（化学工程专业论文）栀子蓝色素制备的工艺研究.pdf

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溶液中，放入冰箱冷藏 至颗粒固化为白色，即得到固定化酶颗粒，颗粒直径大小为3 2 m m 左右。 4 确定了栀子苷水解平衡的条件：以谷氨酸钠为显色剂对水解液中栀子 苷元的生成量实时监测至水解平衡。经过实验证明此种方法有效可行。 5 对合成栀子蓝色素的工艺条件进行优化，确定了适宜合成栀子蓝色素 的条件：谷氨酸钠用量为m 栀子昔：册谷氟酸钠- - 1 ：1 2 ，合成浓度为水解前水解液中 栀子菅的浓度2 4 m g m l ，加入p h 值为7 4 的缓冲溶液，合成温度为8 0 c 。 6 对栀子蓝色素的稳定性分别进行了耐热性、耐光性、耐金属离子、耐 氧化还原倦耐酸碱性方面的研究，确定了栀子蓝色素的存放、使用条件。结 论是栀子蓝色素适宜于存放在温度6 0 以下、p h 在6 8 、避光的条件下。 关键词：栀子蓝色素谷氨酸钠固定化酶水解平衡 ”冀毒篓霉繁i i 竺苎鬻警鼍。警锚：鼍：；：麓5 j 攀色鼍擘i 置强鼍攀是托既鼍簟翟笋蠢黟蠹弘溉夥。勰鼠纛嚣嚣j 五量蠢蠢童善曩焉瑟瑟嚣磊瑟 二：薹：= ：i ：兰三兰：2 二曼j 二：二一二j + 。? j 一+ ，：，ij 。”i ：u j ，”? 。：? ：lj _ 鬟# 鼍。二_ j “誓i ，7 7 = = ? ：4 j “鬻臻0 警置 a b s t r a c t a b s t r a c t g a r d e n i aj a s m i n o i d e se l l i si sac o m m o n l y u s e dt r a d i t i o n a lc h i n e s eh e r b a l m e d i c i n e a n dg a r d e n i ay e l l o wp i g m e n ta n dg e n i p o s i d ea r et h et w om a i nc h e m i c a l c o m p o n e n t si nt h ef r u i to fg a r d e n i aj a s m i n o i d e se l l i s c u r r e n t l y , t h em a i nu s eo f g a r d e n i ai st h ee x t r a c t i o no fg a r d e n i ay e l l o wp i g m e n t t h ee x h a u s t e ds o l u t i o no f g a r d e n i ay e l l o wp i g m e n ts t i l lc o n t a i n sa m a s so fg e n i p o s i d e i fi ti sd i s c h a r g e d ，i ti s n o to n l yp o l l u t i o no ft h ee n v i r o n m e n tb u ta l s ow a s t eo ft h er e s o u r c e s t h e r e f o r e ， g a r d e n i ab l u ep i g m e n tw a sm a d ef r o me x h a u s t e ds o l u t i o n o fg a r d e n i ay e l l o w p i g m e n t a n dm o n o s o d i u mg l u t a m a t e a n dt h et e x tm a k e si m p r o v e m e n t st o t r a d i t i o n a lc r a f t t h es t u d yl a i dt h e o r e t i c a lf o u n d a t i o nf o rl a r g e s c a l em a n u f a c t u r e o fg a r d e n i ab l u ep i g m e n t t h ef o l l o w i n ga r et h es e v e r a la s p e c t so ft h i sw o r k 1 t h et e c h n o l o g yo fi m m o b i l i z e de n z y m ew a sa d o p t e d ，w h i c hi sa p p l i e di n t h ef o o di n d u s t r y a n dt h et e c h n o l o g yh a sr e p l a c et h et r a d i t i o n a lt e c h n o l o g yo f f e r m e n ti np r e p a r a t i o no fg a r d e n i ab l u ep i g m e n t i tw i l lh e l pt or e d u c et h ec o s ta n d i m p r o v et h eq u a l i t ya sar e s u l to ft h ec h a r a c t e r i s t i co f i m m o b i l i z e de n z y m e ，w h i c h i sr e p e t i t i o nu s ea n dc l e a r 2 t h ef e r m e n t a t i o nm e d i u mo fa s p e r g i l l u sn i g e rc m c cb9 8 0 0 3i s d e t e r m i n e d i tc o n s i s t so f1 5 o f b r a n ，1 5 o f f i c eb r a n ，0 2 o f ( n h 4 ) 2 s 0 4 ， 0 1 o f k h 2 p 0 4 ，0 1 o f c a c l 2 ，0 0 5 o f m g s 0 4 7 h 2 0 ，a n dt h er e s ti sd i s t i l l e d w a t e r t h et i m eo ff e r m e n tc u l t i v a t i o ni s8 4 h 3 t h ei m m o b i l i z e de n z y m ei sm a d eb ye n t r a p m e n ta n dt h ec a r r i e ri ss o d i u m a l g i n a t e t h er i p p i n gm e t h o d o fi m m o b i l i z e de n z y m ei sd e t e r m i n e db ye x p e r i m e n t f i r s t ，m i xu pt h ee n z y m es o l u t i o nw i t ht h es o d i u ma l g i n a t es o l u t i o no fs a m ev o l u m e s e c o n d ，e x t r a c tt h em i x e ds o l u t i o nb ym e a n so fas y r i n g e ，a n dt r i c k l et h em i x e d s o l u t i o ni n t ot h e5 o fc a c l 2s o l u t i o n l a s t ，p u tt h e mi n t ot h es a f eo fr e f r i g e r a t o r t i l lt h ep e l l e t sb e c o m ew h i t e t h ed i a m e t e ro fp e l l e ti sa b o u t3 2 m m 4 t h ec o n d i t i o n so fh y d r o l y s i se q u i l i b r i u mo fg e n i p o s i d ew e r ed e t e r m i n e d t h er e a l t i m em o n i t o r i n go fg e n i p i nw a sm a d eb ya d d i n gm o n o s o d i u mg l u t a m a t e w h i c hi sc o l o rd e v e l o p m e n tr e a g e n t t h ee x p e r i m e n t ss h o w e dt h a tt h i sm e t h o di s c o g e n ta n de f f e c t i v e 5 o p t i m i z et h et e c h n o l o g i c a lc o n d i t i o n so fp r e p a r a t i o no fg a r d e n i ab l u e p i g m e n t t h ep r e p a r a t i o nc o n d i t i o n so fg a r d e n i ab l u ep i g m e n ts h o w et h a t t h e d o s a g eo fm o n o s o d i u mg l u t a m a t ei s 脚g 朗i p i d c ：m m o d i 哪g l 咖越e 2 1 ：1 2 ，t h e i l a b s t r a c t r e s p o n s e c o n c e n t r a t i o ni s 2 4 m g m l w h i c hi sc o n c e n t r a t i o no fg e n i p o s i d ei n e x h a u s t e ds o l u t i o no fg a r d e n i ay e l l o wp i g m e n t ，t h ep ho fb u f f e rs o l u t i o nw a s 7 4 ， t h er e a c t i o nt e m p e r a t u r ew a s8 0 c 6 t h i st e x ts t u d i e do nt h es t a b i l i t yo fg a r d e n i ab l u ep i g m e n tf o rr e l a t e df a c t o r s s u c ha sh e a t ，l i g h t ，m e t a li o n s ，o x i d a n t sa n dr e d u c i n ga g e n t ，a c i d i ca n da l k a l i n e a n dt h eb e s tc o n d i t i o n sw e r ed e t e r m i n e d ，w h i c ha r es u i t a b l ef o ru s i n ga n ds t o r i n g t h eg a r d e n i ab l u ep i g m e n t t h er e s u l t ss h o wt h a tt h eg a r d e n i ab l u ep i g m e n t s s t a b i l i t yi sb e t t e rw h e n t h et e m p e r a t u r eu n d e r6 0 i nt h eo p a q u eb a c k g r o u n d ，a n d t h e p h i s a t 6 8 k e y w o r d s ：g a r d e n i ab l u ep i g m e n tm o n o s o d i u mg l u t a m a t ei m m o b i l i z e de n z y m e h y d r o l y s i se q u i l i b r i u m i i i 警霉攀0 攀擘$ 翠鞴$ 甾z 等碍警掣挚嚣：鞯：j ：j 巍嚣鞘删譬谬厶瑶i 瑶勰强i 嚣聱：警鼍i ：戮警掰i 南秽i ：越城：罱锷：荔弛翟麓。三螽翳；灞蠢爱：j ：象磊 二盖誓= - 三二互二：上。一：二：0i ：j o j j j 、；o ：一，一一一。一“一：一”j 。二：，一一4 _ ：一。- t o 量- j 。一、，：一，。，j ，。 ：j _ - _ - - _ _ _ 二- _ _ _ _ - 。二。_ “一二j 2 一l 一 。、，。一 ” *，一， ” 目录 目录 摘要i a b s t r a c t i i 目录l 1概述。1 1 。1 食用色素简介。l 1 1 1食用色素的发展1 1 1 2 天然食用色素概述2 1 1 3 我国与全球天然食用色素的现状与展望。4 1 2 栀子和栀子系列色素5 1 2 1 栀子5 1 2 2 栀子系列色素5 1 3 栀子系列色素的制备7 1 3 1 栀子黄色素的制备7 1 3 2 栀子蓝色素的制备8 1 4 固定化酶技术9 1 4 1 固定化酶技术的发展9 1 4 2 固定化酶的优点1 0 1 4 3 酶的固定化方法1 0 1 5 本文立项背景1 2 1 6 本文的研究内容和创新点1 2 1 6 1 本文的研究内容1 2 1 6 2 本文的创新点1 2 2 实验材料与方法1 4 2 1 实验材料1 4 2 1 1 实验试剂1 4 2 1 2 仪器1 5 2 2 实验流程。1 5 2 3 分析测试1 6 目录 2 3 1 栀子苷标准曲线的制定1 6 2 3 2 栀子蓝色素的检测1 7 3 固定化酶的制作1 8 3 1 酶液的制作1 8 3 1 1 实验部分1 8 3 2 对酶的固定化2 0 3 3 结果讨论2 0 3 3 1 发酵培养基的确定2 0 3 3 2 发酵时间的确定2 l 3 3 3 海藻酸钠浓度的确定2 l 3 3 4固定化酶颗粒的大小2 3 3 4 本章小结2 3 4 确定栀子苷的水解平衡2 5 4 1 传统水解栀子苷的方法2 5 4 2 氨基酸显色法确定栀子苷水解平衡2 5 4 3 氨基酸显色法显色条件的确定2 6 4 4 本章小结2 7 5 栀子蓝色素的合成2 8 5 1 实验方法2 8 5 1 1 栀子苷元与谷氨酸钠的反应2 8 5 1 2 栀子蓝色素的检测及质量评价2 8 5 2 结果与讨论2 8 5 2 1 谷氨酸钠加入量2 8 5 2 2 栀子苷浓度对合成的影响2 9 5 2 3 不同p _ h 值缓冲溶液对合成的影响3 l 5 2 4 反应温度对反应的影响3 3 5 3 本章小结3 5 6 栀子蓝色素稳定性的研究3 6 6 1 栀子蓝色素稳定性的研究内容3 6 6 2 实验试剂3 6 6 3 实验方法3 7 6 4 实验结果分析3 7 6 4 1 栀子蓝色素的耐热性3 7 目录 _ _ _ _ 一 6 4 2 光照栀子蓝色素的影响：3 8 6 4 3 金属离子对栀子蓝色素的影响3 9 6 4 4 栀子蓝色素的耐氧化还原性4 0 6 4 5 栀子蓝色素的耐酸碱性4 l 6 5 本章小结4 2 7结论4 3 参考文献4 5 致谢4 8 个人简历、在学期间发表的学术论文及研究成果4 9 i i i 1 概述 1 1 食用色素简介 1 1 1 食用色素的发展 食用色素在食品添加剂中占有重要的地位，可以用来改善食品的色泽，促 进人的食欲，其广泛应用于食品、日化、医药等行业。食用色素按来源可以分 为两大类，一类是人工合成食用色素，另一类是天然食用色素【l j 。 世界上第一个人工合成食用色素是英国人在1 8 6 5 年从煤焦油中提取的，从 此揭开了食品加工中人工合成食用色素的历史t 2 1 。人工合成食用色素具有色泽鲜 艳、着色力强、性能稳定、价格低廉等优点，因此在食品工业中被广泛应用。 据我国食品添加剂使用卫生标准( g b 2 7 6 0 1 9 9 6 ) 规定，我国允许使用的人工 合成食用色素共有8 种：苋菜红、胭脂红、赤藓红、新红、柠檬黄、日落黄、 靛蓝、亮蓝，可以通过这8 种人工合成食用色素调配出实际需要的色调，满足 生产的需要。 随着科技的进步与医学的发展，人工合成食用色素的安全性逐渐受到质疑。 前些年出现的“苏丹红1 号”事件就是很好的范例。人们发现很多种人工合成食用 色素都具有毒性、致泻性和致癌性【3 】。在人工合成食用色素中，偶氮化合物类合 成色素的致癌作用明显。偶氮化合物在人体内分解，能够形成多种芳香胺。这 些芳香胺经过体内代谢活动后与靶细胞直接作用，就可能引发细胞癌变【4 j 。因此 开发新品种的食用色素越来越受到人们的重视，为天然食用色素的发展带来了 新的契机。 目前国外发达国家的食用色素大多以天然食用色素为主，人工合成食用色 素为辅，有些国家甚至禁止使用人工合成食用色素1 5 j 。人工合成食用色素的种类 在不断减少，美国1 9 6 0 年允许使用的合成色素有3 5 种，现仅剩下7 种。瑞典、 芬兰、挪威、印度、丹麦、法国等早已禁止使用偶氮类色素，挪威等国还完全 禁止使用任何人工合成食用色素f 6 】。纵观食用色素的发展历史，就是由天然食用 色素_ 人工合成食用色素_ 两者并存_ 天然食用色素。 概述 1 1 2 天然食用色素概述 随着人们对食用色素领域的认知不断加深，天然食用色素大有取代人工合 成食用色素的趋势。 人类使用天然食用色素的历史要远远早于人工合成食用色素的历史，早在 公元六世纪，贾思勰所著的齐民要术就对如何从植物中提取色素进行了记 载，古代的食经中也有使用天然食用色素给酒和食品着色的记载【7 j 。从古至 今人们一直都在利用天然食用色素为食品着色，但是伴随着人工合成食用色素 的出现，天然食用色素渐渐淡出了人们的生活，直到近些年人们才开始逐渐认 识到食用色素的重要性，加快天然食用色素的开发与研究。 天然色素的种类在不断增加，我国从上世纪7 0 年代以来不断加快对天然食 用色素的研究和开发，1 9 8 9 年，已批准使用的天然食用色素有3 4 种，到1 9 9 8 年国家批准允许生产和使用的天然食用色素已经达到4 8 种，如：紫草红、辣椒 红、红米红、红曲米、红曲红、高粱红、萝卜红、葡萄皮红、虫胶红、姜黄、 栀予黄、红花黄、菊花黄浸膏、栀子蓝、叶绿素铜钠、可可壳红、胡萝卜素、 焦糖色红米红、黑豆红、玉米黄、落葵红、黑加仑红、沙棘黄、玫瑰茄红、橡 子壳棕、桑椹红、天然芥菜红、金缨子棕、姜黄色、蓝靛果红、藻蓝、植物炭 黑、密蒙黄、茶绿色、柑桔黄、胭脂树橙、胭脂虫红等拶j 。 天然食用色素的种类有很多，根据其主要原料资源可分为：植物天然食用 色素资源、动物天然食用色素资源和微生物天然食用色素资源等1 9 】，我国目前研 究和应用最多的是植物天然食用色素资源。植物天然食用色素按化学结构式分 类，大体可以分为以下几类：( 1 ) 类胡萝卜素类，如栀子黄色素、辣椒色素、 胡萝卜色类等；( 2 ) 花色苷类，如玉米色素、葡萄色素、玫瑰茄色素等；( 3 ) 查尔酮类，如红花黄( 红) 色素、菊花黄色素等；( 4 ) 黄酮类，如高粱色素、甘草 色素、可可色素等；( 5 ) 醌类，如胭脂虫色素、虫胶色素、茜草色素、紫草根 色素；( 6 ) 叶琳类，如叶绿素等；( 7 ) 甜菜花青类，如甜菜红色素；( 8 ) 双酮 类，如姜黄色素【l o 】。 由此可见，天然食用色素种类繁多，发展前景很大。与人工合成食用色素 相比，其优点主要表现在【l l j ： ( 1 ) 天然食用色素安全性高，基本无毒副作用。人工合成食用色素由于其 制备和分离的特殊要求，因此很难保证其食用的安全。人工合成食用色素本身 对人体的危害通常表现为一般毒性和致癌作用，这都是由于人工合成食用色素 2 本身或者其在人体内的代谢产物产生的。另外就是在制备人工合成食用色素的 过程中分离提纯不完全，其中含有了苯酚、苯胺等物质对人体造成毒害【l2 1 。 相比之下天然食用色素基本都是由动、植物本身合成，人们利用不同的提 取分离方法将其从动、植物的组织中提取出来，因此天然食用色素的安全性普 遍较高，也为人们所信赖。 ( 2 ) 大部分天然食用色素含有人体所需要的营养物质【1 3 1 。由于天然食用色 素来源于自然界，这不但使其在安全性上优于人工合成食用色素，而且天然食 用色素大部分都具有一定的营养价值，这是人工合成食用色素所无法相比的。 例如，由栀子中直接提取得到的栀子黄色素，是一种非常罕见的水溶性类胡萝 卜素，在人体内极易被吸收利用，转化成维生素a ，补充人体的维生素不足；从 红藻和蓝藻中提取的藻蓝色素属于蛋白质结合色素，其中氨基酸组成比例非常 合理，并且八种营养必需的氨基酸含量都超过或接近f a o ( 联合国粮食及农业 组织) 的推荐的标准【1 4 】，此外日本的研究人员发现藻蓝还可以和铁形成可溶性 化合物，提高了人体对铁的吸收【1 5 j 。 ( 3 ) 有的天然食用色素还具有药理作用，能对疾病有治疗预防的作用i l 6 j 。 例如，栀子黄色素就有类似于栀子的药理作用，主要表现在凉血利胆，清热祛 火，降低胆固醇等作用，另外制备栀子蓝色素的主要原料栀子苷还具有保肝利 胆的作用；卜胡萝卜素不但是自然界中广泛存在的天然食用色素，而且其在预 防癌症和抑制癌症方面有明显的作用【1 7 】，同时在预防心血管疾病上也有一定的 作用 1 8 】。 ( 4 ) 天然食用色素色调自然。天然食用色素与人工合成食用色素相比，其 所呈现的颜色更加自然，能够更好的模仿自然界天然产物的颜色，增加人的食 欲，促进消费者的购买欲望i l 引。 当然，天然食用色素的优点是突出，但是就其目前的使用情况来看，缺点 也是很明显的，主要表现在【1 1 j ： ( 1 ) 部分天然食用色素稳定性较差，对光、热、氧、金属等敏感。天然食 用色素稳定性差是由其自身结构所决定的，由于大多数天然食用色素都含有可 以被氧化基团( 如不饱和双键等) ，可以与空气中的氧发生反应，被氧化后而褪 色。光照也会对天然食用色素产生影响，例如番茄红素在室内自然散射光的照 射下8 d 后全部褪色，而在室外太阳光的直接照射下8 h 颜色就褪色完全了 2 0 j 。 金属离子影响要区别对待，因为有的可以使天然色素稳定性降低，有的则可以 概述 加强其稳定性，例如，黑加仑色素在a 1 3 + 、c u 2 + 、f e ”存在的条件下稳定性变 差，而在n a + 、c a 2 + 、m 9 2 + 中则会增强稳定性【2 1 1 。另外，关于栀子黄色素的稳 定性，有些添加栀子黄色素的产品在存放一定时间后变成绿色，这不是因为栀 子黄色素本身发生了改变，而是由于色素的提取纯度不够，其中栀子苷含量过 高导致栀子蓝色素生成，在黄色和蓝色的调配下呈现出绿色。 ( 2 ) 大多数天然色素着色力较差，着色不易均匀。天然食用色素着色力差 是相对于人工合成食用色素的，人工合成食用色素使用剂量小并且不容易褪色， 因此着色力强；而天然食用色素使用剂量大且容易褪色，着色力差。 ( 3 ) 天然色素对p h 值变化十分敏感，色调会随之发生很大变化。例如， 花青素类的天然食用色素受p h 值的影响就十分明显，p h 值小于7 时为红色， p h 值在7 至8 时为紫色，p h 值大于1 1 时为蓝色瞄j 。 ( 4 ) 天然色素种类繁多、性质复杂，就一种天然食用色素而言，相对于人 工合成食用色素，应用时范围较窄。 因此才需要人们不断地探索发现，研究出更好的天然食用色素来。 1 1 3 我国与全球天然食用色素的现状与展望 近年来，天然食用色素在国际市场上销售额的年增长率一直保持在1 0 以 上【2 3 1 。市场上对天然食用色素的需求量正在逐年上升，天然食用色素的发展前 景巨大1 2 4 1 。 在国际上，对天然食用色素的开发和使用最先进的国家是日本，日本在1 9 9 5 年天然食用色素就已经达到5 0 多种，使用量达到2 3 6 0 4 吨，而人工合成色素仅 为1 8 6 吨f 2 卯。其次是美国，早在1 9 7 6 年美国的天然食用色素使用量就为4 5 0 0 吨，是当时人工合成色素使用量的5 倍【2 酬。 我国目前仍然处于天然食用色素与人工合成食用色素并存的状况，但是天 然食用色素的发展越来越快，仅国家“七五”重点科技攻关项目就开发了4 种天然 食用色素新产品。我国允许生产和使用的天然色素有4 0 余种，生产厂逾百家年 产量超万吨，生产和使用的主要品种是焦糖色素，约占天然食用色素总量的 7 0 t 2 7 1 。 我国植物资源丰富，部分植物资源经人们长期食用，营养丰富、无任何毒 副作用，这是我国大力发展天然食用色素有利的原料保障。此外，随着近些年 来人们对食品安全意识的不断增加，使用天然食用色素制备的食品也倍受消费 4 者的青睐，这使得天然食用色素的市场前景变得更加广阔。2 0 0 3 年我国天然食 用色素的产量已经是人工合成食用色素的2 l 倍【2 8 1 ，相信在不久的将来这种绿 色、健康”的食用色素必将大有作为。 1 2 1 栀子 1 2 栀子和栀子系列色素 图1 1 栀子果实 f 适1 1 t h ef r u i to f g a r d e n i a 栀子是茜草科植物栀子( g a r d e n i aj a s m i n o i d e se l l i s ) 的成熟果实，为常用中 药，具有泻火除烦、清热利尿、凉血解毒的功效【2 9 1 ，在我国用于临床治疗已有 1 6 0 0 多年历史，在中医临床常用于治疗黄疸型肝炎、扭挫伤、高血压、糖尿病 等症，属卫生部颁布的首批药食两用资源。 栀子中化学成分复杂。经分析栀子中含环烯醚萜苷类( 栀子苷、羟异栀子苷 等) 、二萜类化合物( 藏红花素、藏红花酸等) 、三萜类化合物( 栀子花甲酸、栀子 花乙酸等) 、黄酮类化合物( 栀子素a ，b ，c ，d ，e 等) 、有机酸酯类 绿原酸、3 , 4 二咖啡酰5 ( 3 羟基3 甲基戊二酰) 奎尼酸等 、挥发油类( 醋酸苄酯、苯甲酸甲酯、 橙花叔醇等) 、多糖、胆碱、熊果酸及各种微量元素【3 0 】。其中栀子苷在各种环烯 醚萜苷中含量最高，是栀子中主要有效成分之一，其不但具有镇痛、缓泻、抗 炎、利胆、治疗软组织损伤和抑制胃液分泌等药用价值，同时也可以作为治疗 心脑血管、肝胆等疾病及糖尿病的原料药物，并且以栀子苷为底物经过p 葡萄 糖苷酶水解可制备天然食用色素栀子蓝色素，在日本已经商业化【3 。 1 2 2 栀子系列色素 栀子系列色素主要包括【3 2 】：栀子黄色素、栀子蓝色素、栀子红色素，而通 5 概述 过这三种代表三原色的色素又可以调配出其他很多不同的颜色，因此栀子可谓 是生产天然食用色素极佳的原料。 在栀子黄、蓝、红色素中，栀子黄色素是由栀子果实直接提取纯化的，在 提取栀子黄的同时也提取了生产栀子蓝、红色素的重要原料栀子苷。栀子蓝、 红色素属于栀子黄色素的下游产品，生产工艺也相对复杂，两者都是以栀子苷 为原料经过微生物发酵水解制备。而天然红色素在自然界中存在广泛，如辣椒 红、番茄红等，生产工艺也相对简单，故生产栀子红色素不如栀子蓝色素的生 产更有前景。 目前，天然蓝色素的来源还很有限，我国允许使用天然蓝色素有五种，分 别是从栀子、螺旋藻、念珠藻、紫甘蓝、链霉菌中提取的蓝色烈3 3 1 ，因此有必 要开发新品种的天然蓝色素和改进已有生产工艺来增加天然蓝色素的产量，满 足消费者的需要。本文就是对已有的栀子蓝色素生产工艺进行改进，以提高其 产品质量，降低成本，并适应工业化生产。 下面分别对栀子黄、蓝色素进行介绍： ( 1 ) 栀子黄色素栀子黄色素在栀子中的含量比较丰富，其约占栀子果实 重量的1 0 ，它是世界上唯一存在的水溶性类胡萝卜素3 4 1 ，为橙黄色粉末，无 毒、安全性高，具有一定的营养和保健价值【3 5 】。栀子黄色素的主要成分是藏花 素( c r o c i n ) 和藏花酸( c r o c e t i n ) 【3 6 1 ，其水溶液在紫外可见光区内最大吸收峰在 4 4 0 n m 附近【”1 。藏花素和藏花酸的分子结构式见图1 2 。 弘邓咖弘掣， o 丫k k 飞o o 啪少弧人a 1 代吖咖h 乜锄 也 幽，幽， 藏花素藏花酸 图1 2 藏花素和藏花酸结构式 f i g 1 2 t h es _ 仃u c n l r eo fc r o c i na n de r o c e t i n ( 2 ) 栀子蓝色素栀子蓝色素是采用生物工程技术制得的一种安全、无毒 副作用的天然食用色素【3 8 】，为深蓝色粉末，易溶于水，我国于1 9 9 0 年在制定新 增食品添加剂的使用卫生标准时将其列入，用于蛋白质、糖和淀粉等食品染色 【3 9 1 ，特别是在配制酒的生产中，栀子蓝是石榴红等复配色素中不可缺的成分【4 0 】。 6 概述 早在上个世纪8 0 年代f u j i k a w a 等就发现，在p 葡萄糖苷酶f 4 2 】催化条件 下，一分子的栀子苷会被水解生成分子的葡萄糖和一分子的栀子苷元，如下 图所示。继而栀子苷元与氨基酸反应生成栀子蓝色素。 图1 3 栀子苷水解反应式 f i g 1 3 t h er e a c t i o no f h y d r o l y z i n gg e n i p o s i d e 1 3 栀子系列色素的制备 1 3 1 栀子黄色素的制备 大部分天然食用色素的制备都可以分为两步，一步是提取，另一步是分离 纯化。从植物中提取色素的方法主要有：溶剂提取法、超声提取法、酶反应法、 超临界萃取法等方法【l o 】。对提取物进行纯化的方法主要有：c 0 2 超临界法1 4 3 1 、 凝胶层析法心】、超滤法【4 5 1 、吸附法【4 6 】等。 一在本项目的前期工作中，张富芳等【4 7 】以溶剂提取法，结合大孔树脂吸附法 纯化对栀子黄色素进行精制取得较好的效果，得到高品质的栀子黄色素。其制 备栀子黄色素的实验流程如下： 7 西洲 分离 吸附后余液栀子苷 图1 4 栀子黄色素实验流程图 f i g1 4 t h ee x p e r i m e n tf l o wc h a r to fg a r d e n i ay e l l o w 由上图可以看出，在制备栀子黄色素过程中，首先通过溶剂浸取法，得到 浸取液，浸取液中除了含有大量栀子黄色素，还含有栀子苷、果胶、绿原酸、 多糖等成分。然后利用大孔树脂对浸取液进行纯化，大孔树脂吸附了大量的栀 子黄色素，余液中就主要含有栀子苷、果胶、绿原酸、多糖和少量栀子黄色素。 再将其分离可以得到含有大量栀子苷的溶黼文称为栀子黄废液，是制各栀子 蓝色素的主要原料之一。 1 3 2 栀子蓝色素的制备 我国关于栀子蓝色素的研究起步较晚，目前，国内关于栀子蓝色素制备的 报道不多。栀子蓝色素的制备方法可以归纳总结为两种：一种是在培养基中直 接加入粉碎后的栀子果实，将发酵水解与合成一步完成【4 引，此种方法不但产品 质量不高，而且还造成了栀子黄色素的浪费；另一种方法被称为两步法，将栀 子苷的水解与栀子蓝色素的合成分开，以提高栀子蓝色素的质量 4 9 1 5 0 l 。 虽然制备栀子蓝色素有两种不尽相同的方法，但是不难看出栀子蓝色素的 制各过程中必不可缺的两步：一步是水解，就是在酶做催化剂的条件下将栀子 8 概述 苷水解为栀子苷元；另一步是合成，就是在一定条件下栀子苷元与氨基酸反应 生成栀子蓝色素。 在直接发酵法中，水解与合成是同时进行的，这种方法虽然操作简单，但 是得到的产品多灰暗泛绿或偏紫并且收率低。两步法在工艺上对直接发酵法进 行改进，将栀子苷的水解与合成栀子蓝色素分开进行，既可以提高栀子蓝的品 质有增加了收率。但是两步法是采用游离酶水解，在水解过程还属于间歇操作， 这样不利于栀子蓝色素的连续化、工业化生产。 因此，本课题对栀子苷水解过程进行优化，选用固定化酶技术来水解栀子 苷，为栀予蓝色素的连续化工业生产奠定基础。 1 4 固定化酶技术 1 4 1固定化酶技术的发展 酶( e n z y m e ) 是由生物体内活细胞产生的一种生物催化剂，大多数由蛋白 质组成( 少数为r n a ) ，大多数酶是水溶性的。酶可以在机体内温和的条件下， 高效率地催化各种生物化学反应，促进生物体的新陈代谢。由于酶的这种催化 反应具有底物专一性、催化高效性、反应条件温和等优点【5 1 1 ，已在很多领域得 到广泛应用。虽然酶催化反应具有很多优点，但是缺点也很明显，例如：酶的 稳定性差，容易失活；酶催化反应后，难于回收再利用，不利于连续化生产； 需要对产物进行纯化处理，增加产品成本等【5 2 】。因此，为了避免以上缺点，提 高酶的利用率，酶的固定化技术应运而生。 固定化酶技术始于上个世纪初，最早人们发现酶在不溶于水情况下同样具 有活性的现象，但是直到在19 5 3 年g r u b h o f e r 和s c h l e i t h 首先将羧肽酶、淀粉糖 化酶、胃蛋白酶、核糖核酸酶等结合在修饰过的聚苯乙烯树脂上，实现了酶的 固定化【5 4 】。并且在1 9 7 1 年的第一届国际酶工程会议首先提出“固定化酶”这名 称并被采用【5 4 1 。我国在固定化酶技术方面的研究始于1 9 7 0 年，首先是微生物所 和上海生化所的酶学工作者同时开始了固定化酶的研究工作【5 3 1 ，后来国内许多 单位相继开始了固定化酶的应用研究。 固定化酶( i m m o b i l i z a t i o no f e n z y m e ) 技术是用固体材料将酶束缚或限制在 一定区域内进行酶催化反应，仍能进行其特有的催化反应，并且可以重复利用 的一类技术【”】。 9 概述 1 4 2 固定化酶的优点 固定化酶技术的出现相比传统的游离酶还是有了很大进步，其优点如下： ( 1 ) 游离酶对热、酸、碱、有机溶剂等稳定性差，易于失活，而固定化酶 稳定性高。 ( 2 ) 固定化酶的利用率高，容易与底物分离，可回收重复使用。 ( 3 ) 产物容易纯化，反应生成物中无残留酶和残留的培养基成分。 ( 4 ) 可实现连续化和自动化生产。 因为固定化酶具有以上优点，所以在现代工业中被广泛应用，尤其是在食 品工业中，例如在果汁生产中利用固定化果胶酶澄清果汁【5 5 1 ，生产代可可脂过 程中利用固定化酶改性棕榈油【5 6 】【5 7 1 ，利用固定化酶连续生产低乳糖牛奶来解决 人体对牛奶中乳糖的不良反应【5 8 】等。 本文选用固定化酶来水解栀子黄废液中的栀子苷，其与传统的游离酶相比， 在制备栀子蓝色素的过程中具备以下特点： 1 微生物在发酵过程中分泌的酶将培养基中的多糖分解成单糖。在一定的条 件下，这些单糖能与某些氨基酸作用，生成棕红色的氨基糖【5 9 】。因此，固定化 酶可以避免向水解液中引入多糖及其他物质，这样既保证栀子蓝色素颜色的纯 正，又提高了栀子蓝色素的色价。 2 传统的游离酶制备栀子蓝色素，水解结束后都要对水解液中的酶进行灭 活，而固定化酶因其易与底物分离的优越性，既简化了生产步骤，同时也节约 了生产成本。 3 固定化酶的可重复使用大大降低了栀子蓝色素的生产成本，也为栀子蓝色 素在工业上连续化、自动化生产提供必要的前提条件。 1 4