（食品科学与工程专业论文）双菌种发酵提高烟草薄片和废次烟叶品质研究.pdf

中国农业大学硕士学位论文 摘要 摘要 废次烟叶的综合利用和烟草薄片质量的提高对烟草企业有巨大的经济意义。本论文筛选出一 株产香菌a 1 7 ，并对本试验室原有的能降解烟碱的节杆菌a n 进行了诱变处理，提高其产酶能力； 进而研究了两者的发酵条件，最终将其应用在废次烟叶的强化发酵和烟草薄片提取液的处理中， 结合酶制剂的作用，取得了良好的效果。论文主要内容和结论如下： 筛选鉴定：通过平板筛选和提取液摇瓶复筛，筛选出一株产香菌，根据其生理生化特征及1 6 s r d n a 序列分析，鉴定为巨大芽孢杆菌( b m e g a t e r i u m ) ，命名为a 1 7 。对实验室原有降烟碱菌a n 进行紫外诱变，使其烟碱脱氢酶酶活提高7 2 2 。 发酵条件：经过摇瓶实验，a 1 7 在烟草提取液中的最佳发酵条件为：初始p h 7 0 ，摇床转速 2 0 0 r r a i n ，接种量6 ，发酵温度3 0 。拮抗试验表明：降烟碱a n 与致香菌a 1 7 在平板上无拮 抗作用，但在液体培养基中，降烟碱能力受到抑制。 烟草提取液发酵工艺研究：以物水比1 ：8 浸提烟叶，以磷酸调p h 值至3 5 ，先后加入植物水 解酶制剂和蛋白酶，各搅拌1 h ，渣液分离。滤渣干燥粉碎用于化学成分测定，滤液定量。测定结 果表明7 0 蛋白降解，5 2 的烟碱、全部还原糖进入提取液。为进一步处理打好了基础。 提取液巴氏杀菌，先后接种a n 和a 1 7 菌液，发酵3 6 h ，提取液嗅香明显好转。离心得到菌 体，用以生产美拉德香气物质，再与浓缩过的原离心上清液混合，回加到烟叶上，测定结果表明 烟叶化学品质更协调，香气品质得到很大提高。 先后接种a n 和a 1 7 菌液到废次烟叶上进行强化发酵，结果显示烟叶颜色稍有加深，青杂气 显著减少，嗅香转好，吸食质量提高。 关键词：巨大芽孢杆菌，香气，蛋白质，烟草薄片，强化发酵 中国农业大学硕士学位论文 英文摘要 a b s t r a c t i nt h i sp a p e r , f l a v o u re n h a n c i n gs t r a i n sw e r ei s o l a t e df r o mt o b a c c o b yt h ee x p e r i m e n t a lr e s u l t so f p h y s i o l o g i c a l ，s t r u c t u r a lc h a r a c t e r i s t i c so ft h i sb a c t e r i u ma n di t sw h o l es e q u e n c eo f1 6 sr d n a t h e b a c t e r i u ms t r a i nw a sn a m e da sb m e g a t e r i u ma 1 7 o nt h eo t h e rh a n d ，a r t h r o b a c t e rs p a ni sm u t a t e d w i t ht h em u t a g e n so fu l t r a v i o l e tr a y ( u v ) a f t e rt h et r e a t m e n t , a n 6w a so b t a i n e d i t sn i c o t i n e d e h y d r o g e n a s ea c t i v i t yw a si m p r o v e db y7 2 2 a n dh e r e d i t yi ss t a b l e t h eo p t i m u mf e r m e n t a t i o nc o n d i t i o n so fa 1 7i nt o b a c c oe x t r a c t i n gs o l u t i o nw e r es t u d i e di ns h a k e f l a s k s t h eb e t t e rr e s u l t sa r er e a c h e da f t e r3 6 ho fc u l t u r i n gi nr o t a r ys h a c k e r ( 2 0 0 r m i n ) a t3 0 c ，i n i t i a l p h7 o 6 i n o c u l u mc u l t u r e f u r t h e rs t u d ys h o wa 1 7a n da nh a v es y m b i o s i s b u t , t h ea b i l i t yo f d e g r a d i n gn i c o t i n eo f a nw a sr e s t r a i n e dw h e nt h e ms y m b i o s e t h ee n z y m a t i ct r e a t m e n ta p p r o p r i a t e l yt a k e sp l a c ei nam i x t u r eo ft o b a c c oa n dw a t e ri naw e i g h t r a t i oo f1 ：8 a sar e s u l t ，a l li n t e n s ea c t i o no ft h ee n z y m eo nt h ep r o t e i nc o m p o n e n t sa n ds u b u n i t si s a s s i s t e d a f t e re n z y m a t i ct r e a t m e n t ，t o b a c c op r o t e i n sw a sd e g r a d e db y7 0 0 a m e a n w h i l e ，a nt h e r e d u c i n gs u g a ra n d5 2 0 an i c o t i n ee n t e ri n t oe x t r a c t i n gs o l u t i o ni nl i q u i dc u l t u r em e d i u m t h es e p a r a t e ds o l u t i o ni sa p p r o p r i a t e l ys t e r i l i z e da n dt h e ni n o c u l a t e dw i t l lac u l t u r eo f a na n da 1 7 i n t ot h ee x p o n e n t i a lg r o w t hp h a s et h e r e o f t h es m e l li sm u c hb e t t e ra f t e rf e r m e n t a t i o ni ns h a k ef l a s k s f o r3 6 h a tt h i st i m e s e p a r a t i n gt h eb i o m a s sa n du t h a tt op r o d u c ea m a d o r ic o m p o u n d s m i xt h e a m a d o f ic o m p o u n d sa n de x t r a c t i n gs o l u t i o na n ds p n yt h em i x t u r eo n t op r e p a r e dt o b a c c o t h e n ，ab e t t e r t o b a c c ow h i c hc o n t e n to fp r o t e i nw a sr e d u c e dg r e a t l ya n da r o m ai n c r e a s e dw a so b t a i n e d t h eq u a l i t yo ft o b a c c oc a nb ei m p m v e db ya d d i n gc u l t u r eo fa na n da 1 7d u r i n gm a n - m a d e f e r l n e n t a t i o n k e yw o r d s b m e g a t e r i u m , a r o m a ，p r o t e i n ，r e c o n s t i t u t e dt o b a c c o ，m a n - m a d ef e r m e n t a t i o n u 独创性声明 y9 3 9 2 6 9 本人声明所呈交的论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成 果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发 表或撰写过的研究成果，也不包含为获得中国农业大学或其它教育机构的学位或证书 而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明 确的说明并表示了谢意。 研究生魏诙慨 时间：蒯年如乃日 关于论文使用授权的说明 本人完全了解中国农业大学有关保留、使用学位论文的规定，即：学校有权保留 送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅，可以采用影印、缩印或扫描等复 制手段保存、汇编学位论文。同意中国农业大学可以用不同方式在不同媒体上发表、 传播学位论文的全部或部分内容。 ( 保密的学位论文在解密后应遵守此协议) 研究生签名： 导师签名： 时间：矽多年月五日 蝴癣 中国农业大学硕士学位论文 第一章绪论 1 1 研究的目的和意义 第一章绪论 我国烟草工业每年产生大量的废次烟叶和上部烟叶积压，这些品质不高，化学成分不甚协调 的烟叶通常的处理方法一是伟4 成烟草薄片，二是进行强化发酵。以下分而述之。 1 1 1 生物技术在烟草薄片加工中应用的意义 烟草薄片也就叫再造烟叶，是一种以烟梗，烟签，烟末等烟草物为原料，经过重新组合而成 的产品，因此也叫重组烟草【1 1 。造纸法烟草薄片是借助造纸工艺及技术，按造纸的方法，处理劣 质烟草、烟未、烟梗等以提取其中的水溶性物质。再将烟草纤维分散在水中阻后用抄纸机制成片 基。烟草萃取物浓缩后加在片基上，经干燥后制成烟草薄片。 造纸法烟草薄片的产品具有填充性高，密度小，机械加工性能好，具有降低焦油和便于调 节控制尼古丁含量、调整卷烟吸味、控制燃烧速度等优点而成为发展低焦油卷烟必不可少的技 术手段之一口】。在国际上的众多卷烟中，造纸法烟草薄片已成为一种重要的配方原料广泛使用。 然而，受我国制造技术和工艺所限，我国的薄片产品通常存在着蛋白质含量高，香气不足， 杂气较大等问题唧。其原因很大程度上是因为在烟叶上进行化学成分的调整不易操作，效果不甚 明显。 本研究旨在利用酶和微生物技术，结合造纸法烟草薄片的加工工艺，解决烟草薄片蛋白含量 高，香气不足等问题，提高烟草薄片的综合品质。因此具有巨大的使用价值和经济意义。 1 1 2 多菌种发酵对烟草的强化发酵的意义 烟叶发酵主要有自然发酵( 也称醇化或陈化) 和人工发酵( 又称加温发酵) 两种方式i j 。前者主 要是在烟叶贮存期间，借助自然气候的变化，促使烟叶内各种化学变化加速进行，进而达到改善烟叶 品质和理化性状的目的。后者则是在人为控制温湿度的条件下。使堆放于发酵库内的烟叶理化性质 变化加速，在较短时间内改善烟叶品质的方法。虽然自然醇化烟叶贮存周期长( _ 一般需1 3 年) ，占 用仓库大，积压资金多，生产成本高，但由于自然发酵具有烟叶色泽鲜亮、香气优美、刺激性弱、工 艺简单、操作简便等优点，且提高香气与吸味品质的效果明显优于人工发酵烟叶，所以，经济发达国 家普遍采用自然发酵的方法。而人工强化发酵，一方面因为其发酵周期短( 一般为1 2 2 0 d ) ，资金 积压少，生产成本低，在我国国内中小型卷烟厂还有一定的市场。另一方面，对某些品质较低的烟 叶，尤其是上部烟叶，纵然是自然发酵也不能使其化学成分达到协调，而通过强化发酵则可以在 较短时间内达到这个目的。 因此，进一步研究和改进烟叶强化发酵技术，具有巨大的市场需求，本研究利用微生物进行烟 叶强化发酵可以加快发酵过程，提高发酵效果，因此也具有重大的经济意义。 中尾农业大学硕士学位论文 第一章绪论 1 2 烤烟发酵过程中品质及香吃昧的形成 烟草是一种以吸食为主要目的的特殊经济作物。其吸食品质基本上决定了它的利用价值或可 用性，而发酵是烟叶吸食品质形成过程中的重要环节。因为当年收获烤制的烟叶( 原烟) 在品质 上尚存在着不同程度的缺陷。如在吃味方面表现为粗糙、苦、辣、涩及滞吞等：在气味方面表现 为香气量少、香气质差、地方性杂气和青杂气较多，刺激性较大，烟叶色泽及燃烧性也不符台要 求，必须经过发酵以促使烟叶内在化学成分的转化，使上述缺陷得到改善，以达到卷烟工业要求。 1 2 1 烤烟发酵过程中色素转变对香气的影响 烟草的色泽是鲜叶中原有的色素和色素源以及在调制和发酵过程中由棕化反应形成的有色 物质的综合表现。鲜烟叶中植物色素主要是叶绿素、b 一胡萝h 素、叶黄素、新黄质和紫黄质。 新鲜烟叶中叶绿素含量一般为o 5 - - 4 ，胡萝r 素和叶黄素的总量约为叶绿素含量的1 5 1 3 。 在叶片成熟及采收烘烤过程中，叶绿素在叶绿素酶作用下迅速降解；叶片中的酚过氧化物酶一 过氧化物系统能加速叶绿体膜结构的衰退，导致叶绿素脱色。烘烤变黄末期7 4 以上叶绿素已降 解l ，l ，而类胡萝h 素的降解主要是由于发生氧化作用引起，其速度远低于叶绿索降解速度。烤烟 在发酵过程中，这些色素进一步降解，类胡萝h 素总量不到新鲜叶的2 6 ，而叶绿素与新黄质在 发酵后烟叶中很少存在。叶绿素的降解产物新植二烯、绿原酸及类胡萝h 素的降解产物b 一大马 酮、b 一紫罗兰酮均是烤烟的重要香气物质。可见，发酵过程中上述色素的降解不仅有利于烟叶 色泽的转变，而且有利于烟叶香气的增加。 烟叶中含有大量的多酚类物质，烤烟多酚含量一般为5 左右，包括单宁类( 如绿原酸) 、 香豆素类( 如莨菪亭) 和黄酮类( 如芸香苷) 等。烟草在烘烤及发酵过程中，多酚类物质在多酚 氧化酶和过氧化物酶作用下发生酶促棕化反应，产生大量棕色色素。在陈化的烟叶中鉴定出一种 铁一蛋白质绿原酸芸香苷复合物的深棕色色素，表明多酚与蛋白质结合后形成了棕色色素， 而这个蛋白质部分可能就是多酚氧化酶本身i o j 。多酚的酶促棕化反应是引起烟叶在发酵过程中发 生褐变的主要原因，这一反应受烟叶水分含量影响很大。随着烟叶水分的增加，烟叶褐变反应的 速度迅速加快。烤烟在发酵时，水分必须控制在较低水平，以防烟叶颜色过度转深，保证烟叶外 观质量。 另外，烟叶中的单糖与氨基酸或胺类在烟叶发酵过程中发生的非酶棕化反应，也可形成棕色 色素或类黑素i “。 上述色素的转变，对烤烟色泽产生了综合作用。使叶色由发酵前的浅黄、正黄色向较深的金 黄、深黄、棕黄色转变，烟叶的外观质量得到明显改善。 1 2 2 烤熘发酵过程中碳水化合物的变化及其对烟叶品质的影响 碳水化合物是烟株代谢的主要产物，是烟叶内所有化合物中含量最大的一类。其含量水平对 烤烟质量有重要意义，如糖、淀粉、有机酸在烟叶燃吸时参与调节烟气酸碱平衡、烟气醇和性和 芳香性。烘烤后的烟叶水溶性碳水化合物含量一般为1 0 一2 5 ，烟叶淀粉含量为2 左右，有 机酸含量为0 2 - 0 5 。烤烟发酵过程中，水溶性碳水化合物如糖类损失较大，而高分子的淀 2 中国农业大学硕士学位论文 第一章绪论 粉、糊精、纤维素等基本上不发生变化，有机酸总量有所增加，而某些有机酸则减少，如苹果酸 含量可下降5 0 8 0 。有机酸含量增加与碳水化舍物的降解有关，烟叶中有机酸具有按三羧酸 循环反应的特性，并可分解为c 0 2 和h 2 0 。烤烟发酵过程中果胶质大幅度减少，约2 0 左右。 果胶质被认为对烟气品质不利，在燃吸时易产生甲醇，对口腔有强烈刺激作用。烤烟经发酵，水 溶性糖适当减少( 其中一部分参与致香物质的形成，如糖氨反应等) ，有机酸增加，果胶质大量 降解，烟叶的香吃味品质得到改善，烟气更酵和芳香，刺激性大大减少。 1 2 3 烤烟发酵过程中含氮化合物的变化及其对品质形成的影响 烟草中含氮化合物主要包括蛋白质、核蛋白、烟碱、氨基酸、胺类、氪杂环如吡咯、吡嗪等。 烤烟总氮含量一般为2 。氮化物在燃吸时对烟气的主要作用是影响烟气酸碱度。增加烟气生理 强度及香气浓度，过多的氮化物会造成烟气粗糙、刺激性大、香气差。 烟叶在发酵过程中，蛋白质等高分子氮化物结构稳定，含量基本不变或略有下降悼，而氨基 酸、烟碱、胺类等小分子氨化物活性较强，大量转化、降解，如烟叶发酵前氨基酸含量为2 2 5 m g g ， 而发酵后降至1 7 5 m g g p j 。氨基酸的降解主要是通过下列途径： ( 1 ) 在有氧条件下氧化脱氮， 形成有机酸( 2 ) 与单糖发生非酶棕化反应； ( 3 ) 降解形成醛、酮类，进而缩合形成吡嗪类化 台物。发酵过程中氨基酸的转化及降解对烟叶品质形成有重要作用，能减轻烟气刺激性。消除烟 草杂气，增进烟香。 烟碱是烟草中最主要的生物碱，烟草的用途首先是由于烟碱的刺激作用。吸烟时，烟碱通过 肺的吸收到达脑部的时间只有7 秒钟l l u j ，并对大脑产生兴奋刺激作用。烟叶在发酵过程中，烟碱 显著降低，在酶作用1 1 1 1 、氧化作用 1 2 1 、微生物作用下【1 3 1 。降解为烟酸、米喔斯明、氧化烟碱、 烟酰胺、n 一甲基烟酰胺和可的宁等。发酵过程中烟碱的降解有利于烟气刺激性下降，生理强度 趋于适宜，使香气显露。 1 2 4 烤烟发酵过程中致香物质的变化及风昧的形成 香气质量是烟叶品质的重要方面。烟叶香气成分十分复杂，从提取物状态来说，包括精油、 树脂、石油醚提取物、腺毛分泌物等。从化学成分来看，烟叶香气成分主要是萜烯类、醇类、酮 类、醛类、醑类、酚类、低级脂肪酸类等。烟叶在发酵过程中，香气品质明显改善，这与致香物 质的转变是紧密相关的。 1 2 4 1 多盼类物质的氧化 多酚类物质是烟草尤其是烤烟的重要致香物质，荟香苷、绿原酸和莨菪亭是烟叶中最丰富的 多酚，可赋予烟气清甜香、烤香。烤烟中多酚含量可达7 ，远大于晒晾烟多酚含量( 一般不到 o 5 ) i i 耳j 。烟叶在发酵过程中，多酚物质将发生氧化降解，其中绿原酸含量下降较大，达5 0 ， 而芸香苷基本不变或略有下降l “j 。多酚氧化可转化成其它香气物质及棕色色素，因此，正确控制 发酵条件( 如温湿度) 以使多酚适度转化，对于发酵后烟叶香气质量及外观品质有重要意义。 1 2 4 2 类菇烯及其降解产物 类萜烯及其降解产物是烟草的重要特征香气成分，对烟气的质量和香气有特殊的重要性。烟 叶中主要类萜烯包括双萜烯( 如赖白当和西柏烷类) 、多萜烯( 如类胡萝h 素) 、单萜烯( 如芳 3 中国农业大学硕士学位论文 第章绪论 樟醇) 、三萜烯( 如b - 香树素) 和四萜烯( 如叶黄素、紫黄质) 。上述萜烯化合物中以赖白当 类、西柏烷类及类胡萝h 素对烟草香气最为重要，其中以西柏三烯二醇最为著名。 虽然烟草的赖白当、西柏烷类化合物，如2 ，7 ，1 1 一西柏三烯一4 6 一二醇一般被认为本身 缺乏香味，但它们在烟叶发酵过程中可转化生成大量具有烟草主要特征香味的降解产物，对烟草 风味增强有重要作用。类胡萝h 素属高分子萜烯化合物，本身无特殊香味，但在烟叶发酵过程中 发生氧化降解，裂解而形成许多香味成分，其中c 1 3 化合物就有3 7 种。降解产物中的b 一紫罗 兰酮、8 一大马酮和7 一巨豆三烯一4 ，6 一二醇，是重要的烟草特征香气物质，能赋于烟气清 甜香、花香气息。 1 2 a 3 羰基化合物的形成 羰基化合物如醇类、酮类、醛类等是烟草中主要的小分子香气成分，在烟草发酵过程中其含 量显著提高p j ，如烤烟调制后烟叶总羰基化合物( 包括挥发性及非挥发性羰基化合物) 含量为 6 6 5 m g g ，经过发酵。其含量可增至8 3 7 m g g 。发酵过程中羰基化合物的增加与氨基酸、类萜烯、 脂类的降解有关i “j 。发酵过程促进了羰基化台物的形成，从而增强了烟叶的清甜香韵。 1 2 a a 脂肪酸的变化 脂肪酸，尤其是低级脂肪酸对烟草香吃味有重要影响，它们是烟草的酸性致香成分，能改善 烟香酸碱度、使烟气吃味干净、醇和芳香。某些低级脂肪酸能增加不同类型烟草的特征香味，如 烤烟中正戊酸含量较高，而香料烟有较高含量的异戊酸和b - - 甲基戊酸。白肋烟低级脂肪酸含量 较低。烟叶发酵过程中，低级脂肪酸总量增加，其中b 一甲基戊酸、异戊酸含量明显增加，而正 丁酸、丙酸有所下降例。发酵后烟叶低级脂肪酸的增加使烟气更加醇和，并赋予烟气果香、陈酵 香。 烟叶中高级脂肪酸包括月桂酸( c 1 2 ) 、肉豆蔻酸( c 1 4 ) 、棕榈酸( c 1 6 ) 、油酸等烟叶发 酵过程中其总量变化不大， 1 2 a 5 非酶棕化反应物的形成 非酶稼化反应通常是指氨基酸与糖类之间的缩合反应，是烟草特征香味形成的重要反应之 一，这一反应可产生各种挥发性化合物和大分子棕色化合物，如酸类、醛类、酮类、呋喃类、吡 嗪类、吡咯类、醑类等，对烟气的烤焙香、坚果香、焦糖香有重要贡献。在烟叶发酵过程中，烟 叶中游离氮基酸、胺类与单糖、醛类发生棕化反应，并产生大量上述致香物质，如2 一甲酰吡咯、 乙酰吡咯、2 一乙酰呋喃等，使烟叶香气品质进一步改善。但在发酵的后期，如自然发酵二年后， 棕化产物则逐渐减少【l o j 。这与烟叶陈化二年后品质逐渐变劣是一致的。 综上所述，烤烟发酵对于烟叶品质的进一步改善至关重要。然而，目前圉内外有关烤烟发酵 过程中品质及香吃昧形成的研究，以及发酵机理的研究尚不甚深入。因此，进一步开展烟草发酵 及其机理的研究将具有重要的理论及实践意义。 1 3 微生物改善烟叶品质的机理探讨 1 3 1 微生物诱导或者激活酶 微生物在生长发育过程中可产生的多种酶类物质或者其代谢产物，其作用于烟叶可诱导或激 4 中国农业大学硕士学位论文 第一章绪论 活烟叶内多种酶系统，进而作用于烟叶内的化学物质( 主要为多糖和蛋白质) ，使底物充分降解， 转变成为小分子的香气物质，如酸类、醇类、羰基类、酯类和内酯、酚类、氮杂环类、酞胺和亚 胺类等各种香味化合物，或者其前体物和中间产物，具有增加香气效果。 酶是植物、动物及微生物新陈代谢赖以生存的基础。与动植物相比，用微生物发酵生产各种 酶，具成本低，产量高，酶的提取和纯化方便等优点。目前工业上应用的酶主要来源于细菌和真 菌，如芽抱杆菌( b a c i t t u s ) ，曲霉( a s p e r g i l l u s ) ，青霉( p e n i c i l l i c u m ) 、根霉( p , h i z o p u s ) 等。 1 3 2 微生物产生香昧化和物或其前体物 烟叶内许多致香物质为小分子的酸类、醇类、酯类、内酯类、酚类及氮杂环类，而微生物在 代谢过程中自身可产生单萜类、内酯类以及氮杂环类香味物质。s h a r p e l l t l 8 1 f 1 9 8 5 ) 报道，假单胞菌 可产生香味物质，孙爱东等【1 9 1 ( 1 9 9 8 ) 发现香气掷孢酵母在标准培养基上可产生特别的水果味的主 香葵内酯。这些单萜类、内酯类以及氮杂环类对增加烟叶内香气成分具有重要的作用。因此可以 适当施加微生物产生的香气物质来增加烟叶香气，改善烟叶品质。 总之，微生物发酵烟叶改善烟叶品质过程中的作用比较复杂。既有酶的催化作用又有化学 作用，促使底物发生分解、氧化、转化等复杂的生化反应，最后形成低分子香气物质。根据对烤 烟叶面微生物种类的研究分析，许多烟叶叶面微生物可能是加速烟叶自然发酵过程中物质转化和 品质改良的生物催化剂。 1 4 研究现状及进展 i a 1 烟草薄片处理工艺及生物技术在其中应用的研究进展 早在1 9 世纪5 0 年代就有人提出将造碎烟叶回收，制成再生烟叶，充当烟叶使用。随着烟草 工业技术的不断提高，经过不断的研究，改进，到本世纪5 0 年代，再造烟叶生产渐发展并形成 工业化生产。针对不同途径，推出了多品种等系列的再造烟叶。是将整个卷烟生产过程( 包括打叶 等工序) 中废弃的烟梗和烟末以及部分低次烟叶经过不同加工方法的处理，制成性状接近甚至优于 天然烟叶的薄片，再用于卷烟生产闭。 世界上曾开发的再造烟叶工艺方法主要有造纸法、辊压法、稠浆法、浸透法和喷层法等，其 中前三种方法在世界上采用的最为普遍。在这三种工艺方法中，又以造纸法烟草薄片工艺，具有 其他方法不可比拟的优势：一是可以改变薄片物理性能，使烟草薄片质地疏松，提高填充值和燃 烧性，显著降低焦油量，从而起到降焦减害的作用；二是可以方便地调整薄片的化学成分( 如烟 碱、总糖等) ，进而起到天然烟叶不能起到的灵活卷烟配方，改善香吃味，全面提高卷烟产品质 量的重要作用。故而在目前的应用最为广泛，逐渐在国际市场上占据了主导地位。在欧美国家占 烟草薄片生产和使用6 0 以上，目前国内随着吸烟与健康问题日益受到关注，在全球卷烟的焦油 量逐年降低，相关法规不断出台的形势下，国内在卷烟降焦减害方面也有了较明确具体的要求。 造纸法烟草薄片的使用作为一种国际所公认的降焦手段，已被国内烟草行业所普遍认同，在我 国也在近些年里大力推广造纸法烟草薄片，在0 3 年烟草总公司发行了针对造纸法烟草薄片的行 业标准，在“中式卷烟”提出后，加大了对造纸法烟草薄片的应用推广，现大多数国内烟厂已采用 5 中国农业大学硕士学位论文第一章绪论 了造纸法烟草薄片。因此，国内造纸法烟草薄片的市场需求量将迅速增大。 我国再造烟叶生产起步较晚，在2 0 世纪7 0 年代到8 0 年代初，才刚刚起步，经过二十余年 的不懈努力，有了较大的进步和提高。特别是近年来，在国家局领导的高度重视和大力推动下， 经过有关部门的技术攻关和推广普及，再造烟叶的生产有了迅速发展，据不完全统计，全国现有 辊压法再造烟叶生产线2 1 0 条，年产。辊压法烟草薄片虽然生为工艺简单，投资小，能耗、电耗 及生产成本低，但产品质量的可调性差，提高产品的技术难度大，技术和产品的发展受到极大的 限制。9 0 年代初引进的稠浆法烟薄片由于技术和产品特性与辊压法相近，在国内没得到发展。在 1 9 9 8 年国内开始大规模正式开发造纸法烟草薄片，在2 0 0 1 年，汕头造纸法烟草薄片项目通过了 国家局组织的工艺评审，杭州造纸法薄片也于2 0 0 1 年正式批量生产，在2 0 0 3 年发行了针对造纸 法烟草薄片的行业标准。上海太仓年产1 万吨的造纸法烟草薄片开始生产。但是造纸法再造烟叶 的生产工艺复杂，投资大，能耗水耗大，生产成本高，适合一定规模的集中生产。在我国目前的 造纸法薄片生产技术还不是很成熟，工艺、设备、生产效率和产品质量的技术水平不高，技术含 量有限，产品应用技术研究也开展得不够深入，工艺技术和设备不是很成熟，涂布质量还有待提 高，我国造纸法薄片技术总的来说还是在处于较低的阶段。 目前国际上普遍采用的是典型的造纸法再造烟叶法其特点是原料经浸泡提取后需先经过一 道固液分离工序，然后将固形物( 主要为纤维、半纤维、木质素等) 用于抄造成型为片基，而提 取液则经浓缩调配后用于片基涂布加料。具体根据生产工艺过程分别按原料预处理段、提取浓缩 段、浆料制备段、抄造成型段、涂抹后处理段。工艺流程如1 - 1 圈； 田1 - 1 改进型两步法烟草薄片生产工艺 f i g 1 - 1 i m p r o v e d t e c h n o l o g y o f s n u c i 酣t o b a c c o b y t w os t e p s 造纸法烟草薄片制造工艺尽管有很多优点，同时也存在如下的难点：一是设备多、投资大。 如l t r 公司所提供的有关数字，上一套年产万吨薄片的装置，需要数千万美元，而上同样规模 的辊压法薄片厂只需1 0 0 万美元的投资。二是能耗高。在原料浸泡、解纤，制造薄片纸基、浓缩 溶液，反复的烘干过程要耗用大量热能和水，再加上三废的处理，便其制造成本远远高于辊压法。 三是要求大规模连续化生产。要求能源充沛廉价，并能随时保证供给，可避免停车造成损失，已 大规摸连续化生产来降低成本，弥补高耗能的弊端。四是三废处理及废水排放量大，弄得不好还 会污染环境破坏生态。 6 中国农业大学硕士学位论文第一章绪论 除了成本，还存在着技术方面的问题，对进口与国产造纸法薄片的全面对比剖析发现，国产造 纸法薄片在物理性能、常规化学成分和降低焦油释放量方砸与进口薄片作用相当，但是其内在品质 要明显低于进口薄片，蛋白质含量较高，杂气较大而香气较低，这将成为制约国产造纸法薄片广泛 应用( 特别是在一类卷烟中的应用) 的关键。 这一方面的研究国外傲的比较多，相对而言，国内只有少量文献田1 报道。 据u s 4 8 8 7 6 1 8 报道，先使用一种含水溶剂萃取出烟草有关组分后，再用蛋白酶水溶液处理萃 取过的烟料，将烟料中大量基本不溶于水的蛋白质分解成水溶性的多肽。最后，将经过如此处理 的烟料过滤即得到降低蛋白质含量的烟草。经过处理的烟料，其蛋白质含量较低，可与萃取液一 起制造成低蛋白质含量的烟草薄片。奥地利烟草公司和维也纳大学共同开发并推广使用了一种造 纸法烟草薄片加工技术，该技术称a r l ( a u s t r i a r e c o n s t i t u t e l e a f ) 方法，其生产线由微机全自动 控制，该方法省去了萃取液浓缩工序，并对加工过程中的水进行回收，水和烟草溶液循环使用。 克服了一般造纸法的耗水、耗电量大和占地空间大的缺点用德国h b 公司的填充力测定仪测 定结果显示，此法生产的薄片与一般传统的造纸法相比，其填充力提高2 0 左右。由于加入的化 学添加剂很少，故能保持天然烟叶香味。 g a i s c h 等人报道了m s4 4 0 7 3 0 7 ) 另一种去除烟草中蛋白质的方法。他们先将蛋白酶加入烟草 和水的混合体系中降解烟草中的蛋白质，然后将烟草与体系分离、干燥水解液接种微生物，通过 微生物的代谢作用去除水溶液中的多肽等，再将水溶液中微生物通过离心或过滤的方法除去，最 后将此水溶液浓缩物回喷到先前干燥好的烟草上，制得去除蛋白质的烟草，该法可以去掉烟草中 5 0 以上的蛋白质。u $ 5 6 0 1 0 9 5 报道了使用膨润土( b e n t o n i n e ) 吸附去除酶降解后烟草水溶液中 可溶性蛋白质的方法。u s 5 3 1 1 8 8 6 报道了使用十二烷基磺酸钠去除经酶解的烟草水溶液中蛋白质 碎片的方法。 美国菲利浦一莫里斯公司的s p a n n 等【4 7 对烟草薄片的酶处理进行过研究。他们将烟梗含量约 5 0 的烟末制成圆形物含量为1 2 - - 1 8 的稠浆，加入o 0 7 5 - - o 7 5 , r , , ( 按i ：烟末重量计) 的纤维素 酶，用乙酸或柠檬馥调p h 值至4 5 ( 酶活性最高) 于室温下放置过夜发酵，然后按稠浆法制成烟 草薄片。化学分析表明，此种薄片的水溶性物质、总还原性物质和还原糖的含量均高于原来的烟 草原料，草酸铵可溶物、氯化钠和纤维素的量均较低，总灰份、苯乙醇可溶物和半纤维素的量不 变。评吸结果表明，用少量酶、甘油和乙酸处理的烟草薄片的身份最厚、刺激性较小、甜味较重， 但缺乏“万宝路 卷烟中的生物碱劲头。b r o w n w i l l i a m s o n 公司i 笠】选择微生物e r w i n i a c a r o t o v o r a 降解烟梗中的果胶，目的是为了替代莱些机械加工步骤来降低薄片制备过程中的烟末粒度。处理 是将烟梗末悬浮于此微生物的营养液中，浓度为1 0 ( w v ) 。最佳操作条件为：温度2 8 3 0 c ， p h 6 5 - 7 0 ，遥风以便有足够的溶解氧使微生物繁殖生长。耐受烟碱量可高达o 6 m g m l ，微生物 的菌落数一般为1 0 乙1 0 9c f u m l 。与传统法生产的烟草薄片相比，由微生物消化的烟梗制各的烟 草薄片的p h 略高，糖和硝酸盐的量降低，感官评价略优。 虽然，目前造纸法薄片技术己相当成熟。但国内外上对薄片的研究仍未停止，如何更好地保 证薄片的产品质量，如何在实际生产中降低生产成本，提高烟梗的利用宰。提高薄片的有效利用 率，增加企业的经济效益是我们当今面临的一个重要课题。 7 中国农业大学硕士学位论文 第一章绪论 1 4 2 微生物应用于烟叶发酵的研究进展 生物技术尤其是酶解和微生物发酵技术在烟草中的应用研究，已成为当前科技工作者关注的 热点。近年来，一些烟草科技工作者在应用微生物和酶改进烟叶发酵过程、缩短烟叶醇化的周期、 提高发酵烟叶内在品质方面作了许多有意义的探索 2 a - 2 4 j 。国内外近期的研究表明，通过微生物发 酵能够大大缩短烟叶醇化的时间，明显消除烟叶的青杂气和减轻刺激性，并且对烟叶香气质量的改 善有一定的帮助。特别是通过发酵的方法，用微生物或酶改善烟叶、烟草薄片及烟梗的品质和降解 亚硝胺等有害物质的研究，受到烟草生产企业的广泛重视。 表1 - 1 烤烟自然发酵主要微生物 t a b l e1 - 1m o s t l ym i c r o o r g a n i s md u r i n gt o b a c c of c r m e a t a t i o n 微生物广泛存在于自然界中， 烟叶在初加工过程中，由于自然接 种微生物，烟叶表面就有微生物存 在，据报道在发酵中的烟叶上始终 存在细菌和放线茁，霉菌在自然发 酵后其消失，d _ ) b a c i l l u s 、cl o s t r i d i u m 为优势种群，共占叶面微生物 总数的9 0 左右，如表l 所示。这些 微生物在条件适宜时，必然活动而 起作用。烟叶在人工发酵和自然发 酵过程中，适宜的温湿度环境使微 生物生命活动加强并大量繁殖。微 生物在进行物质的吸收和排出、分 解和合成并包括放能与吸能等一系 列复杂的新陈代谢过程中，必然引 起微生物机体内外物质的交化，同 时微生物产生的酶类也作用于烟叶 发酵。因此，微生物的营养与代谢 以及微生物产生的酶类是烟叶发酵 的基础，烟叶发酵过程中所发生的 一系列复杂的生理生化变化离不开 酶和微生物。 赣生物 自然睁化时间( 月) 06 1 21 82 43 0 注tt r 表示救量 9 9 生化试剂 生化试剂 分析纯 生化试剂 r t 分析纯 分析纯 分析纯 化学纯 分析纯 o x o i d 北京益利精细化学品有限公司 云南东方香料有限责任公司 o x o 北京奥博星生物技术责任有限公司 北京益利精细化学品有限公司 北京奥博星生物技术责任有限公司 北京拜尔迪生物技术公司 北京化工厂 北京益利精细化学品有限公司 北京益利精细化学品有限公司 北京益利精细化学品有限公司 北京益利精细化学品有限公司 酪素培养基：蛋白胨1 ，葡萄糖0 1 , n a c l 0 5 ，c a c l 2 0 0 1 ，琼脂1 8 ，酪素0 5 ，p h 调 整为7 0 ，1 2 1 ，灭菌3 0 m i n 。 2 2 42 液体发酵培养基 酵母青o 5 ，x h o o 1 ，n a 艘0 4 2 h 2 00 3 ，( n i - h ) 2 s o 0 4 ，自然p h 值为7 1 ，1 2 1 c 灭菌2 0 m i n 。 2 2 4 , 3 菌种保藏培养基 p y s 培养基：酵母膏0 4 ，蛋白胨0 8 ，n a c l0 3 ，琼脂1 8 ，p 6 0 ，1 2 1 c ，灭菌3 0m i n 。 2 2 5 实验方法 2 2 5 1 富集 将烟叶样品各取1 0 9 ，加入9 0 m l 0 9 的生理盐水在3 0 c ，1 8 0 r r a i n 摇床振荡培养3 0 m l n 。 2 2 5 2 增香蔷的筛选 烟叶品质的缺陷很大程度是因为烟叶内物质的转化不够充分，而微生物发酵烟叶提高烟叶品 质的作用机理就在于某些微生物能产生酶域能激活烟叶中的酶系统，使烟叶中的物质转化更为充 分；能够耐受烟碱是用于烟草发酵必备的条件；发酵产生香气是最终的目的。基于以上原因，本 论文确定蛋白酶活力大于1 0 u m l ，能耐烟碱浓度为0 4 ，发酵后p h 值上升，嗅香转好为筛选 标准。 1 3 中国农业大学硕士学位论文 第二章增香菌的分离鉴定及降烟碱菌a t h r o b a c t e ra n 的诱变 用0 9 的生理盐水做 0 0 1 0 7 系列梯度稀释富集培养液，取0 2 m l 涂布在初筛培养基上，在 3 0 c 培养2 d ，检查菌落是否产生蛋白酶水解圈，计算水解圈直径和菌落直径的比值。 在经巴氏杀菌的烟草提取液中，接入初筛优良的菌株，在3 0 ，1 8 0 r r a i n 条件下震荡培养 2 d ，取样测定发酵液中的蛋白酶活力、p h 值。嗅香评价由7 人参照国家卷烟香气评吸标准进行。 于营养琼脂+ o 4 烟碱平板上接种以上各菌株，观察是否对烟碱有耐受能力。 2 2 5 3 降烟碱菌a t h r u b a c t e r a n 的诱变和筛选 因为降烟碱菌a t h r o b a c t e ra n 在含烟碱的营养琼脂平板上会因烟碱的分解发生兰黄黑的颜 色变化，其中黄色阶段比较稳定，所以可以将产生黄色圈的大小作为筛选的标准。在用于摇瓶复 筛中，以烟碱的降解率作为筛选的标准。 选择处于指数期的菌液，先以无菌玻璃球打碎，再用脱脂棉过滤，得到均匀分散的细胞悬液。 以5 0 m m o l 磷酸缓冲液稀释至1 5 x 1 0 6 个肺1 。 先打开紫外线灯( 3 0 w ) 预热1 0 r a i n ，取上述制备好的菌悬液5 m l 置于直径为6 c m 培养皿 中，放置在离紫外灯3 0 c m ( 垂直距离) 处的磁力搅拌器上照射1 0 r a i n ，将照射后的菌液涂布于平 板上进行初筛。挑选出平板上生长快，产生黄圈直径最大的1 5 个单菌落进入复筛。 将上述1 5 株菌接种到复筛培养基中，1 8 0 r m i n 震荡培养3 0 h ，观察培养基颜色变化，并测其 烟碱降解率，选择颜色最深，烟碱降解最多的菌株，测定其烟碱脱氢酶活力。 将分离出来的菌株接种到含有o 2 的烟碱的液体发酵培养基里，检测烟碱的降解情况，找出 降解烟碱能力最好的蓠株。 2 2 5 4 蛋白酶活力的测定：采用q b 1 8 9 3 紫外分光光度法 原理：蛋白酶在一定的温度与p h 条件下，水解酪素底物，产生含有酚基的氨基酸( 如：酪 氨酸、色氨酸等) ，然后加入三氯乙酸终止酶反应，并使未水解的酪素沉淀出去，滤液对紫外光 有吸收，可用紫外分光光度法测定。根据吸光度计算其酶活力。 步骤如下所示： 试管0 ( 空白) i 加树钿演枷 加三氯乙蕞4 瑚m i ( 描匀) 5 5 水穹忙6 0 疵 加2 酷素4 0 0 m l ( 搐匀) 静置1 0 l n i n ，翘取滤液稀释1 0 倍 以空白为对照， 试管1 ，2 ，3 ( 试样，需傲3 个平行试样) 加待测液2 m l 加2 酪囊 5 5 水浴，t = 6 0 m h l 加三氯乙酗专 静止1 0m i n ，过滤取滤液稀释1 0 倍 i 测定试样的2 7 5 m 处丧光度 1 4 句摇 中国农业太学硕士学位论文第二章增香苗的分离鉴定及降烟碱菌a t h r o b a c t e ra n 的诱变 单位酶活力定义为，l m l 酶液在4 0 c 、l m i n 水解酪素产生珈g 酪氨酸为一个酶活力单位， 以u m l 表示。 2 2 5 5 烟碱测定m 在烟碱的定量分析检测中，紫外检测法因仪器价格便宜、检测成本低、操作简便快速，适用 于大批量的检测。本论文的研究中，烟碱的定量检测采用紫外分光光度法。 培养液经过1 2 ，0 0 0 r m i n 离心1 5 m i n 后，取上清液0 5 m l ，用o 0 5 m o l lh c l 定容到1 0 0 m l ， 以0 0 5 m o v lh a 为参照，在2 3 6 ，2 5 9 ，2 8 2 n m 波长下测吸光度值，调整烟碱浓度使吸光值范围 处在0 3 - 0 7 之间。参照以下公式计算烟碱含量。 腑：! ：型啦箜! 蚀也幽 3 4 3 x 1 0 0 0 其中1 0 5 9 是校订系数；n 为稀释倍数；3 4 3 表示0 1 的烟碱标准溶液的吸光度。 2 2 5 6 烟碱脱氢酶酶活的测定 鹌】 酶活的定义：以吸光度每分钟减少o 0 0 1 所需要的酶量定义为一个酶活力单位( 室温，5 7 8 n m ) ， 酶活单位：u m l 培养液。 在室温下，把下列试剂加到4 0 r n l 比色皿中：磷酸盐缓冲液( p i6 8 5 ) 2 m l ，酶液0 2 m l ， 烟碱( 0 0 1 t o o l l ) 0 1 m l ，靛酚兰指示剂0 2 m 1 , 。 向比色皿中依次加入规定量的磷酸缓冲液、指示剂、烟碱液、酶液，测其在5 7 8 n m f5 分钟 内吸光度的变化，以磷酸盐缓冲液为空白。 2 2 5 7 菌种常规鉴定 4 9 1 删 按( - - 般细菌常用鉴定方法，细菌分类基础中的方法进行，参照伯杰氏细菌鉴定手册 得到结果，一般包括细菌形态、细胞形态、芽胞形态、以及生理生化特性等。 2 2 5 7 1 实验菌株的菌落、液体培养特征及细胞形态 实验菌株活化后接入平板和液体培养基，3 0 c 培养2 0 - - 2 4 h 后，观察菌落形态和液体培养物 的生长情况。革兰氏染色后，在光学显微镜下观察细胞形态并拍照。 2 2 5 7 2 芽孢观测实验 将菌苔按革兰氏染色法涂片后