（细胞生物学专业论文）中华绒螯蟹性腺抑制激素纯化及其免疫定位的研究.pdf

摘要摘要x 器官一窦腺复合体( xo r g a n - s i n u sg l a n ds y s t e m ，x o s g ) 是位于甲壳动物眼柄内视上神经节中的重要内分泌器官。它合成和分泌甲壳动物高血糖素( c r u s t a c e a nh y p e r g l y c e m i ch o r m o n e ，c h h ) 、蜕皮抑制激素( m o l t - i n h i b i t i n gh o r m o n e ，m m ) 、性腺抑制激素( g o n a d - i n h i b i t i n gh o r m o n e ，g i h ) 和大颚器抑制激素( m a n d i b u l a ro r g a n - i n h i b i t i n gh o r m o n e ，m o i h ) 等多种神经类多肽激素，这些激素同属于c h h 家族，具有相似的性质和一级结构。中华绒螯蟹( e r i o c h e i rs i n e n s i s ) 在各地养殖过程中普遍发生一龄蟹性早熟现象，给经济生产带来了巨大的损失。研究发现中华绒螯蟹性腺抑制激素的分泌和代谢失调与其性早熟有着密切的关系。由于河蟹眼柄视上神经节中神经多肽激素的合成很少，性腺抑制激素在x 器官窦腺复合体中的含量极低，给分离、纯化工作带来了一定的困难。本试验采用高效液相色谱反相层析法( r p 玎? l c ) 分离中华绒螯蟹眼柄视上神经节的激素蛋白提取液，收集其在高血糖激素家族区域内出峰的组分。通过体内注射的方法，检验每个分离组分的性腺抑制活性，发现洗脱液在3 8 - 4 0m l 处时收集到的峰物质具有最强的性腺抑制活性。进一步纯化后，利用基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱( m o l d i t o f m s ) 测量出其分子量为68 0 0u 。由于此蛋白或多肽在反向层析中处于高血糖激素家族之中，并具有小分子量、较高的热稳定性和极高的性腺抑制活性，这与其它甲壳动物中的性腺抑制激素的基本性质一致，因此认为此蛋白或多肽即为性腺抑制激素。将此性腺抑制激素在中华绒螯蟹视上神经节中进行免疫定位发现，性腺抑制激素主要分布于视上神经节端髓的腹面基部外侧，包括类型1 和类型4 细胞之中；无论是性早熟还是正常的中华绒螯蟹中都存在性腺抑制激素，而且正常河蟹中的分泌量或储存量要多于性早熟的河蟹。关键词中华绒螯蟹性腺抑制激素提取纯化活性鉴定免疫组化a b s t r a c ta b s t r a c txo r g a n - s i n u sg l a n ds y s t e m ( x o s g ) i sa ni m p o r t a n te n d o c r i n eo r g a ni no p t i cg a n g l i ao fc r u s t a c e a n se y e s t a l kw h i c hc o u l ds y n t h e s i z ea n de x c r e t es e v e r a lk i n d so fn e u r o p e p t i d e ，s u c ha sc r u s t a c e a nh y p e r g l y c e m i ch o r m o n e ( c h h ) ，m o l t - i n h i b i t i n gh o r m o n e ( m i h )，g o n a d i n h i b i t i n gh o r m o n e ( g i h ) a n dm a n d i b u l a ro r g a n - i n h i b i t i n gh o r m o n e ( m o i h ) t h e s en e r o p e p t i d e sw h i c hh a v es i m i l a rc h a r a c t e ra n dp r i m a r ys t r u c t u r ea t t r i b u t et oc h hf a m i l ya l lt o g e t h e r c h i n e s em i t t e n - h a n d e dc r a b ( e r i o c h e i rs i n e n s i s ) i sa no w nk i n do fa q u a t i cc u l t u r e da n i m a l so fc h i l 扭w h i c hh a st h ew i d er a n g eo fg e o g r a p h i cd i s t r i b u t i o n m a n yc u l t u r e dl a r v a ea r ep r e c o c i o u si ns c o r e s nw i l lb r i n ga b o u ts m a l l e rb o d ya n dh i g h e rd e a t hr o t e ，w h i c hc o n s t r i c td e v e l o p m e n to ft h eb r e e d i n ga n db r i n gn u m e r o u sl o s s e sf o rp r o d u c t i o n t h es e c r e t i o nu n b a l a n c ea n dm e t a b o l i s md i s o r d e ro fg i hi sc l o s e l yr e l a t e dt os e xp r e m a t u r e t h eg i hi san e u r o p e p t i d eo ft h e r m a ls t a b i l i t ya n da c d i ci s o e l e c t r i cp o i n t , w h i c hc a l li n h i b i tv i t e l l o g e n e s i si nf e m a l e ，s y n t h e s i so fg o n a ds t i m u l a t ef a c t o r , a c t i v i t yo fa n d r o g e n i cg l a n di nm a l e ，s y n t h e s i so fv i t e l l i ni nh e p a t o p a n c r e aa n dm e t h y lf a m e s o li nm a n d i b u l a ro r g a n t h en e r o u p e p t i d e s s y n t h e s i sa n dt h ec o n t e n to fg i hi no p t i cg a n g l i ao fc r u s t a c e a n se y e s t a l ki sv e r yl o w , s oi ti sv e r yd i f f i c u l tt os e p a r a t ea n dp u d f i c a t e i nt h i sr e s e a r c h , t h ec r u d eh o r m o n ee x t r a c t so fc r a b so p t i cg a n g l i aw a si s o l a t e db yr e v e r s e - p h a s eh i g h - p e r f o r m a n c el i q u i dc h r o m a t o g r a p h y ( r p - h p l c ) s e v e r a ls i n g l ef r a c t i o n sw h o s ee l u t i o np e a kc a m eo u ti nt h er a n g eo fc h hf a m i l yw e r eo b t a i n e d t h eb i o l o g i c a la c t i v i t yo fe a c hf r a c t i o nw a sa s s a y e dt h r o u g hi n j e c t i n gi nv i v ot ot h ec r a b s ；w ef i n dt h a tf r a c t i o nw h i c hw a se l u t e di n38 - 4 0m lh a dt h eg r e a t e s tb i o l o g i c a la c t i v i t yt os u p p r e s st h ed e v e l o p m e n to fc r a bo o c y t e s m e a s u r e db ym o l d i - t o f - m sa f t e rf u r t h e rp u r i f i e d ，i t sm o l e c u l a rw e i g h tw a s68 0 0u s ot h i sp r o t e i nw h o s ee l u t i o np e a kc a m eo u ti nt h er a n g eo fc h hf a m i l yb yr p - h p l ch a st h es i m i l a rp r o p e r t yw i t ho t h e rc r u s t a c e a n s ，s u c ha ss m a l lm o l e c u l a rw e i g h t ，t h e r m a ls t a b i l i t ya n dh i g hb i o l o g i c a la c t i v i t yo fg o n a di n h i b i t i n g s ow enc o n s i d e rt h a tt h i sp r o t e i ni st h eg i ho f e s i n e n s i s a f t e ri m m u n el o c a l i z a t i o no fg i hi l lc 砷，so p t i cg a n g l i a , w ef o u n dt h a tg i hl o c a t e da l w a y si nt y p e1a n dt y p e4c e l l so fo p t i cg a n g l i a ；g i he x i s t e di nb o t hn o r m a lc r a b sa n ds e xp r e m a t u r ec r a b s ，a n dt h el e v e lo fc o n t e n to rt h es e c r e t o r yo fg i hi nn o r m a lc r a b sw a sl a r g e rt h a ns e xp r e m a t u r ec r a b s k e yw o r d se r c d h p 加s n p n s s ；g o n a di n h i b i t i n gh o r m o n e ；p u r i f i c a t i o n ；a c t i v i l yi d e n t i f i c a t i o n ；i m m u n oh i s t o c h e m i s t r yi h河北大学学位论文独创性声明本人郑重声明：所呈交的学位论文，是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写的研究成果，也不包含为获得河北大学或其他教育机构的学位或证书所使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示了致谢。作者签名：堡盔日期：坦z 年厶月上日学位论文使用授权声明本人完全了解河北大学有关保留、使用学位论文的规定，即：学校有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文被查阅和借阅。学校可以公布论文的全部或部分内容，可以采用影印、缩印或其他复制手段保存论文。本学位论文属于1 、保密口，在年月日解密后适用本授权声明。2 、不保密口。( 请在以上相应方格内打“ )作者签名：复摩日期：导师签名：湔丝丛2日期：第1 章绪论第1 章绪论1 1 甲壳动物内分泌调控研究概述甲壳动物内分泌学研究起始于2 0 世纪初，至今，已累积了大量的研究成果和资料，涉及的范围很广泛，这些研究包括：早期的甲壳动物色素系统与体色变化的关系，x -器官窦腺复合体的发现和描述及其调控蜕皮、性成熟、血糖浓度等的功能；后来的激素分离、提纯及其化学性质分析，利用放射免疫、细胞免疫化学、e l i s a 、气相和液相色谱技术检测各种激素在甲壳动物相关组织内的浓度及变化【l 卅；以及近十几年来广泛开展的与水产养殖相关的虾、蟹生长繁殖与内分泌的关系，尤其是内分泌系统对甲壳动物卵黄生成、卵巢发育的生理调控功能等。甲壳动物能够在温度、光照周期等外界因子的变化下调节其自身的生理状态，使它们的生殖活动处于最合适的状态之下，来自外界因子的信息作用于甲壳动物的中枢神经系统，后者将其传递到神经内分泌系统，神经内分泌系统能够分泌一些促进因子和抑制因子以实施对其生殖发育的调控。由于甲壳动物成体的生殖和蜕皮常常交替出现，因此神经内分泌系统的精确调控非常重要。长期以来，由于实验手段的局限性，神经内分泌调控功能被理解得过于简单化，随着研究的逐步深入现在人们普遍认为甲壳动物的生殖调控是在多激素的基础上进行的，它们直接或间接地影响甲壳动物的性腺发育、性别分化和交配行为1 5 j 。目前已知的甲壳动物体内对甲壳动物的生理活动具有重要调控功能的内分泌腺包括x 器官窦腺复合体( x o r g a n - s i n u sg l a n ds y s t e m ，x o - s g ) 、围心腺( p e d c a r d i a lg l a n d ，p g ) 、y - 器官( y - o r g a n ) 、雄性腺( a n d r o g e n i cg l a n d ，a g ) 和大颚器( m a n d i b u l a ro r g a n , m o )等。这些内分泌腺共同作用，以调控甲壳动物的各种生理活动，下面将这些内分泌腺进行简要的介绍。位于环心脏的静脉腔中的围心腺是一种神经血管器，由神经轴突末端构成。这些神经从每一胸神经节发出进入围心腔，在那儿形成围心的网状组织。该结构在上世纪就已发现，但直至5 0 年代初才弄清其功能是促使心脏兴奋【6 】。v 器官属于非神经的上皮内分泌腺，也是甲壳动物的重要内分泌器官。这对腺体位于头胸部的前鳃腔，调控甲壳动物蜕皮。从比较内分泌学观点来看，该器官类似昆虫的河北大学理学硕十学位论文前胸腺1 4 。通常蟹类y - 器官为一致密的集合体，而螯虾和龙虾y - 器官为弥散带。y - 器官的超微结构显示，它由一种类似于脊椎动物的类固醇分泌细胞的细胞构成【7 1 。另一个上皮内分泌腺体是雄性腺，为雄性甲壳动物所特有，至今只发现软甲亚纲的种类具有该器官，c h a m i a u x 于1 9 5 4 年首次报道了该器官的功能【2 1 。雄性腺一般位于输精管的次射精端，其所分泌的激素能够促使甲壳动物的性分化并参与雄性生殖发育。超微结构显示，雄性腺的细胞类似于脊椎动物蛋白质激素分泌细胞，具有发达的粗面内质网1 2 】。国内李霞和李嘉永i s ) 报道了中国对虾雄性腺分泌细胞具发达的粗面内质网和线粒体，这些结构为合成、分泌蛋白质激素所需。李富花和相建海【9 】的研究结果证明，雄性腺对中国对虾外形特征，尤其是交接器的发育起着重要作用。甲壳动物另一重要内分泌腺是大颚器，l e r o u x 首次描述了该器官，由于它邻近v器官，所以经常被误认为是v 器官【4 】。与y - 器官仅具有一种类型细胞不同，大颚器由两种类型的细胞组成。大颚器的作用可能与甲壳动物的蜕皮、生殖有关，因为在蜕皮和生殖阶段，其超微结构发生明显变化。大颚器的超微结构显示其具有脂质分泌结构。l a u f e r【l o 】发现大颚器分泌甲基法尼醇( m e t h y lf a r n e s o a t e ，m f ) ，该激素被认为与同为节肢动物的昆虫体内的一种重要激素保幼激素( j u v e n i l eh o r m o n e ，j h ) 类似。因此从比较内分泌学观点看，甲壳动物体内的大颚器类似于昆虫体内的咽侧体【1 1 1 。此外大颚器还可能是类固醇激素的合成场所。x 器官窦腺复合体是甲壳动物重要的神经内分泌器官，类似哺乳动物的下丘脑垂体系统【1 2 1 3 1 。在大多数有眼柄的种类中，该器官位于眼柄，而在无眼柄的等足类和其它少数有眼柄的种类中，窦腺位于头部近脑侧。许多肽类神经激素都是在x 器官窦腺中分泌和储存的。包括蜕皮抑制激素( m o l t i n h i b i t i n gh o r m o n e ，m i h ) 、性腺抑制激素( g o n a l d - i n h i b i t i n gh o r m o n e ，g i h ) 又称卵黄发生抑制激素( v i t e l l o g e n i n i n h i b i t i n gh o r m o n e ，v i h ) 、大颚器抑制激素( m a n d i b u l a ro r g a ni n h i b i t i n gh o r m o n e ，m o i h ) 和高血糖激素( c r u s t a c e a nh y p e r g l y c a e m i ch o r m o n e ，c h h ) 等，这些激素调控着甲壳动物的蜕皮、生殖、性腺发育、血糖平衡、体色变化、代谢和渗透压调节等多种重要的生理功能1 4 , 1 4 , 1 5 。对x 器官窦腺复合体这一系统的研究一直是甲壳动物内分泌学的重点内容。组织、细胞学和同位素示踪观察结果表明，x 器官由视上神经节内一些相互无连接的单轴突神经分泌细胞组成，它们的轴突末梢在血窦附近膨大形成窦腺【1 3 】1 3 。在x o 中的神经内分泌细胞的胞体中不断合成的神经多肽激素经轴突运输到s g 中储存；当受到释放信号的2 第1 章绪论刺激后以胞吐作用方式释放到血淋巴中，且新合成的激素优先释放，经血淋巴运输到靶器官发挥作用【1 6 】1 6 。由于眼柄神经多肽激素的合成少，在s g 中的含量甚微，给分离、纯化工作造成了困难，影响了神经内分泌的研究进展。自上世纪9 0 年代初，我国开始对甲壳动物眼柄神经内分泌系统的研究，但研究工作还停留在对锯缘青蟹( s c y l l as e r r a t a ) 、罗氏沼虾( m a c r o b r a c h i u mr o s e n b e r g i o 、中国对虾( f e n n r o p e n a e u sc h i n e n s i s ) 眼柄神经内分泌系统的组织学和细胞学观察【1 7 , 1 8 , 1 9 , 2 0 。在生物化学和分子生物学研究方面，仅有邱高峰等 2 1 】、王在照等【2 2 】和宋霞等f 2 3 】利用同源克隆方法进行了中国对虾和河蟹眼柄m i h 编码基因的序列分析，郭豫杰等【2 4 】开展了河蟹m i h l 融合蛋白表达的研究，而未见甲壳动物性腺抑制激素的分离纯化和性质分析等方面的研究报道。1 2 甲壳动物高血糖素家族在早期研究中人们从一些传统的生理学实验中认识了神经激素的生理功能，这些实验方法包括切除或移殖神经内分泌组织和注射组织提取物或异源生物活性物质。近年来随着高效的化学分析方法包括反相高效液相色谱( r p h p l c ) 、质谱分析、气相微量蛋白测序等，以及分子生物学方法包括p c r 、e d n a 克隆等的普遍采用，多种甲壳动物神经肽的一级结构已经被测赳5 1 。甲壳动物的神经激素产生于眼柄的端髓x 器( m e d u l l at e r m i n a l i s xo r g a n ，m t - x o )或无眼柄甲壳类前脑相应的位置，释放到窦腺，进入血淋巴系统，参与调节甲壳类许多重要的生理过程，如蜕皮、生殖、色素移动、渗透压调节和糖代谢【2 6 】。这些激素根据肽链的长短和分子量的不同可分为两大类：促色素细胞激素( c h r o m a t o p h o r o t r o p i n s ) 和甲壳动物高血糖激素家族( c h hf a m i l y ) 【2 6 2 7 。其中促色素细胞激素包括色素集中激素( p i g m e n t - c o n c e n t r a t i n gh o r m o n e ，p c h ) 和色素分散激素( p i g m e n td i s p e r s i n gh o r m o n e ，p d h ) ，这类多肽分子量较小，约8 2 0 个氨基酸残基。甲壳动物高血糖激素家族是甲壳动物特有的多肽类神经激素，它们主要由眼柄的x o s g 合成，包括：c h h 、g i h 、m i h 和m o i h 。由于这四类激素在结构及理化性质上有许多相似之处，在生理功能上又相互关联，并且这一组神经多肽的一级结构与c h h有许多相同之处，因此许多学者把它们归为个激素家族，称作高血糖激素家族。这一家族内的成员其肽链约由7 0 8 0 个氨基酸残基组成，为甲壳动物特有的多肽激素【5 】，迄- 3 河北大学理学硕士学位论文今只在甲壳类动物中发现。这是一些热稳定的肽类物质，在生化性质上有许多相似之处，如酸性等电点、疏水性、封闭的c 或n 末端、链内二硫键等，它们在调控甲壳动物的糖代谢、蜕皮及变态发育、性成熟以及对环境的适应代谢等一系列重要的生理活动中起着关键作用【1 2 1 3 。高血糖激素家族各成员的结构特征又不尽相同【2 8 】，尽管g i h 和m i h 一级结构中形成二硫键的半胱氨酸的位置以及保守氨基酸序列绝大多数与c h h 的相同，但是c h h 的前激素原结构组成中比g 1 h 和m m 多一个c h h 前体相关肽( c p r p ) ，它位于信号肽与神经激素之间，而g i h 和m i h 前激素原的神经激素前面直接连有信号肽，因此c h h家族中的g i h 、m i h 与c h h 属于同一家族中的不同类型。1 2 1 甲壳动物高血糖素a b r a m o w i t z 于1 9 4 4 年首次描述了甲壳动物高血糖激素( c h h ) ，c h h 由窦腺分泌，具种间特异性，为分子量60 0 0 70 0 0u 的多肽 2 9 , 3 0 。主要参与甲壳动物血糖水平的调控，受5 羟色胺的调节，它对甲壳动物的生殖活动也具有促进作用。不同种类的c h h 具有不同氨基酸组成。目前已对下列甲壳动物的c h h 进行了氨基酸序列测定：普通滨蟹( c a r c i n u sm a e n a s ) 川、美洲龙虾( h o m a r u sa m e r i c a n u s ) 3 、寻常平甲虫( a r m a d i l l i d i u mv u l g a r e ) d 列、泥污鲸螯虾( o r c o n e c t e sl i m o s u s ) 【3 3 】、原螯虾( p r o c a n b a r u sb o u v i e r o 枷、克氏原螯虾( p r o c a m b a r u sc l a r k i ) 3 引。甲壳动物的c h h 氨基酸序列具有较高的保守性，不同种的c h h 间的同源性比例均高于5 5 ，c h h 的主要特征有：( 1 ) 氨基酸残基数目相n ( 7 2 或7 3 ) ；( 2 ) 肽链上c y s 残基位置的保守性；( 3 ) 肽链核心部位存在保守氨基酸序列【5 】。1 2 2 蜕皮抑制激素在甲壳动物生长过程中，要不断增加身体的体积和重量，必须首先蜕去其身体表面的限制其生长的外骨骼。这种蜕皮活动受y 器官分泌的蜕皮激素和x 器官窦腺复合体合成的蜕皮抑制激素( m m ) 共同调控。一般认为在蜕皮周期的多数时间内m i h 抑制y 二器官的活动，当m i h 的分泌活动降低到一定水平或停止时，才发生蜕皮。1 9 9 1 年w e b s t e r 和d i r c k s e n 【3 6 j 已经对普通滨蟹( c a r c i n u sm a e n a s ) 的m i h 前激素原序列进行了测定。近些年来，有更多的甲壳动物的m i h 序列被测定，这些动物包括：凡纳滨对虾( p e n a e u sv a n n a m e i ) t 3 训、优游蟹( c a l l i n e c t e ss a p i d u s ) 3 8 。、日本对虾( p e n a e u s第1 章绪论j a p o n i c u s ) 3 9 、刀额新对虾( m e t a p e n a e u se n s i s ) t 4 0 1 和黄道蟹( c a n c e rm i g i s t e r ) t 4 。通过对优游蟹蜕皮周期中眼柄内编码m i h 的m r n a 进行n o r t h e r n 印迹分析表明，在蜕皮前期m i h 的m r n a 逐渐降低，到蜕皮晚前期达到最低，蜕皮以后m i h 的m r n a 水平突然升高十倍，在蜕皮间期持续升高【4 2 】，这在m r n a 水平证实了m i h 的生理功能。斑节对虾的m m 由7 7 个氨基酸残基组成，具有游离的氨基酸末端，它与普通滨蟹的m m 的序列表现出高度的相似性【4 3 1 。在研究美洲龙虾的m i h 时发现，它还具有c h h相似的作用 4 4 】。k e l l e r 指出尽管不同的激素之间的关系并不像c h h 单体间那样近，但是m m 在同种中与其它c h h 的序列对比，表明它们就属于同一个家族。c h h 和m i h的长度不同，其末端都是游离的。1 2 3 大颚器抑制激素1 9 9 3 年l a u f e r 等发现大颚器官的分泌活动受眼柄因子的抑制，切除眼柄可引起大颚器官的增生和血淋巴中法尼酸甲酯( m f ) 的增加，窦腺提取物的体内和体外生物活性检测实验都证明它能够降低m f 的分泌速度。1 9 9 4 年l a u f e r 等【4 5 】发现克氏原螫虾的一种c h h 异构体对大颚器官m f 的合成有抑制效应。而在蜘蛛蟹( l i b i n i ae n a r g i n a t a ) 和美洲龙虾中，对m f 合成起调节作用并不是c h h ，而是眼柄中的另外一种神经肽4 6 , 4 7 1 ，目前具有这种活性的神经肽的结构还未研究清楚。而另外的两个研究表明c h h 家族的某些神经肽能够在体外实验中抑制m f 的分泌活动，因此可以把这些激素称作大颚器官抑制激素( m o i h ) 。w a i n w r i g h t 等【4 8 】已经确定普通黄道蟹的两种m o i h ，它们都由7 8 个氨基酸组成，它们之间只有一个氨基酸的差异，这两种多肽与黄道蟹的m i h 和龙虾的g i h在结构上非常相似。此外，l i u 和l a u f e r 4 9 1 从蜘蛛蟹的窦腺中纯化到了三种对m f 合成有抑制作用的多肽，这些多肽由7 2 7 6 个氨基酸组成，它们被看作为一组异构体，其中一种m o i h 的部分氨基酸序列与普通滨蟹的c h h 相似。1 2 4 性腺抑制激素在甲壳类雌性动物中性腺抑制激素( g i h ) 具有抑制卵黄发生的活性，因此也称g i h为卵黄发生抑制激素( v i t e l l o g e n e s i si n h i b i t i n gh o r m o n e ，v i h ) 。最初是p a n a c s e 在1 9 4 3 年发现并命名的，后来因为它在雄体内也有分泌，并对雄性个体性腺发育也有抑制作用，所以又称为性腺抑制激素。g i h 是甲壳动物特有的高血糖素家族中的一员，由眼柄中位于x 器官中神经分泌细胞分泌【4 】，经轴突神经束运送到窦腺暂时储存，之后进入血液循河北大学理学硕士学位论文环f 矧。它的靶器官是肝胰腺、卵巢、大颚器和雄体的雄性腺。g i h 的作用主要是抑制雄体促雄性腺的活性、抑制雌体的卵黄发生及性腺刺激因子的生成，而且对肝胰腺合成卵黄蛋白及大颚器合成m f 也有抑制作用。在雄体中g i h 作用于促雄性腺，而雌体中则是作用于卵巢，抑制卵黄蛋白的合成。甲壳动物g i h 是一种具有酸性等电点的热稳定性产物，由7 1 7 8 个氨基酸残基构成，分子量约为20 0 0 60 0 0u 2 5 1 。1 9 9 1 年s o y e z 等【5 l 】对美洲龙虾g i h 的一级结构进行了完整的序列测定。他们采用气相微量蛋白测序和快速原子轰击质谱分析( f a b m s ) 的方法对其结构进行了研究。应用高效液相色谱反向层析( i 冲h p l c ) 的方法分离美洲龙虾眼柄提取物只得到一种有生物活性的多肽，这种多肽由7 7 个氨基酸组成，它具有1 个自由n 末端和3 个二硫键，分子量是91 3 5u ，等电点为p h 6 8 。在其它的研究中g i h 的一个异构体被确定，该异构体的氨基酸序列与g i h 相同，但没有生物活性。d ek l e i j n 等【2 8 】对编码美洲龙虾的g i h前激素原的m r n a 进行了克隆和表达研究，该研究表明这种多肽的开放阅读框由一个编码信号肽的序列和它后面编码g i h 多肽的序列组成，编码g i h 的m r n a 序列与前面提及的g i h 氨基酸的序列具有9 8 的相似性。美洲龙虾的g i h 具有一种前激素原和两种多肽异构体，这种现象说明在其基因表达中可能存在翻译后调控。1 3 中华绒螯蟹及其性早熟现象1 3 1 。中华绒螯蟹中华绒螯蟹( e r i o c h e i rs i n e n s i s ) 又称河蟹( 以下简称河蟹) ，是我国重要的经济水产养殖种类。由于原产我国，且两只大螯上密生绒毛，故把它命名为中华绒螯蟹。中华绒螯蟹是高等甲壳动物，在动物分类地位上隶属于节肢动物门( a r t h r o p o d ) 、甲壳纲( c r u s t a c c a ) 、十足目( d e c a p o d a ) 、方蟹科( g - r a p s i d a e ) 、绒螯蟹属( e r i o c h e i r ) 。河蟹是我国特有的经济水产养殖动物。目前全国有2 0 多个省市养殖【5 2 。5 4 】，由于其肉质鲜美、营养丰富、商品价值大而倍受养殖者和消费者的青睐，具有重要的经济养殖价值。目前对河蟹的生殖生物学、遗传学等许多方面，已有很多学者进行过比较系统的研究，为该品种的养殖生产提供了宝贵的基础资料，但有关内分泌方面的研究却是刚刚起步，尤其是与养殖效益密切相关的内分泌研究同国外相比差距较大1 4 j 。1 3 2 河蟹的雌性生殖系统结构与发育河蟹早期的卵巢很小，位于心脏和肠道的背面，呈透明状，左右各一，主要由疏松第1 章绪论结缔组织和生殖上皮构成。原始生殖细胞团紧贴予内生殖上皮的侧面，原始生殖细胞呈圆形，核大而明显，胞质呈弱嗜碱性。成熟时河蟹的卵巢为相互触联的左右两叶，呈“h 形，呈酱紫色或豆沙色，非常发达，可占满背甲下的大部分空间并延伸到腹部前端、后肠的两侧。河蟹卵巢发育过程大致可分成6 期。第1 期：6 月下旬，卵巢外观呈白色。卵巢内仍有大量疏松结缔组织和内生殖上皮，内生殖上皮将卵原细胞分隔成一个个发育区。各发育区内主要以小生长期的初级卵母细胞和卵原细胞为主。第1 i 期：卵巢发育到一定阶段，约7 月上旬，各发育区之间逐渐汇合，基本具有卵巢的整体形态，卵巢内仍然以卵原细胞和小生长期的初级卵母细胞为主，已有大量滤泡细胞。第1 i i 期：9 月份，卵巢呈h 形，白色，卵巢内已开始有大生长期l 的初级卵母细胞形成，其周围已有单层滤泡细胞包围。第期：1 0 月份，卵巢体积已较大，呈浅咖啡色，其中已有大生长期2 的初级卵母细胞形成，滤泡细胞成极薄的扁平细胞层，紧贴在初级卵母细胞的周围。此外，卵巢中尚有各级卵细胞并存。第v 期：1 1 月份的卵巢已呈豆沙色，几乎充满整个体腔，卵巢内主要以成熟前期的初级卵母细胞为主。第v i 期：至1 2 月份时，卵子已基本成熟，卵巢呈深豆沙色，充满整个体腔，卵粒明显，已从滤泡腔中游离出来，核消失【5 5 】o根据雌性河蟹的发育过程推测性腺抑制激素分泌量最多的时期应该是河蟹发育的早期，即卵巢具有了整体的形态到卵母细胞大生长期前的这一段时间。1 3 3 河蟹的性早熟河蟹是一种海水中繁殖、淡水中生长的洄游性甲壳动物，近年来随着天然资源的大幅衰减，河蟹人工繁育及商品养成迅猛发展，但与此同时，生产中出现的问题也随之增多，其中，性早熟现象是最令养殖者头疼的突出问题和导致养殖失败的重要原因之一 5 3 , 5 6 1 。在各地河蟹养殖过程中普遍发生一龄蟹性早熟现象。性早熟直接导致河蟹生长缓慢甚至停滞，个体小，死亡率高，严重制约了河蟹养殖业的发展，给生产带来了巨大损失。河蟹性早熟问题是制约河蟹养殖业发展的一个重要因素，也是经济甲壳动物发育调控的重要问题。河蟹性早熟是指幼蟹经过培育，一龄蟹性腺已发育成熟，其规格一般不超过5 0 9 ，它包括一龄蟹和二龄没长大的小个体河蟹。性早熟河蟹到第二年4 月份开始陆续死亡，至6 月份死亡率达8 0 以上【5 7 1 。一般来说，河蟹正常情况下性腺为第二年秋末冬初达到河北大学理学硕十学位论文成熟，但是在养殖过程中在正常河蟹成熟之前性早熟个体就会出现陆续死亡的现象【5 2 5 8 ，5 9 o中华绒螯蟹的性早熟问题从1 9 9 5 年以来已受到研究者的普遍关注，但由于其研究方法和研究手段大多侧重于生产性摸索与经验性积累，因此未能从根本上有所突破【删。导致中华绒螯蟹性早熟发生的机制非常复杂，通常认为导致性早熟是外在因素和内在因素综合作用的具体表现。外在因素主要包括环境因素和人为因素。多数学者着重研究和分析了河蟹发生性早熟的外在因素，如环境温度、水质( p h 值、盐度) ，水深及人为因素中的放养密度、营养等与河蟹性早熟的关系【6 1 1 ，普遍认为水体积温高和营养过剩是导致河蟹发生性早熟的主要原因。河蟹性早熟的内在因素是其适应长期生存的环境下所形成的遗传特性，主要是生殖内分泌调控方面【6 2 】，河蟹的内分泌有类似于高等脊椎动物的一方面，同时又有自己独特的调控体系【3 】，许多学者通过组织切片、组织化学、电镜、免疫学和分子克隆等技术对很多内分泌组织( x o s g ，m o ，a g ，y - o r g a n ，e ta 1 ) 及相关因子( c h h ，m i h ，m o i h ，g i h ) 进行了研究。对一龄蟹，二龄蟹和性早熟蟹窦腺形态结构和神经分泌物的释放方式比较研究发现，性早熟蟹窦腺形态结构与一、二龄蟹无显著差异，然而其神经激素颗粒释放情况明显不同【6 3 1 ，这可能与河蟹性腺发育加快有关。这种释放情况的改变可能受到外界信号的刺激，影响了河蟹窦腺神经肽激素的储存和释放，使得释放抑制性腺发育的因子减少而加快性腺的发育，从而诱发了河蟹性早熟。1 4 河蟹的视上神经节与x o s g河蟹的眼柄视上神经节位于复眼之下，呈乳白色，椭球形。视上神经节主要由神经分泌细胞、视觉神经细胞和胶质细胞组成，外面由一层结缔组织膜包裹，视上神经节自上到下分为外髓( m e d u l l ae x t e r n a ，姬) 、内髓( m e d u l l ai n t e r n a ，m i ) 和端髓( m e d u l l at e r m i n a l i a ，m t ) 三部分。外髓的一端凹陷，形似“椅状 ，表面大部分有视觉神经细胞分布，基本没有神经分泌细胞；内髓呈椭球状，与外髓连接处有视觉神经细胞分布，在靠近窦腺上方与端髓相连处( e 3 ) 有一些神经分泌细胞：端髓外观像一个椭圆球，是三部分中体积最大的，其中部有一凹沟，将它分成大、小不等的两部分，后者与内髓相连，端髓表面也有部分视觉神经细胞分布，在端髓下部( e 1 ) 和中部背侧( e 2 ) 有大量的神经分泌细胞，凹沟处( e 4 ) 也有神经分泌细胞分布，并与内髓神经分泌细胞连成一第1 章绪论片。神经分泌细胞轴突末端聚集在一起形成窦腺，是储存激素的场所，窦腺位于内髓与端髓之间侧面，略偏端髓( 图1 1 ) 。h a n s t r u mp 4 l 首次发现眼柄中的x 器官和窦腺是内分泌器官，并将窦腺描绘成神经血窦器。研究表明，窦腺本身并不产生激素，只起贮藏和释放激素的功能，它由许多神经分泌细胞的轴突构成删。x 器官位于端髓的外缘，窦腺位于内髓与端髓交处的背方，由窦腺壁与中央血窦腔组成，窦腺壁由x 器官神经分泌细胞轴突的末梢及神经胶质细胞交织而成。窦腺不具分泌功能，由x 器官神经分泌细胞分泌的激素经轴突神经束，运送至窦腺暂时储存，后进入血液循环1 1 3 , 6 4 , 6 5 。x 器官神经分泌细胞聚成多个亚群，根据大小及粗面内质网的不同，康现江等【2 0 】将神经分泌细胞分为5 种类型；根据神经分泌颗粒的大小、形状、电子致密度及轴浆密度等特征，孙金生等1 6 3 将其分为6 种类型；上官步敏等【1 7 1 将其分为2 种类型，4 个亚型，并在其周围观察到5 种类型的分泌颗粒。对早熟河蟹与正常河蟹显微及超微结构的比较观察结果表明，早熟河蟹窦腺形态结构未发生明显变化，但其各种神经末梢内神经分泌物质的释放发生明显改变，尤其类型5 神经末梢在早熟河蟹窦腺中未观察到分泌现象。这些现象表明，某些养殖环境因子可能影响了河蟹窦腺神经肽激素的储存和释放，从而诱发了养殖河蟹1 龄蟹性早熟【1 7 】。m e ：外髓( m e d u l l ae n e m a ) ；m h 内髓( m e d u l l ai m e m a ) ；m t ：端髓( m e d u l l at e r m i n a l i a ) s g ：窦腺( s i n u sg l a n d ) ；e 1 ：端髓下部：e 2 ：端髓中部背侧：e 3 ：窦腺斜上方内髓部；e 4 ：端髓凹沟部。：细胞类型l ；v ：细胞类型2 ；口：细胞类型3 ；一：细胞类型4 ；o ：细胞类型51 中华绒螯蟹眼柄左侧面观2 中华绒螯蟹眼柄右侧面观图1 1 中华绒螯蟹眼柄神经节与神经分泌细胞、窦腺的分布位置( 摘自康现江等1 9 9 8 )f i g 1 1o p t i cg a n g l i ao fe s m e n s 西，t h ed i s t r i b u t i o no fn e u r o s e c r e t o r yc e l l s ，a n dt h ep o s i t i o no fm es i i l u s 百觚d9 河北大学理学硕士学位论文顾志敏等【删首先研究了切除眼柄对河蟹的蜕皮，生长和性腺发育的影响。切除眼柄后，性腺发育显著加快。康现江等【6 7 】研究发现去除河蟹眼柄后，可使肝脏的结构和氨基酸的含量发生变化，为生殖腺的发育提供营养，促使生殖腺发育。对比1 龄蟹、早熟蟹和2 龄成熟蟹窦腺的形态结构没有明显的差异，但神经颗粒的释放情况却明显不同，这从形态结构上证实了眼柄中视上神经节内的神经激素对中华绒螯蟹的性腺发育具有调控作用。z e l e n y l 6 8 1 发现切除甲壳动物眼柄可缩短蜕皮间期，促进蜕皮，从而推测眼柄中存在某种蜕皮抑制因子，随后其他研究者发现切除眼柄不仅可以促进蜕皮，还可产生其它一系列显著的生理变化，如心跳节律的加速、血糖浓度的升高、性腺发育的加速等【6 9 】。康现江等【6 7 7 0 】通过切除河蟹眼柄研究其对精巢发育及其氨基酸含量的影响，发现切除眼柄能促使精巢发育加快，使精子发生和精巢发育同步，且影响精巢发育中氨基酸的含量，g l y ，p h e ，t y r ，a l a 含量低于正常对照组。崔青曼等实验证明切除河蟹双侧眼柄可明显增加幼蟹体重和蜕壳频率，极显著提高卵巢指数、肝胰腺指数和卵巢与肝胰腺的质量比，极显著地增大卵母细胞直径；切除单侧眼柄可极显著增加卵巢指数和卵巢与肝胰腺质量比，极显著增大卵母细胞直径【7 9 1 。堵南山发现罗氏沼虾( m a c r o b r a c h i u mr o s e n b e r g i i ) 眼柄粗提液对其初级卵黄发生时期和成熟前期的卵巢发育具有抑制作用，可使卵母细胞直径显著减小( p 0 0 5 ) 0 7 1 】。切除河蟹眼柄后，m o 光面内质网减少，线粒体膨大，空泡数量增多【7 2 1 。性早熟蟹当年合成速率m f 为正常河蟹的2 倍【7 引。而且发现凡当年蟹一旦出现m o 发育，m f 就大量合成和分泌，导致性腺提早发育。性腺受到高浓度m f 的刺激，就会启动发育，并且使性腺一直发育至成熟。环境因子和过度营养等原因导致幼蟹的m o 的提早发育，使m f 淋巴中的浓度迅速提高，这可能也是引起早熟的内分泌原因之一。1 5 研究的目的与意义近7 0 年来已对甲壳动物的内分泌学作了大量的研究，积累了丰富的成果资料，但仍有相当多的课题有待人们去进一步深入研究。如：( 1 ) 激素的化学性质分析：仍有相当多激素的化学性质有待分析，尤其是肽类神经激素，其分子量较大，种与种间的氨基酸组成差异颇大。( 2 ) 激素的生物化学检测：激素在体内的水平很微小，通常l o 母1 0 4 2幽1 l l ，这就给检测带来困难，目前仅放射免疫、色谱技术等少数几种方法可用于少数几第1 章绪论种激素的测定。更灵敏便捷的测定方法有待进一步研究和建立。( 3 ) 激素调节机制：激素调控蜕皮、生殖等生理活动，同时又受其它激素或神经递质的调控，有许多机理机制尚待进一步研究。( 4 ) 激素在水产养殖上的应用：这是人们最期望解决、最有实用价值的研究课题，如何在真正弄清甲壳动物内分泌调控机理的基础上，象鱼类等脊椎动物一样，实现人工控制甲壳动物繁殖的目的。河蟹是我国重要的经济水产养殖种类，2 0 0 0 年，我国河蟹养殖总产量达2 3 1 0 5 t ，产值逾l o 亿元。河蟹养