活性进行研 究。为陈皮提取物作为保健功能因子迸一步开发利用提供一些依据。下面是本试验 所研究的具体内容： ( 1 ) 陈皮提取物主要抗氧化成分的测定； 陈皮提取物抗氧化活性的研究 f 2 ) 陈皮提取物总抗氧能力的研究； ( 3 1 陈皮提取物对几种自由基的抑制作用研究 ( 4 ) 陈皮提取物体外抗氧化作用的研究； ( 5 ) 陈皮提取物在币常小鼠体内抗氧化研究。 河南工业大学硕士学位论文 第二章材料与方法 2 1 主要试验原料及试剂 陈皮 氢氧化钠( 分析纯) 亚硝酸钠( 分析纯) 硝酸铝( 分析纯) 七水合硫酸亚铁( 分析纯) 无水乙醇( 分析纯) 石油醚( 分析纯) 甲醇( 分析纯) 甲醇( 色谱纯) 碘化钾( 分析纯) 柠檬酸( 分析纯) 硫代硫酸钠( 分析纯) 磷酸( 分析纯) 水杨酸( 分析纯) 芦丁标准品 四氢呋喃( 色谱纯) 乙腈( 色谱纯) 双氧水h 2 0 2 ( 分析纯) 2 ，2 一二苯一1 苦肼基 d 1 0 1 型大孔树脂 邻苯三酚( 分析纯) 郑州仟僖堂大药房 北京化工厂 北京化工厂 北京化工厂 天津福晨化学试剂厂 洛阳化学试剂厂 洛阳化学试剂厂 洛阳化学试剂厂 天津市四友生物医学技术有限公司 北京化工厂 洛阳化学试剂厂 洛阳化学试剂厂 新乡市化学试剂厂 天津市科密欧化学试剂开发中心 f l u k a 进口分装 天津市科密欧化学试剂开发中心 天津市四友生物医学技术有限公司 上海桃浦化工厂 f l u k a 公司 河北沧州宝恩化工有限公司 北京化工厂 陈皮提取物抗氧化活性的研究 盐酸( 分析纯) 乙= 胺四乙酸钠( e d t a ) 抗坏血酸( 分析纯) t r i s 川陈皮素对照品 冰乙酸( 分析纯) 卵磷脂( 生物级) 三氯化铁( 分析纯) 硫代巴比妥酸( t b a ) 三氯乙酸( t c a ) ( 分析纯) 硫脲( 分析纯) 总抗氧化能力测试试剂盒 m d a 测试试剂盒 s o d 测试试剂盒 c a t 测试试剂盒 生理热水 2 2 主要试验仪器及设备 微型食物粉碎器 电热真空干燥箱 t u 一18 0 0 p c 型紫外可见光光度计 7 2 1 分光光度仪 高速离心机 a e 2 4 0 双量程分析天平 电子天平 北京化工厂 北京化工厂 天津市化学试剂研究所 沃德赛斯生物技术公司 s i g m a 进口分装 开封化孥试剂总厂 北京双旋微生物培养基制品厂 北京化工厂 f l u k a 进口分装 天津市科密欧化学试剂开发中心 北京化工厂 南京建成生物工程研究所 南京建成生物工程研究所 南京建成生物工程研究所 南京建成生物工程研究所 河南竹林众生制药股份有限公司 顺德肯德利电器有限公司 湖北黄石医疗器械 北京普析通用仪器有限责任公司 上海第三分析仪器厂 上海手术器械厂 m e t t l e rt o l e d o 公司 上海民桥精密科学仪器有限公司 河南工业大学硕士学位论文 恒温水浴锅 高效液相色谱仪 循环水式真空泵 恒温水浴振荡器 2 3 试验方法 2 3 1 芦丁标准曲线的绘制【2 6 上海医疗器械七厂 德国c e n t u r y s i lc 1 8b d s 柱 河南巩县英裕仪器厂 江苏太仓医疗器械厂 准确称取芦丁标准试剂0 0 3 0 2 9 ，用3 0 7 , 醇溶解，并完全转入1 0 0 m l 容量瓶 中，用3 0 7 , 醇定容，分别取上述芦丁标准溶液0 m l 、l m l 、2 m l 、4 m l 、6 m l 、8 m l 于2 5 m l 容量瓶中，用3 0 乙醇补至1 2 5 m l ，加入o 7 m l n a n 0 2 溶液，摇匀，放置 5 m i n ，加入o 7 m l1 0 a i ( n 0 3 ) 3 溶液。摇匀，6 r a i n 后加入5 m l1 m o l l n a o h 溶液， 摇匀，用3 0 z - , 醇稀释定容至刻度，1 0 m i n 后于波长5 0 0 n m 处比色测定( 以零管为 空白) 。 2 3 2 陈皮黄酮的提取制备2 7 】 陈皮黄酮的提取工艺为：脱脂一乙醇浸提一浓缩一精制一干燥。采用石油醚对 陈皮进行脱脂处理，脱脂时间2 5 h 。提取时间1 h ，水浴温度5 2 ，乙醇浓度7 3 ， 液料比8 ，提取次数一次，选用d 1 0 1 型大孔树脂精制。 2 3 3 类黄酮含量的测定 准确称取陈皮提取物用3 0 甲醇溶解，定容至2 5 0 m l 容量瓶中充分混合。准确 量取1 m l ，定容于2 5 m l 容量瓶中，按2 3 1 测定其在5 0 0 n m 处的吸光度。然后在芦 丁标准曲线上查出相应的类黄酮含量。样品中类黄酮含量按以下公式计算： 陈皮提取物抗氧化活性的研究 x y 2 5x 2 5 0 1 0 0 0 lo m 1 0 0 式中：x 样品中类黄酮含量， y 芦丁标准街线上相应的浓度g l l r r l - 样品质量g 。 2 3 4 川陈皮素含量的测定 2 8 公式( 2 1 ) 川陈皮素，又称蜜橘黄素( n o b i l e t i n ) 是芸香科植物橘皮的干燥成熟果皮所含的 一种多甲氧基黄酮类化合物。 2 3 4 1 试剂的配制 ( 1 ) 对照品溶液的配制：取川陈皮素对照品约3 m g ，精确称定( 实称3 ，2 0 m g ) ， 置1 0 m l 量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，精确吸取此溶液1 o o m l 置1 0 m | 量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，0 4 5 m 滤膜滤过，弃去初滤液，收集续滤液，得 川陈皮素对照品溶液。浓度o 0 3 2 m g m l 。( 2 ) 试品溶液的配制：取陈皮乙醇提取物 约1 0 0 m g ，精密称定( 实称1 0 1 。5 0 m g ) ，置2 5 m l 量瓶中，加甲酵溶解，放置过夜， 稀释至刻度，摇匀，o 4 5 u m 滤膜滤过，弃去初滤液，收集续滤液，即得供试品溶 液。 23 4 2 色谱条件 r p h p l c 法，德国c e n t u r y s i lc 18 b d s 柱( 1 5 0 m m 4 6 m m ，5 1 a m ) ，室温，流动 相：四氢呋哺一乙腈甲醇水( 1 5 ：5 ：2 5 ：5 5 ) ，流速：0 6 m l m i n ，检测波长：3 2 8 n m 。 2 3 4 3 测定方法 吸取对照品溶液5 l , t l ，2 次进样；吸取试品溶液1 0 1 , t l3 次进样，于2 3 4 2 色谱 条件下测定。 2 3 5 总抗氧化能力的测定 河南工业人学硕士学位论文 陈皮黄酮测定液的配制：准确称取已制备的陈皮黄酮提取物，用蒸馏水溶解， 配成陈皮提取物浓度为1 0 m g l 的溶液，溶液用蒸馏水稀释成0 5 m g l 、l m g l 、 2 m g l 、4 m g l 、5 m g l 、8 m g l 测定液备用。 测定方法：采用f e ”还原试剂盒法，抗氧化物质能使f e ，+ 还原成f c + ，后者可 与菲啉类物质形成稳固的络合物，通过比色可测出其抗氧化能力的高低。具体操作 参考南京建成生物工程研究所提供的总抗氧化能力的测定试剂盒说明书。总抗氧化 能力计算按下式： 总抗氧化能力( u m l ) 测定管o d 对照管o d反应体积( m l ) o 0 1x 3 0 取样量( m l ) 样品稀释倍数 公式( 2 2 ) 单位定义为：在3 7 。c 下，每分钟每m l 测定液使反应体系吸光度增加0 0 i 为一个总抗氧化 能力单位( u m l ) 。 2 3 6 对有机自由基的清除作用的研究 陈皮提取物溶液用蒸馏水制成5 0 m g l 、1 0 0 m g l 、l5 0 m g l 、2 0 0 m g l 、 4 0 0 m g l 、6 0 0 m g l 测定液备用，同时配制2 x 1 0 。4 m o l l 的d p p h 乙醇溶液。分别 取各浓度提取物测定溶液2 0 0 m l ，加入d p p h 乙醇溶液2 0 0 m l ，摇匀后放置 3 0 m i n ，以溶剂为对照，分别测定在5 1 7 n m 处的吸光度值a i 。然后取各浓度提取 物溶液2 0 0 m l ，与2 0 0 m l 乙醇溶液混合后在5 1 7 n m 处的吸光度值a i 。再测 2 0 0 m l d p p h 乙醇溶液于2 0 0 m l 溶剂混合后在5 1 7 n m 处的吸光度值a 。自由基 的清除能力用抑制率k 表示。计算按下式： k = 1 一 a i a j a c 1 0 0 1 6 公式( 2 3 ) 陈皮提取物抗氧化活性的研究 2 3 7 对羟自由基的清除作用的研究3 0 1 陈皮黄酮测定液的配制：准确称取陈皮提取物1 0 0 m g ，溶于1 0 0 m l 蒸馏水中， 制成1 0 0 0 m g l 陈皮提取物溶液。用蒸馏水将该溶液稀释成1 0 m g l 、5 0 m g l 、 1 0 0 m g l 、2 0 0 m g l 、4 0 0 m l 、6 0 0 m g l 测定液备用，。15 m l 试管中依次加入2 m m o l l i 的水杨酸2 m l ，摇匀，与3 7 水浴中加热1 5m i n ，取出，于5 1 0 n m 处测吸光度a l ， 再加入一定浓度的陈皮提取物溶液l m l ，摇匀。水浴继续加热1 5m i n 后取出于 5 1 0 n m 处测吸光度a 2 。自由基的清除能力用清除率表示。计算按下式： 清除率= a 1 a 2 a 1 a l 对照吸光度值 a 2 测定吸光度值 1 0 0 2 3 8 对超氧阴离子的清除作用的研究【3 公式( 2 - 4 ) 用蒸馏水将陈皮提取物配制成5 0 m g l 、1 0 0 m g l 、2 0 0 m g l 、4 0 0 m g l 。6 0 0 m g l 、 8 0 0 m g l 测定液。采用邻苯三酚自氧化法产生0 2 。取4 5 0 m l0 1 m o l l t r i s h c l 缓 冲液( p h 8 ，2 ) ，依次加入1 0 0 m l 乙二胺四乙酸钠( e d t a ) 溶液，1 0 0 m l 样品溶液， 2 4 0 m l 水，混匀，2 5 下保温1 0 m i n ，再加入1 0 0p _ l9 m m o l l 邻苯三酚，计时， 摇匀，准确反应6 0 m i n 后，加入5 0 p , l1 2 m o l l 的抗坏血酸溶液，终止反应，在3 2 5 n m 处测定测定吸光度值a s 空白管以1 0 0 m l 蒸馏水代替1 0 0 m l 样品，操作方法同样 品管，测得空白管的吸光度值a c 。自由基的清除能力用清除率表示。计算按下式： a c a s 清除率( 1 0 0 ) = 1 0 0 a s a 。含有待测物的反应液于3 2 5 n m 的吸光度值 a 。：不舍有待测物的反应液于3 2 5 n m 的吸光度值 公式( 2 5 ) 河南f 业大学硕士学位论文 2 3 9 对h 2 0 2 的清除作用研究【3 2 】 3 3 对h 2 0 2 的清除作用采用碘量法测定。用蒸馏水将陈皮提取物配制成5 0 m g l 、 1 0 0 m g l 、2 0 0 m e f l l 、4 0 0 m g l 、6 0 0 m g l 、8 0 0 m g t l 测定液备用。在碘量瓶中加入 一定量的测定液和p h 3 。0 的柠檬酸缓冲液，加入定量的蒸馏水和1 0 m l ，0 ，1 m o l l h 2 0 2 ，于3 7 。c 恒温水浴反应2 0 m i n 后取出，加入1 0 k i 和2 m o l l 的磷酸反应 1 2 0 m i n ，用标准的n a 2 s 2 0 3 滴定剩余的1 2 。自由基的清除能力用清除率表示。计算 按下式： v l - v 2 清除率= 1 0 0 v i v 0 公式( 2 6 ) 式中：v 1 - 一阳性对照h 2 0 2 消耗的n a 2 s 2 0 3 的体积( m 1 ) v 2 样品消耗n a 2 s 2 0 3 的的体积( m 1 ) v o 阴性对照空白消耗的n a 2 s 2 0 3 的体积( m 1 ) 2 , 3 1 0 对脂质体过氧化抑制作用的研究1 3 4 】 3 5 】 脂质体分散液的制备：将3 0 0 m g 卵磷脂溶解于3 0 m l 磷酸缓冲溶液( p b s d h 7 4 5 ，1 0 m m o l l ) 配成脂质体分散液。三氯乙酸( t c a ) 硫代巴比妥酸( t b a ) 盐酸( h c l ) 混合液：1 5 9t c a ，0 3 7 5 9t b a ，2 1 m l 浓盐酸按序加入1 0 0 m l 蒸馏 水中。 测定方法：在样品管中依次加入1 0 m l 卵磷脂溶液、1 0 m l4 0 0 肛m o l l 三氯化铁 溶液、1 0 m l4 0 0 9 m o l l 抗坏