（生物化学与分子生物学专业论文）神经肽酪氨酸（npy）调节肝脏再生的实验研究.pdf

浙江理工大学硕士学位论文 神经肽酪氨酸( n p y ) 调节肝脏再生的实验研究 摘要 肝衰竭、肝硬化和原发性肝癌等终末期肝病严重威胁人类的健康。我国每年因原发性 肝癌死亡人数达2 0 万；1 9 9 0 年美国因肝衰竭死亡达2 7 ，0 0 0 人；据5 5 个国家向w h o 提供 的数字，每年全世界死于肝硬化的人数超出3 l 万，近几年来已增加到5 0 万。目前已有的治 疗手段当中，只有肝脏移植能彻底治疗终末期肝病。但是肝脏移植后供体肝的再生能力低 下严重限制了肝脏移植的治疗效果和大规模临床应用。其主要原因在于对肝脏再生的机制 的研究仍然处于初级阶段，对肝脏再生的机制了解不够详细。目前的研究认为肝脏再生受 到多种基因和信号通路的调控。对肝脏再生的机制研究其目的是能够找到促进肝脏再生的 药物，以提高肝脏移植后病人的存活率。 肝脏内有大量自主神经分布，近来自主神经在肝脏再生过程中作用日益引起人们的关 注。研究资料显示交感神经和迷走神经都参与肝脏部分切除后的再生过程。最新的研究还 发现神经递质5 羟色胺在肝脏再生过程中起着重要作用。文献显示在豚鼠、狗、猪、猴及 人的肝实质中也有n p y 阳性自主神经，且在肝细胞周围交织成网状。应用全基因组表达芯 片，我们对小鼠肝脏四氯化碳损伤后再生过程中全基因组表达作了系统研究，发现神经肽 酪氨酸( n p y ) 的基因表达与肝脏损伤后再生相关。目前还未见n p y 调节肝脏再生过程的研 究报道。本课题拟制备小鼠n p y ( m n p y ) 的真核表达质粒通过电转染小鼠大腿肌肉的方式来 初步检测n p y 对肝脏功能和肝细胞增殖的影响；然后再通过给小鼠注射蛋白的方式进一步 确认初步的实验结果；最后再利用n p y 多克隆抗体阻断四氯化碳损伤后的小鼠肝脏再生过 程最终确定n p y 的作用。本课题的研究结果有望为找到促进肝脏移植后供体肝的再生药物 的研究提供新的线索。 本课题从基因克隆开始，构建了m n p y 的真核表达质粒。再将构建好的m n p y 真核表达 质粒电转染到小鼠大腿肌肉细胞内提高小鼠血浆内的n p y 浓度，再检测肝脏功能和增殖的 相关指标。然后，人工合成n p y 多肽并注射小鼠进一步重复l i l n p y 真核质粒电转染实验结 果。最后构建l i l n p y 原核表达载体，在大肠杆菌中表达i i l n p y 融合蛋白，经过纯化后免疫大 浙江理工大学硕士学位论文 白兔获得n l n p y 兔多克隆抗体，再利用获得的多克隆抗体阻断小鼠四氯化碳后肝脏损伤再 生过程。 本研究的主要结果和结论如下：利用p c r 方法成功从小鼠肝脏c d n a 文库中克隆得到 m n p y 成熟肽的基因片断，琼脂糖凝胶电泳验证约3 0 0 b p 大小；成功将i i l n p y 成熟肽克隆到 p c d n a 、p e t 一2 8 和p e t - 3 0 载体上，并且测序结果正确；成功表达m n p y 融合蛋白并制备了 l l l n p y 融合蛋白兔多克隆抗体，且w e s t e r nb l o t 检测抗体效价较高：i i l n p y 真核表达载体电 转染实验和n p y 多肽小鼠注射实验发现n p y 可能促进肝细胞的增殖；m n p y 融合蛋白兔多克 隆抗体阻断小鼠肝脏四氯化碳损伤实验发现肝脏损伤后再生过程受到延迟。以上实验结果 初步说明n p y 可能在小鼠肝脏损伤再生过程中起着重要作用。本课题为进一步研究n p y 调 节肝脏再生作用和作用机理奠定了实验基础。 关键词：神经肽酪氨酸( n p y ) ，肝脏再生，自主神经，蛋白质纯化，抗体阻断 浙江理工大学硕士学位论文 n e u r o p e p t i d eyr e g u l a t i n gl i v e rr e g e n e r a t i o n e n d s t a g eli v e rd is e a s e s ( c a r c i n o m ao f t h eli v e r 、li v e rf a il u r e 、li v e r c i r r h o s i sa n ds oo n ) h a v et h r e a t e n e dg r e a t i yt oh u m a nh e a l t h m o r et h a n2 0 0 ，0 0 0 p e o p l ed i e do fc a r c i n o m ao ft h el i v e ri nc h i n ae a c hy e a r ；2 7 ，0 0 0p e o p l ed i e do f l i v e rf a i l u r ei na m e r i c ai n1 9 9 0 ：t h ed a t aw h i c h5 5c o u n t r i e sh a dp r o v i d e dt ow h o s h o w e dt h a tt h ea m o u n to fp e o p l ed i e do fl i v e rc i r r h o s i sa r o u n dt h ew o r l di sm o r e t h a n3 1 0 ，0 0 0a n dc l o s et o5 0 0 ，0 0 0i nr e c e n ty e a r s m a n yt h e r a p i e sh a v eb e e nu s e d t ot r e a ts u c hs e v e r v eh e p a t i cd is e a s e s ，b u to n l yli v e rt r a n s p l a n tc a nc o m p l e t e l y c u r et h e m h o w e v e r ，t h el o wr e g e n e r a t i n gc a p a c i t yo ft h ed o n o rl i v e ri nc l i n i ch a s l i m i t e dt h ee f f e c t sa n da p p li c a t i o no ft h e1i v e rt r a n s p l a n t a l t h o u g hi ti sn o w w i d e l ya c c e p t e dt h a tl i v e rr e g e n e r a t i o ni sr e g u l a t e db yag r e a td e a lo fg e n e sa n d s i g n a l i n gp a t h w a y s ，t h em e c h a n i s m so fl i v e rr e g e n e r a t i o na r em o r ec o m p l i c a t e dt h a n w ek n o w t h ea i mo fr e s e a r c h i n gli v e rr e g e n e r a t i o ni st of i n daw a yt op r o m o t e t h eli v e rr e g e n e r a t i o na f t e rli v e rt r a n s p l a n ti nc li n i c a u t o n o m i cn e r v o u ss y s t e md i s t r i b u t e si nt h e1 i v e ra n di t sr o l ei nl i v e r r e g e n e r a t i o nh a sb e e nd r a w nm o r ea t t e n ti o ni nr e c e n ty e a r s i tw a sr e p o r t e dt h a t v a g a ln e r v ea n ds y m p a t h e t i cn e r v ew e r ei n v o l v e di nl i v e rr e g e n e r a t i o n n e wp a p e r i ns c i e n c es h o w e ds e r o t o n i n ，an e u r o t r a n s m i t t e r ，p a l y e dai m p o r t a n tr o l ei nl i v e r r e g e n e r a t i o n n e u r o p e p t i d ey ( n p y ) p o s i t i v ea u t o n o m i cn e r v e s w e r ef o u n di nt h e li v e ro fg u i n e ap i g ，d o g ，p i g ，m o n k e ya n dh u m a n ，a n de v e nd is t r i b u t e da r o u n dt h e h e p a t i cp a r e n c h y m ac e l l s w ei d e n t i f i e dn p ya sap o t e n t i a lr e g u l a t o rf o rl i v e r r e g e n e r a t i o n t h ee x p r e s s i n gp a t t e r no fn p yd u r i n gc c i , i n d u c e d1i v e rr e g e n e r a t i o n w a sf o u n dt ob er e l a t e dt ot h er e c o v e r yo ft h ed a m a g e d1i v e r t h er o l eo fn p yi n l i v e rr e g e n e r a t i o nh a sn e v e rb e e nr e p o r t e d i nm yt h e s i s ，id e s i g n e das e r i e s e x p e r i m e n t st oi n v e s t i g a t et h ea c t u a lr o l eo fn p yi nl i v e rr e g e n e r a t i o ni no r d e r t op r o v i d en e wc l u e sf o rd e s i g n i n gn e wm e d i c i n et op r o m o t et h ed o n o r1i v e r r e g e n e r a t i n gc a p a c i t yi nc li n i c 5 浙江理工大学硕士学位论文 ic l o n e dt h em o u s en p y ( m n p y ) f u llc d n a ，a n di n s e r t e dt h eg e n ei n t ot h e e u k a r y o t i ce x p r e s s i n gp l a s m i dp c d n a t h e nie l e c t r o p o r a t e dt h ep l a s m i di n t ot h e m o u s el e gm u s c l et oi n c r e a s et h em o u s es e r u mn p yc o n t e n tt oi n v e s t i g a t et h ee f f e c t s o ft h en p yt ol i v e rf u n c t i o na n dl i v e rc e l l sp r o i f e r a t i o n t h ea r t i f i c a l l y s y n t h e s i z e dn p yw a si n j e c t e di n t om o u s et of u r t h e rd e t e c t i t sr o l ei nli v e r f u n c t i o na n d1 i v e rc e l i sp r o l i f e r a t i o n a tl a s t ，ic o n s t r u c t e dm n p yp r o k a r y o t i c e x p r e s s i n gp l a s m i da n di n d u c e dt h ee x p r e s s i o no fm n p yr e c o m b i n a n tp r o t e i n ( r m n p y ) i ne c o li t h er m n p yw a sp u r i f e db ys d s p a g ea n dw a si n j e c t e di n t oar a b b i tt o g e tt h ep o l y a n t i b o d yo fm n p yw h i c hw a su s e dt od i s t u r bt h er e c o v e r yp r o c e s so f m o u s eli v e rr e g e n e r a t i o na f t e rc c l 4d a m a g e t h em a i nr e s u l t sa n dc o n c l u s i o n so fo u rw o r ka r ea sf o ll o w s ：f i r s t ，w eg o t t h em n p yg e n ef r a g m e n tf r o mm o u s eli v e rc d n ali b r a r y a f t e ra g a r o s eg e l e l e c t r o p h o r e s i s ，w es a wt h eg e n ef r a g m e n t3 0 0 b a s ep a i r so rs o ；w es u c c e e d e dc l o n i n g t h em n p yg e n ef r a g m e n ti n t op l a s m i dp e t 一2 8 ，p e t 一3 0a n dp c d n aa n dt h er e s u l t sh a v e b e e nc o n f o r m e db yd n as e q u e n c e ：w em a d et h er m n p yr a b b i tp o l y a n t i b o d y ；w ed e l a y e d t h er e c o v e r yp r o c e s so fm o u s eli v e rr e g e n e r a t i o na f t e rc c l d a m a g eb ys u b c u t a n e o u s l y i n j e c t i n gt h en e wp o l y a n t i b o d y s u c hr e s u l t sp u tab a s ef o rf u r t h e ru n c o v e r i n g t h es p e c i f i cd e t a i l sa n dm e c h a n i s m so fn p yr e g u l a t i n gl i v e rr e g e n e r a t i o n k e yw o r d s ：n e u r o p e p tid ey ，l i v e rr e g e n e r a tio n ，a u t o n o m icn e r v o u ss y s t e m , p r o t e i n p u r i f i c a ti o n ，a n t i b o d yi n t e r d i c t i o n 6 附录5 9 致谢6 3 硕士期间发表的论著6 4 缩略 语 a m p b p c c i 。 c d n a d d h ：o d n a d n t p h k a n a k d l b m l n o d o r f p c r r p m s d s x 。g a l r n a 英文名称 符号、单位、术语等的说明 a m p i c i l li n b a s ep a i r c a r b o l o yt e t r a c h l o r i d e c o m ple m e n t a r yd n a d o u b l ed i s t i l l a t e dw a t e r d e o x y r i b o s en u c l e i ca c i d d e o x y n u c l e o s i d e st r i p h o s p h a t e h o u r k a n a m y c i n k i l o d a l t o n l u r i a - b e r t a n ic u l t u r e m i n u t e o p t i c a ld e n s i t y o p e nr e a d i n gf r a m e p o l y m e r a s ec h a i nr e a c t i o n r e v o l u t i o n sp e rm i n u t e s o d i u md o d e c y ls u l f a t e 5 - b r o m o - 4 - c h l o r o - 3 - i n d o l y l b d - g a l a c t o s i d e r i b o n u c l e i ca c i d 9 中文名称 氨节青霉素 碱基对 四氯化碳 互补脱氧核糖核酸 双蒸水 脱氧核糖核酸 脱氧核糖核苷三磷酸盐 小时 卡那霉素 千道尔顿 l b 培养基 分钟 光密度 开放阅读框 聚合酶链反应 辕 食 十二烷基磺酸钠 5 一溴- 4 - 氯一3 一哼l 哚一b d - 半乳糖苷 核糖核酸 浙江理工大学硕士学位论文 学位论文独创性声明 本人声明，所呈交的学位论文系在导师指导下本人独立完成的研究成果。文中依法引 用他人的成果，均已做出明确标注或得到许可。论文内容未包含法律意义上已属于他人的 任何形式的研究成果，也不包含本人已用于其他学位申请的论文或成果。 本人如违反上述声明，愿意承担以下责任和后果： 1 交回学校授予的学位证书； 2 学校可在相关媒体上对作者本人的行为进行通报； 3 本人按照学校规定的方式，对因不当取得学位给学校造成的名誉损害，进行公开 道歉。 4 本人负责因论文成果不实产生的法律纠纷。 论文作者签侧啸坶如出 浙江理工大学硕士学位论文 学位论文知识产权权属声明 本人在导师指导下所完成的论文及相关的职务作品，知识产权归属学校。学校享有以 任何方式发表、复制、公开阅览、借阅以及申请专利等权利。本人离校后发表或使用学位 论文或与该论文直接相关的学术论文或成果时，署名单位仍然为浙江理工大学。 论文作者 导师签 日期硒年孓月丛日 日期：哮月日 浙江理工大学硕士学位论文 第一章引言 肝脏疾病是常见病、多发病，病情发展到一定程度常常会出现肝硬化，甚至癌变，从 而影响人们的身体健康，影响人们的生存质量，严重时可导致死亡。特别是中国是乙型肝 炎发病大国，世界上现在有4 亿多乙肝病毒携带者，中国占1 3 亿，加上3 千万慢性乙肝患 者，中国共有1 6 亿乙肝病毒携带者，占中国人口的1 1 0 强，乙肝成为影响中国人健康的 大问题。乙型肝炎很容易发展成结节性肝硬化、并具强烈的癌变倾向。严重的晚期肝脏疾 病最终多出现肝功能不全或肝功能衰竭，病死率高达7 0 - 、一8 0 目前临床上治疗晚期肝脏 疾病最有效的手段就是人工肝和肝脏移植。暂时性的人工肝支持，可以使因肝衰竭所产生 的各种有害物质得以清除，并替代肝脏的部分代谢功能，病变的肝脏可望通过再生而恢复 其原有的结构和功能，以渡过危险的肝功能衰竭难关而获生存。即使因为严重而广泛的肝 细胞坏死而不能恢复肝功能，人工肝支持治疗亦可维持患者生命使其等到肝脏移植。肝脏 移植就是利用手术的方法将新的具有功能的肝脏来替换原来功能损坏的肝脏。尽管人工肝 和肝移植在临床上取得了一定的成效，但是由于移植后供体肝的再生能力低下严重制约了 肝脏移植的手术效果。因此，提高供体肝的再生能力一直是临床上的重大课题。 肝脏再生是指肝脏因手术、创伤、中毒、感染坏死以及肝移植术后等致部分肝脏丧失 后，肝细胞重新修复的过程。相对于其巨大的代谢负荷而言，肝脏在细胞增殖是一静止器官 ，因在任何时间仅0 0 0 1 2 0 0 1 肝细胞在进行分裂，但在重大创伤或中毒情况下肝脏具 有很大的再生能力，通过d n a 合成和有丝分裂重建与机体大小相适应的肝脏体积n 1 。在部分 肝脏切除后再生，是由剩余的肝叶增大直至恢复原肝的重量，一旦恢复到原肝的重量细胞 增殖即停止圆。部分肝脏切除术( p h ) 后肝脏的增殖发生于整个成熟的细胞群中，包括肝细 胞、胆管上皮细胞、k u p f f e r 细胞以及贮脂细胞( i t o 细胞) 。i t o 细胞具有贮存维生素a ， 合成结缔组织蛋白和分泌多种生长因子的功能。这些细胞的增殖重建了失去的肝组织。大 鼠的肝脏在手术切除后，剩余的肝细胞立即从g 。期转向g ，期。此后1 2 小时内肝细胞d n a 合成 开始增加，随即进入s 期，2 4 小时正在合成d n a 的肝细胞数量最多。小鼠的合成d n a 的肝细 胞数量高峰期在3 6 4 0 小时之间。大约三天后部分切除后的肝脏重量基本恢复到原来大小 ，5 7 天后完全恢复脚。肝脏再生是多基因，多种信号通路相互调节的复杂过程h 1 ，主要涉 1 浙江理工大学硕士学位论文 及 ! u 1 0 0 多个基因的参与眵1 。已经发现许多细胞因子，如肝细胞生长因子( h g f ) 、肿瘤坏死 因子( t n f ) 、白细胞介素一6 、表皮生长因子( e g f ) 和转化生长因子( t g f ) 等在肝脏再生过 程中起着重要作用1 。最新研究发现肝脏再生还受激素细胞核受体f x r 口3 、神经递质 s e r o t o n i n 阳1 、c a v e o l i n 一1 跨膜蛋白分子嗍和神经营养素受体p 7 5 n t r n 们等基因的调控。尽管 肝脏再生的机制许多细节已经阐明，但仍然有很多未知的因素需要探究。近来越来越多的 文献显示肝脏再生与自主神经的调控有关，关于这方面的研究已经成为肝脏再生研究的新 趋势。 肝脏与神经的联系是通过两侧胸7 9 交感神经发出分支及延髓发出左右两侧迷走神 经( 副交感神经) 并形成分支而实现的，此外还有右侧膈神经的分支。交感神经是肝内的 主要神经，其主要分布于肝脏汇管区血管周围，尚有神经末梢分支分布于肝小叶内。 g a r d e m a n n 等m 1 证明门静脉周围有大量的肾上腺素能神经纤维，在肝门门静脉旁的大的神 经束中大部分为肾上腺素能神经，而在门静脉分支及胆管旁却偶能见到；在肝动脉分支周 围也常见到肾上腺素能神经纤维，此外还发现在人和大鼠的肝动脉周围还有多巴胺能神经 分布。应用神经元特异性烯醇化酶( n e u r o ns p e c i f i ce n d o l a s e ，n s e ) 与儿茶酚胺合 成相关酶的抗体发现6 0 的无髓鞘轴索供应肝实质，那些供应脉管系统的神经纤维表现为 交感神经。近来a k i y o s h i 等n 2 1 的研究表明，在人和大鼠的肝汇管区存在胆碱能神经，其 主要定位于肝动脉和胆小管周围。 研究资料显示自主迷走神经参与了肝脏的再生过程。在动物肝脏部分切除模型中，残 余肝脏在7 2 小时后重量就恢复到原来的8 0 n 羽。大鼠膈下迷走神经切除后再行肝脏部分切 除，则残余肝脏的重量恢复受到阻碍n 1 。这主要与大鼠的摄食量减少有关，因为实验后体 重与没有行肝脏部分切除的对照组没有显著差异n 副。同时大鼠膈下迷走神经切除也使大鼠 体重和残余肝脏的d n a 和蛋白质的合成量显著降低，此外肝细胞的d n a 合成受到延迟和抑 制。大鼠膈下迷走神经切除后残余肝脏内天冬氨酸甲酰基转移酶和脱氧胸腺嘧啶苷激酶一 一肝脏再生中嘧啶核苷酸从头合成和补救途径两种主要酶的合成也受到强烈的抑制和阻 断，同时肝脏部分切除后残余肝细胞的d n a 合成的起始也延迟。而大鼠肝脏迷走神经切除 后，部分切除后的残余肝细胞d n a 的合成受到延迟但d n a 合成的增加率和脱氧胸腺嘧啶苷 激酶的活性并没有受到抑制n 引。肝脏迷走神经切除后并不影响肝脏部分切除后大鼠的摄食 量和体重。膈下迷走神经切除和肝脏迷走神经切除不同在于前者切除不仅影响到肝脏神经 2 浙江理工大学硕士学位论文 还影响到许多其他器官n 7 3 。此外，隔下神经切除减少大鼠摄食量和严重延迟胃排空m 1 。 p i e t r o l e t t i n 们等检测了自主神经与肝脏部分切除后残余肝脏再生时双向血液供应的 关系。他们发现入门自主神经三合体在肝脏再生过程中至少起着重要的支持作用。因此， 肝脏迷走神经可能通过减少因缺血而引起的血管激进损伤来影响肝细胞功能。但是，大鼠 门静脉变换以便增加肝脏血液流，肝脏d n a 氚标记的腺嘧啶脱氧核苷的渗入与对照组没有 显著差别踟。此外，切断肝内脏神经和迷走神经后肝脏动脉和入门静脉血液流并没有改变 船。通过切断神经来改变肝脏的血液供应在肝脏再生中并没有起多大作用。因此，迷走神 经可能通过直接或者特殊的方式来促进肝脏再生，但是其调节机制仍需进一步的研究。 研究资料显示自主交感神经也参与肝脏再生的过程。c r u i s e 等报道肾上腺素能药物能 调节肝脏再生馏羽；去甲肾上腺素能通过a1 肾上腺素受体促进体外培养的大鼠肝细胞的d n a 合成1 。此外，1 w a i 和s h i m a z u 幽1 利用半乳糖胺处理过的轻微损伤离体肝脏研究发现激活 肝脏交感神经提高血液中的儿茶酚胺含量能加速肝脏急性损伤，该作用过程依赖细胞外的 钙离子的渗入。c a l v e r t 和b r o d y t m 1 9 6 0 年提出四氯化碳诱导的肝脏坏死不是直接作用于 肝细胞，而是持续的破坏交感神经的电位减少肝脏血流和细胞氧气供给。但是最近研究发 现四氯化碳是通过p - 4 5 0 肝脏代谢途径诱导细胞损伤啪1 。h s u 昭刀等利用自发性高血压大鼠 ( s p o n t a n e o u s l yh y p e r t e n s i v er a t s ，s h r ) 和正常血压w i s t a r k y o t o 大鼠i ( w k y ) 的四， 氯化碳损伤模型来检测交感神经在该过程中的作用。研究发现四氯化碳损伤后s h r 大鼠肾 上腺儿茶酚胺含量升高，且荧光免疫组化也发现肝脏肾上腺素的含量显著增多。此外，s h r 大鼠的交感神经系统要比w k y 大鼠对四氯化碳的损伤更敏感，急性损伤后肝脏血流减少并 且肾上腺中的儿茶酚胺急剧减少，慢性损伤后血压降低。两种大鼠四氯化碳损伤后血清中 g p t 的活性都升高但是s h r 升高更明显。免疫组化检测发现s h r 肝脏出现部分肝硬化，而w k y 只是出现部分纤维化桥。因此，h s u 等推、狈i j s h r 大鼠更易受四氯化碳损伤的病理学原因在于 增强的交感神经的反应而释放出大量的儿茶酚胺而引起血管收缩和促进肝脏损伤的代谢 改变。 1 w a i 恻等利用肝脏部分切除模型研究交感神经在肝脏再生过程中的作用并测量组织 中的去甲肾上腺素含量的改变和周转率。去甲肾上腺素周转分数在肝脏部分切除后2 4 - 4 8 小时内显著降低，8 - 9 天后恢复到正常水平；因此，交感神经的活性在肝脏再生的早期阶 段受到抑制。但是，k n o p p 啪1 等研究却发现在肝脏部分切除2 0 分钟内血浆中的去甲肾上腺 浙江理工大学硕士学位论文 素水平升高，但是i d , 时后降低到基础水平并持续到2 4 小时。此外，血浆的肾上腺素和皮 质酮含量也在2 0 分钟内显著增加。儿茶酚胺的第一个高峰时期是由于手术相关的应急反应 引起的。然后，4 d , 时后血浆内的肝脏部分切除的大鼠肾上腺素水平提高，2 4 d , 时后肾上 腺素的水平恢复到基础水平。肾上腺素水平的升高似乎与肝脏部分切除后的残余肝脏的再 生有关。 o h t a k e 等用超声流量计测量麻醉后大鼠的腹部交感神经调节门脉血流的情况。结果 显示交感神经直接调节入门静脉血流。并且肝动脉闭塞或肝脏部分切除并不影响该交感神 经的调节作用。肝脏部分切除的实验动物激活交感神经肝脏分支对肾脏血流没有影响，但 是却能减少肠系膜上静脉的血流。这可能与交感神经影响肝脏再生是肝门静脉血流的变化 有关。但是，他们也指出交感神经切除后只是增加肝脏血流，不影响肝脏再生。肝脏部分 切除后2 4 小时由于应急反应一般伴有胸腺萎缩症。m i n a g a w a m l 等人为交感神经可能在诱 导肝脏部分切除后的免疫过程中起着重要作用。肝脏部分切除后交感神经首先受到信号， 然后激活自然杀伤细胞，参与肝脏再生过程中的免疫防御。 神经肽y ( n e u r o p e p t i d ey ，n p y ) 是1 9 8 2 年由t a t e m o t o 首次从猪脑中分离得到，是由 3 6 个氨基酸组成的活性多肽，由于结构中富含酪氨酸，故称为神经肽酪氨酸( n p y ) 。它的结 构与同是3 6 个氨基酸的胰多肽( p p ) 和肽y y ( p y y ) 极其相似，故认为同属胰多肽家族。从分 子结构看，人、大鼠、豚鼠和兔序列安全一致，而牛、羊、猪n p y 序列与人的序列只相差 一个氨基酸，即第1 7 号上人为蛋氨酸，而猪、牛、羊为亮氨酸。n p y 空间三维结构类似于 鸡胰多肽，即有两个相互逆平行的螺旋区，当某些因素造成其三级结构改变时，它便失 活。如：其a 螺旋结构稳定性高度依赖p h 值，p h = 8 时，以a 螺旋为主且稳定，当p h = 1 8 时，a 螺旋丧失，多肽呈松散无活性状态。n p y 广泛分布于中枢及外周神经组织的神经元中。中 枢有脑中的纹状体、下丘脑、海马、延髓、间脑、前皮质层及脊髓，周围神经系统中有颈 上神经节、星状神经节、腹腔神经节等交感神经节细胞，此) b n p y 也存在于组织、器官及 腺体中，如骨骼肌、血管、心、肝脏、脾脏、肺、肾上腺、甲状腺及颌下腺中，而胰脏和 肾中较少。另外，n p y 也可由非神经元细胞合成释放嘲。大鼠及某些品系小鼠的原始巨核细 胞和血小板可合成释放n p y 。一般随着动物年龄增长，体内np y 衰退，其调节生物功能的 能力较成年动物低。 n p y 具有促进动物采食，影响激素分泌、心血管功能、调节体温、生物节律、性行为 及情绪等各种生物功能，。n p y 可作用于下丘脑，具有增强食欲，改变机体 代谢环境，激活脂肪组织的脂蛋白酶，促进脂肪的合成和储存等作用。但它的摄食效应并不 浙江理工大学硕士学位论文 是借助于去甲肾上腺素( n e ) 产生的。n p y 也作用于下丘脑垂体性腺轴，对 垂体分泌黄体生成素( 1 u t e i n i z i n gh o r m o n e ，l h ) 有促进作用，这一作用主要通过两个途 径实现，一是作用于下丘脑，通过促进促性腺激素释放激素( g o n a d o tr o p i n 2 r e l e a s i n g h o r m o n e ，g n r h ) 的分泌间接促进垂体分泌l h ；二是直接作用于垂体，促进l h 分泌，同时还 增强垂体对g n r h 的敏感性。另有报道n p y 参与动物的学习、记忆过程。n p y 可直接作用于 肾上腺皮质，刺激醛固酮分泌，促进大鼠球状带的生长，并增加类固醇的含量。此外n p y 对 下丘脑垂体肾上腺轴活动有一定的调控作用。早在8 0 年代初，人们就发现 n p y 具有较强的缩血管效应。它一方面直接促进血管平滑肌收缩：另一方面通过促进血管内 皮释放增强缩血管反应因子而间接起作用。n p y 的缩血管效应在不同血管有很大差异，可能 与n p y 受体分布密度相关，通常大血管n p y 的反应不太稳定，而小动脉和小冠状动脉、脑正 中动脉和软脑膜动脉对n p y 的反应嘲。n p y 可以减弱心肌的收缩力，减慢心率致心输出量 下降。n p y 还能直接引起冠状动脉痉挛，使心肌供血不足。n p y 不能通过突触前膜作用抑制 n e 的释放而产生缩血管效应。 n p y 阳性自主神经在肝脏中分布广泛。在鲤鱼、菜蛙、海龟、鸡、大鼠、仓鼠、豚鼠、 狗、猴及人的肝脏g 1 i s s o n 系统及胆管中均有n p y 阳性自主神经分布泓1 。随着物种的进 化，n p y 阳性神经的密度也增加。在豚鼠、狗、猪、猴及人的肝实质中也有n p y 阳性自主神 经，且在肝细胞周围交织成网状。但是，在大鼠、豚鼠，仅仅在肝脏的被膜观察至u n p y 阳性自 主神经纤维。d eg i o r g i or 等在大鼠胰腺的内分泌部和外分泌部均检测到n p y 阳性自主神 经，但分布密度有所区别，在腺泡、导管、间质及血管周围含量丰富。猫胆囊中n p y 自主神 经分布于各层，n p y 神经元在肌层可见。人的胆囊大部分n p y 自主神经分布在固有层。 m a s a s h iy o n e d a 等发现中枢神经系统的n p y 通过迷走神经调节肝脏胆汁的分泌，说明n p y 参 与肝脏功能的调节汹1 。目前关于n p y 在肝脏再生过程中的作用至今还没有人报道，本文则 对n p y 在肝脏再生过程中的作用进行了深入的探讨，希望能为临床上肝脏严重疾病的治疗 和新型肝病药物的设计提供新的思路。 本文的工作基础是运用基因表达芯片技术，对小鼠四氯化碳损伤过程中基因组表达变 化的规律进行了系统研究。我们的实验模型利用四氯化碳损一次性注射小鼠，诱发肝脏损 伤和再生。该模型是研究肝脏急性损伤的经典模型，损伤的肝脏一般7 天左右恢复。四氯 化碳注射后，取第0 天，0 5 天，1 5 天，4 5 天和7 天的肝脏并提取总r n a 。然后利用小鼠全 5 浙江理工大学硕士学位论文 基因组探针( m o u s eg e n o m e4 3 02 0a r r a y9 0 0 4 9 5 ) 对肝脏总m r n a 的表达水平进行了分 析，发现n p y 基因的m r n a 的表达水平呈现先上升后下降的变化，如图卜1 。n p y 在肝脏损伤 最严重时表达量显著升高，因此我们推测n p y 可能与肝脏再生有关。 本文的研究思路是首先进行小鼠n p y ( i i l n p y ) 的真核表达载体的构建、小鼠肌肉电转 染实验；其次，构建m n p y 原核表达载体、诱导表达、纯化和兔多克隆抗体的制备；n p y 多 肽的合成与注射正常小鼠实验；m n p y 兔多克隆抗体阻断四氯化碳肝脏损伤模型实验。大肠 杆菌遗传表达体系由于其遗传学、生物化学和分子生物学方面已经被人们了解，大肠杆菌 遗传图谱明确，容易培养且费用低廉，对许多蛋白质有很强的耐受能力，能高水平地表达 这些蛋白质，成为表达许多异源性蛋白质的首选系统。本部分研究拟应用小鼠大腿肌肉电 转染m n p y 真核表达质粒提高正常小鼠血浆中的n p y 含量，从而初步检测高水平的n p y 对肝细 胞增殖的影响。再利用p e t 系统对i i l n p y 基因进行原核表达，获得纯化的m n p y 重组蛋白，为 制备高效价的抗体提供基础。由于i i l n p y 多肽活性形式只有3 6 个氨基酸原核表达起来比较困 难，因此我们利用人工多肽合成的方式来获得。为了进一步的确认n p y 在肝脏再生中的作 用，我们利用获得的多克隆抗体降低四氯化碳模型小鼠血浆中的n p y 含量，从而观察降低 后的n p y 是否影响肝脏的再生。通过这种方式来研究n p y 在肝脏再生是否起作用。四氯化 碳模型稳定性好，可操作性强，容易掌握。此外，我们实验室还正在建立肝脏部分切除模 型，从而为本项目的深入研究提供实验手段的保障。 图1 - 1n p y 基因在肝脏损伤修复过程中的表达变化 f i g l 1n p yg e n ee x p r e s s i o nd u r i n g1i v e rr e g e n e r a t i o n 浙江理工大学硕士学位论文 2 1 实验仪器与设备 第二章材料 p t c 一2 0 0p c r 仪 b s2 1 0 s 电子天平 电子天平l dm a x = l o o g d y c z - 3 1 d 型电泳槽 e p s3 0 0 电泳仪 6 1 7 0 0 2 紫外灯2 a 快熔丝 凝胶呈像分析系统 h e r a e u s 离心机d - 3 7 5 2 0 d k - 8 d 型电热恒温水槽 3 7 度恒温培养箱 c l a s s i cc 2 5 k c 恒温摇床 s w c j i f d 洁净工作台a 0 4 111 0 8 8 x w 一8 0 a 涡旋混合器v o r t e x - 7 0 。c 超低温保存箱 紫外可见分光光度计7 5 2 s h it a c h i 高速离心机s c r 2 0 队 s o n i c a t o ru l t r a s o n i cp r o c e s s o r x l 2 0 2 0 - o lo 超声波细胞粉碎机隔音箱 t s - 2 型脱色摇床 p h s - 3 型精密p h 计 磁力搅拌器 m o d e le c li p s ee 2 0 0 0 显微镜 7 b i o r r a dl a b o r a t o r i e s s a r t o r i u s 公司 沈阳龙腾电子有限公司 北京市六一仪器厂 上海天能( t a n o n ) 科技有限公司 上海天能( t a n o n ) 科技有限公司 v ilb e rl o u r m a t ，f r a n c e 美国热电集团公司 上海精宏实验设备有限公司 s a n y o 公司 n e wb r u n s w i c ks c i e n t i f i c c o m p a n y ，in c 苏州安泰空气技术有限公司 上海医大仪器厂 海尔集团 上海梭光技术有限公司 日立电机株式会社 m is o n i xi n c o r p o r a t e d 宁波新芝生物科技股份有限公司 海门市其村贝尔仪器制造有限公司 雷磁公司 上海司乐仪器有限公司 日本n i k o n 公司 浙江理工大学硕士学位论文 d h g - 9 0 31 a 型电热恒温干燥箱 h h 一4 恒温水浴锅 双蒸水仪 2 1 2 质粒与菌株 上海精宏实验设备有限公司 金坛市新航仪器厂 上海振荣科学仪器有限公司 ( 1 ) 质粒： p c d n a 3 1 m y c h is ( 一) a 、p e t 2 8 a ( + ) 、p e t 3 0 a ( + ) ，由实验室保存； ( 2 ) 菌株： 大肠杆菌d h 5q 、b l 2 1 菌株，由实验室保存。 2 1 3 常用试剂 ( 1 ) t a qd n ap o l y m e r a s e ，t a qp l u sd n ap o l y m e r a s e ，p f ud n ap o l y m e r a s e ，上海 生工有限公司 ， ( 2 ) e c ori 、h i n di i i 、n c oi 、肠di 、b u f f e rt a n g o1 0 x 、t 4l i g a s e 、t 4l i g a s e b u f f e r 、l a m b d ad n a e c ori + h i n d m a r k e r3 ，# s m 0 1 9 1 ，f e r m e n t a s 公司； ( 3 ) p b s t 载体、d 2 0 0 0d n am a r k e r ，t i a n g e nb i o t e c h ( b e iji n g ) c o m p a n y ； ( 4 ) g e n e f i n d e r 核酸染料，厦门百维信生物科技有限公司； ( 5 ) 普通d n a 产物纯化试剂盒、质粒小提试剂盒、离心柱型普通琼脂糖凝胶d n a 回收 试剂盒，t i a n g e nb i o t e c h ( b e i j i n g ) c o m p a n y ； ( 6 ) 无内毒素型超纯质粒d n a 大量制备试剂盒，v - g e n eb i o t e c h n o l o g yl i m i t e d ； ( 7 ) 谷丙转氨酶试剂盒、白蛋白试剂盒，南京建成生物工程研究所； ( 8 ) 简易s a b c 型快速免疫组化显色试剂盒，武汉博士德生物工程有限公司； ( 9 ) 亲和层析柱及试剂，s i g m a 公司； ( i 0 ) n a c i 、异丙醇、甲醇，中国上海埃彼化学试剂有限公司； ( 1 1 ) t r y p t o n e 、y e a s te x t r a c t ，o x o i dl t d ； ( 1 2 ) 甘氨酸、s d s ，北京鼎国生物技术有限