（食品科学专业论文）生物酶解天然奶油制备奶香精基料的研究.pdf

摘要 摘要 奶味香精是食品工业中应用最为广泛的香精之一，奶香精基料可以增加产 品的香味和口感，掩盖合成香精刺激的感觉和产品中不易接受的味道，使产品 更圆润。采用生物酶处理天然奶油制备奶香精基料已成为当前的研究热点。 本论文通过市场调研和感官评价，确定了牛奶品牌a 为主要研究仿制对象， 对a 品牌牛奶的组分进行了分析比较，确定其中的风味贡献基料成分作为生物 酶解目标产物，筛选了合适的脂肪酶，优化确定了酶解工艺条件，制各得到期 望的奶香精基料，最后通过调香，获得与之相配的头香香基及添加比例。 论文研究了四种商品牛奶的物质组成，对牛奶的挥发性成分、蛋白质、脂 肪、脂肪酸进行了分离和定量分析比较，确定了牛奶的主要风味贡献基料成分 为9 十六烯酸、9 十八烯酸( 油酸) 和9 ，1 2 十八碳二烯酸( 亚油酸) 。 以酶解奶油生成的产物为指标，从自主开发的酶制剂中筛选出一种可专一 性水解天然奶油中的甘油三酯释放奶香精所需风味基料成分的酶。研究了酶解 奶油的工艺，确定了最终酶解反应条件为：温度4 5 士2 ，搅拌转速4 0 0 池，加 酶量o 1 ，缓冲液加入量1 4 2 ( 缓冲液加入时间为反应后0 5 3 5h ，匀速添 加) ，反应时间2 8h ，控制终点p h 值在5 2 5 4 之间，酸值在2 3 7 5 士1 2 5 l l 儋。 将获得的酶解奶油基料应用于奶味香精中，筛选出合适的头香香料，确定 其与基料的比例为6 9 ：9 4 9 ，确定其在牛奶中合适的添加量为o 0 5 ，得到具有 明显提高奶香、掩盖杂味和丰富体态的奶味香精。 本论文通过生物酶解奶油制备得到优质的奶香精基料，研究成果已应用到 工业生产中。 关键词：奶香精，基料，脂肪酶，酶解，脂肪酸，调香 a b s t r a c t a b s t r a c t m i l l ( n a v o ri so n ek i l l d0 ft h em o s tp o p l l l a rn a v o r si nf o o di n d l 姆b a s e m a t e r i a lf o rm i ( n a v o rc a ni n c r e a s em ep e r f o m l a n c ei 1 1s m e l l 龇l dt a s t e ，a 1 1 dh e l pt 0 c o v e r 鲥舢l l a t e df e e l i n go fs ) ，n t h e s i z e d 丑a v o n ga 1 1 du n c o m f o r 乞a b l et a s t e t h e r e f o r e ， p r e p a r a ：t i o no fj e l a v 0 rb a s em a ：t c r i a lw i 也e n 巧m a t i cm e t h o dh a sb e c o l n eo n eo f 也e r e s e a r c hf o c u s e sn o w a d a y s i n 也i s 1 e s i s ，c e 慨nl 【i i l do f 皿u 【w a sd e t e m 曲e d 鹪i i l l i t a t i o no b j e c tb ym 酞c t i i l v e s t i g a t i o n 觚ds e 嬲o r ye v 粗嘶o n c o m p o s i ! t i o n 锄甜y s i sw a sc 孤t i e do u ta n dm 洳 c o n l p o n e n t st h a t 脚rc o 删b u t et 0l n i n 【n a v o 血玛i nb 嬲e 删a lw e r ed e c i d e d a s l l i t d b l el i p a s ew 弱s e l e c t e da n dh y d r 0 1 y s i sp r o c e s s i n gw 鹤o p t i i r l i z e dt 0h y 出0 l y z e c r e 锄a c c o r d i i l gt 0 也ec 胁c t e r i s 石c so ft l l eh y d i 0 1 y s a t e s s u i t a b l eh e a dv o l a t i l e s w e i es e l e c t e da i l dm i ) 【e dw i t l lo b t a 妊dn d 墩n a v o rb a s en 墙硎a lt of o n n 加i jkn a v o r 知n o n g 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5h ) 1 1 屺r e a u c 吐o nt i l n ew 弱2 8ha n d 血谢p hw 嬲o b t a i l l e da s5 2 5 4 嘶n 1a c i dv a l u ea t 2 3 7 5 士1 2 5 札g s u i t a b l eh e a dv o l a t i l ew a ss e l e c t e dt op e r 向【i n et h ena _ 泊rb a s em 删a l 锄dt 1 1 e i r r a t i o 惝o p t i i n i z e d 豁6g ：9 4gb ys e n s 0 巧e v a l u a _ t i o n t h en a v o r 觚d 舭r t a s t eo f n l e 而l l 【w 硒i i i l p r o v e dg r e a 廿ya n do 尽f l a v o r sw c 糯m a s k e do b 、，i o u s l yb yu s i n g 0 0 5 o f t l l ec o m b i n e dn a 、，0 ri nm i l l ( t h ei n i 墩壬l a v o rb a s em a t e r i a lp r o d u c e db ye n 巧m a t i cm e 也o di n 也i st h e s i sh a s b e e n 印p l i e d t 0i n d u g t r i a lu s e k e yw o r d s ：血mn a v o r ，b a s em a t e r i a l ，i i p a s e ，e n 巧咖t i ch y d r 0 1 y s i s ，f a l 哆a c i d s ， p e r f m 球巧 摘要 独创性声明 本人声明所呈交的学位论文是拳人在导师指导下进行的研究工 作及取得的研究成果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地 方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含 本人为获得江南大学或其它教育机构的学位或证书而使用过的材料。 与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明 确的说明并表示谢意。 签名：日 期：二oo 八年六月十九日 关于论文使用授权的说明 本学位论文作者完全了解江南大学有关保留、使用学位论文的规 定：江南大学有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和 磁盘，允许论文被查阅和借阅，可以将学位论文的全部或部分内容编 入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、 汇编学位论文，并且本人电子文档的内容和纸质论文的内容相一致。 保密的学位论文在解密后也遵守此规定 签名：导师签名： 日期：二oo 八年六月十九日 绪论 第一章绪论 1 1 酶法生产奶香精基料的国内外研究现状 奶味香精是食品工业中应用最为广泛的香精之一，主要用于冷食、糖果、 饮料等的增香。奶味香精还可以用于饲料的加香，可以显著改善饲料的适口性， 提高动物采食，在饲料行业具有很好的推广应用前景i l j 。 目前奶味香精的制备大致有以下几种：用单体香原料进行人工调配；利用 相关微生物水解奶油，再经修饰调配而成奶味香精；采用天然萃取物调配花色 香精【2 】。酶法水解制备奶味香精是以奶油( 或稀奶油) 做原料，利用酶解技术 将奶油在一定条件下进行水解以增香1 5 0 2 5 0 倍，产生具有奶香特征的化合物。 它是天然的食品添加剂，香气自然、柔和，对加香产品内在质量有明显的改善 和提高，赋予加香产品天然奶香口味，这是单体香料调配而成的同类奶味香精 所达不到的。酶法奶香料的生产方法基于选择适宜的酶源，通过它们的作用使 奶油中甘油三酯水解出奶香所需的脂肪酸( 饱和与不饱和的) 、甘油二酯、甘油 单酯、酮酸和羟酸【3 】。脂肪酸中偶数碳的酸对奶香气贡献较大，羟酸进一步脱 水环化生成不同碳数的丙、丁位内酯，尤其是偶数碳丁位内酯，其含量虽少， 香气贡献却很大。酮酸进一步脱羧，生成甲基酮类化合物，起到增香作用。奶 香组分一般包括醇类、醛类、酸类、酯类、内酯、硫化物等，其香气来源一是 鲜奶中的天然香气成分，二是乳品加工中形成的香气成分，主要包括双乙酰( 2 ， 3 丁二酮) 、乙偶姻、丁位癸内酯、丁位十二内酯、牛奶内酯等【4 】。 2 0 世纪7 0 年代以来，国内外香料香精公司在利用生物酶处理天然奶油生产 天然奶香精基料十分活跃，有大量的文献和专利报道了在该方面的研究进展。 1 9 8 1 年日本长谷川公司【5 l 公布了利用脂肪酶处理食用油、脂肪、糖和氨基酸生 产奶香料的专利。1 9 8 2 年日本高砂鉴臣香料有限公司的研发人员【6 j 报道了利用 微生物脂肪酶生产奶香料的研究，该研究对不同来源酶一动物性酯酶( 牛前 胃酯酶、猪胰脂肪酶) 和微生物脂肪酶( 柱状假丝酵母、产碱杆菌2 6 6 和6 7 9 、 根霉菌、藻菌) 对奶油的作用进行比较研究，结果表明，动物性脂肪酶主要对 c 4 和c 6 脂肪酸表现了高活性，而微生物脂肪酶主要对c 1 6 脂肪酸表现高活性， 此外，柱状假丝酵母脂肪酶作用奶油后得到了极好的奶香料，它对c 4 和c 6 脂 肪酸表现了低活性，而对c 1 6 脂肪酸和c 1 8 ：l 脂肪酸却表现了较高活性。1 9 8 3 年，美国b a k a l 等人【7 】报道了利用油溶性脂肪酶水解奶酪或奶油和脱脂牛奶开始 馏出物得到具有香气的人造奶油。1 9 8 6 年，芬兰k a l op 等人瞵j 报道了利用脂肪 酶转酯化改变固体成分和菜籽油中的甘油三酯成分，从而改变产品的熔化特性， 为制备低熔点天然奶油香基提供了一个研究思路。1 9 8 9 年日本y o s h i d a 等人【9 】 利用脂肪酶处理油脂和杂醇油制备得到具有发酵水果香型香料物质，为生物酶 解产香提供了一个新的方法。v e r l m 曲e 等人【l o 】利用砒此o p u sa 1 1 蚯z u s 脂肪酶作 江南大学专业硕士学位论文 为催化衍u ，两、奶酪、重组奶酪进行水解，发现严韧中嗣脂肪酸成分再很大的 差异，而且利用酶水解牛奶脂肪得到的游离脂肪酸组成受反应条件、酶浓度和 酶专一性的影响，因此，在工艺稳定性研究中，非常有必要保持反应条件和酶 浓度的不变化，当然，由于不同酶、酶浓度和反应条件能得到不同的脂肪酸组 成，所以，可根据需要设计不同香气风格产品。y a m a m o t o 等人【u l 利用脂肪酶、 蛋白酶、乳酸菌和天然奶油、脱脂牛奶、水混合反应获得发酵奶香料，该产品 奶香丰富厚实，此外，该发酵奶香料具有稳定的游离脂肪酸、磷钨酸和丁二酮 含量，可以看出国外先进科研机构在开发新型奶香料时均会对产品的香气成分 进行分析，找出影响产品风格的关键香气成分。日本长谷川公司的t 0 j o 等人【1 2 】 将含有2 5 脂肪的天然奶酪5 0 眶经8 5 灭菌1 5 分钟后，冷却到4 0 ，然后 利用1 0g 去离子水溶解来自色素杆菌( c h r o m o b a c t e 矗啪s p ) 的脂肪酶o 2 5 9 ， 前后两者混合，在4 0 下搅拌反应1 6h 获得4 9 5g 奶油香料，该奶油香料的酸 值为3 2 ，在饼干和人造奶油加香中具有很好的效果。1 9 9 3 年，1 o j o 等人f 1 3 】又公 布了利用来源于青霉属( p e l l i c i l l i 呦c h 巧s o g e n 啪) 的脂肪酶生产持久留香的奶 香料的专利，由于该产品具有较好的稳定性，因此，再饼干等需要高温处理的 产品中得到了较好应用。f 哂i l ( a 、a 【1 4 】利用固定化脂肪酶在溶剂中催化含香气和 不含香气的脂肪和油( 如可可脂和脱臭棕榈油) 得到具有极好香气的转脂化油 脂，这种油脂被用于制造巧克力。k a i l i s a ，a 等人【1 5 】利用l i p a s eo f 和亚麻籽油 混合，然后用其处理碾磨过的大豆，制各得到清新香气物质，经提取分析，证 明该物质由正己醛、1 一戊烯3 一醇、反一2 一己烯醛、顺一2 一戊烯醛按 3 7 ：3 4 ：2 ：l 比例组成，给生物产香又提供了一个新的思路。t o m a s i n i 等人【1 6 】利用 来源于青霉属( p e m c i l l i u mr o q u e f o r t i ) 的脂肪酶分解脂肪生产蓝奶酪( b l u ec h e es 】e ) 香气香料，他们在对奶油和黄油两种底物的比较中发现，经u 玎灭菌过的奶油 是产生具有奶酪香气特征的游离脂肪酸的最佳底物。s i l v e rr s 等人【1 7 】利用一种 脂肪酶、一种蛋白酶和一种肽酶组成的酶系统处理蛋自、脂肪、酸和水混合物， 获得了高度强化的奶酪香料前体，该香料前体经加热灭酶后能得到很强的香气 成分物质，能被用于奶酪的生产。、”e t e i o v am 等人【1 8 j 研究了荧光假单胞菌脂 肪酶对牛奶脂肪脂肪酸释放的作用，他们对添加一定量细胞的牛奶在p h = 6 5 和 1 4 储存7 天的变化进行跟踪，发现中碳链脂肪酸( c 1 2 一c 1 6 ) 被首先释放出来， 然后释放长链脂肪酸( c 1 8 ) ，然而短链脂肪酸( c 6 c i o ) 仅生成很少的量。专一性 脂肪酸从牛奶脂肪中释放出来的变异系数主要影响p h 和游离脂肪酸浓度之间 的关系。当长链脂肪酸的释放占主要优势时，它与p h 的缓慢下降相关；当短链 脂肪酸的释放为主时，牛奶的p h 发生明显下降。 在国内，1 9 9 9 年杭州绿晶香料有限公司的张之涤【3 】进行了酶法奶类香精的 研制和应用研究，他首先对根霉( r j l i z o p u s ) 、酵母( y e a s t ) 、细菌( b a c t 嘶a ) 、 放线菌( a c 如o m y c e s ) 的脂肪酶的分解率和各种脂肪酸含量进行评价( 如表1 1 和表1 2 所示) ，并确定奶油酶解率为5 5 嗡0 和反应时间为3 4h 较适宜，最 2 绪论 终利用奶油酶解物作基础原料调制成自腕香精和牛奶香精，在利用奶酒酶解物 和乳化工艺相结合制成乳化鲜奶和乳化炼奶香精。武彦文【1 9 j 等人对酶法水解奶 油制备奶味香精进行研究，他们选取了脂肪酶p a j a t a s e2 0 0 0l ( 丹麦n o v 0 公司) 对不同类型的奶油、奶酪和牛奶进行酶解，结果发现，在非水介质下水解得到 的奶香浓郁和赋香效果明显的奶味香精。水解时以乙醇或丙酮为溶剂，在p h 7 o 、 5 0 下水解4h ，酶用量为1 1 5 时得到的奶味香精香气最浓郁。刘敏尧等 人【2 0 】以天然奶油为原料，经过加水稀释、搅拌乳化、巴氏杀菌、降温、酶解、 灭酶、浓缩而制成奶味香精，其特征在于：在酶解工艺中，采用复合酶制剂， 复合酶制剂以脂肪酶为主要成分，其他成分还包括蛋白酶、葡萄氧化酶、过氧 化氢酶和乳糖酶中的一种、两种、三种或四种；复合酶制剂的添加量以原料重 量计为o 2 1 0 ；酶解温度为3 5 5 5 ，酶解时间为4 1 6 小时。该发明制备的 奶味香精，香气自然、柔和，与传统工艺制备的产品相比，可增香1 5 0 2 5 0 倍， 对加香产品的内在质量有明显的改善和提高，是一种理想的天然食品添加剂。 表卜1 各种脂肪酶的分解率( ) 表l 一2 各种脂肪酸含量( ) 脂肪酶弋丁掣訾l n 放线菌 1 8 1 2l o888 细菌 1 21 11 31 39 9 根霉 1 01 01 0l o99 酵母 1 91 61 51 61 21 2 在转酯化研究方面，以前的科研工作者开展了大量的研究【2 卜3 1 】，但发现， 在这些研究中，主要侧重于提高油脂的凝固点，对通过转酯化降低奶油的凝固 点，从而使奶油在常温下仍保持透明液体状的研究未见报道。在这里介绍一个 定向转酯化的思路，可作为以后研究降低奶油的凝固点一个技术思路。q 眦i a 等人【3 2 】利用c 弛d i d a 锄t a r 嘶c a 和m u c o f 面e h e i 脂肪酶制得的固定化酶催化亚油 酸和奶油发生转酯化，释放出短链脂肪酸，特别是丁酸和己酸，最终获得高亚 油酸含量的奶油。c a i l l 等人【j j l 利用甘油酯和包含2 0 6 5 c 1 6 ：l 脂肪酸的由1 2 2 4 碳原子数组成的脂肪酸混合物制备c 1 6 ：1 和c 1 6 ：0 比率大于2 o 与c 1 6 ：1 和c 1 8 ：l 比率大于1 2 的油脂产品，该产品在食品中有很好的应用，主要通过c 1 6 ：1 专一 性酶部分水解鱼油，分馏出脂肪酸。例如，利用c 锄d i d an 唱o s a 脂肪酶水解鲱油 得到4 5 转化率水解物，产物利用丙酮分馏，并利用r l l i z o m u c o rm i e h e i 脂肪酶 3 婆童奎兰耋兰竺堡主堂垡丝茎 一 重新莉葺化得至uc 1 6 ：1 含量较军雷的捆。茵此，认为，奢要改夏奶涸的凝固特 性，可定向地利用低碳链脂肪酸与奶油中长碳链脂肪酸进行部分交换，从而获 得低凝固点的奶油香精。 在牛奶香气和滋味研究方面，k a w a s a “【3 4 】公布了奶香型化合物的组成的专 利，专利报道奶香型化合物的组成包括内酯、脂肪酸和脂肪和油的水解产物。 此外，奶香料也包括醛、酯、醇、酮、含氮化合物、含硫化合物、蛋白水解物、 牛奶和乳制品分馏物等。h a s b 血l 等人f 3 5 】研究u h t 牛奶香气的变化情况，他 们的研究表明，牛奶在热处理过程中香气会发生改变，热处理牛奶会使牛奶成 分形成易挥发，利用气相色谱分析u h t 全脂、唧半脂和u h t 脱脂牛奶发现， 牛奶香气受热处理和牛奶成分组成两方面影响。1 w ；a t s u l 【ik 等人州利用感官评 价试验对不同温度对l 刀盯处理后的牛奶的感官特性的影响进行评价测定，他们 认为在u h t 处理工艺下，乳清蛋白变性率和凝乳能力是加热温度对牛奶的物理 化学特性影响的最可靠的指标物，在1 3 0 或以上温度，乳糖也被用于作为指 标物，可口性主要通过对牛奶品尝中香气、余味、新鲜度和强度来判断，他们 比较喜欢的工艺是1 3 0 处理2 秒钟。通过感官评价和主成分分析结果发现， 与牛奶体态相关的感官标记如奶香、牛奶口感、粘稠度和脂肪随明t 处理温度 的上升变得更强。在1 4 0 杀菌2 秒条件下牛奶体态变得更加强烈，但他们发 现唧工艺的变化没有导致牛奶特性方面发现明显的差异。b e n d a l l ，【3 7 】利用一 种新发展的溶剂辅助香气蒸发技术( s a f e ) 对两种不同喂食的新西兰奶牛所产的 新鲜牛奶香气成分进行提取和气相嗅觉测量分析比较，在得到的7 1 种香气成分 中有6 6 种被鉴定出，尽管两种牛奶的滋昧有很大差异，但它们所有的组分几 乎相同，仅有一种化合物，6 一l2 ：2 内酯是明显的香气活性物质发现于饲料喂食 的牛奶中，而在牧草喂食的牛奶中没被发现，因此，不同的牛奶滋味差异首先 是由香气物质的含量差异所造成的，即使是采用唯一的喂食方式也有可能发生。 r ( ) b e r t sd d 等人【3 8 l 通过实验设计，比较了不同水平的非脂乳固体和牛奶脂肪对 香气化合物挥发性的影响，他们利用固相微萃取法和氢火焰检测气相色谱法对 三类化合物的行为进行了鉴定，这三类化合物分别是：( 1 ) 不受牛奶组成的添 加的影响的物质( 如丁二酮，2 ，3 戊二酮，愈创木酚) ；( 2 ) 受牛奶脂肪而不受 非脂乳固体影响而导致挥发性降低的物质( 如3 甲基丁醛，2 一甲基丙醛，4 一乙基 愈创木酚) ；( 3 ) 挥发性受非脂乳固体影响而降低，但受牛奶脂肪影响降低更加 明显的物质( 如大马酮，1 辛烯3 酮) 。最后一组是仅有一个表现了香气成分和 牛奶蛋白或乳糖之间的相互作用。然而，当体系中存在脂肪时，非脂乳固体不 进一步影响香气成分的释放。这个结果表明在液态牛奶体系中，香气化合物被 脂肪吸附是主要的保留机制。因此，开发具有纠味作用和热稳定性较好的奶香 精将十分有意义。 在乳化产品设计方面，t s u j i n a l 【a 等人【3 9 】利用单甘酯和牛奶蛋白混合物制备 食品乳化剂，该乳化剂中的单甘酯主要成分琥珀酸单甘酯、二乙酰酒石酸单甘 4 绪论 酯、柠檬酸单甘酯、乙酸单甘酯和乳酸单甘酯，在乳酪和人造奶油中应用后， 即使添加少量的牛奶成分，就能使产品具有很好的奶香气。 国际上生产天然奶香精基料最著名的公司是美国的伯特毕斯( b u 钍e rb u d s ) 公司，该公司产品剂型齐全，具有水溶性粉末状产品系列、油质香基产品系列、 流动性油质产品、水溶性膏状物等剂型，产品特点鲜明，贴近天然产品风格， 因此，它的产品应用遍及冰淇淋、方便汤包、奶类饮品、酸奶、烘烤类、脂肪 代用和人造奶油，据不完全统计，伯特毕斯公司的奶香精产品每年在中国的销 售额超过一亿元，占据中国奶类香精市场的半壁江山。 国内形成规模的生产厂家是天津艾尔森香料有限公司，该公司在产品外观 和剂型设计方面处于国内领先地位，它具有油质、粉末和乳化香精三种剂型， 目前比较受关注的是其低凝固点油质产品，代表了国内领先技术，据不完全统 计，该公司在中国奶类香精市场的年销售额在5 0 0 0 万左右。 1 2 奶香精基料生产中存在的主要问题 尽管前人在天然奶香精基料方面开展了大量的研究，不过在国内的相关研 究表明应用性研究较多，基础研究较少，从而在产品创新能力方面较弱，产品 的同质化现象严重，以酶源为例，国内采用的酶大多是国外大公司已经商品化 的酶制剂，自主开发的酶制剂未见报道，这也不可避免出现同质化竞争；在产 香手段方面，技术手段较单一，利用较多的是酶水解，然后结合调香修饰，其 他手段如美拉德反应、热裂解反应未见报道；在产品的组分研究方面，未见对 奶香精香气成分的系统研究的报道，采用的较多的是感官评价，从而导致产品 的稳定性较差和应用范围的不确定性；在产品的剂型设计方面，明显不能满足 客户的要求，尤其是低凝固点奶油香精产品的开发，国内厂家除天津艾尔森香 料有限公司具有该产品外，市场上没见其他厂家有该类产品。因此，如何根据 客户的要求开发有针对性的产品将是以后的发展方向。 1 3 本课题研究的意义 中国是世界上人口最大的国家，每年对奶香精的消耗量十分巨大。天然奶 香精基料具有增加应用产品的香味和口感，掩盖合成香精刺激的感觉和产品中 不大接受的味道，使产品更圆润，少量添加时仍保存有浓郁的奶味，可减少使 用其它奶类产品的用量，从而大大降低成本，此外，该产品储存方便，无需冷 藏，因此，利用生物酶处理天然奶油生产天然奶香精基料是当前研究热点。利 用生物酶解天然奶油生产天然奶香精基料具有操作条件温和，产品保存条件要 求不高，产品香气强度大( 比天然奶油强几百倍甚至上千倍) ，应用添加量小， 产品香气天然逼真，稳定性好，对应用产品( 如低蛋白含量乳饮料、冰淇淋、 饼干等) 体态贡献十分明显。形象地描述，天然奶香精基料就像一个毛坯房， 协调的成分组成和较好的稳定性就如房子结构的稳固和布局合理，剂型的设计 就如房型设计( 三房两厅还是两房一厅、一房一厅) ，调香修饰就像给房子装修， 好的调香效果得到的是极品房和精品房，般的调香效果得到的是简装房。因 5 江南大学专业硕学盥论文 此，尽管目前国内外有许多公司( 如美国的伯特毕斯、天津的艾尔森香料有限 公司等) 生产天然奶香精基料，但进行此类研究仍然十分有意义。因为随着人 们生活水平的提高，消费者对奶香精的品质的要求将越来越高，市场的发展趋 势是淘汰无核心技术的简单重复开发产品，而极品和精品奶香精将越来越受欢 迎。因此，奶味香精系列产品的开发具有广阔的市场前景。 1 4 本课题研究的主要内容 本研究的目的就是要克服酶源单一，产品同质化的问题。通过市场调研和 感官评价，确定了牛奶品牌a 为主要研究仿制对象，希望通过对a 品牌组分的 分析和比较，找到它与其他品牌的不同特征组分，然后利用生物酶解工艺制备 拥有a 品牌特性的天然奶香精基料，调配优异的奶香精产品。 l 、奶香成分分析与比较：通过对四种商品牛奶的各物质组成进行系统的研 究，对牛奶的挥发性成分，蛋白质、脂肪进行分离和定量分析比较，以期确定 了牛奶的风味贡献基料组分。 2 、酶的筛选与酶解工艺的确定：生物脂肪酶能在一定的反应体系( 温度、 p h 、水活度) 下能高效地水解甘油三酯为脂肪酸、甘油二酯、甘油单酯和甘油， 但由于不同的酶具有不同的专一性，所以，选择合适的脂肪酶是本研究的重点。 通过对主要介绍目标酶源的初步筛选及结果的评价，最终选出优质生产酶源脂 肪酶，并确定一个稳定的生产工艺。 3 、酶解奶油产品的修饰与稳定性的研究：针对酶解奶油产品存在的缺点， 利用调香修饰手段，通过感官比对实验，确定了酶解奶油产品和奶香香精的最 佳应用比例，最终获得有明显贡献的优质奶香精产品以期提高奶香、掩盖杂味 和丰富体态。最后对相应香精的存储条件进行稳定性的初步研究，为产品的工 业化打下了扎实的基础。 6 牛奶中风味基料成分的分析与比较 第二章牛奶中风味基料成分的分析与比较 2 11 豺言 市场上销售的商品牛奶虽然其蛋白质、脂肪、碳水化合物( 主要是乳糖) 等牛奶主要成分都相近( 见表2 1 ) ，但被消费者接受的程度( 如市场占有率) 却大相径庭。实际上，牛奶的成分十分复杂，它至少含有上百种化学成分，在 牛奶( 乳制品) 的生产加工过程中从奶牛的种群选育到奶牛的喂养、收奶、储 运、加工等各个环节对最终商品牛奶的风味都有影响。虽然牛奶的成分和商品 奶的生产加工环节复杂，但它也不是无规律可寻。a 品牌无论从市场占有率， 还是从感官评价来说，都是其中的佼佼者，如何通过酶法制备有相似性的奶香 精基料，以生产优异的奶香精，是本文的目的。首先可以从牛奶的感官和质地 性状考虑，研究天然奶中致香、致味和致口感的主要功能因子，并进行定量分 析分析，以期发现a 品牌牛奶在物质含量以及比例、浓度等方面与众不同部分， 即主要特征致香成分是本章的主要内容和工作目标。 表2 1 牛乳主要化学成分及含量 2 2 材料与方法 2 2 1 实验仪器 恒温水浴锅 精密天平梅特勒托利多公司 精密p h 计 梅特勒托利多公司 高速离心机b e c k m 趾公司 a 西l e n t 6 8 9 0 5 9 7 3 气质联用仪安捷伦公司 ( 配备毛细管柱h p i 尬o w a x 极性柱( 6 0m o 2 5m m 0 2 5p m ) 层析柱2 0 o o 目硅胶 同时蒸馏萃取仪 固相微萃取头( 见表2 2 ) 固相微萃取手柄 恒温磁力搅拌器太仓市科教器材厂 5 l 发酵罐镇江东方生物工程设备技术有限公司 7 江南大学专业硕士学位论文 表2 吨萄相微萃取头潲l 类及使危情况 2 2 2 实验材料 2 2 2 1 实验原料 a ：纯鲜牛奶( 生产日期：2 0 0 6 1 2 2 4 ) b ：纯鲜牛奶( 生产日期：0 6 1 2 2 4 ) c ：纯牛奶( 生产日期：2 0 0 6 1 1 2 0 ) d ：纯牛奶 ( 生产日期：2 0 0 6 1 1 1 1a e h l o b 0 4 d ) 新西兰天然无盐奶油 脂肪酶天津艾尔森生物科技有限公司 自制缓冲液 2 2 2 2 主要试剂 9 5 乙醇( 分析纯) ，乙醚( 分析纯) ，p h 试纸( p h3 5 之间) ，碳酸钙，氯 化钠( 分析纯) ，异戊酸，浓硫酸( 分析纯) 。 2 2 3 实验方法 2 2 3 1 柱层析条件 3 0 0 4 0 0 目硅胶量：2 0g ；洗脱剂：( 正己烷：乙醚：乙酸) = ( 6 0 ：2 0 ：l ， 讯知) ；上样量：o 2g ；内标：异戊酸；内标量：2 0 “1 1 0 异戊酸甲醇溶液。 2 2 3 2 甲酯化条件 将柱层析样品溶解在1 0i n l5 硫酸甲醇溶液中，8 0 水浴中冷凝回流lh ， 浓缩至lm l 后，用无水硫酸钠干燥，送g c - m s 分析。 2 2 3 3 固相微萃取条件 在每个西林瓶中称取样品4 0g ，放入磁力搅拌子，用塞子密封，放在5 0 士o 5 水浴中搅拌预热1 0m m ，插入活化后的固相微萃取头，4 0m i i l 平衡后，取出 固相微萃取头，送g c m s 检测。 2 2 3 4g c m s 分析条件 8 牛奶中风味基料成分的分析与比较 茜葡赦军取头洗兢可同为2n n n ，迸祥温反：2 5 - o ；载气：h e ：柱温：6 0 保温2i i l i n ，2 细l i n 上升到1 8 0 ，再以1 0 细证上升到2 2 0 ，保温 4 0m i n ；流速：1i n 】协n i n ，分流比：1 0 ：l ；洲s 接口温度：2 8 0 ；质谱扫 描范围：3 5 - 4 5 0a u 加：离子源：e i 源；电子能量：7 0e v 。谱图检索：采用n i s t 谱库进行检索。 2 2 3 5 蛋白质、脂肪、脂肪酸的分离与分析方法 取1 0 0 9 新鲜牛奶于2 5 0 n 1 l 烧杯中，在恒温水浴中加热至4 5 士1 ，边搅 拌边慢慢加入lm o l lh 2 s 0 4 ，通过p h 计测量至4 8 ，然后冷却至室温，离心( 8 0 0 0 r p m ，l om i n ) ，固液分离后将上层清液放出，用2 5 0 i n l 烧杯收集( 固体留在离 心管中备用) ，然后用水浴加温至4 5 士1 ，再边搅拌边慢慢加入1m o 儿 h 2 s 0 4 ，使其p h 至4 6 ，然后冷却至室温，离心分离( 分离条件如前) ，将上层 清液放出，用2 5 0 i n l 烧杯收集( 固体留在离心管中备用) 后再用水浴加温至 4 5 士1 再边搅拌边慢慢加入lm o l lh 2 s 0 4 ，使其p h 至3 8 ，然后冷却至室温， 用离心机离心( 分离条件如前) ，所得清液即为牛奶去蛋白溶液( 用同种方法做 至少2 个平行样) 。 分别将离心管中的沉淀物依次用9 5 乙醇、乙醇乙醚等体积混合液、乙醚 分别洗涤( 用量控制在“沉淀物”重量的5 1 0 倍) ，每次洗涤后都用离心机 ( 8 0 0 0 r p m ) 离心1 0 分钟，然后将上清液分别用容器收集好备用。注意，用乙 醚洗涤时，注意用玻璃棒捣碎成团的固体，并反复翻洗，保证脂肪被洗净。( 用 同种方法做至少2 个平行样) 将收集到的乙醇上清液混合于一个2 0 0 m l 的磨口三角瓶中加盖密封好放入 1 0 1 5 冰箱中静置2 4 士l 小时，取出离心，将上清液放出、收集，然后将收 集的沉淀物用乙醇乙醚等体积混合液、乙醚分别洗涤，乙醇和乙醇乙醚等体积 混合洗涤液合并经浓缩处理后得到含脂肪酸的脂肪，经柱层析分离出脂肪酸， 再经甲酯化后，送检测中心进行g c m s 分析。( 用同种方法做至少2 个平行样) 2 2 3 6 牛奶去蛋白溶液挥发性风味物质的分离与分析 往5 0 0i n l 圆底烧瓶中装入1 0 0g 牛奶去蛋白溶液，加入1 0 0g 纯净水，在 加入2 0g 分析纯氯化钠，另一5 0i n l 茄形烧瓶装入2 5i n l ( 约1 7 5g ) 分析纯乙 醚，在平衡条件下，同时蒸馏3h ，乙醚萃取液经无水硫酸钠干燥后送g c - m s 分析。 2 2 3 7 四种牛奶产品的感官评定 请评定专家对四种品牌牛奶进行描述性感官评定，通过偏好性实验选择风 味最佳的产品。 2 2 3 8 天然奶油的酶解方法 在5 l 发酵罐中加入3 5 蚝奶油，另加入1 8 0g 纯净水，按o 1 比例加入脂 肪酶，在4 0 巧0 和初始p h 为5 2 下开始反应，搅拌转速维持在4 0 0 5 0 0 印m 之间，用自制缓冲液调节p h ，使反应体系p h 维持在5 肛5 5 之间，反应时间以 9 江雨大学专业硕士学位论文 停止添刃口碱液时p h 燹化很缓慢作为终点。 2 2 3 9 天然奶油酶解物中脂肪与脂肪酸的分离分析 利用传统的分离方法直接从牛奶中分离出脂肪和脂肪酸的混合物，加入内 标异戊酸，然后经硅胶柱层析纯化，得脂肪酸混合物，最后在硫酸的催化下， 经甲醇甲酯化和萃取浓缩处理后，g c m s 分析。 2 2 3 1 0 酶解奶油的加香实验和感官评价方法 ( 1 ) 空白样的制备 取a 品牌纯牛奶，根据实际的蛋白含量，加纯净水稀释其蛋白含量至1 o ， 然后充分搅拌均匀，取l o og 保持温度在6 1 0 备用。 ( 2 ) 实验样的制备 取公司新开发的一款奶味头香精e ，按照5 ：9 5 的比例加入到酶法制备的 奶香精基料中。将加热好的实验样在搅拌状态下加入空白样中，添加量为o 0 2 ， 然后放入高速剪切机中剪切1 分钟，冷却至室温，在3 小时内品尝完毕。 ( 3 ) 产品感官评价及统计分析 将空白样、实验样和a 品牌牛奶分别进行暗屋式品尝和比对，按5 分制打 分，对三个样品进行排序，根据排序结果进行统计分析。 2 3 结果与讨论 2 3 1 萃取头的选择 为了对牛奶香气成分主要组成的全面了解，同时考察固相微萃取纤维头的 萃取能力及适应性，以a 牛奶为研究对象对购买的七种不同的萃取头进行了比 较实验，从表2 3 结果看，d v b c 触乙p d m s 、p d m s d v b 和c 刖p d m s 所吸 附的风味组分数量较多，明显优于其它四种。因此，在以后的牛奶风味物质分 析实验中，主要采用上述三种萃取头进行分析。 1 0 n _ 西卜翻2 = 譬2 = 譬竺= 2 是高岱 疆卜链睡将器 斑十 羞心链长十醐eb_i【 硷鹾长+【 璐湫 疆长粼草卜 镫泳醐辍o【 船簸悄十i哆娶镒f2 锚墩 鑫己i蛾n 甾叮 豁区n_【 器卅链旺 湖懈 窿卅n 谧静 襞鞲靶，盎 瀣毯 匿邀，n 滋泳链州链排链邀 甾融l糊tzn 器镁斑腔郴旺，_呻n，潲嫩西 篚阳 盛- l 龉霞卜盐阳 箍窿ini 谧昏* 匿卜n醐嫩 磕蟋【 隘燧i n 嚣镁骈ni，埔峙，粥卜in 螫喾糊昏n邋卜埔n 嚣卜-【 暖- l 由 疆砧卜咪甾心 暖陵 程十 程- l 盛杉+ 镫粼镫m 链悱 滋阳；辋f2n 匿区“，醐1毒精i 箍 将 程m 张 餐卜 筒卜郴烈；寸 匿梆n 链酶粥睁寸警 氍逖n 酶餐1毒 -【，醐融甘，埔-ln 缢链 匿卜n 睚窿 鼯卜“缓睁将器 匿蠼螫 营n醐旧餮iz 链锨 释哥 甾醐fz由 滋泳 般睁镒长十 铽“+ 斑杈 镒带 滋1 己 疆墨_ l 暖嫩，n医毯n 盐心 哿门甾襞瞪，n，撩激，n 蹑精 龌程驻区粥卜醐嶷i叫 镒悱 链卜l叶二 哿链瑷腔蝴rz墒薜fzn 甾粼 疑墨- l 器链门，链门n【 血o、乏q乱 乏dd，世u 乏od世q lurl卜乏ol erloo一乏。乱 q u 山 咿骠 群越导等颦冬球薛件霉婴回匠幡个n 铎翌婶窭太餐求镁荽醐喾匠廿寰廿 江南大学专业硕士学位论文 2 3 2 砖妨酸含量两午奶风唪的关系 利用传统的分离方法直接从牛奶中分离出脂肪和脂肪酸的混合物，加入内标 异戊酸，然后经硅胶柱层析纯化，得脂肪酸混合物，最后在硫酸的催化下，经甲 醇甲酯化和萃取浓缩处理后，g c m s 分析。如图2 1 、图2 - 2 、图2 3 和图2 - 4 所 示。四种品牌牛奶的出峰图大致相似，说明脂肪酸种类差异不大，在7 0 n 血左右 出现油酸，在7 2 n 血l 左右出现亚油酸等，但脂肪酸的含量却大相径庭，根据四种 牛奶的脂肪酸g c m s 分析结果进行数据处理比较，通过图2 5 可以很直观的看出， 四种牛奶中的脂肪酸种类差异不大，但在含量上却有明显的区别。a 品牌牛奶的 十二酸、十四酸、十六烯酸、9 ，1 2 十八二烯酸含量要明显高于其他品牌牛奶，且 在其它酸的含量也要比其他的高，结合对四种牛奶的品尝，可以假设正是在这部 分脂肪酸含量上的差异导致了四种牛奶在滋味上的差异。 对酶解奶油的加香实验和感官评价实验表明，在加入天然奶香精基料的实验 样品中，其综合评分为4 2 分，与a 品牌牛奶的4 5 分较为接近，均显著高于空白 样的2 4 分，因此加入奶味香精可明显改善口感和香味，奶香精基料的应用效果已 经显现出来。 图2 6 酶解天然奶油制备物恰恰也是脂肪酸的含量特别是脂肪酸中的十六烯 酸，9 ，1 2 十八二烯酸含量发生了变化，因此可以说脂肪酸如十六烯酸，9 ，1 2 十八二烯酸等正是本研究所寻找的特征风味贡献基料成分。这样就使酶的筛选和 奶油酶解工艺的确定有了明确的目标，做到有的放矢。对不同酶水解天然奶油或 同一种酶在不同程度上水解奶油得到的奶香精基料的脂肪酸含量进行模块化，然 后根据不同的牛奶体系添加与之相符合的模块的奶香精基料，这样将能使以后的 相关研究更科学更有针对性。 h n d 且n c b 图2 1 a 牛奶脂肪酸g c m s 图 1 2 o 0 o 0 0 0 d d 的 的 的 们 筋 埔 5 牛奶中风味基料成分的分析与比较 t _ a b u n d a n c e 图2 - 2b 牛奶脂肪酸g c m s 图 t 】c ：0 6 1 2 0 6 0 2 d t 五e 专 b u n d a n c e 图2 - 3 c 牛奶脂肪酸o c m s 图 t 血e 争 图2 - 4 d 牛奶脂肪酸g c m s 图 1 3 一女 墨磊8 霉蠹。篓 ( ) m “l 墼 量 。 ：鲁 呈釜 ；季 害 驾 牛奶中风味基料成分的分析与比较 l o o 8 0 妻6 0 蓬4 0 2 0 0 图囵 一 脂肪酸组分 9 一十六烯酸9 八烯酸9 ，1 2 一十，二烯酸 一酶解后酶解可 圈2 _ 6 奶油脂肪酸含量酶解前后比较 2 3 3 去蛋白溶液中主要风味物质与牛奶风味的关系 为了证明推测的准确性，接着又对牛奶的去蛋白溶液体系中的风味气息进行 了同时蒸馏萃取和气质分析研究，结果如表2 4 所示。可以看出，除d 牛奶外， 其他三种牛奶去蛋白溶液气息成分在种类上和含量都比较接近，因此，可以认为 去蛋白溶液中主要香味气息成分并不是构成各种品牌牛奶主体特征的成分。 表2 4 四种牛奶去蛋白溶液中主要风味物质 2 3 4 脂肪含量与牛奶风味的关系 牛奶中的脂肪由分离实验所述得到，低熔点油脂由乙醇和乙醇乙醚等体积混 合液分离后浓缩得到，高熔点油脂由乙醚分离后浓缩得到，结果如表2 5 所示。在 四种牛奶中d 牛奶的脂肪含量要明显低于其它三种，b 牛奶的脂肪含量最高，这 与消费者对四种牛奶的口感评价是一致的，即