（化学工程专业论文）神经干细胞的玻璃化冷冻保存研究.pdf

大连理工大学硕士学位论文 摘要 神经干细胞( n e u r a ls t e mc e l l s ，n s c s ) 的低温冷冻保存对于神经退行性疾病和神 经组织损伤的研究与治疗具有十分重要的意义。为改善神经干细胞的冷冻保存效果，本 课题采用近年来迅速发展起来的无冰晶保存技术玻璃化法对神经干细胞进行冷冻 保存。 本文首先根据低温保护剂( c p a ) 导入过程的细胞体积变化情况设计了等渗透压差、 时间间隔逐渐降低的六步导入方法，并对神经干细胞单细胞悬液的玻璃化进行优化，且 对冻后复苏的细胞进行培养观察和干细胞特性鉴定。然后分别采用两种不同的神经球尺 度筛选方法一培养时间分布法和细胞筛网法获得不同直径范围的神经球，用渗透压仪 测定保护剂一次性导入不同尺度的神经球后的渗透压变化曲线，根据渗透平衡时间，设 计不同的导入方法，并进行玻璃化冻存，用c c k 8 法比较玻璃化组、慢冻组及导入组 冻后细胞的相对活性。分别采用h o e c h s t p i 双染法鉴定冻后细胞球的完整性，采用n e s t i n 特异性蛋白鉴定冻后n s c s 的干细胞特性，并将冻后细胞诱导分化，进行神经干细胞多 向分化能力的免疫荧光鉴定。 实验结果显示，采用每步导入c p a 的体积为5 0 i t l 、6 4 9 l 、8 6 p l 、1 2 0 i - t l 、1 8 0 1 x l 、3 0 0 9 l ， 每步导入后对应的平衡时间分别为8 5 s 、7 5 s 、6 5 s 、5 5 s 、4 5 s 、3 5 s 的导入方案对n s c s 进行玻璃化冻存，冻后细胞活率达到了8 5 5 ，且仍具有良好的生长状态和较强的增殖 能力，经n e s t i n 特异性蛋白鉴定，冻后细胞仍具有神经干细胞特性，这说明采用等渗透 压差、平衡时间间隔逐渐减小的分步导入方法可以有效地减轻细胞的渗透性损伤和毒性 损伤。实验结果还表明，c p a 一次性导入各尺度范围的神经球所需的渗透平衡时间是随 细胞球的尺度和单位体积细胞数的增大而增大的。在本实验所选取的直径范围 ( 8 0 ) 所造成的细胞变性；由于温度低于常温所致的细胞 寒冷损伤，以及冷冲击引发的膜脂肪相的变化，导致细胞膜结构和功能的改变【2 6 】等等。 o 苟 叱 一 田 之 = d s u b o p t i m a lr a t uo p t i m a l 知p l a o p t i f f l m lr a t e s r a t e c o o l i n 8r a t e ( r a i n ) 图1 1 两因素假说的细胞活率与降温速率曲纠1 】 f i g1 1s u r v i v a ls i g n a t u r eo f ah y p o t h e t i c a lf r o z e n - t h a w e dc e l l ，s h o w i n gt h ec o m p e t i n gm o d e s o fd a m a g ea ts l o wa n dr a p i dr a t e so fc o o l i n g , a n dt h er e s u l t i n go p t i m a lc o o l i n gr a t e l i j 1 1 2 低温冷冻保存方法 对于细胞特别是组织的低温冷冻保存，结构损伤是影响保存效果的主要因素。结构 损伤主要由降温过程中细胞内外产生的冰晶对细胞膜、细胞器及细胞间连接的损伤所 致。如果要保持细胞或组织结构和功能的完整性，就要避免冰晶的出现。 到目前为止，低温冷冻保存方法主要有两种：一种是常规慢速冷冻法，另一种是快 速冷却非晶态固化，即玻璃化法，两种方法的比较见表1 1 。常规慢速冷冻法作为一种 较为成熟的技术已沿用多年，成功保存了多种细胞和组织，但这种方法始终无法完全避 免冰晶，特别是细胞外冰晶的形成。而玻璃化法，因其可以在降温过程中部分地或完全 地避免细胞内外冰晶的形成，从而保证冻后细胞或组织的完整性f 2 2 , 2 3 , 2 7 , 2 8 】，成为近年来 低温冷冻保存技术的研究热点。但由于其技术仍不成熟，还有诸多问题亟待解决，例如 冷冻保护剂的选择、反玻璃现象及低温断裂等等。 ( 1 ) 常规慢速冷冻法 到目前为止，低温保存大多采用的慢速冷冻法主要是“两步法”【2 9 】，其一般过程 是先将细胞放在含有冷冻保护剂的溶液中预处理，然后用程序降温仪将细胞及溶液以较 慢的速率降温，细胞外溶液中的水分结冰使溶液的浓度升高，胞内的水分透过细胞膜向 外渗出，细胞体积收缩，胞内液体浓度升高，待温度降到到一定的低温时( 至少3 0 ) ， 神经干细胞的玻璃化冷冻保存研究 再快速降温至液氮温度，于液氮中长期保存。另一种慢速冷冻方法是采用程序降温仪， 即按计算机预先设定的程序，通过开闭阀门来控制液氮的释放，达到精确降温的目的【3 0 】。 无论是两步法降温还是程控降温，都是基于两因素理论的“平衡冻存方法 ，即选择一 种最佳的降温速率，尽量同时减少“溶质性损伤”和“胞内冰晶损伤”。 尽管常规慢速冻存只需要相对低毒性浓度的保护剂( 1 2 ，却经常伴随着细胞损 伤，造成损伤的原因主要包括冰晶的形成、降温过程中细胞质浓度的增加、细胞与保护 剂的长时间接触以及长时间处在1 0 到- 4 0 之间的较冷温度下等【i ，1 2 1 。冰晶的形成也使 保持生物材料和组织的完整性变得尤为困难【3 。因此，采用常规慢速冷冻进行低温保存 虽然实用但却不能得到最佳效果，常常不适应现代医学中创新疗法的发展。 表1 1两种最常用的低温冷冻保存方法的比较3 2 1 t a b1 1ac o m p a r i s o no f t h et w om o s tc o m m o na p p r o a c h e st oc r y o p r e s e r v a t i o n ( 2 ) 玻璃化法 一6 一 大连理工大学硕士学位论文 玻璃化法又称之为无冰晶技术，即采用高浓度的保护剂溶液，使细胞及其保护剂溶 液以足够快的降温速率过冷到玻璃化转变温度，从而被固化为非晶态、非固态的玻璃态， 并以这种状态在低温下长期保存。处于玻璃态的分子间的关系与液态相比无明显改变， 没有冰晶形成，因而可以避免冰晶所造成的挤压损伤和冻融效应。除了可以避免降温过 程中冰晶的形成外，玻璃化法还具有操作时间短、不需要昂贵的程序降温设备以及冻存 效果好等优点，因而成为近年来低温生物学的研究热点。目前玻璃化法已被广泛应用于 多种细胞的冷冻保存，如精子、卵母细胞、脐血造血干细胞、胚胎干细胞、神经干细胞 等，对于皮肤、角膜、关节软骨和胚胎等组织的保存也有许多研究。 1 1 3 低温冷冻保护剂 细胞或组织在低温冷冻保存时，在溶液中加入一些物质可以改变生物样品冻存时的 物理和化学环境，减轻或防止降温和复温时组织或细胞的损伤，尽可能的保持生物样品 原有的生化和生理特性，这类物质称之为低温冷冻保护剂( c r y o p r o t e c t i v ea g e n t ，c p a ) 3 0 1 。一般来讲，大多数有核哺乳类动物细胞在不加冷冻保护剂的情况下，都无法在经历 冻融过程后存活。低温冷冻保护剂可通过多种方式减轻生物细胞和组织对冷冻和解冻的 适应性，适宜的低温冷冻保护剂不仅能提高冻后细胞的存活数量，而且还能提高存活细 胞的结构和功能的完整性。 低温冷冻保护剂按照其能否渗透到细胞内，可划分为渗透性和非渗透性两类。 a 渗透性保护剂 渗透性保护剂多为分子中性物质，可在溶液中结合水分子而发生水合作用使溶液粘 性增加，弱化水的结晶过程，降低细胞的冰点。降温时加入此类保护剂可降低溶液中的 溶质浓度，减少细胞摄入盐量；冷冻保护剂进入细胞内，改变了细胞内过冷状态，使细 胞内外压力接近，降低了细胞脱水引起的皱缩程度和速度。由于渗透性保护剂容易进出 细胞，从而也缓解了复温时渗透性肿胀引起的损伤。常用的渗透性保护剂主要有甘油、 二甲基亚砜( d m s o ) 、乙酰胺、乙二醇等。其中d m s o 除具有上述功能外，还能与水 分子形成氢键，拉住水分子，减轻结冰过程中水分子的重新分布，因而成为低温冷冻保 存中应用最广泛的保护剂【3 3 1 。 b 非渗透性保护剂 这类物质通常是一些分子较大的物质，能够溶于水，但不能渗入到细胞内部，它们 通过使细胞处于过冷状态来降低溶质浓度，从而起到保护作用。在解冻时，能够防止水 分过快地进入细胞而引起的肿胀破坏。非渗透性保护剂主要包括羟乙基淀粉( 髓s ) 、 聚乙二醇、聚乙烯吡咯烷酮( p v p ) 等高聚物和蔗糖、海藻糖等糖类物质。其中，糖类 神经干细胞的玻璃化冷冻保存研究 物质因其不具有细胞毒性而被越来越多地用来代替渗透性保护剂【3 4 】。海藻糖作为一种非 还原性二糖，在细胞保存中的作用已经引起国内外研究人员的广泛关注。除具有非渗透 性保护剂的一般特性外，海藻糖在有机体中以一定浓度存在时能够耐受极低的温度，且 能够保护冻后细胞的结构完整性【3 5 1 。在低温冷冻保存中，海藻糖无论是在细胞内还是细 胞外都会起到积极的作用【3 6 3 7 l 。海藻糖还具有良好的玻璃化形成能力，且在降温和复温 过程中，有助于维持细胞膜和蛋白质的稳定性p 引，从而提高冻存后细胞的活率。 由于单一的保护剂作用有限，且含量低时没有足够的保护效果，含量高时又具有毒 性。为了降低毒性、提高功效，很多学者投身于混合保护剂的研究，并取得了积极的进 展【3 9 ，删。目前几乎所有的低温冷冻保存所使用的保护剂均为混合保护剂。 除了上面介绍的几种保护剂以外，在耐寒鱼类和昆虫等体内发现的抗冻蛋白 ( a n t i f r e e z ep r o t e i n ，a f p ) 也是近年来备受关注的一种保护剂成分。它是一种能抑制冰 晶生长的特殊功能性蛋白，它以非依数性的方式迟滞水溶液的冰点，但不影响水的熔点， 由此产生水溶液冰点和熔点的差异。许多学者使用抗冻蛋白对细胞进行了低温保存，但 结果好坏不一，因此其作用还有待进一步的研究。 1 1 4 低温冷冻保存研究的评价 对于低温冷冻保存研究的评价是很困难的，因为缺少低温保存过程的相关细节及许 多相关变量，包括组织来源、冻前的组织制备、降温后的组织处理以及研究人员在量化 其结果时使用方法的多样性。尽管如此，一般判定低温冷冻保存是否成功时普遍采用的 方法是：首先看复苏后细胞的存活率，在高存活率的基础上再进一步探讨如何更好地令 冻存细胞或组织在复苏后能执行其正常的功能p 引。 细胞或组织的存活率和回收率的检测对于冷冻保存来说是最基本的。常用的检测方 法主要有台盼蓝拒染法、h o e c h s t p i 双染色法、死活试剂盒荧光染色法和c c k - 8 法。 其次，低温冷冻保存后复苏的细胞或组织是否具有增殖能力也是检测细胞的低温保存是 否成功的一个重要评价指标，所以研究人员在冻存的细胞或组织复温后，立即对其进行 培养，观察其增殖情况，一般培养3 至7 天后再进行相关检测。 大多数的文献都报道说细胞冻存后的活率减少，但减少的程度却各不相同。凡报道 称冻存后活率与新鲜细胞相等的，其新鲜细胞的活率本身通常低于9 0 ，且在许多研究 中，从采集细胞的原始细胞库中得到的活细胞的比率本身就不稳定。另外，细胞经低温 冷冻保存后可能会完全溶解，然后在细胞的准备过程中被除去【3 2 1 。低温冷冻保存后的组 织活性也大相径庭，这可能与功能性细胞的损失有关。虽然大多数学者也承认低温冷冻 一8 一 大连理工大学硕士学位论文 保存会导致一些细胞活性损失，但在究竟有多少细胞死亡是具有代表性的这一点上却没 有达成一致。 另外，经低温冷冻后存活的细胞还需要经受移植的考验。通过临床观察与检验来最 终判定冷冻保存的效果。 1 2 玻璃化低温冷冻保存方法 1 2 1 玻璃化法的一般原理 玻璃化法的概念自上个世纪8 0 年代由f a h y 提出以来便发展迅速，多年来一直是低 温生物学研究的热点，也是近年来低温生物技术领域发展最快的研究方向之一。 玻璃化是指液体转变为非晶态的固化过称。它和常见的液体转变为晶体或部分结晶 的固体的冻结过程不同，玻璃态是物质以非晶态形式存在的一种状态，它具有液体的性 质，但由于粘度较大( 一般为1 0 1 2 1 0 1 4 p a s ) ，分子运动受到限制，流动性较差，而 一般的晶体分子之间的关系和液态相差甚远【2 7 1 。 向玻璃态的转变是一种动力学现象而非热力学现象。这种过程完全避免了结晶过程 中浓度梯度的形成，因此避免了结晶过程中伴随的毒性和渗透压损伤。一般认为只要降 温速率足够快，任何材料都可以实现玻璃化来避免冰晶的形成。一旦样品降温至所定义 的玻璃化转变温度疋，就不会发生结晶，且从动力学角度来看是稳定的，能保持很长的 时间【2 6 1 。 对生物材料进行玻璃化低温保存所应达到的理想状态就是实现完全玻璃化。完全玻 璃化过程中冷却速率与保护剂溶液浓度之间的关系，可以用图1 2 来说明。 庶曩c 薯孵桫， 图1 2 一种典型的c p a 溶液补充相图 f i g1 2s u p p l e m e n tp h a s eg r a p ho fat y p i c a lc p as o l u t i o n 神经干细胞的玻璃化冷冻保存研究 在浓度较低的区域i ，如果冷却速率不是很快，一般不能测到玻璃化转变温度疋， 样品过冷到熔融温度以下某个温度，不可避免地会引起冻结，所以一般的冷却方法 在这一区域内无法实现玻璃化，除非冷却速率达到1 0 8 。c s 以上。在浓度较高的区域i i ， 通常的急冷技术所能达到的冷却速率，就可以使小样品被冷却到疋以下实现玻璃化， 但获得的玻璃体中会形成大量细小的晶核，只是在急冷过程中受到抑制，一旦加热复温， 或者在孔附近长时间保温退火，这些晶核可能长大，使玻璃态变为晶态，发生反玻璃 化转变。因此该区域的玻璃态在热力学上是不稳定的。在区域，冷却过程中不会发生 任何冻结，因此能够使体积较大的样品在慢速冷却的条件下实现完全玻璃化。均相成核 温度死线与疋线交点处的低温保护剂溶液浓度，可作为实现完全玻璃化的最低浓度c v ， 在这一区域反玻璃化转变温度死曲线并未终止于c v ，在加热复温时仍会发生反玻璃化 结晶，这可通过提高复温速率来抑制其生长。在区域，反玻璃化转变温度死曲线消 失，该系统避免了所有的成核过程，达到完全稳定，但这时浓度太高，对生物系统有很 大毒性。因此，对生物材料有实际意义的区域是区域i i i t 2 9 】。 1 2 2 实现玻璃化的要素 经过众多学者们多年的研究发现，成功地实现玻璃化取决于三个关键性的要素，即 保护剂的粘度、降温和复温速率以及所保存样品的体积，它们之间的关系如式1 1 所示 【2 6 】。增加保护剂的粘度和降温、复温速率，以及减小样品体积都会增加实现完全玻璃化 的几率。 玻璃化形成的几率：堕堡兰堡望霉嬖堇掣 ( 1 1 ) 样i 诮谇积 a 降温与复温速率 当水或溶液以极快的速度冷却时，使过冷的液体没有足够的时间形成冰晶的晶核， 已有的晶核的生长也受到限制，即降温的速率大于冰晶成核及晶核生长的速率时，液体 就会固化为玻璃态，所以要实现玻璃化就必须加快降温速率。对于纯水而言，可实现玻 璃化的降温速率需达到1 0 6k s ；对于一般溶液，需达到1 0 3 1 0 4k s ；而对于浓溶液， 即所谓的玻璃化溶液，也需达到1 0 2 1 0 3 k s 。通常采用将样品直接投入液氮的方法来 获得较高的降温速率，但实际得到的降温速率并不如预想的那样高，这是因为处于室温 的样品会在液氮上方的蒸汽层中先被“预冷 ，但气相的传热效果要比液相差；而当样 品进入液氮后，又会使样品周围的薄层液氮气化，产生气膜，这也抑制了冷却速率的提高。 为避免这种情况，有人尝试使用温度约为- 2 1 0 0 的液氮融泥来代替液别4 1 , 4 2 】，发现其有 大连理工大学硕士学位论文 助于改善玻璃化的效果。因为当在液氮蒸汽或1 9 6 液氮中降温时，样品或许有时间形 成结晶，但当其在2 1 0 的液氮融泥中降温时则可完全实现玻璃化【2 们。 对于玻璃化法，复温速率一般要与降温速率相匹配，即复温速率也要很快，以使样 品快速通过相变区，以防重结晶和反玻璃化的发生。在1 9 6 8 0 之间时，复温速率 对冻存细胞的存活率无明显的影响，但在8 0 - - 0 之间时，快速复温样品的存活率要 明显高于慢速复温1 4 j 。 b 玻璃化溶液的选择 保护剂粘度的增加一般是通过增大保护剂浓度的方法来实现。当保护剂浓度增大到 可以实现玻璃化时，即称之为玻璃化溶液。对某个特定的玻璃化溶液，其玻璃化能力随 浓度的升高而增大，这点可以从c p a 的熔点温度矗和均相成核温度死随其浓度的升高 而下降，而玻璃化转变温度是随其浓度的升高而上升的趋势做以解释：由于死和疋曲 线交点对应的浓度即为该c p a 形成玻璃化的最低温度，所以死和疋的数值越靠近，越 容易形成玻璃化【2 7 ，4 3 】。玻璃化溶液的使用可以令样品在较慢的冷却速率下也能形成玻璃 态。表1 2 给出了常用的渗透性的低分子量保护剂的玻璃化浓度c v ( 常压, t ) t 2 9 1 。 表1 2 渗透性低温保护剂溶液的玻璃化浓度 t a b1 2 t h ev i t r i f i c a t i o nc o n c e n t r a t i o no fo s m o t i cc r y o p r o t e c t a n t 注：q 为每l o m o l 水中含有的保护剂摩尔数；m 为重量摩尔浓度；m 为体积摩尔浓度； ( w v ) 为体积百分浓度。 神经干细胞的玻璃化冷冻保存研究 由表1 2 可以看出，大多数渗透性保护剂要实现玻璃化所需的最小浓度均在6 - 9 m 之间。然而，通过使用高浓度的渗透性保护剂来实现玻璃化的方法并不是明智之举，因 为它们会对细胞产生极大的毒性作用和高渗作用【2 6 , 4 4 】，给细胞带来额外的伤害。为了减 少玻璃化溶液的毒性，很多学者采用单糖、二糖或多糖以及聚合物来部分或完全地代替 渗透性保护剂 2 2 , 3 4 , 3 9 , 4 5 , 4 6 ，取得了令人满意的效果。另外，对于不同的生物样品，需要 对c p a 的种类、浓度等进行筛选，并采用与该样品相适应的导入和洗脱方式来获得最 佳冷冻保存效果。 c 样品的体积 目前很多学者采用最小化样品体积的方法来减少所需冷却的液体量和冰晶形成的 可能性，因而促进玻璃化。实际上，缩小样品体积也是为了提高降温速率，以实现重要 细胞的玻璃化保存。为缩小样品的体积而设计的低温冻存容器有很多种，其中包括传统 的法式塑料细管、开放式拉管( o p s ) 【4 7 】、封闭式拉管( c p s ) 4 s 1 、电镜铜网( e l e c t r o n m i c r o s c o p yc o p p e rg r i d ) 4 8 4 9 和冷环( c r y o l o o p ) 5 0 】等。开放式拉管法是将聚氯乙烯( p v c ) 制成的常规0 2 5 m l 塑料细管加热软化，拉成内径0 8 m m 、壁厚0 0 7 5 r a m 的管，然后利 用毛细现象将细胞及保护剂一起吸入后投入液氮中。将o p s 两端封闭即为封闭式拉管， 与o p s 相比，c p s 可避免细胞的污染。但由于材料和壁厚，这两者对传热仍有一定的 限制。电镜铜网法是将细胞移入铜载网格中后直接投入液氮，而冷环玻璃化则是将细胞 移到附有玻璃化溶液的尼龙膜环上，再将尼龙膜环投入浸在液氮中的冷冻管内。这两种 方法不仅操作复杂，而且易造成细胞丢失。最近h c 等人使用内径0 1 8 r a m 、壁厚o o l m m 的石英微毛细管成功保存了卵母细胞和胚胎干细胞，由于材料的导热性能得到了极大的 提高，因此可获得极高的降温速率，同时也将保护剂浓度降至较低的毒性水平【1 2 5 。 综上所述，迄今为止玻璃化的研究重点主要为两方面，一是寻求容易实现玻璃化且 对细胞损伤较小的保护剂溶液，即发展所谓的“玻璃化溶液 ，使其浓度达到玻璃化需 要的浓度c v ，在慢速冷却的条件下实现玻璃化转变；二是设法提高冷却速率，使样品能 在无毒性的低浓度下实现玻璃化。 1 2 3 玻璃化法的一般步骤 玻璃化法的一般步骤通常包括四步，即保护剂的导入、降温、复温和保护剂的洗脱。 为了减小高浓度的玻璃化溶液对细胞造成的渗透性损伤和毒性损伤，通常采用逐级导入 法，分步导入保护剂溶液【2 1 1 ，即先将细胞或组织放入较低浓度的c p a 中，平衡一定时 间，再将其移入较高浓度的c p a 中，这样可避免过度渗透及化学毒性。另外，在较低 大连理工大学硕士学位论文 温度下，保护剂对细胞的毒性相对较小，但渗透也较慢，所以一般保护剂浓度低时在室 温下平衡，浓度高时在叫下平衡。也有人采用边降温边导入的方法，使样品温度下 降的同时，保护剂浓度逐渐升高i s 2 。 采用玻璃化法降温时，通常将平衡后的细胞及保护剂溶液装入前面所讲的低温冻存 容器，然后直接投入液氮或液氮融泥中。 复温时，主要采用3 7 c 的水浴快速扰动复温，也有人采用微波的方式进行复温。应 尽量提高复温速率，抑制反玻璃化现象的发生，以提高细胞或组织低温保存的活率和活 性。 复温后，应尽快洗脱玻璃化保护剂，以缩短经历化学毒性的时间。与导入阶段一样， 也可以采用分步的方法，以减轻渗透压变化带来的损伤【矧。稀释时应选择合适的浓度梯 度，并控制暴露的温度和时间。由于溶液中水的渗透速度远比保护剂更快，所以，稀释 时细胞会发生肿胀，这可通过在稀溶液中加入少量糖类来进行缓解。 1 2 4 玻璃化法存在的问题 尽管玻璃化具有操作时间短、不需要昂贵的程序降温仪及冻存效果好等优点，并在 精子、胚胎、卵母细胞等的保存上已取得了成功，但仍然存在一些不足。除了高浓度的 玻璃化溶液所带来的毒性损伤和渗透性损伤以外，还有反玻璃化和低温断裂等问题。 ( 1 ) 反玻璃化 尽管细胞从冻结状态的复温过程中有几种潜在的细胞损伤机理，但复温过程中的低 温损伤一般被认为主要是由细胞内溶液的反玻璃化所致。反玻璃化是指在复温过程中， 细胞内部新晶核的形成或已在降温过程中形成的微小晶核的生长【驯。实际上在降温阶 段，即便是形成了玻璃化，其中也可能有大量的微小晶核和冰晶，但由于其尺寸没有大 于光波长，所以用一般方法检测不到。在复温过程中发生的反玻璃化结晶对细胞产生的 损伤往往比降温阶段形成的胞内冰晶的损伤更致命。 研究显示，较快的降温和复温速率可以减少晶核的数量，提高反玻璃化的温度，抑 制冰晶的形成1 2 6 1 。这并非要完全抑制晶核和冰晶的形成，而是将晶核的数量和冰晶的大 小抑制在样品可以承受的范围内。 ( 2 ) 低温断裂 低温断裂是指在降温或复温过程中，由于样品中产生了热应力而使组织或细胞发生 了断裂【55 1 。热应力的产生原因有如下几种： 降温过程中，样品内部产生了温度梯度。 神经干细胞的玻璃化冷冻保存研究 降温过程中水不断冻结为冰晶，体积增加，样品因膨胀产生了应力。在降温过 程中，样品外层首先结冰，而当样品内部继续结晶膨胀时，就会产生很大的应力挤压外 层直至破裂。 冻结溶液的力学性质( 如弹性或粘性模量，屈服力或断裂力等) 。力学性质与 冻结溶液的微观结构密切相关。 断裂现象多发生在玻璃体相变点附近的温度范围( 1 0 0 1 5 0 ) 。因此建议， 降温复温采用两步法进行，即在1 0 0 以上的温度范围采用较快速率，而在1 0 0 以下 的温度范围采用较慢速率；或者以不产生低温断裂的冻结速率降温到介于其玻璃化转变 温度和低温断裂温度之间的某一温度，并在此状态保存【5 6 , 5 7 】。 1 。3 神经干细胞的低温冷冻保存 1 3 1 神经干细胞概述 ( 1 ) 神经干细胞的概念和一般特性 神经干细胞是一种存在于中枢神经系统( c e n t r a ln e r v o u ss y s t e m ，c n s ) 中的多能干 细胞，它具有向神经元、星形胶质细胞、少突胶质细胞分化的潜能，并能够进行自我更 新以提供足够的细胞给脑组织【5 8 j 。作为干细胞的一种，它具有一般干细胞的基本特性， 即克隆形成能力、自我复制和自我更新能力、分化为本系其他类型细胞的多向分化潜能 等。此外，神经干细胞还具有对称分裂和不对称分裂两种分裂方式，而通常的干细胞仅 具有不对称分裂。随着神经生物学的飞速发展，神经干细胞的研究工作已成为近年来脑 科学研究的一个重要领域，在研究脑的发育和分化以及疾病的治疗上均具有重大价值。 在哺乳动物的胚胎脑组织和成年个体脑区中多个位点都存在着具有自我更新和多 向分化潜能的神经干细胞。如胚胎的大部分脑区，包括海马、纹状体、皮层、中脑、脑 室下区、室管膜下层等，以及成年个体脑组织中的纹状体、海马、皮层、室管膜下层和 嗅球等【3 0 l 。 尽管哺乳动物脑组织中有内源性神经干细胞，但对于大多数脑损伤来说，这种内在 的自身修复是不足或无效的。对于一些先天性和创伤性神经病变、遗传代谢紊乱以及与 年龄相关的退行性病变和肿瘤，传统的移植方法，即将固体组织移植物或有限的非活动 细胞移植到特定的区域，也并不容易达到治疗效果，因为这些疾病病变具有散在性质。 而神经干细胞却能绕开这些障碍，因为它们能充分地分化成神经细胞，以多种神经类型 完全融入神经实质，对正常发育和再生信号起反应，并且迁移到众多分散的神经病变区 域，所以特别适合广泛、弥散变性过程的分子和细胞治疗【5 9 1 。近年来的研究表明，移植 大连理工大学硕士学位论文 神经干细胞对治疗多种急、慢性神经系统疾病，如脊髓损伤、运动神经元变性、阿尔茨 海默病、帕金森病、亨廷顿病、缺血性脑损伤方面具有广阔的临床应用前景，在基因治 疗和药物筛选上也显示出了极大的潜力。 ( 2 ) 神经干细胞的体外培养 神经干细胞的体外培养，一般是将胚胎或成体脑组织的相应部分取出后，制成细胞 悬液，加入一定浓度的有丝分裂原( 如f g f 2 或e g f ) 后进行培养。培养方式主要有 两种，一种是以多聚鸟氨酸和人纤连蛋白作为基质使细胞贴壁生长的单层贴壁培养法， 另一种是使细胞悬浮于培养基中成球生长的悬浮神经球培养法。单层贴壁培养法有利于 细胞的各种观察分析，但很多研究显示，神经干细胞的贴壁生长会诱导其分化，因而大 多数人采用悬浮培养的方式进行神经干细胞的培养和扩增。 悬浮神经球培养法最早由r e y n o l d s 和w e i s s 等 6 0 - 6 2 1 提出并发展，主要是采用添加了 e g f 或b f g f 等生长因子、不添加血清的培养基对神经干细胞进行培养。这种悬浮神经 球的培养方式可以很好地支持干细胞的增殖，并保持其原有特性。在细胞的原代培养中， 有大量的神经球出现己被认为是存在神经干细胞的显著标志之一。 本实验选取小鼠胚胎脑组织中的海马部位作为实验材料并获得种子细胞。针对神经 干细胞低温保存的研究目标，本实验选取有利于细胞增殖的悬浮神经球培养法培养。 ( 3 ) 神经干细胞的检测 对于神经干细胞的鉴定与检测，通常可从如下四个方面进行： 根据形态来检测 经悬浮培养的神经干细胞可以自动聚集成球，健康的神经球透明度好，折光性强， 边界清晰。在相同条件下同时接种的细胞可能产生不同尺寸的神经球。大的神经球通常 有一个暗核，而小的神经球则显示出较好的透光性。 根据增殖能力检测 神经干细胞会在培养的过程中，进行不断的扩增，形成大量神经球，且球的大小会 随培养时间而不断增加，当直径达到2 0 0 t m 时就需要进行传代培养【6 3 】。也有人采用细 胞增殖标记物b r d u ( 5 b r o m o 。2 d e o x y u r i d i n e ) 进行免疫荧光染色，来显示增殖细胞咿l 。 根据表型特征检测 神经干细胞的标记蛋白主要有巢蛋白( n e s t i n ) 、波形蛋白、r n a 结合蛋白及r c l 抗原等。通常采用巢蛋白作为神经干细胞的鉴定标志，可证明神经干细胞仍具有多潜能 性。巢蛋白分布于细胞质中，免疫组化法染色可以观察到其在细胞质中广泛地表达。 根据分化潜能检测 神经干细胞的玻璃化冷冻保存研究 健康的神经干细胞可以分化为中枢神经系统的三类主要细胞：神经元、少突胶质细 胞和星型胶质细胞。可通过诱导分化，再分别检测三种神经细胞的存在。 1 3 2 神经干细胞低温冷冻保存的意义 神经干细胞的移植在治疗多种急、慢性神经系统疾病及脑组织损伤方面具有广阔的 临床应用前景，在基因治疗和药物筛选上也表现了出极大的潜力，但目前神经干细胞的 数量还远远不能满足科学研究和临床应用的需要。在实践中也已经证明神经干祖细胞的 长期扩增和可靠分化存在困难t 6 5 ，因为在长期的培养过程中，可能会出现细胞的微生物 污染，基因型改变以及由于细胞传代次数增加而导致的细胞退化、衰老，甚至突变等情 况，从而导致具有优良特性的细胞系丢失。于是很多学者致力于神经干细胞的冻存研究， 以期解决上述问题。神经干细胞的冻存和复苏，一方面可以建立“神经干细胞库 ，解 决移植细胞源与患者在时间与空间上的匹配问题，使择期手术成为可能，也可以解决临 床上一个捐献者细胞不足的问题；另一方面可以通过对处于早期的神经干细胞的保存， 来保证其本身的优良特性不在反复的传代过程中被改变。另外，由于储存样品可以运输， 也方便了各地间的研究合作和治疗。 目前已有一些实验研究证明了低温冷冻保存不影响n s c 的增殖、分化特性【删。解 冻后的神经干细胞能够存活，能在体外多次传代，并具有冻前的生物学特性，包括其正 常的形态、增殖能力和分化成神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞的多向分化能力【6 j 刀。 1 3 3 神经干细胞低温冷冻保存方法 神经干细胞的低温冷冻保存主要有两种方法，一种是常规的慢速冷冻法，另一种是 近年来发展起来的玻璃化法。 常规慢速冷冻法一般采用1 0 1 5 的d m s o 作为冷冻保护剂，将样品缓慢冷却至 8 0 c 左右，然后再移入液氮中长期保存。h a n c o c k 等用慢速冻存法对胚胎干细胞来源的 神经干细胞进行了冻存，冻后细胞活率仅为5 2 郾】。m i l o s e v i c 等用慢速冷冻法对神经 干细胞球进行了冷冻实验，冻后细胞活率小于7 0 ，一周后小于5 0 【删。但在上述的 实验结果中均发现，冻后的细胞经诱导仍可分化为神经元、星形胶质细胞和少突胶质细 胞，证明了低温冷冻不影响n s c 的增殖、分化特性。徐汉军等用异丙醇盒控温的慢速 冷冻法，对不同代数的神经干细胞进行冻存，活率均在4 0 - - 6 3 之间，且具有多向分 化潜甜6 9 】。高志新等采用胶原包埋神经干细胞的方式，慢速冻存n s c 单细胞，取得了 较好的效果【7 0 l 。 大连理工大学硕士学位论文 玻璃化法通常是在所保存样品中加入具有玻璃化能力的浓度较高的保护剂溶液，然 后快速降温至液氮温度，进行细胞保存。目前对于神经干细胞玻璃化冷冻保存的报道还 较少，但t a n 等【l6 】的初步研究也已经证实，经过玻璃化冷冻后的神经干细胞仍可以保持 与未经冷冻的n s c s 相同的细胞生物学特性，且仍具有向神经元、星型胶质细胞和少突 胶质细胞分化的能力。国内的侯颖等【_ 7 1 】对神经干细胞的玻璃化冻存进行了初步的研究， 发现玻璃化冻存神经干细胞比慢速冻存法更为简单，并筛选出了较适合的保护剂和导入 方法。对于单细胞悬液的冷冻保存，慢速冷冻与玻璃化法的效果并无显著差异。 在对神经干细胞进行慢速低温保存的过程中，细胞内部冰晶的形成可以降低，但不 可以完全避免，且这种常规慢速冻存法一般需要昂贵的程序降温仪。玻璃化法近年来被 广泛应用到各种组织、细胞的低温冷冻保存上，均取得了良好的效果。它可以避免冰晶 的形成，从而改善冻存质量和复苏率，且操作简单方便，不需要昂贵的设备。在对神经 干细胞球慢速冻存与玻璃化法冻存的比较中发现，玻璃化法保存的神经球不仅活率较 高，且保持了细胞球的完整性；而采用慢速冻存法，由于细胞内外均形成了冰晶，神经 球出现严重断裂，其完整性遭到破坏，活率也降低- f 0 6 2 2 l 。因而对于神经球的低温冷冻 保存，玻璃化法更具潜力。所以本文主要采用玻璃化法对神经干细胞进行低温冷冻保存。 1 3 4 神经干细胞球的玻璃化冷冻保存 呈球状生长是神经干细胞的一大特点，虽然对于其内部机理还不太清楚，但m 面 等吲的实验研究结果表明，神经球的三维结构对神经干细胞的增殖有促进作用，推测其 原因是经聚合后细胞细胞相互作用的频率增加，可能会激活细胞间的刻痕信号，导致 神经干细胞增殖的增强。当完全打破这种结构对单细胞悬液进行冻存时，一方面这种联 系被破坏将直接影响细胞活力；另一方面在酶解消化过程中细胞也会受到损伤。p a y n t e t 对神经细胞低温冷冻保存的综述中也提到，神经细胞的冻存状态( 单细胞悬液、小细胞 团、神经球等) 会影响冻存复温后的活率【3 2 1 。在k a l l o s 的论文中也提到，以神经球的 形式冷冻保存神经干细胞会提高解冻后的细胞活力【6 3 】。因此对神经干细胞球的冻存将会 比对n s c s 单细胞悬液的冻存更有效果和意义。 m o r i 等人的实验结果还显示出，大尺度的神经球的增殖速率要明显快于小尺度的神 经球，这说明神经球的尺度会影响神经干细胞的增殖速率。从传质扩散的角度来讲，细 胞球的尺度也会直接影响冻存质量及复苏率。因为冷冻过程的实质就是低温热传导与冷 冻保护剂的传质扩散过程，而这两个过程都受细胞球尺寸的影响，对不同尺度的神经球 的传质传热过程，冷冻保护剂达到渗透平衡所需的时间不同，每种尺度都应存在一个最 神经干细胞的玻璃化冷冻保存研究 佳的渗透平衡时间，可以最大限度地保护细胞不受冷冻损伤。对于一定组分的冷冻保护 剂，存在一个最佳的细胞球尺寸，在这个尺寸下冻存复苏后的细胞活率最大。 1 4 小结 神经干细胞在多种神经系统退行性疾病的治疗以及脑组织创伤的修复上所展现出 来的巨大潜力使其成为世人关注的焦点，也使其在临床上与科研上的需求量不断增加。 然而在临床移植手术中，存在着移植细胞源与患者在时间与空间上的匹配问题和数量不 足的问题，另外在对神经干细胞长期的培养过程中，可能会因多种原因导致具有优良特 性的细胞系丢失。因而对神经干细胞的建库保存成为神经干细胞研究和应用的前提，而 低温冷冻保存技术是神经干细胞建库保存的关键。 目前低温冷冻保存主要有常规慢速冻存和玻璃化两种方法。其中，玻璃化法因在降 温过程中可以避免冰晶的产生，提高冻后细胞和组织的活率和完整性，而被越来越多地 用于多种细胞和组织的低温保存。 本文采用玻璃化法对神经干细胞的低温冷冻保存进行了研究，重点对易造成细胞损 伤的保护剂导入过程进行了优化，并初步研究了神经球尺度和渗透平衡时间对玻璃化冻 存效果的影响。 大连理工大学硕士学位论文 2 神经千细胞的培养 在进行神经干细胞的低温冷冻实验之前，首先要获得足够的神经干细胞，并对其进 行纯化培养以确保神经干细胞在冻存前的状态良好，另外还需通过免疫组织化学鉴定， 确定其为神经干细胞。 神经干细胞的体外培养通常是将从初级神经组织获得的组织块酶解后，用添加了表 皮生长因子e g f 和成纤维生长因子b f g f 的培养基进行体外扩增。e g f 和b f g f 均是神 经干细胞的有丝分裂源信号，可促进细胞不断增殖 7 3 】。其中b f g f 在促进细胞增殖时还 可抑制神经干细胞的分化，而e g f 既可以影响神经干细胞的分化特性，又对神经细胞 的迁移起作用【6 l i7 4 1 。由于使用胎牛血清会令神经干细胞在培养过程中产生分化，故神经 干细胞大多采用无血清培养基进行培养【7 6 1 。 本文选用无血清悬浮培养方式对神经干细胞进行原代和传代培养，并使用神经干细 胞特异性抗体的免疫组织化学检测来验证其干细胞特性。 2 1 实验材料 2 1 1 实验动物 孕龄为1 3 1 5 天( e 1 3 e 1 5 ) 的昆明种小鼠，购自大连医科大学实验动物中心。取 小鼠胚胎作为实验材料。 2 1 2 实验药品及试剂 实验药品及试剂见表2 1 。 神经干细胞的玻璃化冷冻保存研究 d m e m ( 无糖) h a m sf 1 2 r p j i - l6 4 0m e d i u m n e u r o b a s a lm e d i u m b 2 7 n 2 e p i d e r m a lg r o w t hf a c t o r ( e g f ) b a s i cf i b r o b l a s tg r o w t hf a c t o r ( b f g f ) h e p a r i ns o d i u m d - g l u c o s e g l u t a m a x - 1 a l b u m i nb o v i n e h e p e s n a h c 0 3 b s a a c c u t a s e t m p o r n l a m i n i n 注射用青霉素钠 注射用硫酸链霉素 台盼兰( t r y p a nb l u e ) h o e e h s t 3 3 3 4 2 a n t i - n e s t i ni g g a n t i g f a pl g g a n t i - r i p a s ei g g a n t i - l bt u b u l i ni ni g g c c k - 8k i t 封闭用羊血清 罗丹名 i g g - f i t c t r i t o nx 1 0 0 d5 0 3 0 2 1 7 0 0 0 2 6 r1 3 8 3 2 11 0 3 0 4 9 l7 5 0 4 0 4 4 17 5 0 2 0 4 8 1 3 2 4 7 0 5 l l3 2 5 6 0 2 9 2 0 0 10 5 2 8 l5 0 2 3 0 2 1 3 5 0 5 0 0 61 a3 0 5 9 2 2 3 7 7 8 s5 7 6 1 a6 9 6 4 s i g m a ( 美国) g i b c o ( 美国) s i g m a ( 美国) g i b c o ( 美国) g i b c o ( 美国) g i b c o ( 美国) i n v i t r o g e n ( 美国) i n v l l l r o g e n ( 美国) 江苏常州光明生物化学研究所 g i b c o ( 美国) g m c o ( 美国) s i g m a ( 美国) r o c h e ( 德国) s i g m a ( 美国) s l g m a ( 美国) s i g m a ( 美国) s i g m a ( 美国) i n v i t r o g e n ( 美国) 大连美罗大药厂 大连美罗大药厂 英国进口上海化学试剂站分装 s i g m a ( 美国) c h e m i c o n ( 美国) c h e m i c o n ( 美国) c h e m i c o n ( 美国) c h e m i c o n ( 美国) 日本同仁化学研究所 北京中山 s a n t a ( 美国) s a n t a c r u a ( 美国) s i g m a ( 美国) 一2 0 一 大连理工大学硕士学位论文 2 1 3 实验仪器装置 实验中主要仪器装置见表2 2 。 表2 2 实验主要仪器装置 t a b2 2 e q u i p m e n t sf o rt h ee x p e r i m e n t 2 1 4 实验所需溶液的配制方法 ( 1 ) 基础培养基储备液 a d m e m ( 4 x ) 储备液 将可供配制1 l 培养基的瓶装d m e m 粉末( s i g m a ) 溶于2 5 0m lm i l l i q 三级水中 搅拌均匀，转入蔡氏滤器过滤灭菌后，置于4 冰箱储存备用。 b r p m i1 6 4 0 ( 4 x ) 储备液 将可供配制1 l 培养基的瓶装粉末r p m i1 6 4 0 ( s i g m a ) ，溶于2 5 0m lm i l l i q 三级 水中搅拌均匀，转入蔡氏滤器过滤灭菌后，置于4 c 冰箱储存备用。 神经干细胞的玻璃化冷冻保存研究 b f 1 2 ( 4 x ) 储备液 将可供配制1 l 培养基的袋装f 1 2 粉末( g i b c o ) 溶于2 5 0 m lm i l l i q 三级水中搅拌 均匀，转入蔡氏滤器过滤灭菌后，置于4 c 冰箱储存备用。 ( 2 ) 缓冲溶液 a p b s 称取k c l0 2g ，k h 2 p 0 40 2g ，n a 2 i - i p 0 4 1 2 h 2 00 2 8 9g ，n a c i8 0g ，量取8 0 0m l m i l l i q 三级水，依次溶解上述物质，后加m i l l i q 三级水定容至1 0 0 0m l 。过滤后高压灭 菌，于4 下保存备用。 b h e p e s ( 1 m ) 称取2 3 8gh e p e s 溶解于8 0m lm i l l i q 三级水中，搅拌均匀后定容至1 0 0m l ，过滤 灭菌后，于4 下储存备用。 c t r i s - h c i ( 1 m m ，p h = 7 6 ) 称取t r i s ( - - 羟甲基氨基甲烷，m 、肛1 2 1 1 ) 1 2 1 1m g ，先以少量的m i l l i q 三级水 ( 8 m l 左右) 溶解t r i s ，0 1m 的h c i 调节p h 值到7 6 ，然后定容至1 0 m l 。过滤灭菌后， 于4 下储存。 ( 3 ) 生长因子储备液 a e g f ( 1 0 p g m 1 ) 表皮生长因子，每支含冻干粉1 0 0 p g 。将其用无菌水溶解，并加入适量b s a 溶液成 l m l ，之前加入适量b s a ，使其含量至少达到o 1 ，然后再稀释1 0 倍，以每管1 0 0 p 1 分装于0 5m le p 管中，于- - 2 0 1 2 下保存。 b b f g f (