（食品科学专业论文）平贝母生物碱的提取纯化及体外抑菌活性的研究.pdf

摘要 平贝母是我国东北地区常见的一种天然药用植物资源，为百合科贝母属植物。平贝母主要功 效成分为生物碱，这些生物碱有明显的镇咳、祛痰、平喘等功效，对呼吸道疾病有较好的治疗作 用。因此深入研究平贝母的功效成分的提取、纯化及其功效评价可为医药及保健食品加工提供技 术参考，并对进一步开发利用这一资源起到较好的促进作用。 本课题来源于黑龙江省科技攻关项目：北药功能成分的提取在保健食品中的应用研究( 编 号为g c 0 4 c 5 0 1 0 2 ) ，以黑龙江地产平贝母的干燥鳞茎为研究对象，对平贝母中总生物碱的提取、 分离纯化、体外抑菌活性进行了研究，主要研究内容及结果如下： 1 平贝母中生物碱含量测定方法的研究 用酸性染料比色法对平贝母样品中总生物碱的含量进行了测定，测定结果：平贝母样品中总 生物碱含量为o ，2 3 6 。用高效液相色谱一蒸发光散射检测器法( h p l c - e l s d ) 对平贝母样品中 主要的生物碱单体含量进行了测定，测定结果：平贝母样品中贝母素甲含量为o 0 1 3 2 ，贝母素 乙含量为o ，0 1 8 1 。 2 平贝母中总生物碱提取技术的研究 应用溶剂提取法和超临界二氧化碳萃取法提取平贝总碱，并将这两种方法进行了优化。 溶剂提取法先采用单因素试验，分析了乙醇浓度、提取时间、料液比和浸提时间对平贝总碱 提取率的影响，然后采用均匀试验设计法优化了平贝总碱的提取工艺参数，确定出最佳提取方案 为：乙醇浓度9 5 、提取时间6 h 、料液比1 ：9 、浸泡时间1 h ，在此条件下平贝总碱提取率为8 7 1 2 。 超临界二氧化碳萃取法先采用单因素试验，确定了萃取压力、萃取温度、携带剂种类、携带 剂用量和c 0 2 流量等单项条件对平贝总碱提取率的影响，然后采用正交试验优化了平贝总碱的 提取工艺参数，确定出最佳提取方案为：萃取压力2 0 m p a ，携带剂用量3 0 0 l l ，萃取时间2 h ， 萃取温度4 5 ，c 0 2 流量2 0 k g m ，分离压力8 m p a ，分离温度4 0 ，在此条件下平贝总碱萃取 率为9 2 1 4 。与溶剂提取法进行比较，超临界二氧化碳萃取平贝总碱的提取率是溶剂提取平贝 总碱提取率的1 1 倍。 3 平贝总碱体外抑菌试验的研究 采用纸片扩散法考察了平贝总碱对几种常见呼吸道致病菌( 金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、克 雷伯氏肺炎杆菌、铜绿色假单胞杆菌) 的体外抑菌作用，用琼脂平板稀释法测定了平贝总碱对这 几种致病菌的最低抑菌浓度。试验结果表明：平贝总碱对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、克雷伯氏 肺炎杆菌、铜绿色假单胞杆菌均有一定的抑菌作用。对克雷伯氏肺炎杆菌的最低抑菌浓度为 2 5 m 驴n l ；对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、铜绿色假单胞杆菌的最低抑菌浓度为5 m 加n l 。 4 平贝总碱分离纯化技术的研究 采用硅胶干柱层析法对平贝总碱进行分离纯化，分离出贝母素甲和贝母素乙。固定相为薄层 层析硅胶g ，流动相为乙酸乙酯一甲醇氨水( 1 7 ：2 ：1 ) 。用h p l c e l s d 法对分离出的贝母素甲和 贝母素乙的纯度进行了测定。测定结果：贝母素甲纯度为9 3 1 9 、贝母素乙纯度为9 2 0 9 。 关键词：平贝母，平贝总碱，提取，体外抑菌，分离纯化，硅胶柱层析 a b s t r a c t 蹦t i l l a r i au s s u r i e n s i sm a x 油i sp l a n to ffl i l i a c e a ea n di tw i d e s p r e a dn a t 啪l l yi nn o n l i e a s t c h l m t h eb u l b sc o n 乜ma l l c a l o i d si n 酽e d i e n 谯，i ti sk n o w nt h a t 也e 出a l o i 如h a v eb e e nu s e di i l r e l i e v i l l gc o u 曲，r e m o 啊n g 山ep h l e g m 柚dr e l i e v i n ga s m m a t h e r e f o r e ，i ti ss l g r d f i c a n ts n l d i e sf o r m e d i c i l l ea n dh e a l 吐lf o o dp m c e s s i n g 1 1 1 es t l l d i e sa r es u b s 诎z e dh e i l o n d i a l l gs c i e n c ea n dt e c l 】i l o l o h yb u r e a u 1 1 1 ei t e m sn 蛐ei st h e a p p l i c a t i 衄s t u d i e so ne x 仃a c 虹o no fe 圩e “v ec 叫l p o s i b o n s “b e i y a 0i nh e a l t h yf o o d ( n o g c 0 4 c 5 0 1 0 2 ) i l l l i sp a pe r 血ee x t r a c t i o n ，s e p a 糟t i o n ，p 面f i c “0 na 1 1 d b a c t e r i a i 幽b i 血gi nv i 们o f a l l 【a l o i d s 劬md r i e d b u l bo f 州t i l l a r i au s s 埘e 1 1 s i sm a x i i i lw e r ei n v e s t i g a t e d 1 1 1 em a i nc o n t e n t sa i l d r e s u l t sw e r ea sf b l l o s ： 1 s t l l d i e s0 nd e t e 皿m a t i o nm e 廿1 0 d so f m ec o n t e n to f a u ( a l o i di nf r i 证n a r i au s s u r i e i 晤i sm a ) 【i l l l t h ec o n t e n to f t h et o t a la l k a l o i d si i l 州硼l 撕au s s u r i c l l s i sm a x i l nw a sd e t e m 曲e d b yt l l ea c i dd y e c o l o r i m e 自r vm e t l l o d ns h o w e dm a tt h ec o n t e l l ti so 2 3 6 t h ec o n t e n to fa l k a l o i d a lm o n o m e r sw a s d e t 铋商n e db yh p l c 也l s d t h ec o n t e n 坞i nd i i e db u l bo fp e i 曲e ，p e 蛐1 ea r eo 0 1 3 嬲，o 0 1 8 1 r e s p e c t i v e l y 2 s m d j e so nt l l ee x t r a c 石0 nt e c l l l l 0 1 0 科o f t l l et o t a la l k a l o i d si nf r 跏1 a r i au s 叫j e l l s i sm a x 而 s o l v e me x 在a c n o nm e t h o da 1 1 ds f e c 0 2m e 也o dw e r cu s e di n 廿l ee x 皿c 缸o no f l et o 诅la l k a l o i d s i n 蹦t i l l a r i au s s 面e n s i sm a x i i i ia n dw e r eo p 咖z e d t b0 p 埴m i z e dm es 0 1 v e n te x t r a c t i o nm e t l l o d ，l h es i l l d ef a c t o re x p e r i m e n tw 踮f i r s u yu s e dt os t i l d y t 1 1 ee f r e c t so fe t h a n o lc o n c e n 仃a t i o n ，e x 订a c t i i l g 矗m e ，w e i g h ts o l v e n tr a 虹oa n ds t e 印m gt i m e s d b s e q u e n t l y l l l eo p 畦m a lp a r a m e t e r so fe x 缸枷o nw e r eo b h i n e db ym ew e l l d i 8 仃i b u t e dd e s i g n ： e m a l l o 】c o n c e l l 仃址i o n9 5 ，e x 姐c t i i l g 血1 e6 h ，w c i g h ts o l v e mn t i o1 ：9a l i ds t e 印i n gt i l l l e1 h 1 1 1 e e x n _ c d o nr a t i ow a s8 7 1 2 u n d e r 也i sc o n d “i o n t 00 p 缸l i z e ds f e c 0 2r n e m o d ，吐屺s i n 出丘l c t o re x p e r i r n e n tw a sf 弧u yu s e dt os t u d ye x 曲g p r e s s u r e ，e x t r a c t i n gt e l p e r a t i l r e ， e n t r a i l l e r s k i n d s ，e n t r a i n sd o s a g e sa n dc 0 2v 0 1 啪e s u b s e q u e m l y ，t l l e0 p 矗m a lp a r 锄e t e r so fe x 昀c t i o nw e r eo b t a 沁db ym eo n l l 0 9 0 n a l t e s t ：e x m l c n n g p r e s s u r e2 0m p a ，e n 们_ i i l e r sd o s a g c s3 0 0m l ，e x 廿a c 缸n gt i m e2 h ，e x 们c t i l l gt e m p e n m r e4 5 ，c 0 2 v o h n e2 0 k g m ，s e p a r a 曲np r e s s u r e8m p a ，s 印a r 撕o nt e 砷c r a t u r e4 0 w i t l l1 1 1 e s ec o n d i 缸蚰s ，m e e x n a c b o nr a h oc o u l dr e a c h9 2 1 4 w l l i c h w a s l 1 协n e so f a l c o h o le x 自r a c t i o n i n e t h o d 3 s t u d i e so nt l l eb a c t e 抽i 1 1 l l i b i 石n gi nv i 仃oo f t o t a la l k a l o i d si n 确t i l l 撕au s 汕j e l l s i sm a x i n l b a c t e r i a i n i 嘶gi nv i 劬o ft o t a la l k a l o i d s 证蹦m l a r i au s s 嘣e n s i sm a x i mw e r et e s t e do n s 钮p h y l o c o c c l l sa u r e l l s ，e s c 姒c h i ac “，e b s i e l hp n e u 啪n i a e p s e u d o m o t l a sa e m 西n o s a 吐l r o u 曲m t e r p a p e rn l e t h o d m i n i i i l a li i l l l i b i t o r yc o n c e n 仃a t i o n ( m i c ) o ft o t a l a l k a l o i d s ：i 1 if t i l l 撕au s s u i i e n s i s m a x i n lw e r ed e t e r 蚰 1 i n e d 吐l o u g hs t e r i l ea g a rp l a t ed i l u t i o nr r l e t l l o d ns h o w e dt 1 1 a tt o t a la 1 1 ( a l o i d si 1 1 蹦t i n a r i au s s 嘶e n s i sm a x 曲w e r ee 疵c n v eo ns 协p h y l o c o c c u s 删s ，e s c h r i c h i ac o h ，础e b s i e l l a p n e m n o n i a e ，p s e u d o m o n a sa e m g i l l o s a i ts h o w e dt 1 1 a t t 1 1 em i co ft o t a la l k a l o i d s 抽蹦m l a a u s s u r i e l l s i sm a x i ma g a i n s tk l e b s i e l l ap n e u m o n i a e ，a s25 m g ，l l t h em i co ft o t a la l k a l o i d sm i i 蹦m 1 撕au s s u r i e n s i sm a x i ma g a i n s ts t 印h y l o c o c c u sa u r e u s ，e s c c h l ac o l i ，p s e u d o m o n a sa e n l 百n o s a w a s5 m m l 4 s t i l d i e so nt h es 印a r a 石o na n dp 耐6 c a d o nt e c 量】1 1 0 l o g yo f 也et o t a l a l l a l o i d si n 确t i l l 删a u s 嘶e n s i sm a x i m s 疵ag e lv 0 1 啪el a y e rc l - o m a t o 舯p h yw a su s e dt os e p 啪t et o 瑚a l k a l o i d si n 蹦d l l 撕a u s s u r i e n s i sm a 】【i r 工1 p e i i n ea n dp e i i l 血ew e r es e p a r a t e d s o l i dp h a s e ：t l l i nl a y e rc h a t o g r a p hs l l i c ag e l m o b i l ep h a s e ：e 1 y 1a c e 诅t e r n e 廿1 a n o l 一籼o n i a ( 1 7 ：2 ：1 ) t h ep 1 1 r i t yo ft l l e m 他r ed e t e 删n e db y h p l c e l s d 1 1 1 ep u r i t yo f p e i i l i n ei s9 31 9 t h ep 面t yo f p e i i l i n ei s9 2 0 9 k e yw o r d s ：两埘l a r i au s s 删e l l s i sm a x i m ，t o t a la l k a l o i d si nf r i t i l l 撕au s s u l l e n s i sm a x 峨e x t r a c t i o n ， b a c t e 血一i n h i b i t i n g i n v i 廿o ，s 印a r a t i o n a n d p u r i f i c a t i o n ， s i l i c a g e lc o l u 珊1 c h r o r r m t o g r a p h y i i i 独创性声明 本人声明所呈交的论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成 果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其它人已经发 表或撰写过的研究成果，也不包含为获得黑龙江八一农垦大学或其它教育机构的学位 或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中 作了明确的说明并表示了谢意。 研究生签名：互确氛 时间：二卯缉月，日 关于论文使用授权的说明 本人完全了解黑龙江八一农垦大学有关保留、使用学位论文的规定，即：学校有 权保留送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅，可以采用影印、缩印或扫 描等复制手段保存、汇编学位论文。同意黑龙江八一农垦大学可以用不同方式在不同 媒体上发表、传播学位论文的全部或部分内容。 ( 保密的学位论文在解密后应遵守此协议) 研究生签名：互确笊 时间： 上卯缛，月穸日 导师签名：足七鱼、老 时间：工的占年月。丫日 黑龙江八农垦大学硕士学位论文 第一章文献综述 第一章文献综述 1 1 引言 中医药是一个伟大宝库，它蕴含着中华民族几干年医疗实践经验体现了中华民族的崇高智 慧，为中华民族的繁衍生息做出了巨大贡献，并仍将在全人类的健康事业中发挥越来越重要的作 用。随着人们对医药保健要求的不断提高，回归自然的呼声日益高涨，传统医学及天然药物在世 界范围内得到前所未有的重视和应用。中药及天然药物的开发已成为世界各国新药开发的新热 点。近年来，在临床实践中，人们逐步认识到化学药物毒副作用大，药源性疾患逐渐增多而天 然药物毒副作用小，特别是对那些难治的疑难杂症，中药更具有其独特的效果。因此在全世界药 品市场上天然药物的需求日盏扩大，对中药和中药制品的需求也在迅速增大。 中药之所以能防治疾病，是因其含有治疗疾病的化学物质。中药中古有各种各样的化学成分， 这些化学成分一部分是构成植物细胞的化合物一部分为细胞中的后含物，即细胞的新陈代谢产 物。中药能起治疗作用的化学成分主要是一些次生代谢产物，如生物碱、黄酮类、强心甙、皂甙、 萜类、香豆素、挥发油等i ”。天然药物是药物的一个重要组成部分，人类自古蚍来，在与疾病斗 争过程中，通过以身试药、日积月累，对天然药物的应用积累了丰富的经验。在中国，天然药物 主要是中草药，更具有自己的特色，与中医一起构成了中华民族文化的瑰宝，是中华民族五千年 来得以繁荣昌盛的一个重要原囡，也是全人类的宝贵遗产。 黑龙江是我国北方地道药材资源的富集区，素有北药宝库、东北地道药材的美誉。全国中药 普查调查近l 万种中曲药材中，黑龙江占1 0 以上( 一千多种) ，已探明的药材蕴藏量为2 7 亿公 斤叫。因此，开发北方地道药材具有重要的价值。 贝母( 蹦t i l l a n a ) 是来源于百合科( l i l i a c e a e ) 贝母属( 蹦曲a r i a l ) 中多种植物的鳞茎， 有悠久的使用肋史，早在汉代神农本草经中就有记载，列为中品，一般按其功能分为新贝与 川贝两大类，浙贝清热化痰，开郁散结；川贝清热润肺，化疲止咳”j 。平贝母僻u s s 吡c 1 1 s l s m a x 砷) 在临床上与川贝浙贝具有相同或相似的功效，具有镇咳、祛痰、平喘、抗菌消炎等功效，又园 其无性繁殖系数高于其它贝母【4 l ，因此在东北地区常用其代替川贝、浙贝。 在本课题研究过程中，以平贝母中具有药理作用的活性成分的化学结构为基础，以平贝母中 活性成分定量分析研究入手，对平贝母中的活| 生成分成分提取工艺、活性成分体外抑菌作用、有 效成分的分离纯化等方面进行了较为深入的研究。这对更好地阐明平贝母药效作用机理具有很好 的现实的意义，为深入开发利用平贝母资源有着积极的意义。 1 2 平贝母的研究现状 1 2l 平贝母的生态特性及资源分布 平贝母( 蹦h l l 耐a u s s u 五肌s i s m a m ) 为百合科贝母属j t i l l a r i a l l l l a c e a e ) 植物是一种多年生 草本植物。多用其干燥的鳞茎入药，又名甲贝，为中国药典收载品种旧。平贝母是须根系，频根 数量少、短而细弱，喜生在疏松肥沃的中性或微酸性土壤中- 如新林土、腐殖土、油沙士等a 在 豆茬含氮量高的土壤中栽培平贝母，其生物碱含鼋也高。平贝母不耐盐碱，碱性土壤或碱性肥料 豆茬含氮量高的土壤中栽培乎贝母，其生物碱含量也高。平贝母不耐盐碱，碱性土壤或碱性肥料 黑龙江八一农垦大学硕士学位论文 第一章文献综述 不利于平贝母的生长，土壤含水量以3 0 4 0 为宣。 平贝母喜冷凉湿润的环境条件，在春季的3 月下旬至4 月上旬，平贝母就冒寒出苗，逐渐长出 地面。当气温1 3 1 6 时生长旺盛。5 月份就先后开花了。当气温至2 8 3 0 时，其生长受到抑 制，到5 月下旬至6 月上旬地上部分开始枯萎，地下鳞茎进入休眠状态。休眠至8 月中、下旬又开 始了一年中的第二次萌动，此时在鳞片上会长出后代子贝母。直到上冻结冰，又进入年中的第 二次休眠。平贝母这种两季生长、两季休眠、生长繁殖慢的生物学特性，在植物中还是不多的【6 j 。 平贝母成品呈扁球形，高o 5 1c i i l ，直径0 6 2 c m 。表面乳白色或淡黄白色。外层鳞叶2 瓣， 肥厚，大小相近或一片稍大抱合，顶端略平或微凹入，常稍开裂；中央鳞片小。质坚实而脆，断 面粉性。气微，味苦。其粉末类白色【”。 平贝母主产于黑龙江、吉林、辽宁三省，其中黑龙江的主产区为阿城、宾县、五常、尚志、 苇河、亚布力、牡丹江、海林、宁安、东京城、穆棱、密山、虎林、庆安、铁力、伊春等2 0 多个 市县；吉林的主产区为榆树、舒兰、蛟河、桦甸、靖宇、抚松、浑江、敦化、安图、延吉、长白 山等1 8 个市县；辽宁的主产区为本溪、凤城、清原、新宾、西丰、宽甸、岫岩等1 0 余个市县。 平贝母的种植面积和产量近几十年逐年上升，由2 0 世纪8 0 年代的6 7 0 公顷骤增至1 3 0 0 0 公顷， 产量也随之由年产1 5 0 吨狂增至1 5 ，0 0 0 吨，增幅高达百倍之巨。2 0 0 5 年平贝母的种植面积超过 1 6 ，o o o 公顷，产量也再次跃上新台阶，达到1 6 ，0 0 0 吨2 0 ，0 0 0 吨，创历史新高，这其中以黑龙江 的产量最多，其次为吉林和辽宁。在2 0 0 5 年的总产量调查当中，黑龙江韵总产量约为9 0 0 0 吨 l o ，0 0 0 吨：吉林的总产量约为5 ，0 0 0 吨7 ，0 0 0 吨；辽宁的总产量约为2 ，0 0 0 3 ，0 0 0 吨。 1 - 2 2 平贝母化学成分 贝母化学成分最早的研究报道于1 8 8 8 年，德国弗拉格纳( k f m 印e r ) 首先从德旺贝母 ( f r i t i l l “ai 删) e a l i s ) 中分离到帝贝灵( h n p e r i a l i n e ) 【7 】o 从此，植物化学工作者就以贝母的碱 性成分为对象对许多种贝母进行了研究。但在较长的一段时间内都停留在化学式或功能团的测 定，化学结构尚不清楚。我国学者朱子清从1 9 3 2 年开始研究贝母化学成分，其后经过二十多年 的努力，到五十年代中期才取得较大进展，用硒脱氢降解的方法确定了贝母异甾生物碱的骨架【8 】， 沟通了贝母生物碱与藜芦生物碱的关系，是结构研究中的一大突破。到印年代末，从浙贝母、 川贝母和伊贝母中共分离2 0 多种生物碱，但限于当时的技术条件，仅仅确定了西贝素 ( i 呷嘶a l i n e ) 、贝母素甲噼i m i n e ) 、贝母素乙( p e i n i l l e ) 、贝母辛( p e i i i l i s s i n e ) 和西贝素甙的结构。 7 0 年代末，国内外学者深入研究了1 6 种贝母属植物的生物碱成分，共分离得到6 0 多种生物碱。 贝母属生物碱的分离纯化技术和结构研究也有较大的发展【9 】。到9 0 年代末，已从3 5 种贝母中分 离得到大约1 4 0 多个化合物，其中异甾体生物碱占7 2 7 、甾体生物碱占n 5 、非生物碱类占 1 5 8 【1 0 。 平贝母植物体内化学成分十分复杂。所含的化学元素包括碳、氢、氧、氮、钾、钙、钠、镁、 铜、铁、锌、铝、锰、磷等l l “。所含的有机物除了生物碱外，还含有蛋白质、淀粉、生物碱甙、 腺嘌呤核苷、半乳糖醇、琥珀酸、胸苷、腺苷、核苷、挥发油、多糖等物质【1 2 。”。 平贝母很早就用来代替川贝母，但对其化学成分研究较少，仅在1 9 5 6 年陆仁荣等【”3 曾从平 贝母中分得一针状结晶，与贝母碱混合熔点不降低，由此人们才对研究平贝母化学成分引起重视。 2 黑龙江八一农垦大学硕士学位论文 第一章文献综述 徐东铭等f “”1 从1 9 8 1 年开始先后从平贝母中分得西贝素、贝母辛、平贝碱甲、平贝碱乙、平贝 碱丙、平贝碱甙、平贝啶甙、贝母甲素、西贝素甙。 船t a l n u r a ，y u h e 等【1 ”3 1 从1 9 8 8 年开始先后分离出6 种平贝母所特有的生物碱：乌苏里宁 ( u s s 嘶n i o e ) 、乌苏里啶( u s s u r i e d i n e ) 、乌苏里啶酮( u s s u r i e d i n o n e ) 、乌苏里酮( u s s u r i e n o n e ) 、平 贝酮口i i l 曲e i n o n e ) 、和黑龙贝母碱( h e i l o n i n e ) 。h i k a n lk 口”还发现平贝母中含有少量的茄啶 ( s o l a n i d i n e ) 、浙贝母碱甲( v e n i c i n e ) 、浙贝碱酮( v e 俺c i n o n e ) 和d e l 撕n e 。 1 2 3 平贝母生物碱的种类与结构 贝母属中的生物碱主要是异甾生物碱类( i s o s t e “o d 诎a l o i d s ) ，其与甾体生物碱( s t e r i o d a l k a l o i d s ) 相比，c 环上少1 个亚甲基，d 环上多1 个亚甲基，又称为c 。去甲- d 高甾体生物碱 ( c - n o r _ d h o m o s t e r o i da l k a l o i d s ) 。它是由1 ，2 苯芴和1 个含氮杂环骈和而成的一系列衍生物。 西 匕u 异甾生物碱类 甾体生物碱类 平贝母中的异甾生物碱按其杂环的结构可分为两个类型( 如图) ：瑟文类( v i n eg r o u p s ) ， 白藜芦碱类( j e r v i n eg r o u p s ) 。已分离出的平贝母主要生物碱如表1 一l 所示。 瑟文类 白藜芦碱类 c h 3早 黑龙江八一农垦大学硕士学位论文第一章文献综述 表1 。1 平贝母主要生物碱的类型及其物理常数 t a b l e1 - 1 t y p ea i 】dp h y s i cc o n s t 龃to f 鲥k a l o i d si nf r 矧l a r i au s s u r j e n s i sm a ) 【砷 1 2 4 平贝母生物碱的主要药理作用 1 2 4 1 镇咳、祛痰、降压作用 中国传统中医认为贝母具有清热、润肺、化痰、止咳作用。李萍等【2 5 】用平贝母、浙贝母等 1 1 种商品贝母的乙醇提取物部分和总生物碱部分，分别进行了镇咳作用和祛痰作用的实验。将 小鼠分别灌胃给药，再利用氨水引咳法，结果表明1 1 种贝母的总生物碱部分对小鼠氨水引咳均 有显著的镇咳作用，其中平贝母的乙醇提取物亦有显著镇咳作用，但总生物碱的祛痰能力则较弱。 汪丽燕等口”对贝母镇咳机制进行初步探讨，认为贝母抑制咳嗽中枢而不抑制呼吸中枢，这对治 疗慢性支气管炎并发肺气肿咳嗽者更为有利。此外，徐东铭等【l ”研究发现平贝母中的平贝碱甲， 具有明显的祛痰作用和降压作用。 1 2 4 2 平喘作用 哮喘是由于过敏原或其它非过敏因素引起的气管和支气管对各种刺激的反应性增高而导致 广泛的和可逆的气道狭窄。贝母的平喘机制一般认为与其松驰支气管平滑肌，减轻气管、支气管 痉挛，改善通气状况有关。杜少芬等2 1 研究发现川贝、平贝、湖北贝母等都具有明显的平喘功 效。 d 黑龙江八一农垦大学硕士学位论文第一章文献综述 此外，熊玮等口”发现贝母醇提物能明显提高小鼠常压耐缺氧能力，即能降低组织对氧的需 要量，这对哮喘病人也是有利的。 1 24 3 抗溃疡作用 平贝总碱对大鼠结扎幽门性溃疡、消炎痛型溃疡及应激性溃疡都有一定的抑制作用”。局 部溃疡的形成是胃壁组织被胃酸和胃蛋白酶消化的结果，这种自我消化过程是溃疡形成的直接原 因，因而平贝总碱抑制胃蛋白酶活性可能是其抗溃疡作用机制之一。 1 2 4 4 镇静、镇痛作用 平贝母浸膏对实验动物具有中枢神经系统抑制作用【2 9 1 。早在1 9 4 9 年张昌绍等通过对小鼠的 实验表明，指出贝母有中枢抑制作用。人们在研究中发现贝母素甲和贝母素乙在2 m g ，l ( g 的剂量 下能够减少小鼠自发活动，并能对抗咖啡因所致的活动次数增加，与氯丙嗪对抗咖啡因的作用相 协同。经研究证明，贝母素甲和贝母素乙能够延长小鼠戊巴比妥睡眠时间及提高睡眠率，小鼠腹 腔注射醋酸所致的扭体反应也有抑制作用 3 0 】。 1 2 4 5 抗菌作用 1 9 8 4 年熊玮等口8 曾报道川贝母醇提物对金黄色葡萄球菌和大肠杆菌有明显抑制作用。肖灿 鹏等p ”对贝母素甲和贝母素乙等几种贝母单体生物碱进行了体外抑菌实验，结果表明贝母素甲 对卡他球菌、金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、克雷伯氏肺炎杆菌有抑制作用，贝母素乙对卡他球菌、 金黄色葡萄球菌有抗菌活性。虽然贝母的抗菌活性较弱，但是对于治疗呼吸道感染是有帮助的。 1 2 5 生物碱的提取 生物碱的提取方法较多。常用的传统提取方法有煎煮法、回流法、连续回流法、浸渍法、渗 漉法等。近年来，随着科学技术的发展，新技术、新设备的不断出现，一些新提取方法已开始引 入中药提取的研究和开发，如超声波提取、微波提取、超临界流体萃取、膜提取、高速逆流色谱 提取、酶法、仿生提取、破碎提取、空气爆破法、液泛法、大孔树脂吸附分离和双水相萃取等。 这些新工艺的应用，与传统方法相比，具有产率高、纯度高、速度快、物耗、能耗少等特点使 得中药提取既符合传统的中医理论，又有着广阔研究和应用前景p 2 ，3 ”。 1 2 5 1 浸渍法 浸渍法是指将中药粗粉装入适当容器中，加入适当溶剂( 多用水或稀醇) ，以能浸透药粉稍 有过量为度，时常振摇或搅拌，放置一日以上过滤，药渣另加新溶剂，如此再提两次，第二、三 次浸渍时间可缩短，合并提取液，浓缩后可得提取物。浸渍法简便，是晟常用的方法之一。它是 将处理过的药材，用适当的溶剂在常温或温热( 6 0 8 0 ) 的情况下浸渍以溶出其中成分。如王嘉 陵p 4 l 用甲醇浸泡莲子心粉，然后回收甲醇，用酸水、碱水、亲脂性溶剂进行纯化，非水溶性总 碱( 含莲心碱、异莲心碱和甲基莲心碱) 收率为o 6 l 。又如张灿等”】用酸水提取法从北豆根中提 取蝙蝠葛总生物碱，即在3 0 时用o 5 的硫酸溶液浸提，提取液用碳酸钠碱化调口h 值至9 ，过 滤干燥后得粗总碱。该法一般在常温下进行，对中药中有效成分尤其是热敏性物质的提取非常有 利，但操作时间长，浸出效率差，用水为溶剂时提取液易腐败变质，须注意加入适当的防腐剂。 1 2 5 2 渗漉法 渗漉法是往药材粗粉中不断添加溶剂使其渗过粗粉，从渗流筒下端流出浸液的方法。此法特 黑龙江八农垦大学硕士学位论文第章文献综述 点是使药粉不断与新溶剂或含有有效成分浓度低的溶剂接触，因此提取效率较高，且溶剂可以反 复利用，但此法存在溶剂用量较大，操作过程长的缺点。 如黄嘉诺i j ”采用不同浓度的乙醇作溶剂，从药材中提取延胡索生物碱，用渗漉法进行提取， 并与热回流法进行比较，结果用同一浓度乙醇( 5 0 ) 为溶剂，渗辘法提取的生物碱收率( 0 2 2 1 ) 大于热回流法( 0 1 9 1 ) 。但此法溶剂消耗量大，费时长，操作烦琐，且新鲜及易膨胀的药材和 无组织结构的药材不宜用渗漉法。 1 - 2 5 _ 3 煎煮法 煎煮法是将中药粗粉置适宜煎煮器中，加适量水浸没原料，充分浸泡后加热至沸，保持微沸 浸出一定时间。此法既简便，而且经煎煮后，药中的大部分成分可被不同程度地提出，因此是提 取有效成分特别是药物制剂的基本方法。但是含挥发性成分及有效成分遇热易破坏的中药不宜用 此法。如李成网等9 1 将干燥山豆根粉末用8 倍量水煎煮两次，滤过浓缩，加2 倍量医用乙醇， 静置2 4h ，过滤，将滤液浓缩后用氯仿提取法纯化，所得回收率最高达1 3 5 ，结果表明该方 法稳定，工艺简单，成本较低，适宜于工业化生产。 1 2 4 4 回流法 回流法是一种比较成熟的分离方法。其最大特点在于通过溶剂的蒸发与回流，使得每次与原 料相接触的溶剂都是纯溶剂，从而大大提高了萃取动力，达到提高萃取速度和效果的目的。此法 操作简便，但效率不够高，有时不能一次完全提取生物碱，要反复回流提取。 如李文科【38 】从骆驼蓬中提取骆驼蓬生物碱，先用8 0 乙醇密闭浸泡原材料粗粉2 4h ，热回 流3 h ，过滤，反复提取3 次，过滤，将滤液浓缩后用氯仿提取法纯化，得总生物碱，回收率为 3 4 6 。此法不适用于受热易破坏的成分，并且溶剂消耗量大，操作复杂。 1 2 5 5 连续回流提取法 为了弥补分次加热提取法中需要溶剂量大、操作比较麻烦的不足，可采用连续提取法。连续 回流装置，实验室内常用索氏提取器。索氏提取器是由冷凝器( a ) 、带有虹吸管的提取管( b ) 和烧瓶( c ) 三部分构成。应用时是将盛有药粉的袋子置b 中，要注意内装物质的高度不超过虹 吸管上部。将c 盖水浴上加热后，溶剂受热汽化，通过中部提取管旁边的通汽侧管到达上部的a ， 冷凝为液体后流入提取管中，进行成分提取。待滴入的溶剂在提取管中聚集至一定量，即超过虹 吸管上端后，则因虹吸作用，提取有效成分后的溶液即流入c 中。其中溶剂部分可因再受热而 汽化，药材中的提出成分就留在c 中了。如甄攀、杨凤珍等 ”增察了吴莱萸总生物碱的提取条 件，结果表明，在相同的提取时间内，索氏提取的效率高于浸渍提取和超声提取，与回流提取相 当，而且回流提取需要分3 次提取，操作麻烦，因此优选索氏提取。如此反复循环多次，即得达 到提取有效成分的目的。索氏提取的提取液受热时问较长，因此对受热易分解的成分不宜用此法。 1 2 5 6 超声波提取法 超声波是一种弹性机械振动波，是听觉阈以外的振动，它产生强烈振动、高速度、强烈的空 化效应。搅拌作用，因此，超声波提取以超声波辐射压强产生的骚动效应，空化效应和熟效应， 引起机械搅拌，破坏植物药材的细胞，使溶媒能渗透到药材细胞中，从而加速药材中的有效成分 溶解于溶媒中，能够更有效的提高有效部位提取率，瞬间稳定升高温度对热不稳定成分影响较小。 超声提取法具有所需设备简单、操作方便、提取时间短、提取率高、节能、节约药材、无需加热 等优点，因此在提取中药成分方面的应用受到了越来越多的萤视【4 0 1 “ 。本法一般作为生物碱的辅 6 黑花江八一农垦大学硕士学位论文 第一章文献综述 助提取法，单纯采用超声波提取法不多见。像李慧【4 2 1 使用超声波辅助浸提北草乌生物碱，可以 大大提高生物碱的提取收率，缩短浸提时间，并且能很好地保持生物碱的特性和品质。 1 2 5 7 微波提取法 微波是一种电磁波，是由电场和磁场两部分能量结台组成。中药中除个别矿物质存在极少量 铁磁性物质外，绝大部分不会对微波中的磁场能量产生影响，故多认为中药微波提取仅仅是考虑 电场能量所起作用。微波提取是利用高频电磁波穿透萃取介质，到达物料的内部维管束和细胞系 统，使细胞破裂，细胞内有效成分自由流出；微波产生的电磁场还可加速被萃取成分向萃取溶剂 界面扩散，使有效成分在相对较低的温度下以较快的速度被萃取，从而最大限度保证萃取的质量。 微波提取具有选择性高、操作时间短、溶剂消耗量少、有效成分得率高、不产生噪音、适用于热 不稳定物质等特点。已被应用于天然化合物及生物活性成分的提取等方面【4 3 “1 。在国内，微波萃 取技术用于中药有效成分提取这方面的研究报道还比较少。王威等【46 】采用微波破壁法从高山红 景天根茎中提取红景天苷，结果表明该方法具有快速、高效、安全、节能等优点，与传统的乙醇 回流提取相比，该方法在保持较高的提取率的同时，大大缩短了提取过程所用的时间，并且显著 降低了提取液中杂质的含量。范志刚等1 47 】考察了微波技术对麻黄中麻黄碱浸出量影响，并且与 常规煎煮方法进行了比较，结果表明微波技术对麻黄中麻黄碱的浸出量明显优于常规煎煮方法。 1 2 5 8 超临界c 0 2 流体萃取法 超临界c 0 2 萃取技术应用在生物碱提取中最早，最成功的例子是从咖啡豆中提取咖啡碱。 2 0 世纪7 0 年代，德国的z o s e l 博士将超l 临界c o ：萃取工艺成功地应用于咖啡豆脱咖啡因的工业 化生产。j a n i c a t 等”用超临界c 0 2 添加极性添加剂甲醇和水从婴粟茎中提取5 种生物碱；如美 国s c h a e 任h 等f 4 ”1 开发了从野百合植物中提取用于化疗的野百合碱的新技术；董超宇等刚对烟 草中的烟碱进行了超临界c 0 2 萃取研究，寻找到萃取时间1 5 2 h 、萃取温度4 2 5 2 、萃取压 力1 2 1 6m p a 的最佳工艺条件，并且与有机溶剂提取相比，不会产生橡胶状物质，有利于进一 步处理，对环境无污染；原永芳等”2 j 用乙醇为夹带剂从荜茇中提取胡椒碱，最佳萃取温度4 0 ， 萃取压力2 6 1 m p a ，夹带剂为o 4m l 乙醇，静态萃取时间1 5 商n ，动态萃取体积5m l ，与传统有 机溶剂提取法相比较收率提高了7 3 ，且操作简便快速，杂质少；姜继祖等口”以不同浓度乙醇 为夹带剂，从光菇子中提取秋水仙碱，使提取率平均提高为回流萃取法的1 2 5 倍，而萃取时间 为回流萃取法的o ，4 5 倍，每克光菇子粉所需溶剂用量平均为回流萃取法的0 3 6 8 倍，充分显示了 超临界c 0 2 萃取的优势。 现资料报道平贝母中生物碱的提取方法主要有冷浸法、乙醇回流法。国内学者对平贝母中总 生物碱含量的研究主要是采用冷浸法后直接进行含量的测定口4 s ”。采用乙醇回流提取平贝母化 学成分的报道较多l l ”，但尚无对提取工艺进行优选的报道。 1 2 6 生物碱的分离 用溶剂直接提取出的粗生物碱除了含生物碱及盐类外，还含有大量其他腊溶性杂质或水溶性 杂质，须进一步纯化处理，众所周知生物碱的分离方法的确很多，既有经典的分离方法，如溶剂 萃取法、蒸馏法、沉淀法、盐析法、结晶法、膜渗透升华法等，也有较为现代、先进的分离方法， 如色谱分离法。色谱分离法是一种物理的分离方法，利用混合物中各组分性质的差别，使各组分 7 黑龙江八一农垦丈学硕士学位论文 第一章文献综述 以不同程度分布在两相中，从而使各组分以不同速度移动而达到分离。 现资料报道，平贝母中单体生物碱的分离纯化的方法主要是吸附柱色谱分离法”“”。吸附柱 色谱分离法对有效成分与其它成分的分离效果好，一些结构相似、用普通方法不易分离的物质， 用柱色谱分离法往往能得到满意的分离结果。 1 | 2 6 1 硅胶柱色谱分离法 主要是利用二氧化硅作为填料，是较为常用的柱色谱分离方法。硅胶是中性无色颗粒，其性 能稳定。硅胶层析柱适用范围广，既能用于非极性生物碱也能用于极性生物碱，且成本低，操作 方便，是常见的生物碱的分离方法，董新荣等i s 6 】利用g f 2 5 4 硅胶自制的硅胶柱，对北美黄连中 的主要生物碱进行分离，可以得到9 9 5 的北美黄连碱。 1 2 6 2a 1 2 0 3 柱色谱分离法 以a l z 0 3 作为填料的层析分离法，适合于酸性大、活化温度较高的生物碱的分离。比如采用 a l ：o ，层析方法正向分离非酚性粉防己碱与粉防己若林碱旧，其r f 值适中，展开后放置1 0 m - m 以显色剂喷湿润效果为最好且稳定，可得到较好的效果。这种柱色谱分离法也是较为常用的生物 碱分离的方法之一。这是由于许多生物碱极性较小，氧化铝对它们吸附较小，而杂质常被吸附。 1 2 6 3 大孔树脂分离法 大孔树脂是一类有机高聚物吸附剂，具有大孔网状结构和较大的比表面积，可通过物理吸附 从水溶液或其他溶液中选择性的吸附有机物。近年来，大孔树脂在生物碱精制纯化领域中应用越 来越广泛p 8 “j 。 用大孔树脂分离提取生物碱，已有较多的研究。例如m i l l e ，“】应用a n 出竹1 i t ex a d _ 4 大孔树 脂自吗啡溶液中提取吗啡：张红等【6 3 】用a b 8 大孔树脂提取分离喜树果中喜树碱；刘俊红等删 利用d 1 0 1 ，d a 一2 0 1 ，w d i i 三种不同的大孔树脂分离提取延胡索生物碱。这些研究表明，大 孔吸附树脂对于生物碱具有良好的吸附效能，与传统的分离方法相比，具有工艺简单，能耗较少， 成品体积小，产品质量稳定且具有良好的生理活性等特点。 1 2 6 4 离子交换树脂分离法 离子交换树脂对吸附质的作用主要是通过静电引力和范德华力达到分离纯化化合物的目的。 随着人们对生物碱的认识和了解，离子交换树脂已应用于生物碱的分离提取中